專利名稱：生物熒光顯微檢測儀器的制作方法
技術領域：
本發明涉及顯微檢測儀器設計及制造領域，尤其是涉及ー種生物熒光顯微檢測儀器。
背景技術：
全內反射顯微成像技術和共聚焦顯微成像技術各有優缺點全內反射顯微成像具有很高的軸向分辨率，但其橫向分辨率較低；共聚焦顯微成像具有很高的橫向分辨率，但其軸向分辨率較差。如何在一臺顯微鏡中同時利用全內反射顯微成像高的軸向分辨率和共聚焦顯微成像高的橫向分辨率尤為重要。
發明專利申請CN201080024155.9中提出了將全內反射熒光圖像和共焦圖像簡單且正確地重合的圖像處理裝置、程序和顯微鏡，該發明中包含了兩套顯微鏡，一套是全內反射顯微鏡，另ー套是共聚焦顯微鏡，但兩套顯微鏡是分開工作的，通過光路切換的方法先獲得一套顯微鏡的圖像，再獲得另一套顯微鏡的圖像，最后計算機再利用兩套圖像中的基準點將兩套圖像進行了重合。該方法雖然生成了全內反射熒光圖像和共焦圖像的重合圖像，由于兩種顯微鏡是先后工作的，在物理上并不能同時得到三維高分辨率圖像；另外該發明要先后操作兩個顯微鏡拍攝圖像，并要對圖像進行重合，顯微鏡結構比較復雜，控制系統的構成也比較復雜。
發明內容
本發明的目的是提供ー種集成全內反射顯微成像技術和共聚焦顯微成像技術的生物熒光顯微檢測儀器，該生物熒光顯微檢測儀器在橫向及軸向上具有很高的分辨率。本發明的技術方案是生物熒光顯微檢測儀器包括激發光照明単元、激發光和熒光隔離單元、激光掃描単元、顯微成像単元、熒光探測單元及控制單元；所述激發光照明單元包括激光光源、第一擴束鏡及第ニ擴束鏡；所述第一擴束鏡及第ニ擴束鏡之間設有照明針孔，且所述照明針孔位于所述第一擴束鏡的焦點處；所述激發光和熒光隔離單元包括激發光濾色片、二色鏡及熒光濾色片；所述激光掃描單元包括可繞X軸做往返旋轉運動的X掃描振鏡組件及可繞Y軸做往返旋轉運動的Y掃描振鏡組件；所述顯微成像単元包括掃描透鏡、筒鏡、環形光束整形組件及顯微物鏡，所述環形光束整形組件包括設于所述顯微物鏡入瞳位置的環形濾光片，所述環形濾光片具有將激光截止的內環區域和透射激光的環帶區域，且所述內環區域和環帶區域均可透射熒光；所述內環區域的半徑不小于剛好能發生全內反射時所述顯微物鏡入瞳位置的臨界半徑；所述顯微物鏡的入瞳位置與所述X掃描振鏡組件的反射面和Y掃描振鏡組件的反射面沿光軸線的中間位置相共軛；所述熒光探測單元包括成像鏡頭及光電倍增管，所述成像鏡頭與所述光電倍増管之間設有成像探測針孔，所述成像探測針孔位于所述成像鏡頭的焦點處；待觀察對象與所述照明針孔和成像探測針孔處于共軛位置上；所述光電倍増管可探測熒光，并將所述熒光轉換成電信號；所述第一擴束鏡、照明針孔、第二擴束鏡、激發光濾色片、二色鏡、激光掃描單元、掃描透鏡、筒鏡、環形濾光片及顯微物鏡依次沿始于所述激光光源的光軸線設置；且所述顯微物鏡、環形濾光片、筒鏡、掃描透鏡、激光掃描單元、二色鏡、熒光濾色片、成像鏡頭、成像探測針孔及光電倍增管依次沿始于由待觀察對象激發的熒光光軸線設置；所述控制単元，與所述激光掃描單元和所述光電倍増管均電性連接，用于同步采集所述電信號與所述激光掃描單元的位置坐標并進行關聯，以生成待觀察對象區域圖像。下面對上述技術方案進ー步解釋所述環帶區域的寬度可調節。所述顯微物鏡為無窮遠消像差型大數值孔徑的浸油物鏡。
所述控制單元還與所述激光光源電性連接，用于控制激光的波長和功率。本發明的優點是I.本發明提供的生物熒光顯微檢測儀器在第一擴束鏡及第ニ擴束鏡之間且位于第一擴束鏡的焦點處設有照明針孔，在成像鏡頭和光電倍增管之間且位于成像鏡頭的焦點處設有成像探測針孔，有效提高了該儀器的橫向分辨率；同時，在位于顯微物鏡入瞳的位置設置環形光束整形組件，提高了該生物熒光顯微檢測儀器在軸向的分辨率。2.本發明提供的生物熒光顯微檢測儀器由于入射激光光束經顯微成像單元聚焦在區域面積約為艾利斑大小的點狀區域內，即只有一個面積很小厚度很薄區域內的熒光物質能夠被激發，而其它區域內的熒光物質不會被激發，即從源頭上消除了雜散光的來源，因而具有很高的成像信噪比。
圖I為本發明實施例提供的生物熒光顯微檢測儀器結構示意圖。圖2為本發明實施例提供的環形濾光片的結構示意圖。圖3為本發明實施例提供的環形光束通過顯微物鏡的光路傳播示意圖。圖4為本發明實施例提供的激光掃描單元的結構示意圖。其中激發光照明単元110、激光光源111、第一擴束鏡112、第二擴束鏡113、照明針孔114、激發光和熒光隔離單元120、激發光濾色片121、二色鏡122、熒光濾色片123、激光掃描單元130、X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132、顯微成像單元140、掃描透鏡141、筒鏡142、環形光束整形組件143、顯微物鏡144、環形濾光片1432、熒光探測單元150、成像鏡頭151、光電倍增管152、成像探測針孔153、控制單元160。
具體實施例方式請參考圖I至圖4。圖I中標有單向箭頭的光路為激光傳播光路；標有雙向箭頭的光路表不為突光傳播光路。實施例生物熒光顯微檢測儀器100包括激發光照明単元110、激發光和熒光隔離單元120、激光掃描單元130、顯微成像單元140、熒光探測單元150及控制單元160。激發光照明單元110包括激光光源111、第一擴束鏡112、第二擴束鏡113。在第一擴束鏡112和第二擴束鏡113之間且位于第一擴束鏡112的焦點處設有照明針孔114。激發光和熒光隔離單元120包括激發光濾色片121、二色鏡122、熒光濾色片123。激發光濾色121片用于接收激光，濾除激光中偏離中心波長的光束，并透射激光中中心波長處的光束。二色鏡122接收并反射經激發光濾色片121透射的激光，并透射熒光。熒光濾色片123接收并透射經二色鏡122透射的熒光，并截止激光。激光掃描單元130包括X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132。X掃描振鏡組件131可繞X軸做往返旋轉運動。Y掃描振鏡組件132可繞Y軸做往返旋轉運動，隨著X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132的旋轉運動，入射激光束反射后的角度也將隨之改變。顯微成像單元140包括掃描透鏡141、筒鏡142、環形光束整形組件143、顯微物鏡144。環形光束整形組件143包括環形濾光片1432。該環形濾光片1432設置于顯微物鏡144的入瞳位置，具有將激光截止的內環區域A和透射激光的環帶區域B。內環區域A和環帶區域B均可透射熒光。顯微物鏡144的入瞳位置與X掃描振鏡組件131的反射面和Y掃描振鏡組件132的反射面沿光軸線的中間位置相共軛，即X掃描振鏡組件和Y掃描振鏡組件置于零視場角位置時圖4中過M點垂直光軸的位置與顯微物鏡144入瞳位置共軛。熒光探測單元150包括成像鏡頭151、光電倍增管152。在成像鏡頭151與光電倍 增管152之間且位于成像鏡頭151的焦點處設有成像探測針孔153。待觀察對象與照明針孔114和成像探測針孔153處于共軛位置上。光電倍增管152可探測熒光，并將熒光轉換成電信號。其中，第一擴束鏡112、照明針孔114、第二擴束鏡113、激發光濾色片121、二色鏡
122、激光掃描單元130、掃描透鏡141、筒鏡142、環形濾光片1432、顯微物鏡144依次沿始于激光光源111的光軸線設置；顯微物鏡144、環形濾光片1432、筒鏡142、掃描透鏡141、激光掃描單元130、二色鏡122、熒光濾色片123、成像鏡頭151、成像探測針孔153、光電倍增管152依次沿始于待觀察對象激發的熒光光軸線設置。激光光源111發射的準直激光依次經第一擴束鏡112、照明針孔114、第二擴束鏡113擴束后形成平行的激光束；該平行激光束依次經激發光濾色片121、二色鏡122、激光掃描単元130、掃描透鏡141、筒鏡142后經環形光束整形組件143整形為環形光束，該環形光束經顯微物鏡144聚集于待觀察對象處，并激發待觀察對象產生熒光；該熒光光束依次經顯微物鏡144、環形濾光片1432、筒鏡142、掃描透鏡141、激光掃描單元130、二色鏡122、熒光濾色片123、成像鏡頭151后聚焦于成像探測針孔153處，光電倍增管152探測該熒光束并將其轉換成電信號。控制單元160與激光掃描單元130、光電倍增管152電性連接，控制單元160將光電倍增管152輸出的微弱電信號進行放大，并對放大后的電信號進行實時采樣，同時控制X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132沿X、Y軸往返旋轉，使得經顯微物鏡144形成的聚焦激光點在X、Y方向能夠移動。控制單元160將采集到電信號和激光掃描單元130Χ、Y方向的位置坐標關聯起來，生成了ー個區域中熒光物質的圖像。控制單元160還電性連接于激光光源111，用于控制入射激光波長和功率。在該生物熒光顯微檢測儀器100中，顯微物鏡144為無窮遠消像差型大數值孔徑的浸油物鏡，由于環形光束的內環半徑(圖2中A區域的半徑)不小于顯微物鏡144剛好能發生全內反射時入瞳位置處光束的臨界半徑，且蓋玻片200和油300的折射率大致相同，這樣進入顯微物鏡144的環形光束在蓋玻片200和待觀察對象所在的組織溶液400的交界處發生全反射，不能透過蓋玻片200進行傳播，但會在蓋玻片200和組織溶液400的交界處形成隱失場(圖3中C區)，隱失波能夠激發界面附近的熒光分子，產生熒光。調整環形濾光片1432環帶區域B的寬度可以改變穿出蓋玻片200的隱失場的分布深度，從而可以改變熒光物質在Z軸方向的激發深度，可以實現Z軸方向不同分辨率的調節。隱失波的頻率與入射光頻率相同，其強度(単位面積和單位時間的能量)隨離開界面的垂直距離呈指數衰減I (z) = I (O) e_z/d可以看出，透射電磁場的振幅隨進入樣品的深度z減小得非常快，這種電磁場只存在于界面附近ー薄層內。d是理論滲透深度，等于從界面處到隱失波強度衰減到界面處數值Ι/e的距離，d可表示為d = ( λ 0/4 31) Cn12Sin2 θ -η22)_1/2d與入射角(Θ )、波長λ ^以及組織溶液400折射率(η2)和蓋玻片200的折射率(Ii1)有夫。d隨入射角増大而減小，大小與入射光波長為同一數量級或更小。由于隱失場 的獨特特性，使熒光激發的區域非常靠近分界面(約IOOnm)。這樣不會激發距分界面更遠區域的熒光，從而可實現背景噪聲極小的熒光成像，使得生物熒光顯微檢測儀器100在軸向具有很高的分辨率。在該生物熒光顯微檢測儀器100中，通過照明針孔114及成像探測針孔153的聯合使用，實現點對點的照明和點對點的成像。當不考慮噪聲的情況下，光學上常用點擴散函數描述系統成像分辨率，對于激光掃描共焦系統來說，系統最終的點擴散函數由下式描述PSFtot (x, y, z) = PSFill (x, y, z) · PSFdet (x, y, z)其中PSFill對應照明激光點在物方的點擴散函數，PSFdet對應成像探測光路的點擴散函數。由于照明針孔114的作用，入射激光光束通過各單元后在蓋玻片200與待觀察對象交界處形成一個很小的點狀照明區域(照明方點擴散函數)，成像探測針孔153的使用對成像探測方點擴散函數進ー步整形，使得整個生物熒光顯微檢測儀器100的成像點擴散函數由照明方點擴散函數和探測方點擴散函數的乘積組成，由于乘積后的成像點擴散函數強度分布范圍變窄，因而系統具有很高的橫向分辨率。在該生物熒光顯微檢測儀器100中由于入射激光光束經顯微成像単元140聚焦在區域面積約為艾利斑大小的點狀區域內，即只有一個面積很小厚度很薄區域內的熒光物質能夠被激發，而其它區域內的熒光物質不會被激發，即從源頭上消除了雜散光的來源，因而系統具有很高的成像信噪比。當然本發明的生物熒光顯微檢測儀器還可具有多種變換及改型，并不局限于上述實施方式的具體結構。總之，本發明的保護范圍應包括那些對于本領域普通技術人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
權利要求
1.一種生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，包括激發光照明單元、激發光和熒光隔離單元、激光掃描單元、顯微成像單元、突光探測單元及控制單元； 所述激發光照明單兀包括激光光源、第一擴束鏡、第二擴束鏡；第一擴束鏡、第二擴束鏡之間設有照明針孔，且所述照明針孔位于所述第一擴束鏡的焦點處；所述激發光和熒光隔離單元包括激發光濾色片、二色鏡、熒光濾色片；所述激光掃描單元包括可繞X軸做往返旋轉運動的X掃描振鏡組件、可繞Y軸做往返旋轉運動的Y掃描振鏡組件；所述顯微成像單元包括掃描透鏡、筒鏡、環形光束整形組件、顯微物鏡，所述環形光束整形組件包括設于所述顯微物鏡的入瞳位置的環形濾光片，所述環形濾光片具有將激光截止的內環區域和透射激光的環帶區域，該內環區域和環帶區域均可透射熒光；所述內環區域的半徑不小于剛好能發生全內反射時所述顯微物鏡入瞳位置的臨界半徑；所述顯微物鏡的入瞳位置與所述X掃描振鏡組件的反射面和Y掃描振鏡組件的反射面沿光軸線的中間位置相共軛；所述熒光探測單元包括成像鏡頭、光電倍增管，該成像鏡頭與所述光電倍增管之間設有成像探測針孔，所述成像探測針孔位于所述成像鏡頭的焦點處；待觀察對象與所述照明針孔和成像探測針孔處于共軛位置上；所述光電倍增管可探測熒光，并將所述熒光轉換成電信號； 所述第一擴束鏡、照明針孔、第二擴束鏡、激發光濾色片、二色鏡、激光掃描單元、掃描透鏡、筒鏡、環形濾光片及顯微物鏡依次沿始于所述激光光源的光軸線設置，且所述顯微物鏡、環形濾光片、筒鏡、掃描透鏡、激光掃描單元、二色鏡、熒光濾色片、成像鏡頭、成像探測針孔及光電倍增管依次沿始于由待觀察對象激發的熒光光軸線設置； 所述控制單元與激光掃描單元、光電倍增管均電性連接，用于同步采集所述電信號與所述激光掃描單元的位置坐標并進行關聯，以生成待觀察對象區域圖像。
2.根據權利要求I所述的生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，所述環帶區域的寬度可調節。
3.根據權利要求I所述的生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，所述顯微物鏡為無窮遠消像差型大數值孔徑的浸油物鏡。
4.根據權利要求I所述的生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，所述控制單元還與所述激光光源電性連接，用于控制激光的波長和功率。
全文摘要
本發明提供的生物熒光顯微檢測儀器包括激發光照明單元、激發光和熒光隔離單元、激光掃描單元、顯微成像單元、熒光探測單元及控制單元。激發光照明單元的第一擴束鏡及第二擴束鏡之間且位于第一擴束鏡的焦點處設有照明針孔，熒光探測單元的成像鏡頭和光電倍增管之間且位于成像鏡頭的焦點處設有成像探測針孔，有效提高了該儀器的橫向分辨率；同時，在顯微成像單元的顯微物鏡入瞳的位置設置環形光束整形組件，提高了該生物熒光顯微檢測儀器的軸向分辨率。
文檔編號G02B21/36GK102818795SQ201210255748
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者張運海, 張欣, 黃維, 昌劍, 薛曉君 申請人:蘇州生物醫學工程技術研究所