使用數字全息成像對卵子或胚胎進行分析的制作方法

專利名稱：使用數字全息成像對卵子或胚胎進行分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種分析包含至少一個卵子或胚胎的樣本的方法。
背景技術：
自從20世紀70年代末以來，已經實現了體外受精(IVF)，為了增加成功懷孕和健康嬰兒的概率，更加精確地預測卵子或胚胎質量的需求從那開始已經增加。使用兩個或三個胚胎的現代標準植入技術導致雙胎妊娠的風險，這與先天條件的風險相關。此外，如今植入率接近40%。目前的技術通常依賴于基于在一些基本參數幫助下的經驗的主觀判斷。卵子或胚胎通常通過相襯顯微鏡來目視檢查，這樣檢查的質量強烈依賴于進行目視檢查人的技能。目前可用的量化方法通常具有非常高的技術和環境要求或者僅提供通過相稱圖像的軟件分析得到的初步數據。在人類胚胎情況下，通常在受精2天到5天后來研究胚胎。在卵子或胚胎發育能力的預測中，所使用的方法不影響細胞是非常重要的。這就是不能夠使用不同種類的染料和熒光標記的原因。涉及高功率光源的其他技術也被排除在夕卜。所有卵子或胚胎中的絕大多數分類使用相襯顯微鏡或者相襯顯微鏡的變形來制作，例如，微分干涉差顯微鏡(DIC)。當通過相襯顯微鏡研究卵子或胚胎時，進行目視檢查的人幾乎持續地手動設置焦平面以研究卵子或胚胎的不同部分，這是因為焦點深度(即在該深度范圍內可看見清晰圖像)比細胞深度要小。在US 2008/0032325中公開了一種在活組織樣本中計數細胞比如胚胎的方法。通過獲得細胞團的第一和第二圖像，在第二圖像中使橢圓擬合細胞邊界，通過其產生橢球模型細胞，從第一圖像中減去模型細胞以獲取減去后的圖像，其后相同地減去每個細胞直到沒有細胞留在減去后的圖像中，從而對細胞進行計數。細胞數目對應于減法的數目。光學正交顯微鏡(OQM)、偏振干涉、數字全息、傅里葉相位顯微鏡，希爾伯特相位顯微鏡，定量相位顯微鏡或者衍射相位顯微鏡據說是獲取第一圖像的可行的方法，OQM是優選的方法。微分干涉差顯微鏡(DIC)，赫夫曼干涉差顯微鏡以及明場顯微鏡被公開作為獲取第二圖像的可行方法，DIC是優選的方法。在該技術中，第一成像方式，如0QM，和第二成像方式，如微分干涉差顯微鏡，都是所要求的。這樣，需要兩種顯微鏡方法。OQM顯微鏡包含馬赫增德爾干涉儀和全視場成像光學裝置。通過解釋來自四個不同的相機的干涉圖來產生相位圖像，其中參考光穿過1/4波板以產生正交的P平面與S平面偏振的90度相移。偏振分光鏡接著用以分開兩個偏振方向的信號，所述兩個信號然后在兩個分開的相機上被探測到。另外兩個相機也用以探測信號的共軛強度。在US 2008/0032325中使用的顯微鏡的鏡頭的功能是產生圖像，即所研究目標的表示。

發明內容
本發明的一個目的是能夠在不需要人的判斷下分析和分類卵子或胚胎的質量，比如發育能力。判斷的準確性強烈依賴于進行目視檢查的人員的技能和經驗。本發明的另一個目的是提供一種量化方法，相比于現有的方法，該方法能夠以更少的光學要求、更低靈敏度、更少花費的設備完成。根據第一方面，通過一種分析包含至少一個卵子或胚胎的樣本的方法來實現以上目的和其他目的，該方法基于數字全息成像，該方法包括以下步驟a)產生至少一個目標光束和至少一個參考光束，其中所述至少一個目標光束和所述至少一個參考光束彼此相干；b)將所述樣本暴露到所述至少一個目標光束；c)將通過所述樣本的所述至少一個目標光束疊加到所述至少一個參考光束，從而產生干涉圖樣；d)探測所述干涉圖樣，所述干涉圖樣稱為全息圖；e)從所述干涉圖樣重構目標波陣面的相位和/或幅度信息；以及f)從所述相位和/或幅度信息中構建至少一個卵子或胚胎的分析圖像并確定至少一個卵子或胚胎質量表現參數。根據以上方法確定的卵子或胚胎質量表現參數可用于評估卵子或胚胎質量。本發明的方法在無需人的判讀下使對諸如卵子或胚胎的發育能力的質量的分析和分類成為可能。判斷的精確性強烈依賴于進行目視檢查的人員的技能和經驗，這點根據本發明的方法可以避免。本方法也可用作目視檢查的補充。通過根據本發明的方法，可以通過僅使用一種成像技術的相對便宜的設備獲得關于卵子或胚胎的更先進的信息。特別地，本發明的方法能夠利用比在OQM(包括四個相機) 中包括的昂貴且復雜的設備更便宜的設備進行分析。同時，特別是相比于在OQM包括的設備，執行根據本發明的方法所需的設備是穩定的且對外部干擾不是特別敏感。此外，本發明的方法僅需用一個照相機來實現對卵子或胚胎的分析。通過本發明的方法，可以確定若干個卵子或胚胎質量表現參數和基于這若干個參數對卵子或胚胎進行分類。數字全息是一種非常方便的方法，它不需要標記和染色劑就能夠對活細胞進行研究且能夠對所研究的目標進行量化。數字全息使得不需要標記或染色目標就能進行研究成為可能，所述標記或染色目標浪費時間和財物。如此，數字全息使得能夠研究活細胞和細胞的發育情況如細胞生長。數字全息至少和相襯顯微術一樣方便。相襯顯微術是一種目標的折射率變化和厚度變化引起圖像的對比度增加的技術。 在數字全息中，這些變化引起入射光的相位移，所述相位移可定量測量。這樣就為測量圖像的每個像素的光路長度提供可能性，因此提供了對卵子或胚胎進行分類的精確工具。數字全息不包括圖像形成光學器件，因為它僅記錄參考光束和目標光束之間的干涉。基本上，用在數字全息顯微鏡中的透鏡的主要目的不是產生研究目標的圖像，相反，該透鏡用以聚光。之后，通過由計算機執行的重構算法，獲取所研究目標的圖像。該算法利用所記錄的干涉圖樣以在選定的觀察平面或體積上重構復雜的光波場。該方法要求最小數量的光學器件并包括數字聚焦以及色差補償，因為它可以被認為是數字成像系統。這就暗示了對于顯微鏡比如鏡頭的光學精確度不需要特別高的要求。當使用數字全息時，沒有必要設置焦平面。相反，搜集信息，之后通過重建算法可以在任何希望的觀察平面或體積獲取圖像。
根據第二方面，根據第一方面的方法確定的卵子或胚胎質量表現參數用于評估卵子或胚胎的質量的用途。根據第三方面，提供了一種基于數字全息成像來分析包含至少一個卵子或胚胎的樣本的設備。該設備包括至少一個光源，所述至少一個光源被布置以產生至少一個目標光束和至少一個參考光束，其中所述至少一個目標光束和至少一個參考光束彼此相干；用于將所述樣本暴露到所述至少一個目標光束的裝置；用于將通過所述樣本的所述至少一個目標光束疊加到所述至少一個參考光束上， 從而產生干涉圖樣的裝置；傳感器，其被布置以探測干涉圖樣；以及處理單元，其被布置以從所述干涉圖樣重構目標波陣面的相位和幅度信息，以從所述相位和幅度信息構建至少一個卵子或胚胎的分析圖像，和確定至少一個卵子或胚胎質量表現參數。第一方面的特征和優點一般適用于第二和第三方面。本發明的更多特征和優點將在下文中詳細公開。附圖簡述

圖1是兩個胚胎的概略圖，其示出了成功受精的第一跡象。圖2是包圍極體和單個胚胎細胞的透明帶的概略圖。圖3是包括若干個細胞的兩個胚胎的概略圖。圖4是根據本發明的一個實施方式的設備的示意圖。本發明的詳細描述本發明的更多細節將在下文描述到。如其中所使用的，卵子或胚胎質量表現參數指提供有關至少一個卵子或胚胎的質量信息的任何參數。特別地，卵子或胚胎質量表現參數提供與用于受精治療的至少一個卵子或胚胎有關的至少一個卵子或胚胎的質量信息。卵子或胚胎質量表現參數可選自但不限于以下各項所述至少一個卵子或胚胎的透明帶的徑向厚度；所述至少一個卵子或胚胎的透明帶的光學密度；所述至少一個卵子或所述至少一個胚胎內的至少一個細胞的干質量、形態和區域；至少一個極體的干質量、形態和區域；一個卵子相比于至少一個其他卵子的干質量、形態和區域；所述至少一個胚胎內的至少一個細胞相比于至少一個其他細胞的干質量、形態和區域；確定樣本中卵子的數目；確定所述至少一個胚胎內的細胞的數目；確定所述至少一個卵子或胚胎內的原核的數目；確定所述至少一個胚胎內的至少一個限定空間的總的干質量；所述至少一個胚胎內的至少一個限定空間相比于至少一個其他空間的總的干質量；碎裂水平；同步程度；至少一個卵子或胚胎的體積或至少一個胚胎內的至少一個細胞的體積；至少一個卵子或胚胎內的至少一個限定空間的折射率；以及這些的組合。根據本發明的方法的一個實施方式，確定兩個或更多卵子或胚胎質量表現參數， 這些參數被組合為表示卵子或胚胎的質量的一個或幾個參數。根據本發明的方法的一個實施方式，每個確定的卵子或胚胎質量表現參數可由取決于卵子或胚胎質量的有關該具體參數的值表示，例如每個確定的卵子或胚胎質量表現參數可由例如1-10范圍的值表示。表示確定的卵子或胚胎質量表現參數的值可被組合成表示卵子或胚胎的質量的一個具體值。優選地，當組合這些參數時，使用表示每個卵子或胚胎質量表現參數重要性的因子。該組合值將提供關于卵子或胚胎質量的非常直接的信息以及按優先順序放置所分析的卵子或胚胎。根據本發明的方法的一個實施方式，通過將來自相干光源的光束比如通過分光鏡分為兩個光束，產生彼此相干的至少一個目標光束和至少一個參考光束。來自相干光源的光束可以是激光束。激光束可來自各種激光源，例如He-Ne激光器或二極管激光器。優選使用二極管激光器。目標光束和參考光束彼此相干，這就暗示了它們有相同的頻率且隨著時間的推移表現恒定的相位。目標光束通過至少一個卵子或胚胎。參考光束則不受至少一個卵子或胚胎的影響，因為參考光束例如通過分光鏡、鏡子或纖維光學器件被指引到與目標光束不同的另一路徑上。目標光束在通過包含至少一個卵子或胚胎的樣本前有已知的波陣面。當目標光束通過至少一個卵子或胚胎時，卵子或胚胎基本不吸收任何光，但穿過卵子或胚胎的光相比較于穿過周圍介質的光將經歷光學路徑的長度差異。從卵子或胚胎出現的波陣面，即目標波陣面將這樣被相移。自然地，參考光束也有已知的波陣面。光學路徑長度被定義為物理 /幾何厚度與折射率的乘積。根據本發明的方法的一個實施方式，例如通過另一分光鏡將兩個光束聚在一起， 來實現通過包含至少一個卵子或胚胎的樣本的至少一個目標光束與至少一個參考光束的疊加。疊加引起干涉圖樣，干涉圖樣例如包括有關被至少一個卵子或胚胎影響的目標波陣面的信息。根據本發明的方法的一個實施方式，干涉圖樣通過數字傳感器例如CXD或CMOS被探測到。所探測到的干涉圖樣稱為全息圖。為了疊加通過包含至少一個卵子或胚胎的樣本的至少一個目標光束和至少一個參考光束，從而產生干涉圖樣并探測干涉圖樣，例如可以使用傅里葉方案或菲涅爾方案。優選使用菲涅爾方案。傅里葉方案與菲涅爾方案之間的差異被描述為光學配置的差異，這意味著要滿足某些條件，所述條件使近似(例如菲涅爾近似)可應用于重構算法。該近似簡化了圖像重構的過程。在菲涅爾方案中，條件是，相比于目標的尺寸和傳感器的尺寸，目標和傳感器之間的距離很大。通過使用顯微鏡物鏡來實現這點，所述顯微鏡物鏡收集來自目標的散射光并將其以接近平行光束引向傳感器。這就產生了遠離傳感器的虛擬目標。從所探測到的干涉圖樣的相位和幅度信息，重構目標波陣面。該重構通過任何常見的數字重構過程比如傅里葉變換重構或卷積重構可以實現。幅度信息可用于設置所感興趣的焦平面。重構信息例如可用以獲取所研究的至少一個卵子或胚胎的二維或三維的表示的圖像。所獲取的圖像還用于由計算機執行的圖像處理，以確定所研究目標的有用信息， 比如關于所研究的卵子或胚胎質量的參數。進一步的，若干個所獲得的圖像也可用于圖像處理，以便確定關于所研究目標的額外的有用信息，比如關于所研究的卵子或胚胎質量的參數。這種圖像處理涉及分割算法，其中定位預定的形狀。這些所定位的預定形狀進一步被分析，比如關于其尺寸(面積或體積)、干質量、數目等。可能用到的一種分割算法是分水嶺分割。作為產生目標光束和參考光束的替代，可使用同軸數字全息。當研究本說明書時， 如何修改本發明的方法以使用同軸數字全息對本領域技術人員來說很明顯。卵子(卵母細胞、卵細胞)通常由一個單細胞組成。成熟的人體卵母細胞將近 100-120 μ m，使其成為人體中最大的細胞之一。卵母細胞基本上是圓的。正如本文所使用的，胚胎是受精的卵母細胞。在受精后的前幾天，強烈表明該胚胎的質量一些事件發生。該卵細胞包括一個單原核，受精后胚胎包含兩個在單細胞胚胎內可見為較小的圓形狀的原核，如圖1所示。單細胞胚胎稱為受精卵。受精的第一個可視階段為第二個原核的出現。當這出現時，胚胎發生第一次分裂，產生2個細胞。在設想發生同步細胞分裂的情況下，細胞經過進一步的有絲分裂(細胞分裂)形成4、8和16個細胞的階段等。包含不止一個細胞的胚胎被稱為桑葚胚。經過若干細胞分裂后，具有包圍中央的液體填充腔(稱為囊胚腔)的若干細胞的球形層的囊胚形成。囊胚的生長期間，即囊胚腔體積增大的期間是重要的。囊胚變換為具有內細胞團的胚泡，稱為成胚細胞，細胞的外層稱為滋養層，該滋養層后來形成胎盤以及位于滋養層內的囊胚腔。在內細胞團中的細胞的質量和密度很重要。在外層的滋養層的尺寸(即面積或體積)也很重要。在人體胚胎的情況中，囊胚在受精后5天左后形成。胚細胞、滋養層和囊胚腔之間的比例提供了關于在囊胚階段的胚胎質量的信息。 因此，為了評估胚胎質量，這三個區域，即胚細胞、滋養層，囊胚腔可相互比較。比較這三個區域的干質量、面積以及光學密度很有價值。同時，總的干質量、面積和光學密度可給出關于胚胎的質量的信息。本文用到的干質量指的是所研究的目標或者目標的一部分的非水細胞物質，比如蛋白質。光學路徑長度與干質量直接相關。當基于水的液體被用作包圍樣本中的目標的介質時，光學路徑長度是蛋白質含量的直接測量，因為細胞中的水對應于介質。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎為至少一個卵子。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎為至少一個胚胎。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個胚胎包含至少一個細胞。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包括所述至少一個卵子或所述至少一個胚胎內的至少一個細胞的干質量、形態或面積。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎是封裝不止一個細胞的至少一個胚胎，通過確定所述至少一個胚胎內的至少一個限定空間的總的干質量來確定胚胎質量表現參數。根據本發明的方法的又一個實施方式，確定所述至少一個胚胎內的不止一個限定空間的總的干質量，并將一個空間的總的干質量與至少一個其他空間進行比較。卵子或胚胎被暈狀透明帶包圍，在圖2中可見。透明帶為包圍從早期卵細胞到早期胚胎的哺乳動物的多層糖蛋白覆層。在體內，透明帶提供了防止多精受精即多個精子細胞受精以及免疫反應(由于精子可引起與宿主的免疫系統不兼容)的重要成分。在體外， 透明帶在保護卵子或胚胎免于植入的機械應力方面提供同等重要的作用。因此透明帶的徑向厚度是卵子或胚胎質量的重要特征。透明帶的徑向厚度指的是從透明帶的內邊界到外邊界的徑向距離。通過根據本申請的方法來研究透明帶，可以獲取卵子或胚胎的整個圓周的透明帶的徑向厚度的測量結果。透明帶的徑向厚度可表示為平均、最大或最小徑向厚度以及可呈現為表示沿著卵子或胚胎的圓周的透明帶的徑向厚度圖。因此，可獲取透明帶的徑向厚度的變化。也可觀察到透明帶的徑向厚度的逐漸變薄。透明帶的光學密度是卵子或胚胎質量的重要特征。透明帶的光學密度也可以根據本發明所述方法來獲取。與徑向厚度一樣，透明帶的光學密度也可表示為平均、最大或最小光學密度以及呈現為表示沿著卵子或胚胎圓周的透明帶的光學密度圖。透明帶的不同層的光學密度也是很重要的。同時，可通過本發明所述方法研究透明帶的可能的裂縫。通過研究透明帶的生長情況也可獲取胚胎的質量。在精子滲透后，皮質顆粒、卵子內的特殊細胞器，將其內容物釋放到卵周隙，所述卵周隙是卵子或透明帶之間的空隙(即極體位于其中)，這一事件稱為皮質反應。皮質顆粒滲透液改變透明帶的特性，這稱為透明帶反應，如此阻止多精受精滲透。透明帶結構的變化，其導致透明帶在受精過程中固化，伴隨著透明帶蛋白質的次要結構的變化(β結構含量的顯著增加)。因此，受精后透明帶的現有結構被重新排列，通過研究受精之前、受精期間和受精之后的卵母細胞/胚胎，可確定胚胎的質量。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含從以下組中選出來的至少一個參數，所述組由至少一個卵子或胚胎的透明帶的徑向厚度和至少一個卵子或胚胎的透明帶的光學密度構成。極體是具有在減數分裂過程中在不對稱的有絲分裂后形成的小量細胞質的細胞。 極體隨著時間的推移而退化和破碎。一個極體在受精前的卵細胞成熟過程中被擠出。第二個極體在受精后被擠出。發育的第一跡象是兩個極體的出現。在胚胎的單細胞狀態，第二極體的擠出通常被看作可能成功受精的早期跡象。極體的尺寸(即面積或體積)與胚胎質量有關，較大的極體與較低的受精機率和質量較差的胚胎相關。第一極體的碎裂與胚胎質量有關。通過測量極體的尺寸(即面積或體積)和數量(取決于時間點)，可以提高受精發生的幾率和形成高質量的胚胎。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含至少一個極體的干質量、形態或者面積。原核是配子即結合受精前的精子和卵子的原子核。成功受精的首要跡象是兩個原核的出現。應該出現不超過兩個原核，否則胚胎就會是低質量的，應該優選被舍棄。可通過數結合前受精后的原核數量來確定胚胎的質量。而且，核仁的前體位于原核內(圖1)，產生有關胚胎質量的信息。核仁前體的排列、原核的尺寸(即面積或體積)、核仁前體以及原核的位置相互關系與胚胎質量有關。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數通過計數所述至少一個卵子或胚胎內的原核數目來確定。胚胎細胞經過若干次減數分裂(細胞分裂)形成2、4、8和16個細胞階段等。細胞數量和分裂球(胚胎中的原始細胞)的有絲分裂的同步是決定哪個胚胎最適合植入的另一個基本和重要的參數。細胞應該基本上在同一階段，即細胞分裂應該同時在所有細胞中發生，雖然在實踐中經常預期一些變化。同步涉及細胞分裂同時發生和細胞同時分裂就被認為是同步。通過根據本發明所述的方法計數胚胎內的細胞數目，可確定同步程度。在植入之前的幾個時間點計數細胞數目以確保細胞分裂井然有序。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含碎裂水平。碎裂意味著細胞解體成較小的部分，這在圖3中可見。卵子或胚胎中出現碎裂是該卵子或胚胎低質量的跡象，雖然這里經常出現一些程度的碎裂。增加的碎裂經常聯系到在觀察時間點胚胎內的細胞較少，這可能標志缺乏適當的有絲分裂。在研究卵子的情況中， 增加的碎裂可聯系到在觀察時間點樣本內的幾個卵子或卵子碎片。通過根據本發明所述的方法計數樣本中的卵子數目或胚胎內的細胞數目，可確定碎裂程度。碎裂可歸因于基因、代謝缺陷或凋亡(死亡)的細胞或其他不明原因。利用分割算法通過圖像處理可確定卵子或胚胎的數目，其中定位預定的形狀，特定類型的形狀的數目對應于卵子或胚胎的數目。優選地，使用分水嶺分割。根據本發明的方法的一個實施方式，通過計數樣本內的卵子的數目，來確定卵子質量表現參數；通過計數至少一個胚胎內的細胞的數目，來確定胚胎質量表現參數。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含同步程度。直到早期胚胎發育，總細胞質體積(不包含細胞核的細胞或分裂球的體積)不變， 因此每個細胞分裂產生先前一半尺寸的細胞。直到16細胞階段，這被證明是正確的。通過測量每個細胞的細胞面積或細胞體積并相互比較它們，能夠識別具有不同步的細胞周期的胚胎，以及卵子或胚胎的碎裂。在每個細胞階段，在高質量胚胎內每個細胞的干質量是一樣的。這樣，通過比較每個細胞的干質量和胚胎的其他細胞的干質量可提供胚胎的質量信息。根據本發明的方法的一個實施方式，所述樣本包括不止一個卵子，通過比較一個卵子和至少一個其他卵子的干質量、形態或面積可確定卵子質量表現參數；或者所述至少一個胚胎封裝了不止一個細胞，通過比較所述至少一個胚胎內的一個細胞和至少一個其他細胞的干質量、形態或面積可確定胚胎質量表現參數。為了增加在至少一個卵子或胚胎的測量中所收集到的信息，可用到至少兩個波長。折射率取決于波長。因此，通過使用兩個波長，可以按每個像素測量物理/幾何厚度和折射率，不僅是它們的乘積。這意味著可測量目標的準確厚度。這樣，不僅可確定細胞面積， 而且可確定細胞體積，例如胚胎內的卵子或細胞的體積，或者胚胎的體積。同樣，細胞的不同部分具有不同的折射率。例如，細胞核通常具有與細胞體不同的折射率，因此，通過使用至少兩個波長，能夠在數字全息圖像中分別標記和測量細胞核。通過使用至少兩個不同的激光器或者其他光源，可以獲得所述至少兩個波長。利用至少兩個波長有助于與本發明方法相關的計算，因為可使用要求不高的算法。當收集針對兩個不同波長的目標的干涉圖樣時，圖樣之間的差異可被解釋為具有合成波長(頻差波長)的干涉圖樣，所述合成波長長于照亮樣本的波長。用這種技術，以2pi為模的光學路徑長度的信息可以延伸比入射光束的波長長一倍，而沒有相位模糊。這在具有較大的相位移的較大目標諸如卵子或胚胎的情形中特別有意思。此外，利用至少兩個波長產生了具有較少噪聲的圖像。根據本發明的方法的一個實施方式，使用了兩個或更多的波長，對于每一個所使用的波長執行所述步驟a)到e)，構建所述至少一個卵子或胚胎的分析圖像，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數通過利用所述兩個或更多波長重構的相位和幅度信息來確定。根據本發明的方法的一個實施方式，通過兩個或更多不同的激光器或其他光源獲得兩個或更多波長。當使用兩個或更多波長時，基于通過使用該兩個或更多波長收集到的信息來確定所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數。同時，基于通過使用該兩個或更多波長收集到的信息來構建所述至少一個卵子或胚胎分析圖像。在胚胎早期分裂過程中，在每個細胞中可能有比預期的多或少的單核。這種核數目中的不規則偏差被認為產生低質量的卵子或胚胎。核數目可以從根據本發明的方法獲得的標準的卵子或胚胎分析圖像確定，但是當使用至少兩個不同波長時，可以更容易地確定， 因為可以區分細胞核和細胞周圍部分的不同折射率。雖然通過利用至少兩個波長可確定細胞比如卵子或胚胎的體積，但是其不可能獲得細胞或胚胎的真實三維形態，因為其只知道每個像素中的總的物理厚度。其不知道在特定像素中的總的物理厚度是否是一個或幾個物理厚度的總和，即在構成總的物理厚度的兩個或更多距離之間是否存在某些未被占用的空間。基于與所研究的目標即細胞、卵子或胚胎的正常形態相關的假設，無論如何可以獲得細胞或胚胎的三維圖像。如果細胞或卵子位于平面上，將使這些假設更容易。然而，基于通過利用至少兩個波長獲得的信息來獲得真實的三維圖像是不可能的。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含所述至少一個卵子或胚胎的體積或所述至少一個胚胎內的至少一個細胞的體積。根據本發明的方法的一個實施方式，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含所述至少一個卵子或胚胎內的至少一個限定空間的折射率。增加所收集的信息的另外方法是從不同角度拍攝幾個圖像。如果卵子或胚胎以不變的旋轉速度旋轉且以特定的時間間隔拍攝圖像，該圖像可用于胚胎的層析重構。可替代地，卵子或胚胎每次旋轉特定的角度，每次旋轉后拍攝圖像。目標繞著不與目標光束平行的軸旋轉。優選地，目標繞著垂直于目標光束的軸旋轉。卵子或胚胎的旋轉使得卵子或胚胎的真實的三維重構成為可能。根據本發明的方法的一個實施方式，旋轉包含至少一個卵子或胚胎的樣本以及從不同角度拍攝卵子或胚胎的分析圖像，用于產生真實的三維重構。根據本發明的方法的一個實施方式，通過層析算法組合從不同角度拍攝的卵子或胚胎的分析圖像，用于產生真實的三維重構。當旋轉卵子或胚胎時，可以獲得基本球形的卵子或胚胎整個周圍的透明帶的徑向厚度和光學密度，而不僅是沿著卵子或胚胎的二維投影的圓周的透明帶的徑向厚度和光學
也/又。可機械地，例如通過支持卵子或胚胎的微量吸管，或通過光學鑷子或微流體裝置旋轉卵子或胚胎。所述兩個方法，即利用至少兩個波長或從不同角度拍攝圖像，也可結合使用以最大化所收集到的信息。上面提到的卵子或胚胎質量表現參數依賴于在預定的時間點獲取的數字全息圖像。在正確的培養條件下，通過非侵入性的定時成像可研究整個發育過程。例如，可以固定的時間間隔比如一小時、一天來獲取圖像，所獲取的圖像放在一起成為展示所分析的卵子或胚胎隨著時間的發育過程的電影。用本發明的方法也可實現圖像的連續獲取。這樣，可更進一步確定卵子或胚胎的質量。如果多核早期出現或者受精卵的卵裂早期出現是有利的。 通過在不同時間點或連續地研究胚胎可以確定出現多核和受精卵卵裂的時間點。通過在不同時間點或連續獲取圖像，可研究卵子或胚胎的發育情況。例如，研究卵子的可能變化將很有意義，比如當受精發生時，透明帶的變化。根據本發明的方法的一個實施方式，在不同時間點或連續地重復步驟b)到d)，以根據步驟e)重構相位和幅度信息和根據步驟f)構建在不同時間點或連續地獲取的卵子或胚胎的分析圖像。根據本方法的一個實施方式，比較在一個時間點獲取的卵子或胚胎分析圖像和在更早時間點獲取的卵子或胚胎分析圖像。這樣做是為了探測變化。例如，在不同時間獲取的分析圖像中可以確定和比較細胞的數目和尺寸。假若探測到變化，則存儲探測到該變化的時間點。此外，可存儲在探測到該變化的時間點獲取的分析圖像。而且，可基于至少一個卵子或胚胎質量表現參數的比較來比較分析圖像。在一個實施方式中，在保育器內執行至少步驟a)到d)。用這種方法，所述至少一個卵子或胚胎在其所培養的環境中可被方便地研究。而且，這樣簡化了對所述至少一個卵子或胚胎隨著時間的研究，因為不必在每次分析時將所述至少一個卵子或胚胎從保育器里面取出來。可選地，所述方法還包括將干涉圖樣從保育器內傳輸到保育器外的處理單元上。 優選地，所述傳輸包括無線傳輸干涉圖樣。用這種方法，處理單元不必位于保育器內。例如， 處理單元可位于遠程服務器上。現在將參照圖4描述根據本發明的實施方式的設備。圖4顯示了用于分析樣本10 的設備100的示意圖。設備100包括至少一個光源300、傳感器500、分光鏡7a和7b、反射表面9a和％、和處理單元13。分光鏡7a和7b與反射表面9a和9b —起充當用于將樣本暴露到至少一個目標光束21的裝置和將所述至少一個目標光束21疊加到至少一個參考光束23的裝置。光源300被布置以產生相干光的至少一個光束19。相干光的光束19可以是例如源自各種激光源的激光束，比如發射635nm波長的光的二極管激光器。這里，僅顯示了一個光源。然而，一般而言，設備100可包含幾個可同時使用的光源300。優選地，如果使用幾個光源300，這些光源產生不同波長的光。這是有利的，因為樣本10對不同波長的光有不同的反應。因此，通過利用具有不同波長的多個光源300，將獲得更多有關樣本的信息。源自光源300的相干光光束19被引向分光鏡7a。分光鏡7a將所述至少一個相干光光束19分為至少一個目標光束21和至少一個參考光束23。用這種構建方法，所述至少一個目標光束21和至少一個參考光束23彼此相干，暗示著它們有相同的頻率和隨著時間的推移顯示不變的相位關系。如果存在超過一個的光源300，分光鏡7a可將源自光源300 的每個光束19分為彼此相干的目標光束21和參考光束23。當使用設備100時，包含至少一個卵子或胚胎11的樣本10被布置在至少一個目標光束21的光路中。例如，反射表面9a可用以重定向所述至少一個目標光束21如此以使樣本10暴露到至少一個目標光束21。由于目標光束21向樣本10傳播，目標光束21將通過樣本10，尤其是穿過至少一個卵子或胚胎11。由于目標光束21通過樣本10，由于折射率的差異，它將比諸如不通過所述樣本的參考光束23的光束傳播更長的光學路徑長度。這將相應地導致所述目標光束21和參考光束23之間的相位移。光學路徑長度被定義為物理/ 幾何厚度與折射率的乘積。反射表面9b被布置為反射從而重定向至少一個參考光束23。特別地，反射表面 9a和9b被布置使得至少一個目標光束21和至少一個參考光束23被引向用于疊加的裝置， 在這里為分光鏡7b的形式。分光鏡7b疊加至少一個目標光束21和至少一個參考光束23 并將所疊加的光束25引向傳感器500。傳感器500被布置為探測由目標光束21和參考光束23引起的干涉圖樣。由于目標光束21和參考光束23彼此相干，它們將在傳感器500產生干涉圖樣。特別地，由于所述至少一個目標光束21穿過樣本10，目標光束21和參考光束23傳播不同的光學路徑長度， 因此干涉圖樣指示目標光束21和參考光束23之間的相位移。傳感器500可以是例如數字傳感器，諸如CCD (電荷耦合器件)或CMOS (互補金屬氧化物半導體)圖像傳感器。傳感器500還能可操作地連接到處理單元13，處理單元13可包括用于實現任何常見的重構過程的軟件或硬件。重構過程可以從傳感器500探測到的干涉圖樣重構相位和幅度信息。重構信息可以例如用以獲取所研究的至少一個卵子或胚胎11的至少一個分析圖像。該信息還可以例如用以確定所述至少一個卵子或胚胎11的形狀和光學密度。特別地，處理單元13被布置為從所述相位和/或幅度信息確定至少一個卵子或胚胎質量表現參數。換句話說，處理單元13可被布置以執行根據本發明的實施方式的方法的任何數據處理步驟。而且，設備100可包括存儲介質或存儲器(未示出)。存儲介質或存儲器能夠可操作地連接到處理單元13。特別地，存儲介質或存儲器可被布置以存儲分析圖像和關于在分析圖像中探測到變化的時間點的時間數據。設備100可適于在保育器15內操作。通過這樣的布置，為了分析，樣本10可不需要從培養它的保育器中取出來。如圖4顯示的，光源300、傳感器500、光學組件比如分光鏡 7a和7b以及反射表面9a和9b都包括在保育器15內。處理單元13可置于保育器15內或者保育器15外。如果處理單元置于保育器15外，優選處理單元可與傳感器500無線通信。 例如，設備可包含發射機(未被顯示)，該發射機被布置以發射關于來自傳感器500的干涉圖樣的信息到可操作地連接到處理單元13的接收機。發射機可形成被布置為發射信號并從處理單元13接收信號的收發機的一部分。可替代地，設備100可包括保育器15。在這種情況下，保育器15優選與設備100 —體地形成。這樣的布置提供了非常緊湊和靈活的方案。例如，包括一體形成的保育器的設備100可放置在工作臺上或根據需要可方便地移到另一位置。有利地，通過使保育器15和設備100 —體地形成，并不是設備中的所有組件都必須被布置到保育器內。例如，諸如分光鏡7a和7b及反射表面9a和9b的一些光學組件， 其對保育器內的條件比較敏感，可被布置到保育器的外部。在一個實施方式中，僅固定樣本 10的樣本固定器位于保育器15內。設備100可還包括控制器(未被顯示)，所述控制器用于控制保育器15內的濕度、 溫度和二氧化碳百分比中的至少一個。通過這種方法，可獲得用于培養至少一個卵子或胚胎的最理想條件。培養細胞需要某些嚴格規定的參數。首先，細胞培養介質需要將PH值保持在7. 4。由于細胞培養介質最常用碳酸鹽緩沖，這可通過提供5%的二氧化碳到空氣中來獲取，盡管可用有機緩沖劑比如HEPES替代。為了阻礙介質的蒸發，空氣應該是水飽和的。 例如，濕度為大約90-95%或以上。培養細胞在37攝氏度更適宜生長，盡管這依賴于細胞物種。例如哺乳動物細胞更適合37攝氏度，昆蟲細胞更適合20攝氏度，而鳥類細胞更適合 40-42攝氏度。而且，不同的策略可用于設備100，特別是設備100的光學組件，比如分光鏡7a和 7b和反射表面9a和％，以應對保育器15內的條件。根據一個策略，設備100被布置在保育器15內，同時保育器內的溫度和室內溫度基本相同。接著，以較低的速率升高保育器內的溫度。通過這種方法，將避免在設備100的光學組件發生凝結，因為在光學組件和保育器 15內的空氣之間沒有溫差。根據另外一個策略，光學組件比如分光鏡7a和7b及反射表面 9a和9b可被布置和/或處理以應對保育器15內的條件。特別地，光學組件可被處理以避免凝結。通過這種方法，當保育器15內的溫度和室內溫度不是基本相同時，設備100可被布置到保育器15內。結果，可避免以上緩慢升高溫度的程序。如技術人員容易理解的，參照圖4所描述的實施方式僅僅是該套裝備的說明和示意性的例子，其將落在所附權利要求的范圍內。許多變化和修正是可能的。例如，關于將樣本暴露到至少一個目標光束及將至少一個目標光束與至少一個參考光束疊加的特定的幾何和光學裝備，將有很多可能的變化。附圖的詳細描述圖1中，兩個胚胎(1)顯示了成功受精的第一跡象，因為超過一個原核C3)在單個胚胎細胞( 可見。左邊的胚胎有兩個原核(3)，這是正常的，因此被認為具有高質量。然而，右邊的一個顯示了三個原核(3)，因此被認為具有低質量。可看到核仁前體為原核內的微小的點。圖2中，透明帶(5)圍繞胚胎(1)的極體⑷和單個胚胎細胞(2)。圖3中，可見到包含幾個細胞(6)的兩個胚胎(1)。上面的胚胎(1)是具有8個細胞(6)的桑椹胚。上面的胚胎(1)包含具有實質上相同的大小的細胞(6)，因此被認為具有高質量。下面的胚胎(1)發生了嚴重的碎裂(具有不同大小的幾個細胞和細胞碎片(6))， 因而被認為具有低質量。圖3中的胚胎的透明帶(5)弱于受精卵。
權利要求
1.一種分析包含至少一個卵子或胚胎的樣本的方法，所述方法基于數字全息成像，所述方法包括以下步驟a)產生至少一個目標光束和至少一個參考光束，其中所述至少一個目標光束和所述至少一個參考光束彼此相干；b)將所述樣本暴露到所述至少一個目標光束；c)將通過所述樣本的所述至少一個目標光束與所述至少一個參考光束疊加，從而產生干涉圖樣；d)探測稱作全息圖的所述干涉圖樣；e)根據所述干涉圖樣來重構目標波陣面的相位和/或幅度信息；以及f)根據所述相位和/或幅度信息來構建至少一個卵子或胚胎分析圖像和確定至少一個卵子或胚胎質量表現參數。
2.根據權利要求1所述的方法，其中至少所述步驟a)到d)是在保育器內執行的。
3.根據權利要求2所述的方法，還包括將所述干涉圖樣從所述保育器內傳輸到所述保育器外的處理單元。
4.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含從由至少一個卵子或胚胎的透明帶的徑向厚度和至少一個卵子或胚胎的透明帶的光學密度構成的組中選出來的至少一個參數。
5.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含所述至少一個卵子的或所述至少一個胚胎內的至少一個細胞的干質量、形態或者面積。
6.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含至少一個極體的干質量、形態或者面積。
7.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述樣本包含不止一個卵子，且卵子質量表現參數通過比較一個卵子和至少一個其他卵子的干質量、形態或面積來確定；或者所述至少一個胚胎封裝不止一個細胞，且胚胎質量表現參數通過比較所述至少一個胚胎內的一個細胞和至少一個其他細胞的干質量、形態或面積來確定。
8.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中卵子質量表現參數通過計數所述樣本中的卵子數目來確定；或者胚胎質量表現參數通過計數所述至少一個胚胎內的細胞數目來確定。
9.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數通過計數所述至少一個卵子或胚胎內的原核數目來確定。
10.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎是封裝不止一個細胞的至少一個胚胎，且胚胎質量表現參數通過確定所述至少一個胚胎內的至少一個限定空間的總的干質量來確定。
11.根據權利要求10所述的方法，其中確定所述至少一個胚胎內的不止一個限定空間的總的干質量，并將一個空間的總的干質量與至少一個其他空間的總的干質量進行比較。
12.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含碎裂水平。
13.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含同步程度。
14.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中使用兩個或更多波長，對于每一個所使用的波長執行所述步驟a)到e)，并構建所述至少一個卵子或胚胎分析圖像，所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數根據利用所述兩個或更多波長重構的相位和/或幅度信息確定。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述兩個或更多波長通過兩個或多個不同的激光器或其他光源獲得。
16.根據權利要求14和15中的任何一個所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含所述至少一個卵子或胚胎的體積、或者所述至少一個胚胎內的至少一個細胞的體積。
17.根據權利要求14和15中的任何一個所述的方法，其中所述至少一個卵子或胚胎質量表現參數包含所述至少一個卵子或胚胎內的至少一個限定空間的折射率。
18.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中旋轉包含所述至少一個卵子或胚胎的所述樣本，并從不同角度獲取卵子或胚胎的分析圖像以建立真實的三維重構。
19.根據權利要求18所述的方法，其中從不同角度獲取的卵子或胚胎的分析圖像被通過層析算法進行組合以建立真實的三維重構。
20.根據前述任何一個權利要求所述的方法，其中在不同的時間點或連續地重復步驟 b)到d)以根據步驟e)重構相位和/或幅度信息，并根據步驟f)構建在所述時間點或連續地獲取的卵子或胚胎分析圖像。
21.根據權利要求20所述的方法，還包括以下步驟將在所述時間點中的一個時間點或連續地獲取的卵子或胚胎分析圖像與在更早時間點獲取的卵子或胚胎分析圖像進行比較；基于所述比較步驟的結果來探測是否有變化發生；而且，如果探測到變化，則存儲探測到所述變化的時間點。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述比較包括比較至少一個卵子或胚胎質量表現參數。
23.根據前述任何一個權利要求所述的方法確定的卵子或胚胎質量表現參數用于評估卵子或胚胎質量的用途。
24.一種用于基于數字全息成像來分析包含至少一個卵子或胚胎的樣本的設備，所述設備包括至少一個光源，其被布置以產生至少一個目標光束和至少一個參考光束，其中所述至少一個目標光束和所述至少一個參考光束彼此相干；用于暴露的裝置，其用于將所述樣本暴露到所述至少一個目標光束；用于疊加的裝置，其用于將通過所述樣本的所述至少一個目標光束與所述至少一個參考光束疊加從而產生干涉圖樣；傳感器，其被布置以探測所述干涉圖樣；以及處理單元，其被布置以根據所述干涉圖樣重構目標波陣面的相位和/或幅度信息，并根據所述相位和/或幅度信息構建至少一個卵子或胚胎分析圖像，和確定至少一個卵子或胚胎質量表現參數。
25.根據權利要求M所述的設備，還包括保育器，其中所述至少一個光源、所述用于暴露的裝置、所述用于疊加的裝置和所述傳感器都位于所述保育器內。
26.根據權利要求25所述的設備，其中所述處理單元位于所述保育器外，其中所述設備還包括發射器，所述發射器被布置為將所述干涉圖樣從所述傳感器傳輸到所述處理單兀。
27.根據權利要求M-26中的任何一個所述的設備，還包括用于控制所述保育器內的濕度、溫度、以及二氧化碳百分比中的至少一個的控制器。
全文摘要
一種分析包含至少一個卵子或胚胎的樣本的方法，該方法基于數字全息成像，該方法包括以下步驟產生至少一個目標光束和至少一個參考光束，其中所述至少一個目標光束和至少一個參考光束彼此相干；將所述樣本暴露到所述至少一個目標光束；將通過所述樣本的所述至少一個目標光束疊加到所述至少一個參考光束，從而產生干涉圖樣；探測稱作全息圖的所述干涉圖樣；從所述干涉圖樣重構目標波陣面的相位和幅度信息；從所述相位和幅度信息構建至少一個卵子或胚胎的分析圖像和確定至少一個卵子或胚胎質量表現參數。
文檔編號G03H1/08GK102460124SQ201080028232
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月24日 優先權日2009年6月25日
發明者M·西貝斯塔, 倫納特·吉塞爾森, 安娜·莫爾德, 安德斯·朗貝格, 約翰·佩爾松 申請人:相位全息成像Phi有限公司