專利名稱：一種微生物生物印跡薄膜及其制備方法
技術領域：
本發明涉及到分子印跡領域，具體的說是一種微生物印跡薄膜及其制備。
背景技術：
分子印跡技術是以一種合成人工抗體的技術，其主要原理是選擇能與模板分子形成共價鍵或者非共價鍵的功能單體，與模板分子形成復合物，然后通過交聯劑共聚形成交聯聚合物。將模板分子洗脫后，在聚合物中留下的孔穴與模板分子的形狀、大小和表面基團相匹配。通過這些孔穴即生物識別位點對目標分子進行識別。采用分子印跡技術制成人工抗體作為生物識別元件是近幾年來生物傳感器研究的熱門方向。分子印跡技術可以應用催化，分離，純化，藥物傳遞，檢測等領域。在大多數情況下，分子印跡技術的目標物質都是小分子，比如有毒有機物，氨基酸，糖類等等。對于微生物這類微米尺度的物質的印跡技術仍比較少，主要是由于目標物質過大，移動，固定都比較困難。并且分子印跡常用的方法通常都涉及到有機溶劑，有機溶劑本身會使微生物的細胞壁發生溶解，交聯等反應，這些問題給微生物的生物印跡帶來了很多困難。
發明內容
本發明目的在于提供一種制備微生物生物印跡薄膜及其制備方法。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種微生物生物印跡薄膜，導電基體依次沉積殼聚糖/石墨烯復合膜、微生物模板和殼聚糖膜即得到微生物生物印跡薄膜。所述導電基體沉積厚度為15-20 μ m的殼聚糖/石墨烯復合膜，將微生物吸附到復合膜上形成微生物模板，而后采用殼聚糖將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋，微生物高度約即得到微生物生物印跡薄膜，即石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋時殼聚糖厚度控制在250-300nm，SRB高度約為500nm。將上述得到的微生物生物印跡薄膜通過氟硅烷偶聯劑進行表面修飾，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后將微生物模板洗脫掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形狀相匹配的生物識別位點的微生物生物印跡薄膜。所述殼聚糖/石墨烯為濃度為0. 3mg mL-1的石墨烯與質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液的混合液，其中石墨烯按如下步驟制備1)將天然石墨、NaNO3和濃硫酸按體積比1 1 45的比例混合于冰水浴中反應 4-4. 5h，待用；2)向步驟1)冰水浴混合物中加入KMnO4,同時將反應溫度升至35°C并保持反應溫度2-2. 5h，而后加入H2O并將溫度升至98°C，反應進行2-2. 5小時后再加入40_60°C溫水和 30mL H2O2，并在室溫下繼續反應1-1.證，待用；3)將步驟2)所得物質洗滌后烘干，并粉碎加入到H2O中超聲使其得到均一的混合溶液，而后將混合溶液與N2H4按體積比為50 1的比例混合于120-122°C下反應12-12. 5h，得到石墨烯。微生物生物印跡薄膜的制備方法，在導電基體上沉積厚度為15-20 μ m的殼聚糖/ 石墨烯復合膜，再將微生物吸附到復合膜上形成微生物模板，而后采用殼聚糖將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋，包埋后通過氟硅烷偶聯劑對導電基體進行表面修飾，而后浸泡于丙酮中2-池，浸泡后將微生物模板洗脫掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形狀相匹配的生物識別位點的微生物生物印跡薄膜。所述石墨烯/殼聚糖復合膜的沉積，將濃度為0. 3mg mL—1的石墨烯與質量分數為 0. 5%的殼聚糖溶液混合，采用恒電位沉積，以-1. 2V電壓下于導電基體上沉積250-350S， 即可得到均勻的石墨烯/殼聚糖復合膜。所述石墨烯按如下步驟制備1)將天然石墨、NaNO3和濃硫酸按體積比1 1 45的比例混合于冰水浴中反應 4-4. 5h，待用；2)向步驟1)冰水浴混合物中加入KMnO4,同時將反應溫度升至35°C并保持反應溫度2-2. 5h，而后加入H2O并將溫度升至98°C，反應進行2-2. 5小時后再加入40_60°C溫水和 30mL H2O2，并在室溫下繼續反應1-1.證，待用；3)將步驟2)所得物質洗滌后烘干，并粉碎加入到H2O中超聲使其得到均一的混合溶液，而后將混合溶液與N2H4按體積比為50 1的比例混合于120-122°C下反應12-12. 5h， 得到石墨烯。所述微生物模板的吸附，將微生物溶液滴加石墨烯/殼聚糖復合膜表面，并加入 PBS緩沖液后，置于4°C下池，使微生物吸附到復合膜的表面。所述殼聚糖膜的包埋，將質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液采用恒電位沉積法，以-1. 2V沉積30-40s，將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋。所述導電基體為ITO電極或者FTO電極。本發明所具有的優點本發明中采用石墨烯/殼聚糖復合膜作為微生物吸附的載體，石墨烯的加入增強了該復合膜的導電性，殼聚糖分子增加了該薄膜的生物相容性。且使用的沉積條件溫和，可控，易于操作。使用該種方法制備的微生物生物印跡薄膜具有一定的選擇性，對于形狀和尺寸不同的微生物能很好的區分。
圖1.為本發明實施例提供的生物印跡薄膜的制備流程圖。圖2.為本發明實施例提供的生物印跡薄膜生物印跡位點的原子力顯微鏡照片。圖3.為本發明實施例提供的制備方法對不同形狀的細菌的選擇性結果圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步說明。實施例1石墨烯的制備步驟將Ig天然石墨，Ig NaNO3和46mL濃硫酸(98% )混合在冰水浴中反應4_5h。然后將6g KMnO4加入到混合物溶液中同時將溫度升至35°C并保持反應溫度，反應進行2- 后加入90-95mL H2O并將溫度升至98°C，反應進行兩小時后加入200mL溫水，20mL 30%的H2O2，并在室溫下繼續反應l-2h.整個反應過程中要始終保持攪拌。將制備得到的產物過濾，在使用蒸餾水洗滌之后在60°C的烘箱中干燥Μ-4 !，得到黃色固體。將該反應產物研磨碎后，稱取0. Ig加入到IOOmL的H2O中超聲l_2h，得到均一的混合溶液，加入2_3mL N2H4 后分裝在反應釜中在121°C下反應10-1池，得到石墨烯材料。實施例2微生物生物印跡薄膜的制備步驟(見圖1)DITO電極的切割與清洗。將ITO電極用玻璃刀切割為均勻大小的玻璃片 (IXkm)，然后置于燒杯中依次加入無水乙醇和超純水，分別超聲處理30分鐘，取出后用萬用表測出導電面，晾干，備用；2)石墨烯/殼聚糖復合膜載體的沉積。將實施例1中制備得到的石墨烯離心清洗后加入到質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液中，得到含石墨烯濃度為0. 3mg mL—1石墨烯/殼聚糖混合液。采用恒電位沉積方法，使用三電極體系，以鉬絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，以步驟1)中的ITO電極為工作電極，在-1. 2V左右沉積250-350S，即可得到均勻的石墨烯/殼聚糖復合膜，將復合膜晾干，備用；3)微生物模板的吸附。取微生物溶液滴加到步驟2、中制備好的石墨烯/殼聚糖復合膜表面(細菌在滴加之前要通過離心進行洗滌，去除其中的代謝產物和培養基，是微生物很好的分散)，置于干凈的培養皿中，加入少量PBS緩沖液后，置于4°C下2h，使微生物吸附到復合膜的表面；本實施例微生物溶液采用取10 μ L含有IO7Cfu mr1的桿狀細菌溶液。4)殼聚糖膜的二次沉積，在質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液中，采用恒電位沉積方法，使用三電極體系，以鉬絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，以步驟3)中制備的吸附有微生物的ITO電極為工作電極，在-1. 2V左右沉積30-40s，將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋(殼聚糖厚度控制在250-300nm，SRB高度約為500nm)；5)生物印跡膜的表面修飾。為減少使用過程中微生物在非生物印跡位點的吸附， 將步驟4)制備好的包埋有微生物的ITO電極片，浸泡在質量分數為0. 的氟硅烷偶聯劑 (氟硅烷偶聯劑用超純水和異丙醇配置，且需要現配現用)中，在表面修飾含有氟硅烷的基團；6)微生物模板的洗脫。將步驟幻中制備的經表面修飾過的ITO電極浸泡在丙酮中2-3h，將微生物模板洗脫掉，留下有微生物模板分子尺寸和形狀相匹配的生物識別位點 (見圖2)。實施例3微生物生物印跡薄膜的選擇性評價通過電化學阻抗法對實施例2中得到的微生物生物印跡薄膜的選擇性進行評價。 采用三電極體系，以鉬絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，以實施例2)中制備的有微生物生物印跡薄膜的ITO電極為工作電極，使用含有5mM[Fe(CN)6]4V3_的0. 2M PBS(pH 7.4)緩沖液為電解液。電化學阻抗譜的試驗參數設置為開路電位下進行測量，正弦波的振幅為10mV，頻率范圍從0. IHZ到lOOkHZ。分別取相同濃度的桿狀細菌和球狀細菌滴加到實施例2中得到的修飾有微生物生物印跡識別位點的ITO電極上。通過測量滴加前后得到的電化學阻抗譜，并對這些譜圖進行擬合處理，得到微生物加入前后阻抗的變化量(見圖3)。實驗結果顯示由于模板采用的是桿狀細菌，所以該薄膜對桿狀細菌的響應要大于球狀細菌，說明該薄膜表現出一定的選擇性。
權利要求
1.一種微生物生物印跡薄膜，其特征在于導電基體依次沉積殼聚糖/石墨烯復合膜、 微生物模板和殼聚糖膜即得到微生物生物印跡薄膜。
2.按權利要求1所述的微生物生物印跡薄膜，其特征在于所述導電基體沉積厚度為 15-20 μ m的殼聚糖/石墨烯復合膜，將微生物吸附到復合膜上形成微生物模板，而后采用殼聚糖將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋，微生物高度約即得到微生物生物印跡薄膜。
3.按權利要求2所述的微生物生物印跡薄膜，其特征在于將上述得到的微生物生物印跡薄膜通過氟硅烷偶聯劑進行表面修飾，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后將微生物模板洗脫掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形狀相匹配的生物識別位點的微生物生物印跡薄膜。
4.按權利要求1或2所述的微生物生物印跡薄膜，其特征在于所述殼聚糖/石墨烯為濃度為0. 3mg mL—1的石墨烯與質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液的混合液，其中石墨烯按如下步驟制備1)將天然石墨、NaNO3和濃硫酸按體積比1 1 45的比例混合于冰水浴中反應 4-4. 5h，待用;2)向步驟1)冰水浴混合物中加入KMnO4,同時將反應溫度升至35°C并保持反應溫度 2-2. 5h，而后加入H2O并將溫度升至98°C，反應進行2-2. 5小時后再加入40_60°C溫水和 30mL H2O2，并在室溫下繼續反應1-1.證，待用；3)將步驟幻所得物質洗滌后烘干，并粉碎加入到H2O中超聲使其得到均一的混合溶液，而后將混合溶液與N2H4按體積比為50 1的比例混合于120-122°C下反應12-12. 5h， 得到石墨烯。
5.一種權利要求1所述的微生物生物印跡薄膜的制備方法，其特征在于在導電基體上沉積厚度為15-20 μ m的殼聚糖/石墨烯復合膜，再將微生物吸附到復合膜上形成微生物模板，而后采用殼聚糖將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋，包埋后通過氟硅烷偶聯劑對導電基體進行表面修飾，而后浸泡于丙酮中2-3h，浸泡后將微生物模板洗脫掉，即得到留有微生物模板分子尺寸和形狀相匹配的生物識別位點的微生物生物印跡薄膜。
6.按權利要求5所述的微生物生物印跡薄膜的制備方法，其特征在于所述石墨烯/ 殼聚糖復合膜的沉積，將濃度為0. 3mg ml/1的石墨烯與質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液混合，采用恒電位沉積，以-1. 2V電壓下于導電基體上沉積250-350S，即可得到均勻的石墨烯/殼聚糖復合膜。
7.按權利要求6所述的微生物生物印跡薄膜的制備方法，其特征在于所述石墨烯按如下步驟制備1)將天然石墨、NaNO3和濃硫酸按體積比1 1 45的比例混合于冰水浴中反應 4-4. 5h，待用;2)向步驟1)冰水浴混合物中加入KMnO4,同時將反應溫度升至35°C并保持反應溫度 2-2. 5h，而后加入H2O并將溫度升至98°C，反應進行2-2. 5小時后再加入40_60°C溫水和 30mL H2O2，并在室溫下繼續反應1-1.證，待用；3)將步驟幻所得物質洗滌后烘干，并粉碎加入到H2O中超聲使其得到均一的混合溶液，而后將混合溶液與N2H4按體積比為50 1的比例混合于120-122°C下反應12-12. 5h，得到石墨烯。
8.按權利要求5所述的微生物生物印跡薄膜的制備方法，其特征在于所述微生物模板的吸附，將微生物溶液滴加石墨烯/殼聚糖復合膜表面，并加入PBS緩沖液后，置于4°C下 2h，使微生物吸附到復合膜的表面。
9.按權利要求5所述的微生物生物印跡薄膜的制備方法，其特征在于所述殼聚糖膜的包埋，將質量分數為0. 5%的殼聚糖溶液采用恒電位沉積法，以-1. 2V沉積30-40s，將吸附在石墨烯/殼聚糖復合膜上的微生物部分包埋。
10.按權利要求5所述的微生物生物印跡薄膜的制備方法，其特征在于所述導電基體為ITO電極或者FTO電極。
全文摘要
本發明涉及到分子印跡領域，具體的說是一種微生物印跡薄膜及其制備。導電基體依次沉積殼聚糖/石墨烯復合膜、微生物模板和殼聚糖膜即得到微生物生物印跡薄膜。使用本方法制備生物印跡薄膜過程簡單，制備條件溫和，可以應用于微生物的篩選、分離和檢測等領域。
文檔編號B32B9/00GK102514261SQ201110429958
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者萬逸, 張盾, 戚鵬 申請人:中國科學院海洋研究所