專利名稱：中堿性纖維素酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及到生物遺傳領域，具體涉及一種來源于深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21的中堿性纖維素酶及其制備方法。
背景技術：
1904年Seiliere首次發現蝸牛消化液存在纖維素酶，它是由多種組分構成，是能有效水解纖維素及其衍生物的一組酶的總稱。根據纖維素酶的作用位點分為三類。(I)內切-β-1，4_葡萄糖苷酶，也稱羧甲基纖維素酶(endo-1， 4-β—D-glucanase,EC 3.2. I.4,簡稱EG)。它能水解可溶性纖維素,也可作用于無定形纖維素，隨機切斷纖維素內部分子鏈β -1，4鍵，但不能分解排列整齊的結晶纖維素。(2)外切_β-1,4-葡萄糖苷酶,也稱纖維二糖水解酶(θχο-1,4_β-D-glucanase,EC3. 2. I. 91，簡稱CBH)。它不能水解可溶性纖維素，但可作用于結晶纖維素，進攻纖維素還原性末端或非還原性末端，每次作用生成纖維二糖及纖維糊精，扮演著自然界纖維素降解的主要角色。(3) β-1,4-葡萄糖苷酶，也稱纖維二糖酶(β-1,4-D-glucosidase, EC3.2. I. 21，簡稱BG)。經誘導產生的β-1，4-葡萄糖苷酶，可分泌于胞外，也存在于胞內，作用底物是纖維二糖及纖維寡糖，最終生成D-葡萄糖。人們對纖維素酶做了大量的研究，特別是針對里氏木霉等木霉屬真菌纖維素酶的研究更是達到登峰造極的程度，克隆了其基因，構建里氏木霉表達體系，優化了發酵條件，達到了纖維素酶的最高產，但是對于真菌來說所產生的纖維素酶主要是酸性的，這限制了其在堿性條件下的應用，比如紡織、洗滌等行業的應用。紡織行業是中國傳統支柱產業，占國民經濟的比例很大，其中纖維素酶在起花、拋光、除毛的應用很早就已經開始，主要由酸性纖維素酶負責，但因酸性纖維素酶對布料處理非常劇烈，工藝不易控制，返染現象嚴重，重復性差，正逐步被中堿性內切纖維素酶所代替。市場上中性內切纖維素酶的價格一直是酸性纖維素酶的四五倍，且全部由國際酶制劑生產巨頭公司所壟斷，比如，諾維信和杰能科，市場上流通的中性內切纖維素酶，由國內一些企業用上述公司所提供的原酶進行復配而得，導致國內企業利潤空間壓縮。堿性纖維素酶可應用于洗滌劑行業，將此酶以適當的比例與洗滌劑中混合，將明顯提高洗滌效果，可以減少洗滌劑的用量，降低對環境的污染，是洗滌劑行業應用的趨勢。堿性內切纖維素酶能夠作用于非結晶區而去除內部的污物、皮脂等。至今發現的堿性纖維素酶絕大多數來源于芽孢桿菌，還有來源于特異腐質霉。除了上述的兩個應用外，纖維素酶已經在食品、飼料、造紙、化工、釀造、石油、農業、醫藥等行業得到了應用。國內在產中堿性纖維素酶菌的篩選有較多的研究，但是涉及到分子水平的研究較少，以我們所知，中堿性纖維素酶基因序列及氨基酸序列的報道更是少見
發明內容
本發明的目的就是為了解決上述現有技術存在的問題，提供一種中堿性纖維素酶及其制備方法。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案一種中堿性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。 上述中堿性纖維素酶基因，其中，所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。一種上述纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述的編碼多肽，其中，所述的編碼多肽在中堿性條件下具有纖維素酶活性。一種中堿性纖維素酶的制備方法，包括以下步驟I)由深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21培養分離出中堿性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)將基因克隆到表達載體pPIC9K中；3)將構建的表達載體轉入到宿主細胞，生產中堿性纖維素酶的基因工程菌；4)培養基因工程菌，獲得中堿性纖維素酶。上述中堿性纖維素酶的制備方法，其中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，原核細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細胞包括酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細胞。本發明以Phaeosphaeria sp. LH21菌基因組為基礎，利用同源性搜索得到保守性氨基酸片段，設計簡并性引物得到中間序列，用基因組走讀擴增兩端未知序列，反轉錄PCR擴增該基因，然后克隆到表達載體pPIC9K中，并在畢赤酵母GS115中獲得表達。通過Genbank同源搜索和蛋白質功能研究表明，該基因是一個編碼中堿性纖維素酶的基因序列。該基因能在任何宿主細胞中表達具有生物活生功能中堿性纖維素酶。在本發明中，“中堿性纖維素酶基因”指編碼的纖維素酶在中性pH和堿性pH條件下可以表現出最大活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列及其簡并密碼子所產生的序列。由已知密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. I核苷酸序列同源性小于70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列，還包括核苷酸雜交的核苷酸序列。還可包括同源性至少70%，直到至少95%的核苷酸序列。在本發明中，“中堿性纖維素酶”指在中堿性pH條件下具有纖維素酶活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。該術語還包括SEQ ID NO. 2序列的突變體，這些突變體具有與天然中堿性纖維素酶相同的功能。這些突變體包括若干個氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在兩端添加一個、數個或一段氨基酸片段，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在兩端添加一個、數個或一段氨基酸也不影響酶的功能。該術語還包括中堿性纖維素酶的活性片段和活性衍生物。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，比如市場上流通的質粒。在生產本發明的中堿性纖維素酶時，可以將中堿性纖維素酶基因編碼序列連于表達調控序列，從而形成中堿性纖維素酶表達載體。表達載體含有復制起始點、啟動子、增強子和必要的加工信息位點。表達載體還必須含有可拱選擇的標記基因，比如提供卡那霉素，氨芐表霉素，氨甲蝶呤等抗生素或其他毒性物質的抗性蛋白質；互補營養缺陷型蛋白質；提供復合培養基中沒有的必需營養成分的蛋白質。在本發明中，術語宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞如大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、分支桿菌等。常用的真核細胞如酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等，或各種動植物細胞。本發明的中堿性纖維素酶基因開放閱讀框序列或其片段通常可以用PCR擴增法，重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，用本領域技術人員已知的常規方法制備，以Phaeosphaeria sp.全基因組DNA為模板，擴增而得到相關序列。當獲得相關序列時，就可將其克隆至相關載體，再轉入宿主細胞，然后通過常規方法從擴繁后的宿主細胞中得到大批量的相關序列。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作詳細描述I)中堿性纖維素酶基因的克隆首先培養Phaeosphaeria sp. LH21,培養方法按PDA的培養基，按Sambrook等的方法提取基因組DNA。根據P.nodorum SN15基因組測序信息，以其基因登錄號NW_001884559的序列進行同源搜索，找出保守的同源片段，設計簡并性引物5，-TWYTGGGACTGCTGTAAACC-3’ and 5’ -GGACATASRACGCGYTTGAA-3，，擴增中間序列，通過三輪的基因組走讀，擴增兩側未知序列，拼接全長序列，通過ORFfinder軟件預測開放閱讀框，經反轉錄PCR擴增到了預計的目的片段，驗證是正確的。2)中堿性纖維素酶的制備上述獲得的中堿性纖維素酶基因通過SignalP3. O軟件預測信號肽，去除信號肽，在上游引物引入Not I位點，下游引物引入EcoR I，插入到pPIC9K中，再電轉到畢赤酵母GS115中，篩選能夠表達中堿性纖維素酶的基因工程菌。具體操作如下 a、挑取 GSl 15-pPIC9k-cel-l 單克隆，接種至 25mlBMGY 中(250ml 搖瓶)，28 °C，250rpm,大約 18h。b、室溫3000g離心5min，收集細胞，去除上清，用BMMY重懸細胞至100ml，進行誘
導表達。C、在IL搖瓶中加入上述培養物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續生長。d、每24小時，加甲醇至終濃度為O. 5%以繼續誘導。e、通過DNS法測定重組中堿性纖維素酶。f、SDS-PAGE鑒定分子量大小。序列表〈110〉華東理工大學<120>中堿性纖維素酶及其制備方法<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>權利要求
1.一種中堿性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據權利要求I所述中堿性纖維素酶基因，其特征在于所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種根據權利要求I所述的纖維素酶基因的編碼多肽，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
4.根據權利要求3所述的編碼多肽，其特征在于所述的編碼多肽在中堿性條件下具有纖維素酶活性。
5.一種中堿性纖維素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)由深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21培養分離出中堿性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列； 2)將基因克隆到表達載體PPIC9K中； 3)將構建的表達載體轉入到宿主細胞，生產中堿性纖維素酶的基因工程菌； 4)培養基因工程菌，獲得中堿性纖維素酶。
6.根據權利要求5所述中堿性纖維素酶的制備方法，其特征在于，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，原核細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細胞包括酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細胞。
全文摘要
一種中堿性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述中堿性纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明以Phaeosphaeria sp.LH21基因組為基礎，通過基因組走讀和反轉錄PCR克隆到了中堿性纖維素酶基因。該基因能在含有中堿性纖維素酶的轉基因生物中表達，回收獲得該基因編碼的纖維素酶有生物功能活性。本發明中的中堿性纖維素酶在中堿性條件下具有纖維素酶活性，可廣泛用于基因克隆，基因診斷，紡織行業，洗滌行業，石油工業等領域。
文檔編號C12N9/42GK102911953SQ201210396178
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月17日 優先權日2012年10月17日
發明者魏東芝, 趙喜華, 王瑋 申請人:華東理工大學