專利名稱：人鼠嵌合型cd4質粒及其多抗在抑制hiv感染中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種嵌合型質粒，具體地說是人鼠嵌合型CD4質粒，以及由該質粒制備得到的多抗。
背景技術：
近20年來，HIV-I疫苗領域研究結果顯示，通過對HIV-I，SIV和SHIV的研究強烈顯示τ細胞介導的細胞免疫和B細胞介導的體液免疫兩者缺一不可。抗體可以保護機體免受病毒(如麻疹病毒，肝炎病毒和流感病毒等)感染，但是，對于像HIV-I這樣的高度變異的病毒來說，很難通過免疫獲得具有廣譜中和活性的抗體。HIV-I中和抗體靶點主要是病毒膜蛋白三聚體和易感靶細胞表面受體，以阻止HIV-I病毒感染靶細胞。盡管HIV-I通過膜蛋白突變、糖基化位點的掩蓋、蛋白之間的相互作用，以及重要功能區的構象掩蓋等方法逃避宿主免疫系統，但是仍然有6個廣譜中和抗體通過識別HIV-I膜蛋白相對保守區而產生。與HIV-I膜蛋白高度變異相比較，細胞受體CD4及其輔助受體高度保守的特性將成為臨床實驗中治療型抗體的重要靶點，成為HIV-I進入細胞的關鍵。有報道表明，CCR5抑制劑maraviroc僅阻止R5嗜性HIV-I感染靶細胞，對X4和雙嗜性的病毒無效。而針對CXCR4 為靶點的抗體研究則更加困難。在近期HIV疫苗研究過程中，關于CD4單克隆抗體研究表明其具有較強的中和多亞型病毒株的能力。⑶4mAb ibalizumab (即TNX-355和Hu5A8)是人源化IgG4單克隆抗體，在臨床I期和II期實驗中顯示其抗病毒活性。本文通過構建人 CD4及人與鼠嵌合型質粒DNA免疫小鼠，通過多抗血清及單克隆抗體抗病毒能力的篩選，獲得具有廣譜中和能力的單抗。希望為將來的預防性和治療性疫苗提供更多的理論及實驗基石出。
發明內容
本發明的目的是提供一種人鼠嵌合型CD4質粒。本發明的第二目的在于提供利用上述質粒制備得到的對HIV假病毒具有明顯抑制效果的多克隆抗體。本發明的再一目的在于提供所述多克隆抗體的用途。本發明的發明思路為HIV感染靶細胞首先通過與其表面CD4受體和輔助受體結合，因此如果能夠阻斷HIV與CD4受體的結合，則能有效地抑制HIV感染，我們設計了針對人CD4受體V1V2區域的人鼠嵌合型質粒，通過DNA免疫希望能夠獲得具有抑制HIV功能的多克隆抗體，為探索HIV疫苗和藥物研發新靶點提供理論和實驗依據。本發明采用如下具體技術方案一種人鼠嵌合型⑶4質粒，所述質粒的序列如SEQ ID No. 8所示。上述質粒在制備介導HIV病毒感染藥物中的應用。上述的人鼠嵌合型CD4質粒的制備方法，所述方法包括如下步驟(1)分別從(ihost細胞和小鼠脾細胞提取總RNA ；(2)利用Pl、P2擴增人總RNA得到人CD4, P3、P4擴增鼠總RNA得到鼠CD4 ；
(3)P3、P10擴增鼠CD4得到鼠CD4信號肽；P1UP7擴增人CD4得到人CD4V1V2區序列；利用P3、P7擴增鼠⑶4信號肽及人⑶4V1V2區獲得鼠⑶4信號肽與人⑶4V1V2區嵌合產物；(4)將步驟C3)獲得的產物經三輪PCR擴增最終得到人鼠嵌合型CD4質粒；第一輪PCR擴增引物為P3、P8，第二輪PCR擴增引物為P9、P4，第三輪PCR擴增引物為P3、P4。所述步驟(3)中PCR 條件為:94°C 5min ；94°C 30s、55°C退火 40s，72°C 延伸 lmin， 20個循環；72 °C延伸8分鐘。所述步驟(4)中PCR 條件為94°C 5min ；94°C 40s、55°C退火 50s，72°C延伸 90s，25 個循環；72 °C延伸8分鐘。一種人鼠嵌合型CD4多克隆抗體的制備方法，所述方法包括下述步驟使用上述的人鼠嵌合型⑶4質粒DNA免疫4周齡BALB/C小鼠，分別在第1、21、35、49天小鼠雙后肢肌肉注射100 μ L lmg/mL權利要求1所述的質粒DNA，5mm寬雙電極針60V電刺激注射部位， 每次電刺激持續50-ms，共6次，免疫后10天收小鼠血清。上述的方法制備得到的人鼠嵌合型CD4多克隆抗體。上述的多克隆抗體在制備抑制HIV假病毒藥物中的用途。一種真核表達載體，其是利用上述的質粒與載體pcDNA3. l/V5-His-T0P0構建而成的。本發明的有益效果本發明所述質粒制備方法簡便，實驗證實本發明所構建質粒通過與輔助受體共轉染細胞，可以有效介導HIV病毒感染，免疫小鼠后收集的多抗稀釋100倍后對不同亞型的HIV假病毒的抑制率為60-90%，顯示出良好的廣譜中和能力。本發明的可實施性和突出實質性特點以及積極效果可通過以下實例得以體現，但不限制其范圍。
圖1為h⑶4、mhDlD2m、mhD2m和mCD4氨基酸序列比對。構建真核表達質粒 pcDNA3. l-hCD4、pcDNA3. l_mhDlD2m、pcDNA3. l_mhD2m 和 pcDNA3. l_mCD4 并測序，將人 CD4、 人鼠嵌合型CD4和鼠CD4氨基酸序列進行比對。圖2為人鼠嵌合型質粒DNA免疫制備多克隆抗體對HIV-I假病毒的抑制作用(A) 和對人CD4的特異性結合能力(B)。CD4結合力FACS檢測Hela陰性對照細胞與免疫前陰性對照血清反應曲線用黑色表示，Hela陰性對照細胞與人鼠嵌合型質粒免疫后血清反應曲線用紅色表示，TZM-bl陽性細胞與免疫前陰性對照血清反應曲線用綠色表示，TZM-bl陽性細胞與人鼠嵌合型質粒免疫后血清反應曲線用藍色表示。
具體實施例方式實施例1人鼠嵌合型⑶4質粒的構建1.分別從(ihost細胞((ihost細胞為公知細胞，可購買得到，是HOS細胞穩定表達人CD4、CCR5和CXCR4的細胞系)和小鼠脾細胞(細胞源于新鮮的小鼠脾細胞)用TRIzol 提取總RNA ；方法如下
TRIzol法提取細胞總RNA(1)約IO6個細胞，使用無RNase吸頭加入ImL TRIzol，使其作用充分后吹打；(2)室溫靜置5min，將其轉入無RNase 1. 5mL離心管中；(3)加入氯仿0. 2mL,吹打15s，室溫靜置!Min ；下，12000rpm離心，15min，可見到溶液分為三相。上層無色水相，溶有RNA ； 中間相，溶有DNA ；下層紅色酚/氯仿相，溶有蛋白質；(5)吸水相至一新1. 5mL離心管中；(6)加0. 5mL異丙醇，4°C下靜置lOmin，同時配75%的乙醇10mL，即無水乙醇 7. 5mL 力口無 RNase /K 2. 5mL ；(7)4°C下低于12000rpm離心lOmin，棄盡上清液；(8)加lmL75%乙醇，彈勻沉淀；(9)4°C下低于7500rpm離心5min，棄盡上清液；(10)將含有沉淀的1. 5mL離心管放入37°C溫箱中，烘干沉淀；(11)加入 13μ L無 RNase 水，57°C 水浴 lOmin，溶解沉淀；(12)加入 1 μ L 無 RNase 的 DNase，37°C水浴 20min，去除雜質 DNA ；(13)放入4 °C冰箱中備用。利用Pl、P2擴增人總RNA得到人⑶4，P3、P4擴增鼠總RNA得到鼠⑶4 ；RT-PCR第一步反應條件42°C，30min ；第二步反應條件94°C 5min ；94°C變性50s，55°C退火lmin，72°C 延伸2min，35個循環；72°C延伸IOmin0最終得到人CD4核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 最終得到小鼠CD4核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。2.應用引物？3沖10沖11、？7、？8、？9、？4(引物序列見表1)經 overlappingPCR 擴增鼠⑶4信號肽與人⑶4 V1V2區嵌合產物；2. 1以鼠CD4為模板，利用引物P3、PlO PCR擴增鼠CD4信號肽，得到SEQID No. 3 所示序列。PCR反應條件94°C 5分鐘；94°C 30s、55°C退火40s，72°C延伸1分鐘，20個循環；72 °C延伸8分鐘。2. 2以人CD4為模板，利用P11、P7PCR擴增人CD4 V1V2區，得到SEQ IDNo. 4所示序列)；PCR反應體系50 μ 1，見表1 ；PCR反應條件94°C 5分鐘；94°C 30秒、55°C退火40s， 72°C延伸1分鐘，20個循環；72°C延伸8分鐘。2. 3利用P3、P7PCR擴增上述兩個步驟獲得的產物，得到人鼠嵌合型⑶4，序列如 SEQ ID No. 5所示；PCR反應體系50 μ 1，見表1 ；PCR反應條件94°C 5分鐘；94°C 30秒、55°C 退火40s，72°C延伸1分鐘，20個循環；72°C延伸8分鐘。3.經overlapping PCR獲得人鼠嵌合型CD4全長(人CD4的V1V2區替換小鼠CD4 的V1V2區)3. 1P3、P8擴增步驟2. 3獲得的鼠⑶4信號肽與人⑶4 V1V2區嵌合產物，得到序列如SEQ ID No. 6所示；PCR反應體系50 μ 1，見表1。PCR反應條件94°C 5分鐘；94°C 40s、 55°C退火50s，72°C延伸90s，25個循環；72°C延伸8分鐘。3. 2以SEQ ID No. 6為模板，利用P9、P4PCR擴增鼠CD4 V3V4區序列，最終得到序列如SEQ ID No. 7所示；PCR反應體系50 μ 1，見表1。PCR反應條件94°C 5分鐘；94°C 40s、 55°C退火50s，72°C延伸90s，25個循環；72°C延伸8分鐘。
3. 3以上述兩個步驟獲得的產物為模板，利用引物P3、P4PCR擴增得到人鼠嵌合型 CD4全長序列，最終得到人鼠嵌合型CD4質粒，所述質粒的序列如SEQ ID No. 8所示。PCR反應體系50 μ 1，見表1。PCR反應條件94°C 5分鐘；94°C 40s、55°C退火50s， 72°C延伸90s，25個循環；72°C延伸8分鐘。表IPCR 反應體系(5O μ L)
權利要求
1.一種人鼠嵌合型⑶4質粒，其特征在于，所述質粒的序列如SEQ ID No. 8所示。
2.權利要求1所述質粒在制備介導HIV病毒感染藥物中的應用。
3.權利要求1所述的人鼠嵌合型CD4質粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟(1)分別從(^host細胞和小鼠脾細胞提取總RNA；(2)利用PI、P2擴增人總RNA得到人⑶4，P3、P4擴增鼠總RNA得到鼠⑶4； (3P3、P10擴增鼠⑶4得到鼠⑶4信號肽；P11、P7擴增人⑶4得到人⑶4 V1V2區序列；利用P3、P7擴增鼠⑶4信號肽及人⑶4 V1V2區獲得鼠CD4信號肽與人⑶4 V1V2區嵌合產物；(4)將步驟C3)獲得的產物經三輪PCR擴增最終得到人鼠嵌合型CD4質粒；第一輪PCR 擴增引物為P3、P8，第二輪PCR擴增引物為P9、P4，第三輪PCR擴增引物為P3、P4 ；所述引物Pl序列如SEQ ID No. 9所示，引物P2序列如SEQ ID No. 10所示，引物P3序列如SEQ ID No. 11所示，引物P4序列如SEQ ID No. 12所示，引物P7序列如SEQ ID No. 13 所示，引物P8序列如SEQ ID No. 14所示，引物P9序列如SEQ ID No. 15所示，引物PlO序列如SEQ ID No. 16所示，引物Pll序列如SEQ ID No. 17所示。
4.權利要求3所述的人鼠嵌合型CD4質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中 PCR條件為:94°C 5分鐘；940C 30s、55°C退火40s，72°C延伸1分鐘，20個循環；72°C延伸8 分鐘。
5.權利要求3所述的人鼠嵌合型CD4質粒的制備方法，其特征在于，所述步驟中 PCR條件為94°C 5分鐘；94°C 40s、55°C退火50s，72°C延伸90s，25個循環；72°C延伸8分鐘。
6.一種人鼠嵌合型CD4多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟 使用權利要求1所述的人鼠嵌合型CD4質粒DNA免疫4周齡BALB/C小鼠，分別在第1、21、 35,49天小鼠雙后肢肌肉注射100 μ L lmg/mL權利要求1所述的質粒DNA，5mm寬雙電極針 60V電刺激注射部位，每次電刺激持續50-ms，共6次，免疫后10天收小鼠血清。
7.權利要求6所述的方法制備得到的人鼠嵌合型CD4多克隆抗體。
8.權利要求7所述的多克隆抗體在制備抑制HIV假病毒藥物中的用途。
9.一種真核表達載體，其特征在于，其是利用權利要求1所述的質粒與載體pcDNA3. 1/ V5-Hi s-TOPO構建而成的。
全文摘要
本發明公開了一種人鼠嵌合型CD4質粒，所述質粒的序列如SEQ ID No.1所示。本發明所述質粒制備方法簡便，實驗證實本發明所構建質粒通過與輔助受體共轉染293T細胞，可以有效介導HIV病毒感染，免疫小鼠后收集的多抗稀釋100倍后對不同亞型的HIV假病毒的抑制率為60-90％，顯示出良好的廣譜中和能力。
文檔編號C12N15/79GK102321653SQ20111020120
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月18日 優先權日2011年7月18日
發明者劉志英, 史宣玲, 張林琦, 李嵐 申請人:清華大學, 首都醫科大學附屬北京佑安醫院