一種hsath-t-s人鼠嵌合體模型的構建方法及應用的制作方法

專利名稱：一種hsat h-t-s人鼠嵌合體模型的構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞免疫學和實驗動物學技術領域，更具體地涉及一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的構建方法，同時還涉及NKT細胞在HSATH-T-S人鼠嵌 合體模型中再現的移植免疫耐受和排斥反應中的作用。
背景技術：
近年來，陸續報道了有關動物實驗模型的研究，如將人的胎兒胸腺、胎肝和 胎骨甚至成人的外周血造血干細胞移植到患有嚴重聯合免疫缺陷綜合征(severe combined immunodeficiency syndrome, SCID)的小鼠體內，分別建成SCID hyTHy/Liv、 SCID huBone、 SCID HPBL等幾種人鼠嵌合模型。其中，人外周血 淋巴細胞(HuPBL)具有來源方便，重建后的動物模型中T、 B淋巴細胞都具有 功能，并可以檢測到人免疫球蛋白的存在等優點，因而更廣受重視。但是，關于 建立皮膚移植研究排斥反應的HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型在國內外還是空白。
1986年成功克隆了 NKT細胞(natural killer T cell)的特征性抗原受體基因。 將其命名為Votl4基因，與其它T細胞抗原受體(TCR)的基因不同，有其獨特 的結構特征。1987年美國國立衛生研究所的Fawlkes與瑞士的Budd分別領導的 兩個研究小組報告指出，胸腺細胞中的T細胞通常不能表達受體，僅有部分未成 熟丁細胞選擇性表達丫-卩8.2受體。隨后的研究證明這種細胞不是T細胞，原因 V-|38.2受體是NK細胞的受體，這種細胞集的數量極少，生理意義不明。1994 年，這兩個研究小組的研究人員發現，他們報道的細胞為同一種細胞，從此NKT 細胞的研究引起廣泛關注。
與T細胞和NK細胞不同，NKT細胞是一種特殊類型的新型T淋巴細胞，同時 表達NK細胞和T淋巴細胞標記，具有較為恒定的TCRa和獨特的CDld限制性。 NKT細胞不但能分泌Thl和Th2細胞因子，同時還具有與CD8+殺傷性T細胞(CTL)相同的殺傷靶細胞作用，NKT細胞通過調節Thl和Th2細胞發育參與免疫調節。
隨著器官移植手術的廣泛開展，移植排斥反應的高發生率和高病死率已經成
為異體器官移植發展的障礙。目前主要釆用免疫抑制劑、去T細胞移植、組織配
型相結合等方法防治移植排斥反應，但誘發腫瘤、機會性感染、移植物喪失功能 等毒副作用日益顯現，并且人白細胞抗原供應源不斷減少，尋求新的途徑防治移 植排斥反應，已成為移植領域研究的重點。所以誘導移植器官的特異性免疫耐受 是克服免疫排斥的主要發展方向，也是當前器官移植領域研究的熱點問題。
NKT細胞在移植耐受中的作用亦不容忽視。在小鼠的肝移植、心臟移植、胰 島移植及前房相關免疫偏離(ACAID)模型中均證實了NKT細胞在移植耐受中 的重要作用。在小鼠模型中，通過NKT細胞、樹突狀細胞、CD4+T細胞表達IL-10 來維持皮膚移植的免疫耐受。NKT細胞在移植免疫中不僅參與免疫耐受的形成， 相反在某些情況下對免疫排斥反應的產生起促進作用，這取決于移植物所處的微 環境，ToyofukuA等研究發現，CDld—或V14NKT細胞缺乏的糖尿病小鼠在接受 肝內胰島移植后，移植物的存活率明顯高于其野生型小鼠，而將胰島移植到腎臟 則沒有多大差異，可能與NKT細胞在肝臟內存在富集現象及IFN^的分泌有關。
盡管有資料證明NKT細胞在移植反應中的重要作用，但是，還是需要更進一 步去了解人NKT細胞是否參與和介導移植反應中的免疫耐受和排斥反應，以及這 兩種不同的移植反應的作用機制。
總之，隨著對NKT細胞認識的不斷深入及其在移植免疫中的作用機制的進一 步研究，相信利用NKT細胞誘導移植器官的特異性免疫耐受不久將應用于臨床， 這將為預防器官移植術后免疫排斥反應的發生開辟一條新的途徑。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種構建HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的方法， 其技術難點在于按正確比例獲取人胚胎胸腺細胞并注射至SCID小鼠胸腺中， 確定人胚胎軀干部全厚層皮膚移植至小鼠胸腔的時間。該發明為具有人體免疫系 統特征的人鼠嵌合體，作為模式系統，能夠完全模擬人體免疫內環境，并對人類 特有抗原做出正常人體免疫反應，且還具有方法簡單、重復性好、效果顯著等優 點。本發明的另一個目的是在于提供了一種HSATH-T-S人鼠嵌合體模型在移植 免疫耐受和排斥反應中的應用。首先構建HSATH-T-S人鼠嵌合體模型，然后通 過流式細胞儀等技術手段監測此模型SCID小鼠體內NKT細胞及其細胞因子、 趨化因子在耐受模型和排斥模型中的表達變化，探索其在人體移植耐受和排斥反 應中的調節機制，并證實NKT細胞參與了免疫移植反應，進一步豐富了 NKT 細胞在移植反應中的重要作用。
為了達到上述目的，本發明釆用了以下技術措施
本發明所提供的HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型，是將人胚胎胸腺細胞植入 SCID小鼠胸腺內，再分兩個時間點(0周、4周)移植人胚軀干部全厚層皮膚至 SICD小鼠胸腔，分別得到HSATH-T-S人鼠嵌合體的耐受模型和排斥模型。 一種HSATH-T-S人鼠嵌合體模型的構建方法，其步驟如下
A. 選取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠(非肥胖型重度聯合免疫缺陷，購置武漢 大學動物實驗中心)。在進行細胞移植前4個小時，對每只SCID小鼠用放射線進 行全身照射，照射劑量為200-350cGy，優選為300cGy。
B. 制備人胚胎胸腺細胞。人胚來源于孕齡小于24周的自愿終止妊娠者的胚
胎，細胞HLA的分型為HLA-B8+ZHLA-DQ5+。自人胚中剝離胸腺組織，去除被膜， 生理鹽水洗滌，剪至約lmi^的小碎塊，RPMI-1640培養液(HyClone， USA)洗 滌。在胸腺小碎塊中加入RPMI-1640培養基，攪拌20min，研磨分散細胞(此過 程在冰上進行)，在研磨過程中用RPMI-1640培養基沖洗，過200目篩網，收集 篩下濾過物，再將濾過物用RPMI-1640培養基洗滌，離心收集細胞(1000r/min， 10min， 4°C)，即大部分為胸腺細胞，細胞計數，取1X10 個。再將篩網上的殘 余胸腺組織碎片收集，加入膠原酶-中性蛋白酶溶液(125pg/ml;Sigma)在37。C 溫箱中進行消化，三遍，每遍20min,再加入EDTA-胰酶(125ng/ml;Roche)于37。C 溫箱中繼續消化三遍，每遍15min。再加入RPMI-1640培養基吹打，分散細胞， 過200目篩網，再次收集篩下濾過物，大部分即為胸腺上皮細胞及其它基質細胞， 洗滌，離心(1000r/min， 10min， 4°C)收集細胞，細胞計數，取1X10 個。按數 量比例為l:l混合胸腺細胞和胸腺上皮細胞及其它基質細胞，最后用 a-GalCer-CDld四聚體(ProImmune Inc., Bradenton, FL, USA)通過流式細胞儀將 幼稚與成熟的NKT細胞特異性清除。C. 將步驟B中得到的人胚胎胸腺細胞用1XPBS緩沖液制成胸腺細胞單細胞 懸液直接皮下注射至SCID小鼠的胸腺內。SCID小鼠取仰臥體位，在皮膚上作一 個4-5mm的橫切口，切口位于第二肋間隙處，垂直于胸骨，且位于SCID小鼠兩 前臂連接的遐想線上。注射針lml注射器，25-gauge注射針，且注射針經胸骨 一旁的肋間隙進入到胸腺葉。進針角度注射針針頭與胸骨成30°-40°。進針深度: 約3mm，大約為注射針針頭斜面的長度。注射量每次注射25ul。注射完畢，縫 合，關閉創口。
D. 制備人胚軀干部全厚層皮膚。皮膚來源于孕齡小于24周的自愿終止妊娠者
的胚胎，HLA的分型為HLA-A2+7HLA-DRBr。自妊娠者取出人胚，常規消毒， 鋪單，剪下人胚胎軀干部全厚層皮膚置于含1XPBS緩沖液的培養皿中，并將剪 下的皮膚用鑷子剝去脂肪組織，再放入含新鮮的1XPBS緩沖液培養皿中，此步 驟至少重復2-5次，直到脂肪組織完全被剔除。最后將剪下的軀干部全厚層皮膚 切成統一大小(0.8cm々片)的移植片，置于4。C預冷的生理鹽水中待移植。
E. 將步驟D中制備好的人胚軀干部全厚層皮膚移植至步驟C中己注射了人胚 胎胸腺細胞的SCID小鼠中，得到humanized skin-allograft-transplanted human-thymus-SCID chimera (簡稱HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型)。這種人鼠嵌合 模型humanized skin-allograft-transplanted human-thymus-SCID chimera包括HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的排斥模型和HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的耐受模型。
兩組SCID小鼠分兩個時間點(0周、4周)進行皮膚移植，即一組在注射人 胚胎胸腺細胞至SCID小鼠胸腺后立即進行人胚胎軀干部全厚層皮膚移植，得到 HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的耐受模型。另一組在注射人胚胎胸腺細胞至SCID 小鼠胸腺后，待4周免疫重建以后再進行皮膚移植，得到HSATH-T-S人鼠嵌合體 模型的排斥模型。
首先用速眠新(武漢華龍生物制藥有限公司)麻醉良好后，胸腔部備皮，常 規消毒、鋪單。剪去與待移植人皮膚面積相同(0.8cm"片)的全厚層皮膚，將步 驟D中制備好的人胚皮軀干部全厚層皮膚植入SCID小鼠皮膚缺損處并與周圍皮 膚縫合，覆蓋油紗后包扎，l周后去除油紗。
一種HSATH-T-S人鼠嵌合體模型應用過程如下
A.在HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的耐受模型中，皮膚移植與胸腺依賴的NKT細胞同時發生，出現免疫耐受現象。在無菌條件下，取SCID小鼠各個器官 即胸腺、脾臟、肝臟及外周血液，先把器官剪碎，過200目不銹鋼鋼絲網，然后 用Percoll分離液(Pharmacia, USA)分離淋巴細胞并收集。使用抗TCRp單克隆 抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK) ， a-GalCer-CDld四聚體 (Prolmmune Inc.， Bradenton, FL, USA)，抗CD4+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，抗CD8+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，人趨化因子受體單克隆抗體(R&DSystemsEuropeLtd. Abingdon, UK)， 同型對照(DAKO)。
通過流式細胞儀檢測得出，耐受模型中的各臟器(胸腺、脾臟、肝臟及外周 血液)和移植的皮膚的NKT細胞出現頻率呈增加趨勢。而且，特別地，在此胸腺， 脾臟，肝臟，外周血液以》耐受的移植皮片中出現的NKT細胞以CD4 KT細胞 為主。在HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的耐受模型中CD4"NKT細胞誘導移植反應 的免疫耐受，通過在NKT細胞高表達細胞因子IL-4、IL-10及IL-13，并且CD4+NKT 細胞中的CXCR6基因表達增強。
B.在HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的排斥模型中，此時的皮膚移植發生在胸腺 依賴的NKT細胞成熟之后，出現了急性排斥反應。在無菌條件下，取SCID小鼠 各個器官即胸腺、脾臟、肝臟及外周血液，先把器官剪碎，過200目不銹鋼鋼絲 網，然后用Percoll分離液(Pharmacia, USA)分離淋巴細胞并收集。使用抗TCR卩 單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)， a-GalCer-CDld四聚體 OProImmune Inc., Bradenton, FL, USA)，抗CD4+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，抗CD8+單克隆抗體(R&D Systems Eur叩e Ltd. Abingdon, UK)，人趨化因子受體單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)， 同型對照(DAKO)。
通過流式細胞儀檢測得出，排斥模型中的各臟器和移植的皮膚中的NKT細胞 出現頻率呈增加趨勢。而且，在各器官和被排斥的移植皮片中出現的大量NKT細 胞中以CD8 KT細胞為主。在HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的排斥模型中， CD8 KT細胞高表達IFN-Y和IL-2，并且008+ NKT細胞中CCR9基因表達增強。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果本發明的HSATH-T-S人鼠嵌 合體模型，用于研究NKT細胞參與和介導移植排斥反應和免疫耐受，以及NKT細胞在移植反應中的作用與表達。本發明的模型具有重復性好，效果顯著，即耐 受模型中以CD4 KT細胞為主，并高表達了IL-4、 IL-10和IL-13;排斥模型中以 CD8"NKT細胞為主，并高表達了IFN-Y、 IL-2，而且完全模擬了人體內免疫系統 等優點，豐富了國內外對NKT細胞在皮膚移植排斥反應和免疫耐受中作用機制的 認識。該模型將在免疫學基礎研究，誘導移植性器官特異性免疫耐受等方面發揮 十分重要的作用，具有良好的應用前景。


圖1: 一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的建立及其皮膚移植后的存活率示意圖
A. 為HSAT H-T-S嵌合體模型的建立，通過在SCID小鼠內注射配型為
11^-88+氾1^-0(55+人胚胎胸腺細胞使胸腺內免疫重建再進一步移植配型為
1 ^-八2+/1 ^-0腿1+人胚胎軀干部全厚層皮膚。移植時間分為免疫系統重建后 0周或4周后再進行移植，觀察12周。
B. 為在兩個實驗方案中皮膚移植后的幸存率。皮膚移植的受者為植入了配型
為HLA-B8+/HLA-DQ5+人胚胎胸腺細胞的SCID小鼠，供者為配型
HLA-A2+ZHLA-DRBr的人胚軀干部皮膚(同種異體皮膚移植)。而另一供者配
型為111^-88+/1^八-0(55+人胚胎皮膚作為同型皮膚移植的對照。橫坐標為兩組方 案皮膚移植物存活時間
圖2: HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型中CD4+CD8+NKT細胞數示意圖
植入了配型為HLA-B8+ZHLA-DQ5+人胚胎胸腺細胞的SCID小鼠植入配型為
}^八^2+氾1^-01181+的人胚胎軀干部全厚層皮膚，從而建立HSAT H-T-S人鼠嵌 合體模型。收集各臟器和組織的NKT細胞。統計其頻率，用流式細胞儀確定了來
自不同實驗方案中的各組織器官中的CD4+NKT和CD8+NKT細胞數。
A.數據顯示，在HSATH-T-S人鼠嵌合體模型中，分別來自于耐受模型(右
上)和排斥模型(右下)中的總的NKT細胞出現的頻率。
B-C.數據顯示在HSATH-T-S人鼠嵌合體模型中分別來自耐受模型B和排斥模型C中的CD4+NKT細胞(右上)禾BCD8+NKT細胞(右下)出現的頻率。 UD:為未檢測到；ND:為無確切數據。平均值± SD (n = 5). P<0.001
圖3: HSAT H-T-S人鼠嵌合體的不同模型中CD4+和CD8+NKT細胞中趨化因子 CXCR6+和CCR9+表達示意圖
HSAT H-T-S人鼠嵌合體的耐受模型和排斥模型中的CD4+和CD8+NKT細胞 中的CCR9+和CXCR6+的表達。收集胸腺、脾臟的NKT細胞。四色流式細胞儀收
集CD4+和CD8+NKT細胞表達CCR9+和CXCR6+。通過流式得到的實驗性及分析性
數據顯示在圖的左邊。
ND:為無確切數據。平均值± SD (n = 5). P<0.001
圖4: HSAT H-T-S人鼠嵌合體的不同模型中CD4+NKT細胞和CD8+NKT細胞的細 胞因子IFN-y、 IL-4、 IL-10的表達示意圖
在耐受和排斥的HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型中，通過細胞內流式細胞術檢
測CD4+和CD8+NKT細胞中的IFN-Y、 IL-4和IL-10的表達。收集皮膚同種異體移 植物，收集單細胞懸液。四色染色(胞內的細胞因子抗體、CD4/CD8抗體、CDld
四聚體抗體、TCRp抗體)，通過流式來檢測CD4+和CD8+NKT細胞中的IFNi、 IL-4和IL-10的表達。實驗分析數據在圖的最左邊。 ND:為無確切數據。平均值± SD (n= 5). P<0.00具體實施例方式
以下結合具體實施例進一步闡述本發明
實施例1 HSAT H-T-S人鼠嵌合體動物模型的建立，其步驟如下 實驗材料
動物CB-17SCID小鼠(購置武漢大學動物實驗中心)二十只，年齡8周左 右，性別雌，體重20g左右
飼養條件在無菌條件下，飼養溫度22。C，濕度55%， 12小時白/晝節律，飲 用水中給予適當的抗生素麻醉劑鹽酸二甲苯胺噻嗪(0.3mg，遼寧衛星制藥廠)、鹽酸氯胺酮(1.5mg， 遼寧衛星制藥廠)、1XPBS緩沖液300pl
一種HSATH-T-S人鼠嵌合體動物模型的構建方法，包括以下步驟
A. 選取8周齡左右的的CB-17SCID小鼠(非肥胖性糖尿病小鼠，購置武漢大 學動物實驗中心)二十只，分為兩組。在進行細胞移植前的4個小時，對每只SCID 小鼠進行全身X線照射，照射劑量為250-350cGy，優選300cGy。
B. 取人胚胎胸腺細胞人胚來源于小于24周引產自愿終止妊娠志愿者，人胚
胎胸腺細胞111^的分型為111^-88+氾1^-0(55+。具體步驟1)自人胚胎中剝離 胸腺組織，去除被膜，生理鹽水洗滌，剪至約1,3的小碎塊，RPMI-1640培養 液(HyClone， USA)洗滌。2)在胸腺小碎塊中加入RPMI-1640培養基，攪拌20min， 研磨分散細胞(此過程在冰上進行)，在研磨過程中用RPMI-1640培養基沖洗， 過200目篩網，收集篩下濾過物，再將濾過物用RPMI-1640培養基洗滌，離心收 集細胞(1000r/min， 10min， 4°C),即為大部分的胸腺細胞，細胞計數，取1X 107個。3)將篩網上殘余的胸腺組織碎片收集，加入膠原酶-中性蛋白酶溶液 (125叱/ml; Sigma)在37。C溫箱中進行消化三遍，每遍20min，再加入EDTA胰 酶(125叱/ml;Roche)于37。C溫箱中繼續消化三遍，每遍15min。再加入RPMI-1640 培養基吹打，分散細胞，過200目篩網，再次收集篩下濾過物，大部分即為胸腺 上皮細胞及其它基質細胞，洗滌，離心(1000r/min， 10min， 4'C)收集細胞， 細胞計數，取1X10卩個。按數量比例為l:l收集胸腺細胞和胸腺上皮細胞及其它基 質細胞。此制備方法可參見文獻(Gotter J, Brors B, Hergenhahn M, Kyewski B. Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly diverse selection of tissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters. J Exp Med 2004; 19: 155-166) 。 4)將胸腺細胞及胸腺上皮細胞混合，加入a-GalCer- CDld四聚體 (Prolmmune Inc.,Bradenton, FL, USA)在37。C溫箱中孵育，30min,最后通過流式細 胞儀將全部的幼稚及成熟的NKT細胞與這兩種混合細胞分離。5)將最終獲得的
胸腺內的細胞冷凍保存在液氮中，備用。
C. 將步驟B中得到的人胚胎胸腺細胞皮下注射至SCID小鼠胸腺內:具體步驟
如下1)分別麻醉兩組SCID小鼠，首先將鹽酸二甲苯胺噻嗪、鹽酸氯胺酮混合 1 XPBS緩沖液制成麻醉劑，i.p麻醉小鼠。方法可參見文獻(Uldrich AP. Berzins SP,Malin MA, et al. Antigen challenge inhibits thymic emigration. J Immunol 2006; 176: 4553-4561) 2)將之前準備好備用的胸腺細胞用1 XPBS緩沖液制成胸腺細胞單細 胞懸液，待用。SCID小鼠體位仰臥。在皮膚上作一個4-5mm的橫切口切口 約在第二肋間隙處，垂直于胸骨，且位于SCID小鼠兩前臂連接的遐想線上。注 射針:lml注射器，25-gauge，且注射針經胸骨一旁的肋間隙進入到胸腺葉。進針 角度注射針針頭與胸骨成30°-40°。進針深度約3mm，大約為注射針針頭斜面 的長度。注射量每次注射25pl。注射完畢，縫合，關閉創口。方法可參見文獻 (de la Cueva T, Naranjo A, de la Cueva E, Rubio D. Refinement of intrathymic injection in mice丄ab Anim (NY). 2007 May;36(5):27-32.)。
D. 取人胚胸腺軀干部皮膚人胚來源于小于24周引產自愿終止妊娠志愿者，
HLA的分型為HLA-A2+ZHLA-DRBl+。具體步驟如下常規消毒，鋪單，剪下人 胚胎軀干部全厚層皮膚置于1XPBS緩沖液的培養皿中，將剪下的皮膚用鑷子剝 去脂肪組織，再放入新鮮的1XPBS緩沖液培養皿中，此步驟重復2或3或4或5次 (或者更多次)，直到脂肪組織完全被剔除。最后將剪下的軀干部全層皮膚切成 統一大小(0.8cm"片)的移植片，置于4'C預冷的生理鹽水中待移植。
E. 將人胚胎軀千部皮膚移植至步驟C植入了人胚胎胸腺細胞的SCID小鼠胸 腔兩組SCID小鼠，選其中一組先進行皮膚移植，即在傳輸了人胚胎胸腺內細 胞后即0周，進行同種異體皮膚移植，得到HSATH-T-S人鼠嵌合體動物模型的耐 受模型。速眠新(武漢華龍生物制藥有限公司)麻醉良好后,胸腔部備皮,常規消 毒、鋪單。剪去與待移植人皮膚面積相同的全厚皮膚，將步驟D中制備好的人胚 皮軀干部全厚層皮膚植入SCID小鼠皮膚缺損處并與周圍皮膚縫合，覆蓋油紗后 包扎， 一周后去除油紗。而另一組SCID小鼠在人胚胎胸腺細胞傳輸后的第4周再 進行同種異體皮膚移植，得到HSATH-T-S人鼠嵌合體動物模型的排斥模型。
實施例2 —種HSATH-T-S人鼠嵌合體模型其應用過程如下(HSATH-T-S
人鼠嵌合體動物模型的檢測)
實驗材料HSATH-T-S人鼠嵌合體模型建立后，在無菌條件下，分別于0周、 4周、8周、12周從兩組SCID小鼠的各個器官即胸腺、脾臟、肝臟及外周血液中 收集淋巴細胞單細胞懸液。體外分離小鼠器官淋巴細胞的方法為先把器官剪碎， 過200目不銹鋼鋼絲網，然后用Percoll分離液(Pharmacia, USA)分離淋巴細胞，詳細步驟可參考Mebius RE等論文(Transfer of primitive stem/progenitor bone marrow cells from LT alpha-/- donors to wild-type hosts:implications for the generation of architectural events in lymphoid B cell domains.J Immunol.l998;161:3836-43)。
A.在HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的耐受模型中，皮膚移植與胸腺依賴的 NKT細胞同時發生，出現免疫耐受現象。
1) 用常規的NKT細胞表面分子檢測法，使用抗TCRe單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)， a -GalCer- CDld四聚體(ProImm皿e Inc., Bradenton, FL， USA )，抗CD4+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，抗CD8+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)。先將以上 抗體同時加入此模型SCID小鼠組織器官中分離出來的淋巴細胞單細胞懸液中，4 °C，孵育30min，再用l XPBS緩沖液洗滌兩遍，最后通過流式細胞儀檢測。在此 耐受模型中，統計NKT細胞頻率，用流式細胞儀確定了來自耐受模型中的的不同
器官和組織中的CD4+和CD8+NKT細胞數。
隨著檢測時間的推移，0周、4周、8周、12周，各臟器中，即胸腺、脾臟、 肝臟、外周血、以及移植的皮片中的NKT細胞數均逐漸增多。從最初第l周的不 到0.5%到第12周均超過了 1%,且均以胸腺中的NKT細胞量最多。
耐受模型中的CD4 KT細胞和CD8 KT細胞相比之下，CD4^KT細胞幾乎 達總NKT細胞的百分之百，而CD8 KT細胞僅在胸腺中出現了極少量，不到 10%。因此，耐受模型中，出現的NKT細胞以CD4 KT細胞為主。
2) 檢測耐受模型中CD4 KT細胞和CD8"NKT細胞中趨化因子CXCR6+和 CCR9+的表達。使用抗TCRe單克隆抗體，a-GalCer-CDld四聚體，抗CD4+單克 隆抗體，抗CD8+單克隆抗體，抗人趨化因子受體單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)。首先用含有2。/。的BSA及0.P/。疊氮化鈉的l XPBS緩沖 液將收集好的淋巴細胞制成單細胞懸液，再將以上五種抗體一起加入淋巴細胞單 細胞懸液中孵育，4°C, 30min,最后再用l XPBS緩沖液洗滌兩遍，流式細胞儀 檢測。
在耐受模型中，胸腺中的CD4 KT細胞的趨化因子CXCR6+的表達為85。/。而 CCR9+的表達〈2。/。；脾臟中的CD4""NKT細胞的趨化因子CXCR6+的表達為88。/。而CCR9+的表達亦〈2c/。。而胸腺與脾臟里的CD8"NKT細胞中均未發現趨化因子 CXCR6+和CCR9+的表達。綜上所述，在耐受模型中，。04 1^細胞的0乂016+
基因表達增強。
3)檢測耐受模型中NKT細胞內細胞因子。操作步驟將提取出來的NKT細 胞用1 X PBS緩沖液洗滌兩遍，再使用Interprep(Coulter-ImmunoTech)根據產品說 明書作固定和透化處理。使用小鼠抗人細胞因子單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，孵育，室溫下(20-25°C)， 15min。再將細胞用IX PBS緩沖液洗滌兩遍后用羊抗鼠多克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，孵育，室溫下(20-25°C)， 15min。再將細胞用l XPBS緩沖液洗滌兩遍， 使用抗TCRe單克隆抗體、a-GalCer-CDld四聚體，孵育，4°C， 15min。最后， 再用1XPBS緩沖液洗滌細胞，用含0.5% (體積分數)甲醛的PBS固定，流式細 胞儀檢測。
在耐受模型中，CD4 KT細胞表達的IFN卞IL-4、 IL-10分別為4。/。、 12%、 14。/。；而CD8 KT細胞中未發現IFN-Y、 IL-4、 IL-10的表達。因此，在耐受模型中， CD4 KT細胞高表達IL-4、 IL-IO。
B.在HSATH-T-S人鼠嵌合體模型的排斥模型中，在注射人胚胎胸腺細胞后的 第4周，進行皮膚移植，此時的皮膚移植發生在胸腺依賴的NKT細胞成熟之后， 出現了急性排斥反應。
1)用常規的NKT細胞表面分子檢測法，使用抗TCRe單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK), a-GalCer- CDld四聚體(ProImmune Inc., Bradenton， FL, USA )，抗CD4+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK),抗CD8+單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)。先將以上 抗體同時加入此模型SCID小鼠組織器官中分離出來的淋巴細胞單細胞懸液中，4 °C，孵育30min，再用1 XPBS緩沖液洗滌兩遍，最后通過流式細胞儀檢測。在排 斥模型中，收集各臟器組織中的NKT細胞，統計頻率，用流式細胞儀確定了來自
排斥模型中的不同器官和組織中的CD4+和CD8+NKT細胞數。
隨著檢測時間的推移，0周、4周、8周、12周，各臟器中，即胸腺、脾臟、 肝臟、外周血、以及移植的皮片中的NKT細胞數均逐漸增多。從最初第一周的不 到0.5%到第十二周時均超過了1%，且均以胸腺中的NKT細胞量最多。排斥模型中，移植皮片中沒有檢測到NKT細胞，除了第6周時，檢測移植皮片的NKT細胞 達到0.8%。
CD4 KT細胞和CD8 KT細胞相比之下，排斥模型中的CD8^KT細胞明顯 增多，超過了總NKT細胞的50。/。。 CD4 KT細胞在第1周時達到80。/。，隨著時間 的推移，CD4 KT細胞逐漸減少，到12周時還未達到總NKT細胞的50。/。。因此， 排斥模型中，出現的NKT細胞以CD8 KT細胞為主。
2) 檢測耐受模型中CD4 KT細胞和CD8""NKT細胞中趨化因子CXCR6+和 CCR9+的表達。使用抗TCRP單克隆抗體，a-GalCer-CDld四聚體，抗CD4+單 克隆抗體，抗CD8+單克隆抗體，抗人趨化因子受體單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)。首先用含有2。/。的BSA及0.1。/。疊氮化鈉的l XPBS緩 沖液將收集好的淋巴細胞制成單細胞懸液，再將以上五種抗體一起加入淋巴細胞 單細胞懸液中孵育，4°C， 30min，最后再用l XPBS緩沖液洗滌兩遍，流式細胞 儀檢測。
排斥模型中，胸腺中的CD4 KT細胞的趨化因子CXCR6+的表達73%而 CCR9+的表達僅為5。/。，脾臟中的CD4 KT細胞的趨化因子CXCR6+的表達為69n/c 而CCR9+的表達為9。/。。胸腺中的CD8"NKT細胞CXCR6+的表達〈2。/。而CCR9+的 表達高達89%，脾臟中的CD8"NKT細胞CXCR6+的表達僅為6。/。而CCR9+的表達 85%。因此，在排斥模型中，CD8"NKT細胞的CCR9+的基因表達增強。
3) 檢測排斥模型中NKT細胞內細胞因子。操作步驟將提取出來的NKT細 胞用1XPBS緩沖液洗滌兩遍，再使用Interprep(Coulter-ImmunoTech)根據產品說 明書作固定和透化處理。使用小鼠抗人細胞因子單克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK)，孵育，室溫下，15min。再將細胞用l XPBS緩沖液 洗滌兩遍后用羊抗鼠多克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon, UK),孵 育，室溫下，15min。再用1XPBS緩沖液洗滌細胞兩遍，使用抗TCRe單克隆抗 體、a-GalCer-CDld四聚體，孵育，4°C， 15min。最后，再用IXPBS緩沖液洗 滌細胞，用含0.5% (體積分數)甲酵的1XPBS緩沖液固定，流式細胞儀檢測。
排斥模型中，CD4 KT細胞表達的IFN-Y、 IL-4、 IL-10分別為3。/。、 5%、 4%; 而CD8^NKT細胞表達的IFN-Y、 IL-4、仏-10分別為15%、 4%、 3%。因此，在排 斥模型中，CD8 KT細胞高表達IFN-Y。
權利要求
1、一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的構建方法，步驟如下A、選取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠，在細胞移植前4個小時，對每只SCID小鼠進行放射線全身照射，照射劑量為200-350cGy；B、制備人胚胎胸腺細胞人胚胎來源于孕齡小于24周的自愿終止妊娠者的胚胎，細胞HLA分型為HLA-B8+/HLA-DQ5+，自胚胎中剝離胸腺組織，去除被膜，生理鹽水洗滌，將組織剪成碎塊，用RPMI-1640培養液洗滌，往胸腺碎塊中加入RPMI-1640培養液，攪拌20min，研磨分散細胞，在研磨過程中用RPMI-1640培養基沖洗，過200目篩網，收集篩下濾過物，再將濾過物用RPMI-1640培養基洗滌，離心，收集此細胞為胸腺細胞，收集篩網上殘余的胸腺組織碎片，加入膠原酶-中性蛋白酶溶液在37℃溫箱中消化三遍，每遍20min，再加入EDTA-胰酶在37℃溫箱中繼續消化三遍，每遍15min，最后加入RPMI-1640培養基重懸細胞，過200目篩網，收集篩下濾過物，為胸腺上皮細胞及其它基質細胞，洗滌，離心，收集細胞，按數量比例為11混合胸腺細胞和胸腺上皮細胞并收集，最后用α-GalCer-CD1d四聚體通過流式細胞儀將成熟與未成熟NKT細胞特異性清除；C、將步驟B中得到的人胚胎胸腺細胞用1×PBS緩沖液制成單細胞懸液直接皮下注射至SCID小鼠的胸腺內，SCID小鼠取仰臥體位，在皮膚上作一個4-5mm的橫切口，切口位于第二肋間隙處，垂直于胸骨，位于SCID小鼠兩前臂連接的遐想線上，注射針經胸骨一旁的肋間隙進入到胸腺葉，進針角度為注射針針頭與胸骨成30°-40°，縫合，關閉創口；D、制備人胚胎軀干部全厚層皮膚皮膚來源于孕齡小于24周的自愿終止妊娠者的胚胎，HLA分型為HLA-A2+/HLA-DRB1+，自妊娠者取出人胚，消毒，鋪單，剪下人胚胎軀干部全厚層皮膚置于含1×PBS緩沖液的培養皿中，并用鑷子剝去皮膚上的脂肪組織，此步驟至少重復2-5次，直到脂肪組織完全被剔除，最后將剪下的軀干部全層皮膚切成統一大小的移植片，置于4℃預冷的生理鹽水中待移植；E、將步驟D中制備好的人胚軀干部全厚層皮膚移植至步驟C中己注射了人胚胎胸腺細胞的SCID小鼠中，得到人鼠嵌合模型humanizedskin-allograft-transplanted human-thymus-SCID chimera。
2、 權利要求1中所述的一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的耐受模型中的應用。
3、 權利要求1中所述的一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的排斥模型中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型的構建方法及應用。首先選取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠，并對SCID小鼠用放射線進行全身照射；其次是取人胚胎胸腺細胞。細胞來源于孕齡小于24周的自愿終止妊娠者胚胎的胸腺，細胞數量為1×10⁷個，其中胸腺細胞與胸腺上皮細胞及其它基質細胞的數量比例為1∶1，并用α-GalCer-CD1d四聚體特異性清除幼稚與成熟NKT細胞；第三是將得到的胚胎胸腺細胞皮下注射至SCID小鼠胸腺中，進行皮膚移植，得到一種HSAT H-T-S人鼠嵌合體模型。通過將人胚胎胸腺細胞植入重度聯合免疫缺陷小鼠的胸腺中，將人胚軀干部全層皮膚移植至SCID小鼠胸腔上，再現了人體內皮膚移植反應的免疫耐受和排斥反應。本發明重復性好，效果顯著，方法簡單，具有良好的應用前景。
文檔編號G09B23/28GK101438977SQ200810236940
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月19日 優先權日2008年12月19日
發明者何玉玲, 嵐 王, 肖睿璟, 蔣艷萍, 譚錦泉, 朗 陳 申請人:武漢大學