專利名稱：一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體nd5基因的部分dna測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法。
背景技術：
早期的輪蟲分類學和系統學研究主要是依據形態學數據。如Wallace (1989)利用八種形態學特征進行聚類分析研究發現輪蟲門(Rotifera)、真輪蟲總綱(Eutatoria)和單巢綱(Monogonota)為單系，利用九種形態學特征進行聚類分析研究發現葉輪屬(Notholca)分為六個分支。Melone (1998)通過對I種棘頭動物、6種輪蟲和2個外群(渦蟲和顎胃動物)的60個形態特征進行矩陣分析，獲得一個簡約聚類樹，發現雙巢綱(Digononta)為并系類群，但不能確定輪蟲門的單系性。該系統樹不同于依據分子水平數據或演化分類原理而產生的系統樹。以形態學數據所研究的輪蟲系統學存在缺陷，因為輪蟲的形態受遺傳和環境因子兩方面的影響，盡管遺傳因素占主導地位。隨著輪蟲研究的深入，已有研究者發現形態學數據已經不能滿足輪蟲部分種類鑒別和系統進化研究(Guiset，1977 ；Koste, 1978 ；Shiel, 1993 ;Fontaneto, 2007)。Sergi (2005)等研究了褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis) L-型的兩個種 B.plicatilis sensu stricto 和 B.manjavacas 之間的形態度量差異，發現B.plicatilis s.s.比B.manjavacas平均長6%,兩個種的個體之間表現出較大的形態度量交迭，形態學分類不能用于鑒別這兩個種，目前它們的分類只能依據分子指標。2003年，為了了解形態可塑性和基因變異在輪蟲的形態變化中的作用，Derry等研究了不同形態的龜甲輪蟲(Keratella)線粒體CO I基因序列，發現有棘刺和無棘刺的螺形龜甲輪蟲(Keratella cochlearis)遺傳變異較大,核酸序列的差異達到4.4%,暗示它們是不同的種。而單棘刺和雙棘刺的曲腿龜甲輪蟲(K.hiemalis)核酸序列的差異為
0.21%，并且氨基酸序列沒有變異，說明它們的形態變異歸因于環境的誘導。傳統的輪蟲分類主要依據頭冠、棘刺、足和口器等外部形態和內部結構等形態學特征。但由于輪蟲種類眾多、體型微小及表型可塑性，輪蟲外部形態有些物種非常相似，并且同一物種還有季節性的周期變形，且許多種類缺乏有效地形態學分類特征，僅通過傳統的方法進行鑒定和分類存在一定的困難，如壺狀臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲均為臂尾輪屬常見種類，因它們具有相似的形態，早期的研究曾將這兩種輪蟲歸為一種，稱為Brachionusurceus，也譯為壺狀臂尾輪蟲(張家楫)；后來Koste、章宗涉和黃祥飛等根據蟲體前端棘刺的兩側是否對稱和眼點的形狀把B.urceus分為B.urceolaris和B.rubens兩種，因此種的界定標準仍存在模糊不清之處，因此傳統鑒定方法滿足不了鑒定要求，并且內部咀嚼器的超微結構需要電子顯微鏡的輔助，鑒定困難
發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，本鑒定方法使用實驗所設計的引物擴增輪蟲線粒體上ND5 DNA序列，并對PCR產物進行純化、連接、克隆、轉化、測序，將序列進行比對分析來鑒別輪蟲的種類。對輪蟲進行分子生物學的種類鑒定，解決了利用形態學和超微結構存在的鑒定困難，使得在大規模培養輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競爭而造成輪蟲減產甚至大量死亡的可能性。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是:一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測序方法，包括以下步驟:A、臂尾輪屬輪蟲總DNA提取；B、PCR引物擴增及序列測定；C、系統發生分析。所述步驟 B 中 PCR 引物為:ND5W1: 5’ -TTTC (AT) GCTTT (GA) GTTCATTCTTC-3’ 和C03B: 5’ -GTCTACCTCA(AG)TAAAT-3’ ；擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min,共15個循環；95°C預變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，延伸時間每個循環加5s，共15個循環；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。一種鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，使用臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA序列進行鑒定進行鑒定。基于線粒體ND5基因的 部分DNA序列鑒定臂尾輪屬輪蟲，結果準確可靠；本方法中所設計的PCR引物可以擴增出紅臂尾輪蟲、方形臂尾輪蟲、鐮形臂尾輪蟲、裂足臂尾輪蟲、尾突臂尾輪蟲、肛突臂尾輪蟲的線粒體ND5 DNA，利用對ND5 DNA比對結果(包括A、C、G、T堿基的含量、變異位點、簡約信息位點等)進一步分析了有爭議種類的分類地位以及對輪蟲種群之間的親緣關系及輪蟲的系統進化做出分子生物學的解釋，可對紅臂尾輪蟲Brachionusrubens、方形臂尾輪蟲Brachionus quadridentatus、鍵形臂尾輪蟲Brachionus falcatus、裂足臂尾輪蟲Brachionus diversicornis、尾突臂尾輪蟲Brachionus caudatus、肛突臂尾輪蟲進行精確鑒定。解決了利用形態學和超微結構存在的鑒定困難，使得在大規模培養輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競爭而造成輪蟲減產甚至大量死亡的可能性。
具體實施例方式本鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法所用生物材料為紅臂尾輪蟲Brachionus rubens、方形臂尾輪蟲Brachionus quadridentatus、鍵形臂尾輪蟲Brachionus falcatus、裂足臂尾輪蟲Brachionus diversicornis、尾突臂尾輪蟲Brachionus caudatus、肛突臂尾輪蟲，挑取每種輪蟲單個個體,單克隆培養,其中紅臂尾輪蟲、方形臂尾輪蟲采用Gilbert (1963)配方，其余幾種采用原地方水樣過濾后作培養液，溫度與采集時環境溫度基本保持一致，所用食物為以HB-4培養液培養的，處于指數生長期的斜生柵藻，當單個克隆輪蟲個體數目達到一定多的量的時候，用25 μ m孔徑濾網濾出輪蟲，并以無菌蒸餾水沖洗，Eppendof管收集，置于-20°C冰箱保存。總DNA提取:利用董云偉等(2002)的方法提取輪蟲DNA。采用WizardTM基因組DNA純化試劑盒(p0rmega，USA)提取輪蟲DNA。將凍存的輪蟲從_20°C冰箱中取出，離心數秒，吸去多余水分。加入60 μ I核裂解液(nuclear lysis solution),輕彈離心管以使輪蟲懸浮均勻，在4°C放置lOmin，取出，65°C水浴40min，取出冷卻至室溫，加入20μ I蛋白沉降液(protein precipitation solution),劇烈震蕩 IOs,冰浴 5min, 13000g 離心 4min ;小心吸取上清，加入60 μ I異丙醇，2.5μ I糖原(20mg/ml, Sigma, USA)，小心混勻，_70°C放置30min, 13000g離心20min，然后棄去上清，用70%酒精洗滌兩次。在無菌室將其吹干，然后加入50 μ I無菌雙蒸水，4°C放置過夜以溶解DNA。PCR擴增及序列測定:擴增反應在PCR擴增儀上進行。PCR引物設計如下:ND5W1:5’ -TTTC (AT) GCTTT (GA) GTTCATTCTTC-3’ 和 C03B:5’ -GTCTACCTCA(AG) TAAAT-3’，引物于上海Invitrogen公司合成；PCR反應體系的總體積為25 μ 1，包括I XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus), 0.4 mmol/L dNTP, 1.5ymol/L 引物，DNA 模板 2 μ 1，IU 的 TaKaRa La Taq 酶，超純水補至25μ1;擴增反應程序如下:95°C預變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，共15個循環；95°C預變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min,延伸時間每個循環加5s，共15個循環；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。擴增完成后，用BBI試劑盒純化PCR產物，取2 μ I于1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢查，其余_20°C保存備用；將純化產物用TaKaRa Pmd 18_T Vector克隆；最后送上海生工測序。系統發生分析:對測序結果進行處理并分析，序列編輯使用CLUSTAL X (1.81)軟件(Thompson, 1999)進行DNA序列比對。通過引物測得輪蟲ND5序列如下:紅臂尾輪蟲: TTTCagctttagttcattcttctactctagttacttcaggtttatatttaataatgcgtttttcttatcttctttatagatcttatactttaatgaaagtgttattaattttaagattgtttacttctttctatgctggtataaattctatctttgaaaaagattaaagaaaataattgccttatctactttaagtcatttagggtttattggtatggcgttttctgcaggtcttttacaattggccttctttcatatacttactcacgctctttttaagtctcttctttttataactataggtgatattatgatcaatttaaatcattctcaagatattcgttatttgtcttctggtatgctttatactcctatgtcttgtcttgttatatatgtttctattcttaatttattaggtttacctaatttaagtgggtatttttctaaagatttagttttagagataatgaattattcttcttcatctattctagtaatagtagttttatttttaaatgttttttttacttattattatacttatcaattgtttttttattcttttcaacctattaaagttcttccatatcaaaatttccatgctcctatactatttcacacagtttgtttgttttttatagctgtttcgactttggtgtttggtttcttttttataagacatatttgttcttttattttattttatcctgttccaactgtaaataagtggttacctttatttctaaatataatgatgtttttagttcttttttaaataaaaaactttttacttctaatcatcctttaattaattattacttttctaatatgatatatctttctaacattatgttgacggctagttctaatttatattatagtttaggttttatgttagtgaagtcggttgaattaggtattttcaattacacgttaaactcttttactaaa方形臂尾輪蟲:TTTCAGCTTTGGTTCATTCTTCTACTCTAGTTACCGCGGGTTTATACTTAATAATACGTTTTTCTTATCTATTATATAGTTCTTATTTTTTAATAAAACTATTGCTAATTTTAAGCCTTTTTACTTCTTTTTATGCTGGAATAAATGCTATCTTTGAAAAAGATTTAAAAAAAATAATTGCTTTATCTACCCTCAGGCATTTAGGGTTTATTGGAATGGCTTTCTCTGTTGGCTTATTGCAATTAGCATTTTTTCACATACTGACCCACGCCCTTTTTAAATCTTTATTATTCATGACTATAGGGGATATTATAATTAATTTAAATCACTCTCAAGATATCCGTTATTTGTCTTCCGGGATACTATACACTCCTATATCCTGTATAATTATGTATGTGTCAATTTTAAATTTATTAGGAATGCCTAACCTTAGGGGTTATTTTTCAAAGGATTTAGTACTAGAAATAATAAATTACTCTAATGTCTCCTTCTTAGTTATAGGGGTTTTATTTCTTAATGTTTTTTTTACTTACTATTATACTTATCAACTATTTTTTTATTCTTTTCAACCTCTAAAGGTTTACCCTTACCAAAACTTTCATTCTCCTATGTACATCCATACTTTAGGTCTTTTTATTATGGCCTGTTCAACTCTAGTGTTTGGCTATTTCTTTTTGAGCCATATTTGTTACACTGTAATTTACTACCCTATTCCTGTGCTTATTAAATCCTTGCCATTTATTAT 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權利要求
1.一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測序方法，包括以下步驟: A、臂尾輪屬輪蟲總DNA提取； B、PCR引物擴增及序列測定； C、系統發生分析。
2.按權利要求1所述的測序方法，其特征在于:所述步驟B中PCR引物為:ND5W1:5’-TTTC(AT)GCTTT (GA)GTTCATTCTTC-3’ 和 C03B: 5’ -GTCTACCTCA (AG)TAAAT-3’。
3.按權利要求1所述的測序方法，其特征在于:所述步驟B中擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，共15個循環；95°C預變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，延伸時間每個循環加5s，共15個循環；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
4.一種鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，使用臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA序列進行鑒定。
全文摘要
本發明涉及一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，測序方法步驟包括臂尾輪屬輪蟲總DNA提取、PCR引物擴增及序列測定、系統發生分析；鑒定方法使用臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5 DNA進行鑒定。本測序方法中所設計的PCR引物可以擴增出紅臂尾輪蟲等的線粒體ND5 DNA，測序結果可用于對紅臂尾輪蟲等進行精確鑒定，解決了利用形態學和超微結構存在的鑒定困難，使得在大規模培養輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競爭而造成輪蟲減產甚至大量死亡的可能性。
文檔編號C12Q1/68GK103088125SQ20121056296
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月22日 優先權日2012年12月22日
發明者程雙懷, 張逸, 夏夢寧, 劉應龍, 盧燕梅, 閆錦錦, 張寧 申請人:安徽師范大學