檢測犬惡絲蟲病的elisa診斷試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒，屬于免疫學領域。
【背景技術】
[0002] 犬惡絲蟲（亦稱犬心絲蟲）是心肺心絲蟲病的病原體，主要寄生于溫帶、熱帶地區 的家養犬貓及野生哺乳動物體內。作為一種以蚊媒形式傳播的人畜共患傳染病病原，該蟲 可導致人的犬惡絲蟲病。此外，一些血清制品也可能會導致人的犬惡絲蟲病。通常，狗作為 犬惡絲蟲的天然宿主，其成蟲大多寄生在狗的肺動脈和右心室，而其微絲蝴則分散與狗的 血液循環系統。患病狗常因感染少量蟲體而不表現出病狀，但是其血液中的微絲蝴或循環 性犬惡絲蟲抗原卻是目前診斷該病的主要依據；并且在一些沒有微絲蝴的隱性感染情況 下，抗原檢測被認為是最敏感的檢測方法。因此鑒定和篩選一種犬惡絲蟲特異的、敏感的分 子診斷抗原將對該蟲病的防控奠定基礎。
[0003] 發明專利CN102798716公開了一種犬惡絲蟲ELISA檢測試劑盒及其制備方法，利用 從犬惡絲蟲成蟲cDNA表達文庫中篩選出的與編碼馬來絲蟲肌球蛋白尾家族蛋白同源為 88 %的MTFP基因，并在大腸桿菌質粒中表達獲得的MTFP蛋白作為抗原，通過間接ELISA法檢 測犬的犬惡絲蟲感染。該方法可快速檢測犬惡絲蟲感染，但是，其靈敏度有待進一步的提 高，特別是對單一的雌蟲或雄蟲感染，其檢測結果并不準確。
[0004] 因此，亟需一種檢測靈敏度高的ELISA檢測試劑盒。
[0005] 自腫瘤蛋白（TCTP)從小鼠埃利希腹水瘤細胞和紅白血病細胞內被最次描述以來， 該蛋白已在不同的生物，如哺乳動物、植物、較低的真核生物和原核生物內被發現和報道。 此外，在寄生蟲中，tctp基因還被發現存在于惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲、布氏錐蟲、秀麗隱桿 線蟲、馬來絲蟲及班氏絲蟲體內。重要的是，由于絲蟲腫瘤蛋白的鈣結合特性和組胺釋放功 能，該蛋白目前已被認定與犬惡絲蟲的致病性以及其在宿主體內的存活息息相關。當前，相 關研究對于TCTP在寄生蟲中的生理角色已有了詳細了解，然而對于該蛋白質在絲蟲寄生蟲 階段是否具有免疫原性仍知之甚少。有報道稱在馬來絲蟲的微絲蝴和成蟲體內均可檢測到 高水平的TCTP蛋白質表;并且作為一種分泌蛋白，馬來絲蟲腫瘤蛋白（Bm-TCTPs)在其微絲 蝴的分泌、排泄物中含量豐富，可引起宿主免疫反應。鑒于上述研究結果，本發明的發明人 推測絲蟲的TCTP同系物在絲蟲病的檢測上應該具有潛在免疫診斷價值。
【發明內容】
[0006] 本發明解決的技術問題是提供檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒。
[0007] 本發明檢測犬惡絲蟲病的ELI SA診斷試劑盒，包括ELI SA板、洗滌液、封被液、酶標 二抗、顯色物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原為Di-TCTP基因編碼得到 的蛋白，所述Di-TCTP蛋白抗原為Di-TCTP基因編碼得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如 SEQ ID No.l所示；
[0008] 所述洗滌液為PBST，所述PBST為磷酸鹽吐溫緩沖液；
[0009]所述封被液為3wt%牛血清蛋白；
[0010]所述酶標二抗為HRP標記的羊抗狗IgG;
[0011] 所述顯色物為3,3'，5,5'_四甲基聯苯胺;所述終止液為2.5N H2S〇4。
[0012] 其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制備方法包括如下步驟：
[0013] a、從犬惡絲蟲中提取得到RNA，并將其逆轉錄成cDNA;
[0014] b、以cDNA為模板，進行PCR擴增，其中，PCR擴增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQ ID No.2所示;所述下游引物如SEQ ID No.3所示；
[0015] c、將PCR擴增得到的產物連接到表達載體，得重組表達質粒；
[0016] d、將重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21中誘導表達，得融合蛋白，過柱純化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。
[0017] 進一步的，所述PCR擴增體系為:2XTaq PCR MasterMix 12.5yL，上游引物lyL，下 游引物lyL，模板DNA lyL，ddH20 9.5yL;反應條件為：94°C預變性5min; 94°C變性35sec， 53.8°C 退火 35sec，72°C 延伸 35sec，35 個循環；最后 72°C 延伸 lOmin。
[0018] 所述表達載體為pET_28a( + )。
[0019] 本發明解決的第二個技術問題是提供檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，該方 法可以檢測血清以及血清制品中是否存在犬惡絲蟲。
[0020] 本發明檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，包括如下步驟：
[0021] a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，過夜，再使用PBST徹底清洗四次；
[0022] b、將已包被的ELISA板用100yL的3%牛血清蛋白封被lh，再使用PBST徹底清洗四 次；
[0023] c、加入待測血清100yL到孔內，室溫處理lh，再加入HRP標記的羊抗狗IgG二抗反應 1 h后，使用PBST徹底清洗四次；
[0024] d、加入3,3'，5,5'_四甲基聯苯胺進行顯色;顯色反應由2.5N H2S〇4終止，在波長為 450nm的光波下讀取吸光度；
[0025] e、根據吸光度值判斷檢測結果。
[0026] 其中，a步驟所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被濃度為2.5yg/mL;c步驟 所述的HRP標記的羊抗狗IgG二抗稀釋度為1:5000。
[0027] 其中，d步驟所述的顯色時間為5~30min，優選顯色時間為10min。
[0028] e步驟所述的根據吸光度值判斷檢測結果，其判斷方法為:若吸光度值大于或等于 0.294，則血清中存在犬惡絲蟲，若吸光度值小于0.294，則血清中不存在犬惡絲蟲。
[0029] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0030] (1)新基因篩選方法先進:本發明是通過高通量測序技術從犬惡絲蟲的轉錄組數 據中篩選到的Di-TCTP基因。
[0031] (2)敏感性高：以Di-TCTP蛋白作為抗原，不僅能檢測單一的雌蟲感染，而且還能檢 測所有的雄蟲感染。因此優于CN201110419523.6公開的以MTFP蛋白作為抗原建立的ELISA 檢測試劑盒。
[0032] (3)特異性強：本發明檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒分別評估感染有犬鉤 蟲，犬弓蛔蟲和豆狀帶絳蟲3種不同寄生蟲的6份犬血清，均為陰性，表明該試劑盒特異性 強。
【附圖說明】
[0033] 圖1為Di-TCTP基因二級結構。
[0034]圖2為預測的Di-TCTP蛋白三級結構，其中，深色粗線為α-螺旋，淺色粗線為延伸 鏈，其余細線為無規卷曲。
[0035] 圖3a為Di-TCTP蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖3b為Di-TCTP蛋白免疫印跡圖；圖中，箭頭 表明Di-TCTP蛋白位置。
【具體實施方式】
[0036]本發明借助第二代測序技術所產生的犬惡絲蟲成蟲轉錄組中20810個獨特的轉錄 表達基因（unigenes)和15698個編碼序列(CDS)數據集，鑒定和篩選出來一個犬惡絲蟲腫瘤 蛋白基因（以下簡稱Di-TCTP)，基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0037] Di-TCTP是在篩選組裝的犬惡絲蟲轉錄組數據中鑒定的。根據Nr注釋信息，該基因 (Unigene ID 881)表現出與羅阿絲蟲的TCTP高的同源性。0RF分析表明，Di-TCTP含有一個 可編碼181個氨基酸的01^(546&?)，其假定的分子質量為20.73961^) &，？1為4.62。相似性分 析表明，Di-TCTP和羅阿絲蟲的受翻譯調節腫瘤蛋白（TCTP)(基因庫:EF028099.1)在蛋白水 平享有最高的相似點（97%)，其次是和班氏絲蟲的TCTP(GenBank:AAK71499.1)(96%)和馬 來絲蟲的TCTP(GenBank: EDP33421.1) (95% )。信號PV4.0分析表明，在Di-TCTP中不存在信 號肽。Di-TCTP編碼的蛋白有顯著的親水性（圖1)。用不同方法預測的Di-TCTP蛋白的二級結 構表現出明顯的不同。例如，用Garnier-Robson方法預測，有兩個α螺旋和兩個無規則卷曲， 而用Chou-Fasman的方法，Di-TCTP推斷的氨基酸序列預測則有10個阿爾法螺旋，8個片層和 11個無規則卷曲。用Karplus Schulz方法預測，Di-TCTP有13個可變區。圖2為預測的Di-TCTP蛋白三級結構。該預測是利用在線分析工具(http: //swissmodel. expasy · org/)預測 的三級結構。
[0038] 利用Di-TCTP編碼的蛋白具有良好的免疫原性，可用于制備檢測犬惡絲蟲病的 ELISA診斷試劑盒。
[0039]本發明檢測犬惡絲蟲病的ELI SA診斷試劑盒，包括ELI SA板、洗滌液、封被液、酶標 二抗、顯色物、終止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原為利用Di-TCTP基因編碼 得到的蛋白；所述洗滌液為磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)，即在PBS溶液中加入Twen-20配制而 成，優選為含〇 . 〇5wt %吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液;所述封被液為3wt %牛血清蛋白； 所述酶標二抗為HRP標記的羊抗狗IgG;所述顯色物為3,3'，5,5'_四甲