水洗10個柱床體積，再用20%的乙醇洗10個柱床體積，lmL/min的流速， 將柱子于4°C保存。
[0103] 5、D i -TCTP蛋白抗原的性能分析
[0104] 采用SDS-PAGE分析重組的Di-TCTP蛋白，其結果顯示其分子量~43kDa(詳見圖3a)
[0105] 犬惡絲蟲陽性血清所做的免疫印跡如圖313所示，Western-blot分析參考Towbin et al.(1979)的方法進行。純化的rDi-TCTP經SDS-PAGE分離并電轉移至硝酸纖維素膜。以 5 %脫脂奶粉封閉2h，依次用1:500稀釋的細粒棘球蝴感染鼠血清（室溫2h、PBST洗3次）及 BI0RAD公司的羊抗鼠 lgG-HRP(二抗按1:3000稀釋，室溫反應lh、PBST洗滌3次)處理，最后 加底物4-氯-1-萘酚顯色并拍照。
[0106] 從圖3可以看出，Di-TCTP蛋白具有良好的免疫原性。
[0107] 實施例2用Di-TCTP蛋白進行間接酶聯免疫吸附試驗
[0108] 1、抗原和一抗最佳工作濃度的確定
[0109] 用0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液對重組蛋白進行稀釋，抗原包被量按16、8、4、 2ug/孔依次作倍比稀釋，每孔100uL包被96孔的ELISA板，37°C溫箱孵育2h后于4°C過夜包 被;次日將ELISA板甩干，用PBST(0 · 01mol/L，pH 7 · 4PBS中加入0 · 05%吐溫-20)洗滌3次， 5min/次，每孔加入100μ1含5%脫脂奶粉的封閉液37°C封閉2h，甩干;用PBST洗滌3次，將標 準陰性、陽性老鼠血清用PBS依次作1:50、1:100、1:200、1:400共4個梯度做ELISA方陣滴定， 100uL/孔，37°C作用lh;甩干，用PBST洗滌3次后加入1 :3 000稀釋羊抗鼠 lgG-HRP (BI0RAD)，100uL/孔，37°Clh;同上甩干后用PBST洗滌3次，每孔加入100μ1的TMB(天跟)底物 顯色液，37 °C避光反應20min，每孔加入100μ12mo 1/L H2S〇4終止反應，用酶標儀(Thermo)于 450nm處測定DASOnnuP/N值最大時的抗原包被量和血清稀釋倍數為最佳工作濃度。抗原的 最佳包被濃度為2.5yg/mL，血清的最佳稀釋倍數為1:60。
[0110] 2、酶標二抗工作濃度的確定
[0111] 抗原和一抗按最佳工作濃度稀釋，將HRP標記的羊抗狗IgG二抗稀釋為不同濃度， 加底物顯色后，用酶標儀(1'1161'1]1〇)于45〇111]1處測定045〇111]1值，確定酶標二抗的最佳工作濃度 為1:5000。
[0112] 3、ELISA檢測臨界值的確定
[0113] 用ELISA方陣法確定的抗原包被量和血清稀釋度檢測13份羊陰性血清，測定 D450nm值，運用Excel 2013和SPSS 11.5軟件對數據進行統計分析，計算平均值(Mean)和標 準差（SD)，樣品測定D450nm值按Mean+3SD作為陽性和陰性判定標準。其結果表明，ELISA檢 測臨界值為0.294,即吸光度值大于或等于0.294,則判定為陽性，反之則為陰性。
[0114] 4、樣品中犬惡絲蟲的測定
[0115] 所用的ELI SA診斷試劑盒，包括ELI SA板、洗滌液、封被液、酶標二抗、顯色物、終止 液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原為利用權利要求1所述的犬惡絲蟲腫瘤蛋白 基因，在大腸桿菌BL21中誘導表達獲得（即實施例1所制備得到的Di-TCTP蛋白抗原）；所述 洗滌液為磷酸鹽吐溫緩沖液PBST;所述封被液為3wt %牛血清蛋白；所述酶標二抗為HRP標 記的羊抗狗IgG;所述顯色物為3，3 '，5，5 ' -四甲基聯苯胺TMB;所述終止液為2.5N H2S〇4。
[0116] 11份用于Di-TCTP-ELISA檢測的流浪狗血清由四川農業大學動物醫學院寄生蟲室 提供(其中，6只感染犬惡絲蟲，5只未感染）。流浪狗ELISA檢測結果與尸體剖檢做對比，以確 定該血清學診斷法的敏感性。
[0117] 用最佳濃度的Di-TCTP蛋白（2.5yg/mL)包被ELISA板過夜，再使用PBST徹底清洗四 次。然后將這些平板用l〇〇yL的3%牛血清蛋白封被lh，再如上所述一樣的清洗四次。加入 TOST適當稀釋好待測血清100yL到孔內，室溫處理lh，再加入以1:5000稀釋的HRP標記的羊 抗狗IgG二抗反應。反應一小時后，將這些孔如上所述清洗四次。清洗完后，加入TMB(3，3，5， 5-Tetramethylbenzidine)進行顯色。顯色反應由2.5N H2SO4終止，在波長為450nm的光波下 讀取吸光度。其血清學反應檢測結果與解剖犬收回的蟲體數量見表4。
[0118] 表4
[0121] 注:a:犬性別:m表示雄性，f表示雌性；
[0122] b:吸光度值為三組平行試驗的平均值；
[0123] c:陽性臨界值為0.294。
[0124] 5、特異性試驗
[0125]用已建立的ELI SA方法測定兩份犬鉤蟲陽性血清、3份犬弓蛔蟲陽性血清、1份犬豆 狀帶絳蟲陽性血清，結果均為陰性(詳見表5)，說明該方法特異性強。
[0126]表5
[0127]
[0128] 注:a:吸光度值為三組平行試驗的平均值；
[0129] b:陽性臨界值為0.294。
【主權項】
1. 檢測犬惡絲蟲病的ELI SA診斷試劑盒，包括ELI SA板、洗滌液、封被液、酶標二抗、顯色 物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原，其特征在于： 所述Di-TCTP蛋白抗原為Di-TCTP基因編碼得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如SEQ ID No. 1 所示； 所述洗滌液為PBST，所述PBST為磷酸鹽吐溫緩沖液； 所述封被液為3wt %牛血清蛋白； 所述酶標二抗為HRP標記的羊抗狗I gG; 所述顯色物為3，3 '，5，5 ' -四甲基聯苯胺； 所述終止液為2.5N H2S〇4。2. 根據權利要求1所述的檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，其特征在于：所述Di-TCTP 蛋白抗原的制 備方法包括如 下步驟 ： a、 從犬惡絲蟲中提取得到RNA，并將其逆轉錄成cDNA; b、 以cDNA為模板，進行PCR擴增，其中，PCR擴增的引物包括上游引物和下游引物，所述 上游引物如SEQ ID No.2所示;所述下游引物如SEQ ID No.3所示； c、 將PCR擴增得到的產物連接到表達載體，得重組表達質粒； d、 將重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21中誘導表達，得融合蛋白，過柱純化后，即得Di-TCTP蛋白抗原。3. 根據權利要求2所述的檢測犬惡絲蟲病的ELI SA診斷試劑盒，其特征在于： 所述PCR擴增體系為：2XTaq PCR MasterMix 12.5yL，上游引物lyL，下游引物lyL，模 板DNA lyL，ddH20 9.5yL; PCR 反應條件為：94°C 預變性 5min; 94°C 變性 35sec，53 · 8°C 退火 35sec，72°C 延伸 35sec， 35個循環;最后72°C延伸lOmin。4. 根據權利要求2所述的檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，其特征在于:所述表達 載體為 pET-28a( + )。5. 檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于，包括如下步驟： a、 用Di-TCTP蛋白抗原包被ELI SA板，過夜，再使用PBST徹底清洗四次； b、 將已包被的ELISA板用100yL的3 %牛血清蛋白封被lh，再使用PBST徹底清洗四次； c、 加入待測血清100yL到孔內，室溫處理lh，再加入HRP標記的羊抗狗IgG二抗反應lh 后，使用PBST徹底清洗四次； d、 加入3，3 '，5，5 ' -四甲基聯苯胺進行顯色；顯色反應由2.5N H2S〇4終止，在波長為 450nm的光波下讀取吸光度； e、 根據吸光度值判斷檢測結果。6. 根據權利要求5所述的檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于:a步驟所 述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被濃度為2.5yg/mL;c步驟所述的HRP標記的羊抗狗 IgG二抗稀釋度為1:5000。7. 根據權利要求5所述的檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于:d步驟所 述的顯色時間為5~30min，優選顯色時間為lOmin。8. 根據權利要求5所述的檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，其特征在于:e步驟所 述的根據吸光度值判斷檢測結果，其判斷方法為:若吸光度值大于或等于〇. 294，則血清中
【專利摘要】本發明涉及檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，屬于免疫學領域。本發明解決的技術問題是提供檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，該試劑盒包括ELISA板、洗滌液、封被液、酶標二抗、顯色物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原。本發明利用從犬惡絲蟲轉錄組數據中鑒定篩選組裝的Di-TCTP基因，在大腸桿菌BL21中誘導表達獲得Di-TCTP蛋白為抗原，建立間接ELISA方法檢測犬科動物犬惡絲蟲感染。該方法特異性高、靈敏度強，并且操作簡單，檢測快速，易于判斷結果。
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/535
【公開號】CN105606807
【申請號】CN201610134295
【發明人】余華, 楊光友, 嚴玉寶
【申請人】中華人民共和國四川出入境檢驗檢疫局
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年3月9日