混合中性纖維素酶及其制備方法和在造紙打漿中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于造紙打漿的混合中性纖維素酶，屬于酶制劑領域。所述混合中性纖維素酶，重量份數組成如下：纖維素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果膠酶5-10份、甘露聚糖酶3-8份，中草藥粉劑2-8份。本發明制備的混合中性纖維素酶，有效的利用了中草藥粉劑的有效成分，并利用特殊方法克服了傳統的酸性木聚糖酶采用單一菌種發酵的缺陷；經過混合中性纖維素酶處理的磨漿，叩解度相對于未處理漿增加了11.76%，短纖耐破指數提高了11.98%，環壓指數提高了13.99%；長纖拉力指數提高了40.17%,，撕裂指數提高了58.91%，纖維表面變得光滑，酶纖維更為柔軟；成紙的撕裂指數、抗張指數、耐破指數分別提高了8.3%，10.6%，16.5%，紙漿白度提高2%-5%，污水質量大大改善，降低了對環境的污染程度。
【專利說明】混合中性纖維素酶及其制備方法和在造紙打漿中的應用
【技術領域】:
[0001] 本發明屬于酶制劑領域，特別涉及紙漿造紙領域用酶。
【背景技術】:
[0002]制漿造紙工業是國民經濟的重要支柱產業之一，但也是森林、能源、化學品等資源消耗和環境污染的大戶。全球的造紙工業每年要砍伐數億立方米的林木，而其中約半數變為廢棄物又被排回至周圍的大氣和水流中，給人類生存的生態環境造成了巨大威脅和危害。減少能源和化學品消耗、提高紙漿得率、污水生物處理等都是克服上述困難的根本途徑。而生物技術恰恰在這些方面是可以大有作為的。
[0003]纖維素酶是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習慣上，將纖維素酶分成三類:Cl酶、Cx酶和β葡糖苷酶。Cl酶是對纖維素最初起作用的酶，破壞纖維素鏈的結晶結構。Cx酶是作用于經Cl酶活化的纖維素、分解β-1，
4-糖苷鍵的纖維素酶。β葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。
[0004]纖維素酶反應和一般酶反應不一樣，其最主要的區別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結構極其復雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協同作用下將纖維素分解成葡萄糖。
[0005]1950年，Reese等提出了 Cl-Cx假說，該假說認為必須以不同的酶協同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協同作用一般認為是內切葡聚糖酶(Cl酶)首先進攻纖維素的非結晶區，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由β_葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個葡萄糖。不過，纖維素酶的協同作用順序不是絕對的，隨后的研究中發現，Cl-Cx和β -葡聚糖苷酶必須同時存在才能水解天然纖維素。若先用Cl酶作用結晶纖維素，然后除掉Cl酶，再加入Cx酶，如此順序作用卻不能將結晶纖維素水解。
[0006]影響纖維素酶產量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養溫度、pH、水分、基質、培養時間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯系的。張中良等(1997)采用均勻設計C112 (1210),以綠色木霉(T.ViriclePers.expr)為菌種,研究了影響產纖維素酶的五大因素對產酶量和活力的作用，認為基質粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31°C條件下培養45h可獲得最大產酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g.h。王成華等(1997)也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產酶條件，結果表明該菌種以7:3的秸桿粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養基，28-32°C為適宜培養溫度，30°C為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達發酵高峰。張苓花等(1998)研究了以康氏木霉W-925為出發菌，經誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產菌的最佳發酵條件。結果表明，以1:2的麥麩和稻草粉為培養基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始pH4-5，溫度在28-35°C，發酵時間72h為最佳發酵條件。[0007] 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司提交的一種優化改良的中性纖維素酶MEGl及其基因和應用專利，其申請號:201110362928.0。該發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種優化改良的中性纖維素酶MEGl及其基因和應用。本發明提供了一種優化改良的中性纖維素酶MEGl，發明還提供了編碼上述優化改良的中性纖維素酶MEGl的基因，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應用。本發明的優化改良的中性纖維素酶MEGl在中性條件下酶活有很大的提高，并且，通過高拷貝外源基因菌株的篩選，得到能夠在反應器中高效表達的生產菌株，進一步滿足工業化生產的要求，因此，本發明的優化改良的MEGl可在紡織、洗滌、造紙、飼料中顯示出巨大的應用潛力。
[0008]混合中性纖維素酶是由許多具有高協同作用的水解酶組成的，含有纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等生物活性成分。纖維素酶又含有:(I)外切型葡聚糖酶(Cl酶)；(2)內切型葡聚糖酶(Cx酶)；(3) β -葡萄糖苷酶(也稱纖維二糖酶，CBH酶)三種組分。
[0009]混合中性纖維素酶主要是通過對纖維素內部進行分解，促進(打)磨漿過程中纖維的分絲和帚化，使打漿變得更容易，節省打漿能耗。通過對纖維表面進行改性，對纖維末端進行分化，促進纖維的潤脹，同時使纖維表面和末端的羥基和羧基增多，從而增強纖維之間的結合力，達到增強成紙性能、提高成紙品質的效果。
[0010]通過生物酶對纖維素的改性，纖維形態起明顯有益變化，無論是磨前或者磨后，其纖維表面均有更為明顯的分絲帚化，因此漿料的叩解度更易提高，同時表面細纖化有助于提高成紙物理性能和改善留著率，紙張成形時纖維間結合力更強。
[0011]由于纖維得到充分的吸水潤漲，使纖維變得柔軟增粗。從而使成紙的松厚度有所增加，柔軟性提高。同時具有使細小纖維重新組合的作用，有利于濕紙頁的濾水，減少白水中細小纖維的含量，使白水循環率有所提高，從而降低噸紙原漿消耗及清水用量。
【發明內容】
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[0012]本發明所解決的技術問題是克服現有制漿造紙技術中廢棄物排放量大的缺陷，利用一種混合中性纖維素酶過對纖維素內部進行分解，促進磨漿過程中纖維的分絲和帚化，使打漿變得更容易，從而節省打漿能耗，，使白水循環率有所提高，從而降低噸紙原漿消耗及清水用量，改善了污水的質量。
[0013]為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0014]一種混合中性纖維素酶，用于造紙打漿酶；
[0015]所述混合中性纖維素酶，重量份數組成如下:
[0016]纖維素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果膠酶5_10份、甘露聚糖酶3_8份，中草藥粉劑2-8份。 [0017]所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當歸20-30份；黨參10-18份；柴胡10_15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度80°C—95°C保持2—4h，添加混合物料2_3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至55°C—65°C保持3 — 4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0018]所述混合混合中性纖維素酶的制備方法如下:將纖維素酶、酸性木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和中草藥粉劑按照重量份數混合而成；[0019]所述酸性木聚糖酶采用以下技術方案制備:
[0020]一種酸性木聚糖酶制備方法包括如下步驟:
[0021](I)黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化
[0022]將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養基，28_35°C培養36_48h進行菌種活化，如此活化2-4次；
[0023]將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養基，34_35°C培養24_36h進行菌種活化，如此活化2-3次；
[0024]所述黑曲霉斜面培養基組成為:馬鈴薯煮汁200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥劑粉 5-20g,蒸餾水 1000mL, pH 值 5.8，121°C 滅菌 20min ；
[0025]所述枯草芽孢桿菌斜面培養基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL，pH 值 6.8，121°C 滅菌 20min ；
[0026](2)黑曲霉液體種子擴大培養
`[0027]所述黑曲霉一級種子罐發酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0028]枯草芽孢桿菌液體種子擴大培養
[0029]一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度32-36°C，攪拌速度200-400rpm，通風量(V/V) 1:1-2,罐壓0.05Mpa,培養時間 10-20h ；
[0030](3)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級種子罐液體種子混合
[0031]將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合；所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5-1 ；
[0032]所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0033](4) 二級種子罐互生
[0034]將步驟(3)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養基裝量240L，二級種子罐發酵罐，培養溫度28-35 °C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間 15_24h ；
[0035]所述互生培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10-15g，海藻糖10-30g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀 l_2g，純凈水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min ；
[0036](5)菌種混合發酵
[0037]將步驟(4)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度28-30°C，攪拌速度 200-700r/m，通風量(V/V) 1:1-3，培養時間 10_15h;然后以 1-2 °C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5 °C，此時，將步驟(4)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養15_20h ;繼續以
1-20C /h升溫速率緩慢升溫至30-35°C，恒溫培養15-20h ；
[0038]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15-30% ；
[0039]PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在5-7 ；
[0040]補料控制:當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0041 ] 放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0042]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10-15g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀 l_2g，純凈水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min ；
[0043]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，不足部分純凈水補足，pH值5-7，121-123°C滅菌30_40min。
[0044](6)發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
[0045]有益效果:
[0046]本發明制備的混合中性纖維素酶，有效的利用了中草藥粉劑的有效成分，并利用特殊方法克服了傳統的酸性木聚糖酶采用單一菌種發酵的缺陷，將產高活力酸性木聚糖酶的菌種黑曲霉與產強熱穩定性酸性木聚糖酶的菌種枯草芽孢桿菌科學結合、互生穩定，致使混合菌種的產酶能力最大限度地顯現，也使本發明所產酸性木聚糖酶類型全、活力高、作用條件寬泛、穩定性強、適于工業化生產。本發明發酵液酸性木聚糖酶比活力為5300-6800U/mg,比單一菌種黑曲霉發酵液酸性木聚糖酶酶活力平均提高了 2_3倍，熱穩定性強，適用反應溫度范圍為30-78°C ;并且經過混合中性纖維素酶處理的磨漿，叩解度相對于未處理漿增加了 11.76%，短纖耐破指數提高了 11.98%，環壓指數提高了 13.99% ;長纖拉力指數提高了 40.17%，，撕裂指數提高了 58.91%，纖維表面變得光滑，酶纖維更為柔軟；成紙的撕裂指數、抗張指數、耐破指數分別提高了 8.3%，10.6%，16.5%，減少了盤末磨漿時間，降低電耗10 — 20%，紙漿白度提高2%-5%，白水循環系統變得干凈，污水質量大大改善，降低了對環境的污染程度。
【具體實施方式】
`[0047]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0048]實施例1
[0049]本發明提供的黑曲霉菌株保藏號為CICC2475，購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。所述黑曲霉斜面培養基組成為:馬鈴薯煮汁200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL, pH 值 5.8，121°C 滅菌 20min ；
[0050]枯草芽孢桿菌CICC10158購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。所述枯草芽孢桿菌斜面培養基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH值
6.8，121°C 滅菌 20min ；
[0051]所述黑曲霉一級、二級、三級種子培養基組成為:馬鈴薯煮汁200g，葡萄糖20g，海藻糖 10-30g,蒸餾水 lOOOmL, pH 值 5.5，121°C 滅菌 20min ；
[0052]所述黑曲霉一級種子罐培養基組成為:玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10_15g，海藻糖10-30g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，純凈水lOOOmL，pH值5-7，121°C 滅菌 20min ；
[0053]所述枯草芽孢桿菌一級、二級、三級種子培養基重量組成為:
[0054]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀
0.8-1.5%，海藻糖1_3%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121_123°C滅菌30_40min。
[0055]所述枯草芽孢桿菌種子罐培養基重量組成為:
[0056]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿
0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121-123? 滅菌 30-40min。
[0057]所述互生培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10-15g，海藻糖10-30g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀 l_2g，純凈水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min ；
[0058]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10-15g，海藻糖30-40g， 酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀 l_2g，純凈水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min ；
[0059]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，不足部分純凈水補足，pH值5-7，121-123°C滅菌30_40min。
[0060]實施例2
[0061]混合中性纖維素酶的重量份數組成如下:纖維素酶30份、木聚糖酶酶25份、果膠酶8份、甘露聚糖酶5份，中草藥粉劑5份。
[0062]中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當歸24份；黨參14份；柴胡13份；黃芩14份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加4倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0063]所述酸性木聚糖酶采用以下技術方案制備:
[0064](I)黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化
[0065]將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養基，30°C培養40h進行菌種活化,如此活化3次；
[0066]將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養基，35°C培養30h進行菌種活化，如此活化2次；
[0067]所述黑曲霉斜面培養基組成為:馬鈴薯煮汁200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL, pH 值 5.8，121°C滅菌 20min ；
[0068]所述枯草芽孢桿菌斜面培養基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL，pH 值 6.8，121°C 滅菌 20min ；
[0069](2)黑曲霉液體種子擴大培養
[0070]①一級種子培養:將步驟(1)活化后的黑曲霉斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養基裝量100毫升，30°C、80rpm搖床培養40h ；
[0071]②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0072]③三級種子培養:將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養基裝量1000毫升，30°C、80rpm搖床培養40h ；
[0073]④一級種子罐培養:將三級種子以8%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，控制pH值為5，培養溫度28°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V) 1: 0.8，培養時間36h，溶解氧10%;
[0074]所述黑曲霉一級、二級、三級種子培養基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，海藻糖 IOg,蒸懼水 lOOOmL, pH 值 5.5,121°C滅菌 20min ；
[0075]所述黑曲霉一級種子罐培養基組成為:玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，海藻糖10g，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，純凈水10001^，？!1值5，1211:滅菌20min ；
[0076]所述黑曲霉一級種子罐發酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ；
[0077](3)枯草芽孢桿菌液體種子擴大培養
[0078]①一級種子培養:將步驟(1)活化后的枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度35°C，培養時間IOh ；
[0079]②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0080]③三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度35°C，培養時間IOh ；
[0081]④一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度32°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養時間IOh ；
[0082]所述枯草芽孢桿菌一級、二級、三級種子培養基重量組成為:
[0083]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，海藻糖1%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121°C滅菌30min。
[0084]所述枯草芽孢桿菌種子罐培養基重量組成為:
[0085]麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀
0.8%，硫酸鎂0.05%,不足部分純凈水補足，pH值6.8，121°C滅菌30min。
[0086]所述枯草芽孢桿菌種子罐發酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ；
[0087](4)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級種子罐液體種子混合
[0088]將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(3)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合；
[0089]所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5 ;
[0090]所述混合液體種子菌體濃度為:7.0xlO8個/ml ；
[0091](5) 二級種子罐互生
[0092]將步驟(4)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養基裝量240L，二級種子罐發酵罐，培養溫度28-35 °C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V) 1:1，培養時間 15h ；
[0093]所述互生培養基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，海藻糖10g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，純凈水lOOOmL，pH值5，121°C 滅菌 20min ；
[0094](6)菌種混合發酵[0095]將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度28°C，攪拌速度200r/m，通風量(V/V) 1:1，培養時間IOh ;然后以TC /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養15h ;繼續以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養15h ;繼續以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養15h ；
[0096]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ；
[0097]PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在5 ；
[0098]補料控制:當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ；
[0099]放罐標準:60%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0100]所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，純凈水1000mL，pH值5，121°C 滅菌 20min ；
[0101]所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥劑粉5%，不足部分純凈水補足，pH值5，121°C滅菌30min。[0102](7)發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
[0103]所述調配過程不添加任何防腐劑。
[0104]經上述制備方法得到的發酵液酸性木聚糖酶酶活力為5300U/mg。
[0105]實施例3
[0106]所述混合中性纖維素酶的用法及用量:
[0107]根據紙漿原料和工藝、設備的不同選用合適產品，生物酶的添加方法也有所差異，可主要分為以下兩類:
[0108](I)紙廠自己制漿、直接供漿的生產線添加地點:最后一道洗漿機出漿口和叩前池進漿口之間可能的位置；洗漿后漿料獲得適宜的溫度和PH值，叩前池可使生物酶獲得足夠的停留時間。
[0109]添加方法:根據送漿方式和流量，把生物酶配制成易于準確操作的溶液，然后用計量泵同步加入漿料中。
[0110](2)采用廢紙和外來漿板的生產線添加地點:一般情況下碎漿機溫度和pH值均可適合生物酶使用，利于生物酶得到充分的攪拌和反應時間。
[0111]添加方法:根據碎漿方式的不同分兩種情況:一種為連續碎漿:根據碎漿產量，把生物酶配制成易于準確操作的溶液，然后用計量泵同步加入碎漿機中；第二種為間歇碎漿:根據每次碎漿量稱取足量的生物酶，直接投入碎漿機中。
[0112]添加量:50-200g(ml) /t 絕干漿；
[0113]所述混合中性纖維素酶原封裝在陰涼、干燥環境下，保質期為12個月，在5°C -15°C低溫、干燥環境下，保質期為24個月。
【權利要求】
1.一種混合中性纖維素酶,重量份數組成如下: 纖維素酶10-40份、酸性木聚糖酶20-30份、果膠酶5-10份、甘露聚糖酶3_8份，中草藥粉劑2-8份。
2.根據權利要求1所述的混合中性纖維素酶，其特征在于，所述酸性木聚糖酶采用以下技術方案制備: (1)黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化 將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養基，28-35°C培養36-48h進行菌種活化,如此活化2-4次； 將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養基，34-35°C培養24-36h進行菌種活化，如此活化2-3次； (2)黑曲霉液體種子擴大培養 所述黑曲霉一級種子罐發酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ； 枯草芽孢桿菌液體種子擴大培養 一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度32-36 °C，攪拌速度200-400rpm，通風量(V/V) 1:1-2，罐壓0.05Mpa,培養時間 10-20h ； (3)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級種子罐液體種子混合 將步驟(2)得到的黑曲霉種 子罐液體種子與步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合；所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5-1 ； 所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x108-8.0xlO8個/ml ； (4)二級種子罐互生 將步驟(3)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養基裝量240L，二級種子罐發酵罐，培養溫度28-35°C，攪拌速度200_700r/m，通風量(V/V) 1:1-3,培養時間15-24h ； (5)菌種混合發酵 將步驟(4)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V)l:l-3，培養時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，將步驟(4)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h ;最后以1-20C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-35°C，恒溫培養15-20h ； (6)發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
3.根據權利要求1所述的一種混合中性纖維素酶，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當歸20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度80°C—95°C保持2—4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至55°C—65°C保持3 — 4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
4.根據權利要求2所述的一種混合中性纖維素酶，其特征在于，所述黑曲霉一級、二級、三級種子培養基組成為:馬鈴薯煮汁200g，葡萄糖20g，海藻糖10-30g，蒸餾水1000mL,pH 值 5.5，121°C 滅菌 20min ； 所述黑曲霉一級種子罐培養基組成為:玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，海藻糖10_30g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，純凈水lOOOmL，pH值5-7，.121°C 滅菌 20min ； 所述枯草芽孢桿菌一級、二級、三級種子培養基重量組成為: 酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀.0.8-1.5%，海藻糖1_3%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121_123°C滅菌30_40min ； 所述枯草芽孢桿菌種子罐培養基重量組成為: 麥芽糊精5-15%,酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121_123°C滅菌.30-40min ； 所述互生培養基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10_15g，海藻糖10_30g，酵母粉4-8g，玉米漿l-5g，硫酸銨l-3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀.l_2g，純凈水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min ； 所述發酵培 養基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麩皮10_15g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l-5g，硫酸銨l-3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀.l_2g，純凈水 1000mL, pH 值 5-7，121°C 滅菌 20min ； 所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，不足部分純凈水補足，pH 值 5-7，121-123°C滅菌 30_40min。
5.根據權利要求1所述的一種混合中性纖維素酶，其特征在于，所述混合中性纖維素酶的重量份數組成如下:纖維素酶30份、木聚糖酶酶25份、果膠酶8份、甘露聚糖酶5份，中草藥粉劑5份； 中草藥粉劑的制備方法如下:稱取當歸24份；黨參14份；柴胡13份；黃芩14份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加4倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑； 所述酸性木聚糖酶采用以下技術方案制備: (O黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化 將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養基，30°C培養40h進行菌種活化，如此活化3次； 將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養基，35°C培養30h進行菌種活化,如此活化2次； 所述黑曲霉斜面培養基組成為:馬鈴薯煮汁200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水.1000mL, pH 值 5.8，121°C 滅菌 20min ； 所述枯草芽孢桿菌斜面培養基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL, pH 值 6.8，121°C 滅菌 20min ； (2)黑曲霉液體種子擴大培養 ①一級種子培養:將步驟(1)活化后的黑曲霉斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養基裝量100毫升，30°C、80rpm搖床培養40h ；②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同； ③三級種子培養:將二級種子以8%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，液體培養基裝量1000毫升，30°C、80rpm搖床培養40h ； ④一級種子罐培養:將三級種子以8%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，控制pH值為5，培養溫度28°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V)l: 0.8，培養時間36h，溶解氧10% ； 所述黑曲霉一級、二級、三級種子培養基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，海藻糖 IOg,蒸餾水 1000mL, pH 值 5.5，121°C 滅菌 20min ； 所述黑曲霉一級種子罐培養基組成為:玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，海藻糖IOgjt酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，純凈水10001^，？!1值5，1211:滅菌20min ； 所述黑曲霉一級種子罐發酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ； (3)枯草芽孢桿菌液體種子擴大培養 ①一級種子培養:將步驟(1)活化后的枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度35°C，培養時間IOh ； ②二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同； ③三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度35°C，培養時間IOh ； ④一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度32°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V)l:l，罐壓0.05Mpa，培養時間IOh ； 所述枯草芽孢桿菌一級、二級、三級種子培養基重量組成為: 酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，海藻糖1%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121。。滅菌30min ； 所述枯草芽孢桿菌種子罐培養基重量組成為: 麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%,不足部分純凈水補足，pH值6.8，121°C滅菌30min ； 所述枯草芽孢桿菌種子罐發酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ； (4)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級種子罐液體種子混合 將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(3)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合； 所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5 ; 所述混合液體種子菌體濃度為:7.0xlO8個/ml ； (5)二級種子罐互生 將步驟(4)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養基裝量240L，二級種子罐發酵罐，培養溫度28-35°C，攪拌速度200_700r/m，通風量(V/V) 1:1，培養時間15h ； 所述互生培養基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，海藻糖10g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，純凈水1000mL，pH值5，121 °C滅菌20min ； (6)菌種混合發酵 將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度28°C，攪拌速度200r/m，通風量(V/V)l:l，培養時間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養15h ;繼續以TC /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至.10°C，恒溫培養15h ;繼續以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養15h ； 溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ； PH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在5 ； 補料控制:當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時,開始添加補料培養基,補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ； 放罐標準:60%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢； 所述發酵培養基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆粉15g，麩皮10g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，純凈水1000mL，pH值5，121 °C滅菌20min ； 所述補料培養基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥劑粉5%，不足部分純凈水補足，pH值5，121°C滅菌30min ； (7)發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶； 所述調配過程不添加任何防腐劑； 經上述制備方法得到的發酵液酸性木聚糖酶酶活力為5300U/mg。
6.根據權利要求1-5所述混合中性纖維素酶的制備方法，包括如下步驟:所述混合混合中性纖維素酶的制備方法如下:將纖維素酶、酸性木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和中草藥粉劑按照重量份數混合而成； (O黑曲霉、枯草芽孢桿菌菌種活化 將保存完好的黑曲霉的斜面菌種接種于斜面培養基，28-35°C培養36-48h進行菌種活化,如此活化2-4次； 將保存完好的枯草芽孢桿菌的斜面菌種接種于斜面培養基，34-35°C培養24-36h進行菌種活化，如此活化2-3次； (2)黑曲霉液體種子擴大培養 所述黑曲霉一級種子罐發酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ； 枯草芽孢桿菌液體種子擴大培養 一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度32-36 °C，攪拌速度200-400rpm，通風量(V/V) 1:1-2，罐壓.0.05Mpa,培養時間 10-20h ； (3)黑曲霉、枯草芽孢桿菌一級種子罐液體種子混合 將步驟(2)得到的黑曲霉種子罐液體種子與步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌種子罐液體種子按體積比均勻混合；所述黑曲霉種子液與枯草芽孢桿菌種子液體積比為1:0.5-1 ； 所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x108-8.0xlO8個/ml ；(4)二級種子罐互生 將步驟(3)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養基裝量240L，二級種子罐發酵罐，培養溫度28-35°C，攪拌速度200_700r/m，通風量(V/V) 1:1-3,培養時間15-24h ； (5)菌種混合發酵 將步驟(4)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發酵罐，培養溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V)l:l-3，培養時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2_5°C，此時，將步驟(4)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養20-30h ;最后以1-20C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養15-20h ;繼續以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-35°C，恒溫培 養15-20h ； (6)發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得固體酸性木聚糖酶。
【文檔編號】D21C5/00GK103642774SQ201310573648
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】趙迎春, 王剛, 謝合群 申請人:寧夏夏盛實業集團有限公司