專利名稱：一種用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片、制備方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于遺傳檢測領域，具體涉及一種用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片、制備方法及其試劑盒。
背景技術：
肛腸疾病是指與肛門直腸有關的一系列疾病，常見的有痔瘡、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、結直腸癌、肛乳頭瘤、直腸息肉、乳糜腹瀉等，是一種臨床常見病、多發病。可發生任何年齡，其中20 49歲患病率最高。中國肛腸協會資料表明，中國肛腸疾病發病率占總人口的59. 9%，全國約7. 7億人，且呈逐年上升趨勢。傳統的治療方法以手術和藥物為主，而 且往往達不到理想效果，嚴重影響患者的身心和健康。肛腸疾病是多基因位點與環境共同作用的結果，目前已有相關研究報道確定了一些基因的單核苷酸多態性(SNPs)與肛腸疾病相關。單核苷酸多態性是由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性，包括單個堿基的轉換、顛換以及單個堿基的缺失和插入。其中最少的一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。作為第三代遺傳標記的SNP在人類基因組中約每1000個堿基就出現一個，并具有如下特點(I)數量多，分布廣泛；(2)遺傳穩定；(3)易于基因分型；(4)適于快速、高通量檢出。SNP自身的特性決定了它比其他兩類遺傳標記更適合于對復雜性狀的遺傳解析以及基于群體基因識別等方面的研究，促使人們不斷地尋找新的SNP標記和革新SNP檢測技術。目前已有多種方法可用于SNP檢測，傳統的SNP檢測方法有DNA測序、限制性酶切片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、單鏈構象多態性(single strand conformational polymorphism, SSCP)、變性高效液相色譜(denaturinghigh performance liquid chromatography,DHPLC)等。這些技術雖在某種程度上能完成對SNP的檢測，但距快速、高效、自動化的目標還相差甚遠。DNA芯片技術是近年來新開發的一種基因檢測工具。其原理是將大量的寡核苷酸探針有規律地排列在一張玻片上，這些探針可以與信號顯示物質標記的樣品DNA的擴增序列的互補序列進行相結合，通過對信號物質進行檢測，對雜交結果進行計算機軟件處理分析，從而獲得雜交信號的強度及其分布模式圖。基于寡核苷酸芯片的方法為分析SNP提供了一種高通量的技術，為SNP或基因突變提供了一個高通量的檢測平臺，可用來平行分析已知基因在不同疾病樣本中的突變或SNP位點，以獲得疾病易感基因的遺傳學改變，并作為線索加強臨床上早預防、早發現、早診斷和早治療，具有重要的社會和經濟效益。經檢索，利用肛腸疾病相關基因多態性檢測的基因芯片至今還未見報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于肛腸疾病具體包括結直腸癌、先天性巨結腸癥、克羅恩氏病、乳糖不耐受癥、潰瘍性結腸炎、酒精臉紅反應、家族性結腸腺瘤性息肉病、乳糜腹瀉和囊性纖維化九種肛腸疾病患病風險評估的基因芯片、制備方法及其試劑盒。—種用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片，其特征在于包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測肛腸疾病易感基因多態性位點的特異性寡核苷酸探針，所述檢測肛腸疾病易感基因多態性位點如下結直腸癌基因多態性位點(SNP)4 個rs4939827、rs6983267、rs3802842、rs961253先天性巨結腸癥基因多態性位點(SNP) 5個rsl37852525、rsl04894388、rsl801710、rsl93196427、rsl93123285克羅恩氏病基因多態性位點(SNP)11 個rs2066844、rsl0761659、rs2066845、rs2066847、rsll209026、rs2241880、rs7714584、rs3197999、rslll90140、rsl7234657、 rsl893217乳糖不耐受癥基因多態性位點(SNP) 3個rs 193268403、rs 193267205、rsl93116455潰瘍性結腸炎基因多態性位點(SNP)4個rs2395185、rs9858542、rsl0883365、rsll209026、酒精臉紅反應基因多態性位點(SNP) 3個rs 193229433、rs 193200096、rsl93056481家族性結腸腺瘤性息肉病基因多態性位點(SNP)2f:rsl21912665、rsll3993961乳糜腹瀉基因多態性位點(SNP)3個rs2187668、rs6822844、rs6441961囊性纖維化基因多態性位點(SNP)4個rsl93230349、rsl93273640、rsl93221728、rsl93219992 ；針對肛腸疾病易感基因多態性位點，設計了一組寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1-78所示,具體列表如下表I用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片的寡核苷酸探針序列位點名稱探針序列(5，— 3’ )rs4939827 Iff-AAAAGAGGAAACAGGACCCCAGAG
1M-CCAAAAGAGGAAATAGGACCCCAGrs6983267 2W-AGCAGATGAAAGGCACTGAGAAAA2M-AGCAGATGAAAGTCACTGAGAAAArs3802842 3W-AAAATCTATCCCAGAAATTCA3M-AGACCCATAGAAAATCTCTCCCArs9612534W-ACATCAAGTAAATTCAGA4M-ACATCAAGTACATTCAGArs137852525 5W-GTTCAGTACCGCATGCAGTG5M-GTTCAGTACCGCGTGCAGTGrs104894388 6W-TTCATACAGAAAGCCTCCGTG6M-TTCATACAGAAAGGCTCCGTGrsl801710 7W-AGACCTTATGGCCCAAGAGTT
權利要求
1.一種用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片，其特征在于包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測肛腸疾病易感基因多態性位點的特異性寡核苷酸探針，所述檢測肛腸疾病易感基因多態性位點如下 結直腸癌基因多態性位點(SNP) 4 個rs4939827、rs6983267、rs3802842、rs961253先天性巨結腸癥基因多態性位點(SNP) 5個rsl37852525、rsl04894388、rsl801710、rsl93196427、rsl93123285 克羅恩氏病基因多態性位點(SNP) 11個rs2066844、rsl0761659、rs2066845、rs2066847、rsll209026、rs2241880、rs7714584、rs3197999、rslll90140、rsl7234657、rsl893217 乳糖不耐受癥基因多態性位點(SNP) 3個rsl93268403、rsl93267205、rsl93116455潰瘍性結腸炎基因多態性位點(SNP) 4個rs2395185、rs9858542、rs 10883365、rsll209026、 酒精臉紅反應基因多態性位點(SNP) 3個rsl93229433、rsl93200096、rsl93056481家族性結腸腺瘤性息肉病基因多態性位點(SNP) 2個rsl21912665、rsl 13993961乳糜腹瀉基因多態性位點(SNP)3個rs2187668、rs6822844、rs6441961囊性纖維化基因多態性位點(SNP)4 個:rsl93230349、rsl93273640、rsl93221728、rsl93219992 ； 所述寡核苷酸探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1-78所示，具體列表如下 表I用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片的寡核苷酸探針序列 位點名稱探針序列(5，— 3’ ) rs4939827 Iff-AAAAGAGGAAACAGGACCCCAGAG 1M-CCAAAAGAGGAAATAGGACCCCAG rs6983267 2W-AGCAGATGAAAGGCACTGAGAAAA 2M-AGCAGATGAAAGTCACTGAGAAAA rs3802842 3W-AAAATCTATCCCAGAAATTCA 3M-AGACCCATAGAAAATCTCTCCCA rs9612534W-ACATCAAGTAAATTCAGA 4M-ACATCAAGTACATTCAGArs137852525 5W-GTTCAGTACCGCATGCAGTG5M-GTTCAGTACCGCGTGCAGTGrs104894388 6W-TTCATACAGAAAGCCTCCGTG6M-TTCATACAGAAAGGCTCCGTGr s1801710 7W-AGACCTTATGGCCCAAGAGTT7M-CCAAGGGTTCCAACGCCAGrs193196427 8W-TTCTCATAGCCTACGGACTCGAAC8M-ATAGCCTATGGACTCGAACCGGrsl93123285 9W-ACCCTGTCTCGTGGACCGC 9M-CCCTGTCTCGTGGACTGCCCGGrs2066844 IOff-CCGGAGCAGGGCCTTCTCAGAT
2.根據權利要I所述的用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片，其特征在于所述固相載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，所述的固相載體經不同的化學修飾使其表面帶有可以固定核酸分子的活性基團。
3.根據權利要I所述的用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片，其特征在于所述用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片包括陽性對照探針和陰性對照探針，所述的陽性對照探針序列如SEQ ID No. 79所示,所述的陰性對照探針序列如SEQ ID No. 74所示。
4.一種用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片的制作方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)將固相載體預處理，待用； (2)根據表I所設計的探針序列，如SEQID No. 1_78所示，人工合成每條寡核苷酸芯片探針； (3)將上述各寡核苷酸芯片探針溶解在點樣液中，點樣固化即得。
5.根據權利要求4所述的用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片的制作方法，其特征在于所述每條寡核苷酸芯片探針在合成時5’端經氨基基團修飾。
6.根據權利要求4所述的用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片的制作方法，其特征在于所述固相載體為載玻片，所述的預處理為將載玻片用鉻酸洗液洗滌，浸泡過夜，水洗，20wt% 25 1:%氨水浸泡中過夜，水洗，然后浸入氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，用冰醋酸調節pH值至4. O 6. 0，乙醇超聲清洗，烘干4 5小時，戊二醛醛基化處理。
7.根據權利要求4所述的用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片的制作方法，其特征在于所述點樣時每點點樣體積為O. 4 O. 6nL，點心間距為500 600 μ m,點直徑為200 300 μ m,每條探針重復點樣2 3次；所述的固化處理為室溫放置24 26小時固化。
8.一種用于肛腸疾病患病風險評估的試劑盒，其特征在于它包括上述權利要求1-3中任一項所述的用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片。
9.根據權利要求8所述的用于肛腸疾病患病風險評估的試劑盒，其特征在于它還包括用于檢測肛腸疾病各易感基因多態性位點擴增對應所需的引物，其序列如SEQ IDNo. 80-156所示，和陽性對照擴增對應所需的引物，其序列如SEQ ID No. 157-158所示，見表2。
表2 PCR擴增對于所需的弓I物序列 位點名稱引物序列 rs4939827(l)f 5/ -ATATCAACAAGCCCTCTTCA-3' r 5/ -GGAGATGCTGCAAAGCATGA-3'rs6983267(2)f 5/ -CAGCTGCATCGCTCCATAGA-3' r 5/ -ATTGCAGAGTTGCACAGTTA-3'rs3802842 (3)f 5/ -GCCTTCCTCTGCTGTTCCTA-3' r 5/ -ACTGCTTAAGGTGTTGATAC-3'rs961253(4)f 5/ -TCACCCATAATGCTGCTTAG-3' r 5/ -GACAGTTTAGCTCAATATGG-3'rsl37852525(5) f 5/ -ATGGTCATCACGTGGAAGGT-3'r 5/ -GTGGAAGCAGGCGAGCTCAA-3'rsl04894388(6) f 5/ -CACTTTCCTGTCCCATACAT-3'r 5/ -GAAGCAACAGCTCGATATCT-3'rsl801710(7)f 5/ -TTCCTTCCTCTGCTTGTCTC-3' r 5/ -TTCGCATGCACTTGTTCTTG-3'rsl93196427(8) f 5/ -CTCGTCTTAACTGGATAAGG-3'r 5/ -GAGAGTATCTCAGCGTCTGT-3'rsl93123285(9) f 5/ -TGCTGTGCAGGCTCAGGTCT-3'r 5/ -CTCCGTCCAGGTGTGCATGT-3'rs2066844(10) f 5/ -GCCGCACAACCTTCAGATCACAG-3'r 5/ -ATGTCAACTTGAGGTGCCCAACA-3'rs2066845(11) f 5/ -AGTCTGTAATGTAAAGCCACT-3'r 5/ -AAAACTGCAGGATAGACTCTGA-3'rsl0761659(12) f 5/ -AACAAAGGAATCACTAGCAGA-3'r 5/ -GCTAAAGTTTCAGAATGCACA-3'rs2066847(13) f 5/ -ACGGTTACATTTCACTGATGGT-3'r 5/ -CCATTCCTCTCTCCCGTCAC-3'rsll209026(14) f 5/ -TTTATTGGGAATGATCGTCT-3'r 5/ -GTCACCTGTAAAATAGGCCAG-3'rs2241880(15) f 5/ -GAATCTAGAAGGACAGGCTA-3'
10.根據權利要求8所述的用于肛腸疾病患病風險評估的試劑盒，其特征在于它還包括PCR擴增所用的PCR緩沖液，MgCl2, dNTPmix, Taq酶。
全文摘要
本發明涉及一種用于肛腸疾病患病風險評估基因芯片、制備方法及其試劑盒。他包括固相載體、固定在固相載體上的用于檢測肛腸疾病易感基因多態性位點的特異性寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針的核苷酸序列如SEQIDNo.1-78所示。本發明還公開了該基因芯片的制作方法，以及包括該基因方法的試劑盒。其靈敏度高，特異性和可靠性高，可科學預測九種肛腸系統疾病的患病風險，為肛腸疾病的診斷治療提供分析信息。根據檢測分析得到的各肛腸系統疾病的患病風險可有針對性的調整生活飲食習慣，采取相應的其他措施從而預防疾病的發生，或者做到疾病早發現早治療，提高國民素質，有效預防肛腸疾病的發生。
文檔編號C40B50/06GK102876791SQ20121035644
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者徐謀勝, 李兵, 王珊, 袁雅燕, 王寧 申請人:湖北維達健基因技術有限公司