包含木質纖維素生物質發酵過程糖漿的土壤調理組合物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種在木質纖維素生物質發酵過程中所產生的糖漿，其用作土壤調理物質的粘結劑，以使得農用組合物易于處理和施用。所述糖漿使粉末狀土壤調理物質諸如石灰和石膏粘結以形成丸粒或顆粒。
【專利說明】
包含木質纖維素生物質發酵過程糖漿的土壤調理組合物
[00011 本申請要求2014年5月20日提交的美國臨時申請62/000639和2013年10月10日提 交的申請61/889061的權益，所述申請全文各自以引用方式并入。
技術領域
[0002] 本發明涉及土壤調理劑領域。更具體地，將木質纖維素糖漿在農用組合物中用作 粘結劑。木質纖維素糖漿是木質纖維素生物質發酵過程的聯產品。
【背景技術】
[0003] 土壤調理劑用于改善土壤的質量以改善植物生長和收率。期望土壤調理劑以易于 分散于土壤的狀態施用。因此土壤調理劑的活性成分通常為精細研磨或粉末形式。通常將 調理成分與粘結劑結合以形成易于處理、運輸以及分散于施用部位的丸粒。
[0004] 土壤調理劑的示例包括含有碳酸鈣的石灰和其它礦物質（包括鎂），以及石膏（水 合硫酸鈣）。石灰降低土壤酸性，這改善植物生長。石膏改善土壤排水并促進植物生長。
[0005] 與土壤調理劑組合結合的粘結劑的示例為木質素磺酸鹽（或木質素亞硫酸鹽;磺 化木質素）。木質素磺酸鹽是用于由木漿造紙的亞硫酸鹽方法的副產品。在該過程期間，木 材中的木質素與纖維素分離并且被磺化。所得的磺化木質素副產品為粉末狀物質的有效粘 結劑。W0201426048公開了用于生產肥料的方法，其中制得石膏和粘結劑諸如木質素磺酸鹽 的丸粒。US20140030369公開了包含木質素磺酸鹽的土壤改良組合物。
[0006] 在將木質纖維素生物質用作用于發酵的碳源的纖維素乙醇方法中，通常將來自蒸 餾塔(啤酒塔)的全塔餾物分離為固體(濕餅或濾餅)和液體(稀塔餾物)餾分。使稀塔餾物通 過蒸發器以產生糖漿。濾餅和糖漿是纖維素乙醇方法的聯產品。可燃燒具有至少約40%固 體的糖漿，如US20120102823中所公開，由此提供能量。也可燃燒濾餅以提供能量。
[0007] 仍然需要易于獲自可再生資源的另外的材料，其可在土壤調理劑中用作粘結劑。
【發明內容】
[0008] 本發明提供農用組合物，其混合由最初利用木質纖維素生物質的發酵過程產生的 糖漿與至少一種土壤調理物質。本發明的糖漿的物理特性類似于以上所述的木質素磺酸鹽 物質，但是其不需要磺化并且由環境友好的過程制得。
[0009] 因此，本發明提供了農用組合物，其包含：
[0010] a)木質纖維素糖漿;和
[0011] b)至少一種土壤調理物質。
[0012] 在一個實施方案中，所述糖漿是由木質纖維素生物質制備醇的過程的聯產品。
[0013] 在另一個實施方案中，所述糖漿包含：
[0014] a)約40 %至約70 %的固體；
[0015] b)約10g/l至約30g/l的乙酰胺;和
[0016] c)至少約40g/l的糖；
[0017]其中所述纖維素糖漿具有約lg/cm3至約2g/cm3的密度和在100°F(38°C)
[0018] 下小于500SSU的粘度。
[0019] 在另一方面，本發明提供一種用于制備農用組合物的方法，該方法包括使木質纖 維素糖漿與至少一種土壤調理物質結合，其中產生包含糖漿與調理物質的丸粒或顆粒。
[0020] 在又一方面，本發明提供一種用于調理土壤的方法，該方法包括將以上所述農用 組合物施用于土壤。
【具體實施方式】
[0021] 為了高度有效，通常將土壤調理物質制備為可分散并滲透到其所施用的土壤中的 粉末狀物質。然而，為了便于處理和施用，將粉末狀物質與粘結劑結合以形成丸粒或顆粒。 由采用木質纖維素生物質的發酵過程制得的糖漿可用作粉末狀土壤調理物質的粘結劑。
[0022] 以下定義和縮寫用于權利要求和說明書的解釋。
[0023] 如本文所用，術語"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其它變型旨在包 括非排他性的包括。例如，包含元素列表的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設備不必僅 限于那些元素，但可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制 品或設備固有的元素。此外，除非明確指明相反，"或"是指包含性的"或"而非排他性的 "或"。例如，條件A或B滿足下列任一項:A為真實的(或存在的)且B為虛假的（或不存在的），A 為虛假的(或不存在的)且B為真實的(或存在的），以及A和B均為真實的(或存在的）。
[0024] 在本發明的元素或組分前的不定冠詞"一個"和"一種"旨在為有關所述元素或組 分的實例（即出現)數量的非限制性。因此，應將"一個"或"一種"理解為包括一個或至少一 個，并且元素或組分的詞語單數形式也包括復數指代，除非有數字明顯表示單數。
[0025] 如本文所用，術語"發明"或"本發明"是非限制性術語，并且不旨在意指本發明的 任何單獨實施方案，而是涵蓋如本說明書和權利要求所述的所有可能的實施方案。
[0026] 如本文所用，用術語"約"修飾本發明的成分或反應物的量時是指數值量的變化， 它們可能發生在例如，典型的測量和用于制備濃縮液或實際使用溶液的液體處理程序中； 這些程序中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或實施方法的成分的純度的差異 中；等。術語"約"還涵蓋由于對于起因于特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同 的量。無論是否由術語"約"來修飾，權利要求包括量的等同量。在一個實施方案中，術語 "約"指在報告數值的10%以內，優選地在報告數值的5%以內。
[0027] 術語"可發酵糖"是指在發酵過程中能被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。
[0028] 術語"木質纖維素"是指包含木質素和纖維素兩者的組合物。木質纖維素材料也可 包含半纖維素。
[0029] 術語"纖維素"是指包含纖維素和附加組分(包括半纖維素)的組合物。
[0030] 術語"糖化"是指由多糖產生可發酵糖。
[0031] 術語"經預處理的生物質"是指在糖化之前已經過預處理的生物質。預處理可為物 理的、熱的或化學方法的形式以及它們的組合。
[0032] 術語"丁醇"是指異丁醇、1-丁醇、2-丁醇、或它們的組合。
[0033] 術語"木質纖維素生物質"是指任何木質纖維素材料，并且包括含有纖維素、半纖 維素、木質素、淀粉、寡糖和/或單糖的材料。生物質也可包含附加組分諸如蛋白質和/或脂 質。生物質可來源于單一來源，或者生物質可包含來源于多于一種來源的混合物；例如，生 物質可包含玉米棒和玉米秸桿的混合物，或草和葉片的混合物。木質纖維素生物質包括但 不限于生物能作物、農業殘余物、市政固體垃圾、工業固體垃圾、來自造紙的淤渣、庭院垃 圾、木材和林業垃圾。生物質的示例包括但不限于玉米棒、作物殘余物諸如玉米皮、玉米秸 桿、草(包括細葉芒）、小麥秸桿、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱植物材 料、大豆植物材料、由谷物的研磨或由生產過程中使用谷物獲得的組分(諸如DDGS:含可溶 物的干酒糟）、木質材料諸如樹、枝、根、木片、鋸末、灌木和灌叢、葉、蔬菜、水果、花、棕櫚空 果串和能源甘蔗。
[0034] 術語"能源甘蔗"是指培育用于產生能量的甘蔗。其因纖維百分比高于糖而被選 擇。
[0035] 術語"木質纖維素生物質水解產物"是指木質纖維素生物質糖化產生的產物。生物 質也可在糖化前進行預處理或預加工。
[0036] 術語"木質纖維素生物質水解產物發酵液"是指包含產物的發酵液，所述產物得自 包含木質纖維素生物質水解產物的培養基中的生物催化劑生長和生產。所述發酵液包含木 質纖維素生物質水解產物的成分，所述成分為沒有被生物催化劑消耗的，以及生物催化劑 本身和生物催化劑產生的產品。
[0037] 術語"漿料"是指不溶解的材料和液體的混合物。漿料還可包含高水平的溶解固 體。漿料的示例包括糖化液、發酵液和塔餾物。
[0038] 術語"全塔餾物"是指蒸餾的塔底物。所述全塔餾物包含高沸騰物和蒸餾進料流的 任何固體。全塔餾物是枯竭的發酵液的類型。
[0039] 術語"稀塔餾物"是指來自全塔餾物、發酵液、或產物枯竭的發酵液的固體/液體分 離的液體鎦分。
[0040] 術語"糖衆"指濃縮的產物，其由稀塔餾物去除水而產生，一般來講為蒸發。
[0041] 術語"目標產物"是指任何由發酵中的微生物生產宿主細胞生成的產物。目標產物 可為宿主細胞中遺傳工程的酶的途徑的產物或可由內源性途徑產生。典型的目標產物包括 但不限于:酸、醇、烷烴、烯烴、芳烴、醛、酮、生物聚合物、蛋白質、肽、氨基酸、維生素、抗生素 和藥物。
[0042] 術語"發酵"是指廣義地使用生物催化劑來產生目標產物。通常生物催化劑在發酵 液中利用發酵液中的碳源生長，并且通過其代謝產生目標產物。
[0043] "固體"是指可溶固體和不可溶固體。來自木質纖維素發酵過程的固體包含用于制 備水解產物培養基的木質纖維素生物質的殘余物。
[0044] 本文"揮發物"是指在引入熱的過程中將較大程度氣化的組分。通過確定嚴格受控 條件下由加熱至950°C所引起的重量損失來測量本文揮發物含量(如在ASTM D-3175中）。典 型的揮發物包括但不限于氫氣、氧氣、氮氣、乙酸以及一些碳和硫。
[0045] 本文"固定碳"是指通過將水分百分比、灰分百分比、和揮發物百分比相加，然后用 100減去該百分比得到的計算百分比。
[0046] "灰分"是根據ASTM D-3174,在受控條件下燃燒后剩余的殘余物的重量。
[0047]如木質纖維素糖漿組合物中所提及的"糖"意指單糖和可溶性低聚糖的總和。
[0048]本文"土壤調理物質"是指改善土壤的物理特性的物質，其可包括為植物提供營養 的能力。
[0049] 本發明的農用組合物包含木質纖維素糖漿和至少一種土壤調理物質。
[0050] 木質纖維素糖漿的制備和組合物
[0051] 本發明的木質纖維素糖漿作為來自于使用木質纖維素生物質的過程的聯產品而 產生，所述木質纖維素生物質作為可用作生物催化劑的碳源的可發酵糖的來源。生物催化 劑在發酵過程中利用糖產生目標產物。
[0052]為了從木質纖維素生物質產生可發酵糖，對生物質進行處理以釋放糖諸如來自于 生物質多糖的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。本領域技術人員可用任何已知的方法處理木質纖 維素生物質，在水解產物中產生可發酵糖。通常，所述生物質使用物理的、熱的和/或化學的 處理進行預處理，并酶解糖化。熱-化學預處理方法包括蒸汽噴發或使生物質溶脹以釋放糖 的方法(參見例如W02010113129;W02010113130)。也可以采用化學糖化。用于預處理生物質 的物理處理包括但不限于磨削、研磨和切割。諸如這些的物理處理可用于在進一步化學處 理前減小粒度。化學處理包括堿處理諸如用強堿（氨或NaOH)或酸處理（US8545633; W02012103220)。在一個實施方案中，用氨處理生物質（US 7932063;US 7781191;US 7998713 ;US7915017)。這些處理從生物質釋放聚合糖。低氨預處理是特別有用的，其中生物 質與包含氨的水溶液接觸，形成生物質-氨水混合物，其中氨的濃度足夠保持生物質-氨水 混合物的堿性pH，但相對于生物質的干重小于約12重量％，并且相對于生物質-氨水混合物 的重量，生物質的干重為至少約15重量％的固體，如US 7，932,063所公開的，其以引用方式 并入本文。
[0053]將聚合糖轉化為單糖的糖化可以通過酶處理或化學處理進行。在一個方面，使經 預處理的生物質與糖化酶聚生體在合適的條件下接觸，以產生可發酵糖。在糖化之前，可使 經預處理的生物質達到期望的含水量并對其進行處理以改變PH、組合物或溫度使得糖化酶 聚生體中的酶將有活性。可通過添加固體或液體形式的酸改變pH。另選地，可利用可從發酵 中回收的二氧化碳(C0 2)來降低pH。例如，如果存在足夠的液體，可從發酵罐中收集C02并將 其進料到閃蒸槽中的預處理產物頂部空間或起泡通過經預處理的生物質，同時監控PH，直 至達到所需的pH。可使溫度達到下文提到的與糖化酶活性相容的溫度。通常，合適的條件可 包括約40 °C至50 °C的溫度以及約4.8至5.8的pH。
[0054]纖維素或木質纖維素生物質的酶促糖化通常利用酶組合物或共混物來降解纖維 素和/或半纖維素并且產生包含糖諸如例如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的水解產物。糖化酶參 見 LyncUL.R.等人（"Microbiol .Mol .Biol .Rev.，66:506-577,2002)。使用至少一種酶，并且 通常使用糖化酶共混物，其包含一種或多種糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚 鍵，并且存在于廣義"水解酶"（EC 3.)的酶分類EC 3.2.1 .x(Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press，San Diego，CA，以及增補1 (1993)、增補2( 1994)中、增補3( 1995、增補4 (1997)和增補5[分別在Eur·J·Biochem·，223:l-5，1994 ;Eur·J·Biochem·，232:l-6，1995; Eur .J.Biochem.，237:1-5，1996 ;Eur · J.Biochem.，250:1-6，1997;以及Eur · J.Biochem."， 264:610-6501999中])中。可用于糖化的糖苷酶可通過它們水解的生物質組分進行分類。可 用于糖化的糖苷酶可包括纖維素水解糖苷酶(例如，纖維素酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖 酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶）、半纖維素水解糖苷酶（例如，木聚糖酶、內切木聚糖 酶、外切木聚糖酶、木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡 糖醛酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖 苷酶、異淀粉酶）。此外，將其它活性物質加入糖化酶聚生體(諸如肽酶(EC 3.4.xy)、脂肪酶 (EC 3.1.1.X和3.1.4.X)、木質素酶(EC 1.11.1.X)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73))中以促進 從生物質的其它組分中釋放多糖可為有用的。本領域熟知生產多糖水解酶的微生物常常表 現出某種活性，諸如降解纖維素的能力，該活性由具有不同底物特異性的若干種酶或一組 酶催化。因此，來自微生物的"纖維素酶"可包括一組酶、該組酶中的一種或多種酶或所有 酶，它們都可有助于纖維素降解活性。取決于獲取酶時利用的純化方案，商業或非商業酶制 劑(諸如纖維素酶)可包括多種酶。對于糖化有用的許多糖基水解酶和它們的組合物公開于 TO 2011/038019中。用于糖化的另外的酶包括例如糖基水解酶，其水解兩個或更多個碳水 化合物之間的糖苷鍵，或碳水化合物與非碳水化合物部分之間的糖苷鍵。
[0055]糖化酶可商購獲得。此類酶包括例如Spezyme" CP纖維素酶、Multifec.r木聚糖 酶、Acc.eleras.ef& 1500、Accdlerasel!DUET、.以及 Accellemse?Tr i〇TM(Dupont?/ Genencor'',Wi lmington，DE)，以及Novozyme_188(諾維信，2880Bagsvaerd，丹麥 (Novozymes，2880Bagsvaerd，Denmark))。此外，糖化酶可以是未經純化的并以細胞提取物 或全細胞制劑的形式提供。可使用已經工程化以表達一種或多種糖化酶的重組微生物來制 備所述酶。例如，可用于經預處理的纖維素類生物質的糖化的H3A蛋白質制劑是由里氏木霉 (Trichoderma reesei)的遺傳工程菌株生產的酶的未純化的制劑，其包括纖維素酶和半纖 維素酶的組合，并且描述于W0 2011/038019中，該文獻以引用方式并入本文。
[0056]可采用化學糖化處理并且其對于本領域的技術人員是已知的，諸如用無機酸包括 HC1 和 H2SO4 處理（US5580389;TO2011002660)。
[0057]通過木質纖維素生物質的糖化來釋放糖諸如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，并且這些 單糖提供用于生物催化劑(用于發酵過程)的碳水化合物源。糖存在于用作發酵培養基的生 物質水解產物中。發酵培養基可僅由水解產物構成，或可包含水解產物之外的組分，諸如山 梨醇或甘露糖醇，最終濃度為約5mM，如US 7，629，156中所述，其以引用方式并入本文。生物 質水解產物通常占發酵培養基的至少約50%。通常發酵液的終體積的約10%是包含生物催 化劑的種菌。
[0058]在發酵罐中發酵包含水解產物的培養基，所述發酵罐為容納水解產物發酵培養基 和至少一種生物催化劑并且具有閥門、通氣孔、和/或用于管理發酵過程的端口的任何容 器。
[0059] 天然地或通過基因工程利用葡萄糖且優選地還利用木糖生產目標產物的任何生 物催化劑可用于木質纖維素生物質制成的生物質水解產物中可發酵糖的發酵。可通過發酵 生產的目標產物包括例如酸、醇、烷烴、稀烴、芳烴、醛、酮、生物聚合物、蛋白質、肽、氨基酸、 維生素、抗生素和藥物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁 二醇、甘油、赤蘚醇、木糖醇、甘露糖醇和山梨醇。酸可包括乙酸、甲酸、乳酸、丙酸、3-羥基丙 酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、檸檬酸、琥珀酸、3-羥基丙酸、富馬酸、馬來酸和乙酰丙酸。氨基 酸可包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨 酸。附加的目標產物包括甲烷、乙烯、丙酮和工業酶。
[0060] 生物質水解產物中糖轉化為目標產物的發酵可通過一個或多個能夠在包含生物 質水解產物的培養基中生長的合適的生物催化劑在一步或多步發酵過程中進行。生物催化 劑可以是選自細菌、絲狀真菌和酵母的微生物。生物催化劑可為野生型微生物或重組微生 物，并且可包括例如屬于埃希氏菌屬(￡8(：1161'；[(31113)、發酵單胞菌屬(271]1011101^8)、酵母屬 (Saccharomyces)、假絲酵母屬（Candida)、畢赤酵母屬（Pichia)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、芽胞桿菌屬（Bacillus)、乳酸桿菌屬（Lactobacillus)和梭菌屬 (Clostridiuma)的生物體。通常，生物催化劑的典型示例包括重組大腸桿菌(Escherichia coli)、運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌（Bacillus stearothermophilus)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、嗜熱梭菌（Clostridia 1：1161'1]10。61111111)、高溫產氫菌（1'1161'1]10&11&61'0&&(^61'；[111118&(^11&1'0171：；[(311111)、以及樹干畢赤 酵母(Pichia stipitis)。為生長良好和在木質纖維素生物質水解產物發酵液中有高的產 物產量，可選擇或工程化生物催化劑以具有對生物質水解產物中存在的抑制劑諸如乙酸鹽 的更高的耐受性。例如，生物催化劑可產生作為目標產物的乙醇，諸如通過運動發酵單胞菌 產生乙醇，如在US 8,247,208中所描述，其以引用方式并入本文。
[0061] 發酵在適用于所用特定生物催化劑的條件下進行。可對條件諸如PH、溫度、氧含量 和混合進行調節。用于酵母和細菌生物催化劑的發酵的條件在本領域中是已知的。
[0062] 此外，糖化和發酵可在同一容器中同時發生，這稱為同步糖化和發酵(SSF)。此外， 在稱為HSF(混合糖化和發酵)的過程中，在糖化和發酵并發的時間段之前可發生局部糖化。
[0063] 對于較大規模的發酵，通常較少的生物催化劑培養物首先生長，其稱為種子培養 物。將種子培養物作為種菌添加至發酵培養基中，通常在約2%至約20%的終體積的范圍 內。
[0064] 通常通過生物催化劑發酵產生包含由生物催化劑制得的目標產物的發酵液。例 如，在乙醇方法中，發酵液可為包含約6%至約10%乙醇的發酵醪。除目標產物之外，發酵液 還包含水、溶質和固體，它們得自水解產物培養基以及得自水解產物培養基中糖的生物催 化劑代謝。通常使目標產物與發酵液分離，產生枯竭的發酵液(可稱為全塔餾物）。例如，當 乙醇為產物時，通常使用啤酒塔蒸餾發酵液，以產生乙醇產物流和全塔餾物。蒸餾可使用本 領域技術人員已知的任何條件，包括在大氣壓或減壓下。使餾出的乙醇進一步通過精餾塔 和分子篩以回收乙醇產物。可另選地在隨后步驟中去除目標產物，諸如在分離發酵液之后 從固體或液體鎦分中去除。
[0065] 木質纖維素生物質發酵過程的糖漿聯產品由發酵液或枯竭的發酵液制得。制備糖 漿的示例在US20120102823中公開，其以引用方式并入本文。發酵液或枯竭的發酵液，諸如 全塔餾物，分離為固體和液體流，其中液體流被稱為稀塔餾物。可使用多種過濾裝置，諸如 帶式過濾器、壓帶機、螺桿式壓縮機、轉鼓過濾器、碟式過濾器、Nutsche過濾器、壓力過濾機 和離心過濾器。可通過諸如施用真空、壓力或離心力輔助過濾。為了提高過濾的效率可使用 熱處理，如在共同擁有的和共同未決的US20120178976中所公開，其以引用方式并入本文。
[0066] 在對木質纖維素生物質水解產物發酵液或枯竭的發酵液進行液體/固體分離后， 固體部分或濾餅(也稱為濕餅)可以燃燒以為生產過程提供能量。所述濾餅可在燃燒前干 燥，諸如空氣干燥，以降低水分。
[0067] 在對木質纖維素生物質水解產物發酵液進行液體/固體分離后，去除產物流。例 如，液體流可萃取或蒸餾以產生產物流，諸如蒸餾產生乙醇產物流和剩余液體。
[0068] 液體鎦分通過蒸發而進一步純化以產生能回收的水和糖漿。在蒸發之前，液體鎦 分的一部分可回收作為渦流使用，其可添加到過程中需要水的任何一點，諸如在預處理、糖 化或生物催化劑種子制備中。蒸發可在任何蒸發系統中進行，諸如降膜、升膜、壓力環流、板 式或機械和熱蒸汽再壓縮系統。蒸發可為連續的或分批的，并可用多效蒸發器。蒸發的水可 循環用于木質纖維素生物質水解產物發酵總體過程。
[0069] 蒸發后剩余的物質是糖漿，其為本發明的木質纖維素糖漿。在一個實施方案中，木 質纖維素糖漿組合物包含約40%至約60 %固體或約40%至約70%固體（可具有約40%、 45%、50%、55%、60%、65%或70%固體），約1(^/1至3(^/1乙酰胺，至少約4(^/1的糖，約 lg/cm3至約2g/cm3的密度，以及在100°F(38°C)下小于500SSU的粘度。"SSU"是以秒計的賽波 特通用粘度(Burger VL.，Encycl · Ind.Chem.Anal · (1966)，第3卷，768-74)。可調制蒸發程 度來實現期望的固含量。當用于制備用于糖化的生物質的預處理過程是使用氨的過程時， 木質纖維素糖衆包含至少約5g/1的氨。
[0070] 土壤調理物質
[0071]將土壤調理物質與本發明的木質纖維素糖漿結合來產生本發明的農用組合物。土 壤調理物質是這樣一種物質：在將其施用于土壤時改善土壤的性質，使得植物生長和收率 中的至少一者增大。可改善的土壤性質包括但不限于PH、排水、提供植物營養素、土壤結構、 陽離子交換量和保水率。任何可混合的土壤調理物質可用于本發明。通常，使用的土壤調理 物質為顆粒物，并且為粉末狀、塵狀或顆粒狀。在一個實施方案中，土壤調理物質為粉末形 式。
[0072]在各種實施方案中，附加燃料組分為石灰或石膏。用于土壤應用的石灰通常為由 碳酸鈣制得的粉碎或研磨的石灰石。白堊是石灰石的一種形式，其為軟質白色多孔的沉積 巖。白云石石灰是一種包含碳酸鈣和碳酸鎂的石灰類型。石灰呈堿性并且用于中和酸性土 壤并且添加鈣，并且可添加鎂(如果使用白云石石灰的話）。石膏為水合硫酸鈣。石膏除去土 壤的鈉并且用鈣對其進行替換從而降低土壤的鹽度，并且通過與粘土中的鹽競爭來化學松 動粘土從而改善排水和植物根部的生長。
[0073] 農用組合物
[0074]本發明的農用組合物包含本文所述的木質纖維素糖漿和土壤調理物質，如上所 述。使木質纖維素糖漿與土壤調理物質以其中糖漿用作土壤調理物質的粘結劑的量結合， 土壤調理物質通常為粉碎或粉末狀的。在各種實施方案中，糖漿按糖漿與土壤調理物質的 最終結合的重量計為約2%至約20%。糖漿可為總合重量的約2%、3%、4%、5%、6%、7%、 8%、9%、10%、11 %、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20%。在各種實施方 案中，糖漿為糖漿與土壤調理物質的最終組合的約2%至20%，或約2%至10%，并且土壤調 理物質為石灰、石膏、或它們的組合。
[0075]在用于制備農用組合物的本發明方法中，使木質纖維素糖漿與土壤調理物質以約 1:50至約1:5的比率結合。木質纖維素糖漿與土壤調理物質的比率可為約1:50至1:6.7,或 約1:50至1:10。木質纖維素糖漿與土壤調理物質的組合形成便于處理的固體物質。可成形 為各種形狀，諸如丸粒、顆粒、不規則形狀等。在一個實施方案中，在轉鼓旋轉時，在轉鼓中 將糖漿噴灑到土壤調理物質上。在一個實施方案中，對木質纖維素糖漿和土壤調理物質組 合物進行干燥。另選的處理可包括諸如加熱、壓縮、擠出、粒化、模塑和/或干燥這些處理。
[0076] 農用組合物的用途
[0077]可通過本領域技術人員已知的任何方法將本發明的農用組合物施用于土壤。例 如，諸如對于草地護理或農田，可通過使用任何尺寸的常規撒肥機進行撒布來施用農用組 合物。農用組合物可在種植前耕入土壤中，在種植后進行施用，和/或在生長季節期間進行 周期性地施用。通常在施用前進行土壤測試以確定待施用于土壤的農用組合物的特定類型 和量。
[0078] 實施例
[0079] 本發明將在以下的實施例中進一步闡述。應該理解，這些實施例盡管說明了本發 明的優選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領域的技 術人員可確定本發明的必要特征，并且在不脫離本發明的實質和范圍內的前提下，可對本 發明進行各種變化和修改以適應多種用途和條件。
[0080] 所用縮寫的含義如下："S"是指秒，"min"是指分鐘，"h"或"hr"是指小時，"μΓ或"μ Γ是指微升，"mL"或"ml"是指毫升，"L"或Τ是指升，"m"是指米，"nm"是指納米，"mm"是指 毫米，"cm"是指厘米，"μπι"是指微米，"mM"是指毫摩爾每升，"M"是指摩爾，"mmol"是指毫摩 爾，Viole"是指微摩爾，"g"是指克，"yg"是指微克，"mg"是指毫克，"kg"是指千克，"rpm"是 指每分鐘轉數，"C"是指攝氏度，"ppm"是指份每一百萬份，"cP"是厘泊，"g/Γ意指克每升， "SSU"是以秒計的賽波特通用粘度，"wt%"是指重量％。
[0081] 一般方法:
[0082] 糖化酶
[0083] Accellerase?1500(A1500)和 Mllltifect? 木聚糖酶購自 Danisco U.S.Inc.， Genencor，International(Rochester，NY)〇
[0084] 纖維素酶和半纖維素酶生產菌株
[0085] 菌株229:里氏木霉菌株，來源于RL-P37(Sheir_Neiss and Montenecourt，1984， Appl.Microbiol.Biotechnol. 20:46-53)通過誘變和對高纖維素酶產量的選擇，采用PEG介 導轉化法與β-葡糖苷酶表達盒（cbhl啟動子，里氏木霉β-葡糖苷酶1基因，cbhl終止子和 amdS標記）和內切木聚糖酶表達盒（cbhl啟動子，里氏木霉xyn3和cbhl終止子）共轉化 (Penttila等人，1987，Gene 61(2) :155-64)。眾多的轉化體被分離出來并檢驗β-葡糖苷酶 和內切木聚糖酶產量。一個轉化體，稱為里氏木霉菌株229,被用于本文所述的某些研究中。 [0086] 菌株Η3Α:里氏木霉菌株229采用電穿孔法，與β-木糖苷酶Fv3A表達盒（cbhl啟動 子，Fv3A基因 ，cbh 1終止子和alsR標記）、β-木糖苷酶Fv43D表達盒(egl 1啟動子，Fv43D基因， 原生Fv43D終止子）以及Fv51Aa-阿拉伯呋喃糖酶表達盒(egll啟動子，Fv51A基因，Fv51A原 生終止子)共轉化。轉化體在包含氯嘧磺隆的Voge 1 s瓊脂平板上選擇。許多轉化體被分離出 來并檢驗木糖苷酶和L-a-阿拉伯呋喃糖酶產量。里氏木霉整合表達菌株H3A被分離出來， 其重組表達里氏木霉β-葡糖苷酶1、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv51A、以及Fv43D。
[0087]在菌株H3A發酵期間產生的細胞外蛋白通過離心從細胞群中分離出來，通過經由 1;[111口0^101^分子截留分子量膜進行的膜超濾進行濃縮，并將口!1調節至4.8。使用 Weichse 1 baum和Gorna 11修改的改性的縮二脲方法測定總蛋白，該方法使用牛血清白蛋白 作為校準物（Weichselbaum，1960，Amer.J.Clin.Path· 16:40;Gornall 等人， 1949J.Biol.Chem 177:752)。這種H3A細胞外蛋白制劑本文稱為H3A蛋白，它用作組合纖維 素酶和半纖維素酶制劑，在SSF期間影響絡合碳水化合物水解。
[0088] 生物催化劑和種菌制劑
[0089] 用于發酵的運動發酵單胞菌菌株的起源
[0090] 木質纖維素生物質水解產物發酵液可采用另選的生物催化劑產生。以下描述了示 例性菌株。作為替代方案，菌株ZW658，保藏號為ATCC#PTA-7858，可用于制備處理用的木質 纖維素生物質水解產物發酵液。
[0091] 運動發酵單胞菌菌株ZW705產自菌株ZW801-4,其采用US 8 247 208所述的方法， 其以引用方式并入本文，在此簡要重述。運動發酵單胞菌菌株ZW801-4的培養物生長在如下 的脅迫條件下。ZW801-4是運動發酵單胞菌的重組的木糖利用菌株，其描述于US 7,741， 119，其以引用方式并入本文。菌株ZW801-4來源于菌株ZW800，菌株ZW800來源于菌株ZW658， 它們均描述于US 7，741，119中。ZW658通過經由序貫轉座事件將兩個操縱子(PgapxylAB和 Pgaptaltkt)整合到ZW1(ATCC#31821)基因組中，然后通過包含木糖的選擇培養基改型進行 構建，所述操縱子包含四個編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮醇酶的木糖利用 基因。ZW658以ATCC#PTA-7858保藏。在ZW658中，使用宿主介導的基因雙交換同源重組和作 為選擇性標記的奇放線菌素抗性使編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶的基因插入失活以產生 ZW800。使用Cre重組酶，通過位點特異性重組移除由ΙοχΡ位點界定的奇放線菌素抗性標記 以產生ZW801-4。
[0092] ZW801-4的連續培養在250ml攪拌的、pH和溫度受控的發酵罐（Sixfors; Bottmingen，Switzer land)中進行。發酵基礎培養基是5g/L酵母提取物，15mM磷酸銨，lg/L 硫酸鎂，10mM山梨醇，50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通過在97天中逐漸提高加到上述連續培養 基中的乙酸銨濃度，同時保持通過特定稀釋速率測得的確定生長速率來影響在高濃度乙酸 和氨的存在下的適應生長。將乙酸銨濃度提升至160mM。通過加入磷酸銨至在連續培養139 天的末期最終總銨離子濃度為210mM來實現銨離子濃度的進一步提高。通過接種單菌落并 擴增一個選擇的菌落來從適應種群中分離菌株ZW705。
[0093] 菌株AR3 7-31產自菌株ZW705,通過進一步改型在玉米棒水解產物培養基中生長， 如U. S. 8，476，048所公開的，其以引用方式并入本文。ZW705生長于恒濁器中（US 6，686， 194;Heurisko USA，Inc ·Newark，DE)，其為連續流動培養裝置，其中培養物中的細胞濃度通 過控制培養基到培養物的流動而保持恒定，使得培養物的濁度保持在指定的狹窄限制內。 培養物在連續培養裝置中可利用兩種培養基生長，一種為靜息培養基(培養基A)，一種為刺 激培養基(培養基B)。培養物生長在生長室中的靜息培養基上到濁度設定點，然后以設定的 稀釋速率進行稀釋以保持細胞密度。通過每10分鐘加入一次限定體積的培養基來進行稀 釋。當恒濁器進入培養基刺激模式時，基于在前一次培養基添加后返回設定點的速率選擇 加入刺激培養基或靜息培養基。生長室中培養基的穩態濃度為培養基A和培養基B的混合； 根據從各個培養基提取的速率決定兩種培養基的比例，其為設定的稀釋速率以允許保持設 定的細胞密度。代表生長室中種群的細胞樣品以每周的間隔從恒濁器外流液中回收(在捕 獲室）。所述細胞樣品在MRM3G6培養基上生長一次并在-80°C作為甘油原液保存。
[0094] ZW705生長至一個任意濁度設定點，其表明培養物使用了輸入培養基中存在的全 部葡萄糖和大約一半的木糖，以在設定的稀釋速率下滿足細胞密度設定點。使用靜息培養 基以及刺激培養基，靜息培養基為50%的HYAc/YE和50 %的MRM3G6.5X4.5NH4Acl2.3，刺激 培養基為HYAc/YEj周后分離的菌株用于另一輪恒濁器改型，使用HYAc/YE作為靜息培養基 以及HYAc/YE加9重量％乙醇作為刺激培養基。菌株AR3 7-31在2周后分離，在水解產物培養 基中鑒定為一個具有提尚木糖和匍甸糖利用率以及提尚的乙醇廣量的菌株。通過序列分 析，發現AR3 7-31在運動發酵單胞菌基因組開放閱讀框中有一個突變，所述開放閱讀框編 碼具有膜轉運蛋白性質的蛋白，并注釋為編碼鐮刀菌酸抗性蛋白。
[0095] 培養基
[0096] 每升MRM3包含:酵母提取物（10g)、KH2P〇4 (2g)和MgS〇4 · 7H20 (1 g)。
[0097] MRM3G6包含的是MRM3，其包含60g/L葡萄糖。
[0098] MRM3G6 · 5X4 · 5NH4Ac 12 · 3是包含 65g/L 葡萄糖、45g/L 木糖、12 · 3g/L 乙酸銨的 MRM3。
[0099] HYAc/YE包含芯水解產物，固體通過離心從其去除并過濾滅菌，其包含68g//L葡萄 糖，46g/L木糖和5g/L乙酸鹽，補充有6.2g/L乙酸銨和0.5 %酵母提取物，調節至pH5.8。 [0100] 木質纖維素生物質處理和發酵
[0101] 將玉米秸桿研磨至3/8〃（0.95〇11)。在140°(：下用14%順3和65%固體預處理6011^11。 在47°C和pH 5.3下用7.8mg/g葡聚糖+木聚糖的酶聚生體糖化96小時。糖化酶為在如上所述 里氏木霉菌株H3A中表達的纖維素酶和半纖維素酶的混合物。所得的水解產物用于發酵。將 10mM山梨醇添加至水解產物中以制備發酵培養基，并將pH調節至5.8。
[0102] 對于種子，使第一冷凍菌株運動發酵單胞菌AR3 7-31原液在33°C下于MRM3G6 (10g/L BBL酵母提取物、2g/L KH2P〇4、lg/L MgS〇4*7H20、60g/L葡萄糖)上生長8小時而不搖 動，作為再生培養基。用再生培養基接種MRM3G10培養基（如同MRM3G6但具有100g/L葡萄 糖），并在搖動下于33°C孵育14-16小時。生長為1.5至3.1的OD600。使用整個培養基來接種種 子發酵罐至約0.05的初始OD 600。
[0103] 在lOg/1 酵母提取物、2g/L KH2P〇4、5g/L MgS〇4*7H20、10mM山梨醇和 150g/L葡萄糖 中進行種子發酵。在33°C和pH 5.5下進行種子發酵。在首次觀察到葡萄糖減少至小于50g/L 后收獲種子，使用YSI 2700SELECT?生物化學分析儀（YSI Life Sciences;Yellow Springs，0H)測定葡萄糖。
[0104] 在發酵罐中，將種子添加至水解產物培養基中。使發酵在30°c-33°c下進行48-72 小時。
[0105] 木質纖維素糖衆
[0106] 蒸餾發酵液以回收乙醇并過濾剩余的全塔餾物。使液體鎦分通過蒸發器以除去塔 頂水，并且產生糖漿。
[0107] 實施例1
[0108] 由研磨的石灰石和木質纖維素糖漿制備石灰石丸粒
[0109] 將開采自采石場(Weeping Water，Nebraska)的生石灰石碾磨成細粉并且氣動地 進料至轉鼓中。在轉鼓旋轉時，將由木質纖維素生物質乙醇制備過程制得的糖漿(參見一般 方法)噴入到填充有經研磨石灰石的轉鼓中。按照經研磨石灰石和糖漿的總重量的2重量％ 至10重量％來使用糖漿制備批次。將所得混合物進料至干燥器中并使所得丸粒冷卻并硬 化。使石灰石粉末在所得固體丸粒中保持在一起，幾乎沒有粉狀物質。
[0110] 實施例2
[0111] 由研磨的石膏和木質纖維素糖漿制備石膏丸粒
[0112]將開采自采石場(Fort Dodge，ΙΑ)的生石灰石碾磨成細粉并且氣動地進料至轉鼓 中。在轉鼓旋轉時，將由木質纖維素生物質乙醇制備過程制得的糖漿(參見一般方法)噴入 到填充有經研磨石膏的轉鼓中。按照經研磨石膏和糖漿的總重量的2重量％至10重量％來 使用糖漿制備批次。將所得混合物進料至干燥器中并使所得丸粒冷卻并硬化。使石膏粉末 在所得固體丸粒中保持在一起，幾乎沒有粉狀物質。
【主權項】
1. 一種農用組合物，所述農用組合物包含： a) 木質纖維素糖漿;和 b) 至少一種土壤調理物質。2. 根據權利要求1所述的農用組合物，其中所述糖漿是由木質纖維素生物質制備醇的 過程的聯產品。3. 根據權利要求1所述的農用組合物，其中所述糖漿包含： a) 約40 %至約70 %的固體； b) 約10g/l至約30g/l的乙酰胺;和 c) 至少約40g/l的糖； 其中所述纖維素糖衆具有約lg/cm3至約2g/cm3的密度和在100°F(38°C )下小于500SSU 的粘度。4. 根據權利要求2所述的農用組合物，其中所述由纖維素生物質制備醇的過程使用氨 來預處理所述木質纖維素生物質，并且所述糖漿包含至少約5g/l的氨。5. 根據權利要求2所述的農用組合物，其中所述木質纖維素生物質選自玉米棒、玉米秸 桿、草、小麥秸桿、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材 料、木本植物、蔬菜、水果、花、棕櫚空果串、以及能源甘蔗。6. 根據權利要求1所述的農用組合物，其中所述至少一種土壤調理物質選自石灰、石 膏、以及它們的組合。7. 根據權利要求1所述的農用組合物，其中所述至少一種土壤調理物質為粉末形式。8. 根據權利要求1所述的農用組合物，其中所述糖漿按所述組合物的重量計為約2%至 約 20 %。9. 根據權利要求1所述的農用組合物，其中所述組合物為丸粒或顆粒形式。10. -種用于制備農用組合物的方法，所述方法包括使根據權利要求1所述的木質纖維 素糖漿與至少一種土壤調理物質結合，其中產生包含所述糖漿和所述調理物質的丸粒或顆 粒。11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述糖漿是由木質纖維素生物質制備醇的過程 的聯廣品。12. 根據權利要求10所述的方法，其中所述糖漿包含： a) 約40 %至約70 %的固體； b) 約10g/l至約30g/l的乙酰胺;和 c) 至少約40g/l的糖； 其中所述纖維素糖衆具有約lg/cm3至約2g/cm3的密度和在100°F(38°C )下小于500SSU 的粘度。13. 根據權利要求10所述的方法，其中所述土壤調理物質選自石灰、石膏、或它們的組 合。14. 根據權利要求10所述的方法，其中在轉鼓中將所述糖漿噴灑到所述土壤調理物質 上。15. 根據權利要求10所述的方法，其中對所述丸粒或顆粒進行干燥。16. 根據權利要求10所述的方法，其中以約1:50至約1:5的比率使所述木質纖維素糖漿 與所述土壤調理物質結合。17.-種用于調理土壤的方法，所述方法包括將根據權利要求1所述的農用組合物施用 于土壤。
【文檔編號】C05G3/00GK105980336SQ201480067310
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年10月10日
【發明人】S.W.奧格勒, S.C.維拉卡斯, D.W.伍德
【申請人】納幕爾杜邦公司