專利名稱：生產l－谷氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及L-谷氨酸產生菌和使用該細菌通過發酵方法生產L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一種重要的食用、醫用氨基酸。
迄今，L-谷氨酸一直通過發酵方法生產，主要使用產L-谷氨酸的所謂棒狀細菌，它們屬于短桿菌屬或棒桿菌屬(氨基酸發酵，GakkaiShuppan Center，pp.195-215，1986)。作為這種棒狀細菌，從自然界中分離的野生型菌株和其突變體被用于提高產率。
另外，現在已經公開了多種提高L-谷氨酸生成能力的技術，它們通過重組DNA技術改進參與L-谷氨酸生物合成系統的酶的基因。例如，日本專利公開63-214189公開了通過改進谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶和檸檬酸合酶基因提高L-谷氨酸生成能力的技術。
另一方面，對L-蘇氨酸來說，已知可以使用破壞該氨基酸吸收系統的技術來增加該氨基酸的生成(Okamoto，K.et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，61(11)，1877-1882(1997))。
對于L-谷氨酸，已經揭示了谷氨酸棒桿菌中L-谷氨酸吸收系統的基因簇(gluABCD操縱子)的結構(Kronemeyer，W.et al.，J.Bacteriol.，177(5)，1152-1158(1995))。并且，Kronemeyer等構建了一種菌株，其中缺失了由gluABCD操縱子編碼的L-谷氨酸吸收系統，并使用該菌株研究了L-谷氨酸的分泌。在該研究中，他們認為谷氨酸棒桿菌的L-谷氨酸分泌不依賴于gluABCD，而依賴于其他吸收和分泌機制。此外，已經報導了不是由gluABCD編碼的一種L-谷氨酸吸收系統(Burkovski，A.etal.，FEMS Microbiology Letters，136，169-173(1996))。這些報導表明，即使在gluABCD操縱子編碼的L-谷氨酸吸收系統缺失時，培養基中L-谷氨酸的積累量也不受影響。因此，從未嘗試通過破壞gluABCD編碼的L-谷氨酸吸收系統來提高L-谷氨酸的生成能力。
本發明的目的是培育具有高的L-谷氨酸生成能力的細菌菌株，從而提供更有效的廉價生產L-谷氨酸的方法，以便滿足對L-谷氨酸日益增長的需要量。
為了實現上述目的，發明人進行了大量研究。結果發現，與上述現有技術的結論相反，一種gluABCD操縱子缺失的產L-谷氨酸棒狀細菌具有較高的L-谷氨酸生成能力，從而完成了本發明。
即，本發明提供(1)一種生產L-谷氨酸的方法，包括在培養基中培養具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌，在培養基中生成和積累L-谷氨酸，從培養基中收集L-谷氨酸，其中棒狀細菌中的L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低。(2)上述(1)的方法，L-谷氨酸吸收系統由gluABCD操縱子編碼。(3)上述(2)的方法，其中棒狀細菌中缺失了gluABCD操縱子的至少一種表達產物。(4)上述(3)的方法，其中棒狀細菌中至少缺失了gluA。(5)上述(4)的方法，其中棒狀細菌中gluA，gluB，gluC，gluD均缺失。
與傳統技術相比，本發明可以以較高的產率生產L-谷氨酸。
本發明中，“L-谷氨酸生成能力”是指本發明所用的棒狀細菌在培養基中培養時在培養基中積累L-谷氨酸的能力。
以下詳述本發明。
本發明的棒狀細菌是具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌，其中L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低。
在本發明中屬于棒桿菌屬的細菌是伯杰氏鑒定細菌學手冊第8版599頁(1974)中限定的一組微生物。這些細菌是好氣，革蘭氏陽性，不抗酸，不形成芽胞的桿菌，包括曾被分類為短桿菌屬但現在已歸入棒桿菌屬的細菌(國際系統細菌學雜志，41，255(1981))，并包括與棒桿菌屬密切相關、屬于短桿菌屬和微桿菌屬的細菌。用于生產L-谷氨酸的優選棒狀細菌的實例包括如下。
嗜乙酰乙酸棒桿菌醋谷棒桿菌Corynebacterium alkanolyticum美棒桿菌谷氨酸棒桿菌百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)Corynebacterium melassecola
Corynebacyerium thermoaminogenes力士棒桿菌Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)Brevibacterium immariophilum乳發酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌解糖短桿菌生硫短桿菌產氨短桿菌(產氨棒桿菌)Brevibacterium albumBrevibacterium cerinum嗜氨微桿菌具體而言，可舉出這些細菌的下列菌株嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，13032，13060百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868Brevibacterinm divaricatum(谷氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826，ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳發酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13655，ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產氨棒桿菌(產氨短桿菌)ATCC6871Brevibacterium album ATCC15111
Brevibacterium cerinum ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354棒狀細菌L-谷氨酸吸收系統的上述缺失或活性降低可以通過使用誘變處理或遺傳重組技術突變或破壞編碼吸收系統的基因來實現。“L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低”表示使吸收系統功能不正常，包括至少一種組成吸收系統的蛋白缺失或該蛋白的活性降低，兩種或多種蛋白缺失或活性降低。此外，“蛋白缺失”在本文中包括蛋白完全不表達和表達的蛋白功能不正常兩種情況。
編碼L-谷氨酸吸收系統的基因可以通過利用同源重組進行基因置換來破壞。棒狀細菌染色體上的基因通過以下方法來破壞用含有缺失了其內部序列的修飾基因(缺失型基因)的DNA轉化棒狀細菌，使缺失型基因和染色體上的正常基因之間發生重組，因而吸收系統功能不正常。這種利用同源重組的基因破壞技術是成熟的技術，在上述技術中已有利用線性DNA、含有溫度敏感型復制起點的質粒等的方法。優選利用含有溫度敏感型復制起點的質粒的方法。
作為編碼L-谷氨酸吸收系統的基因，gluABCD操縱子是已知的(Kronemeyer，W.et al.，J.Bateriol.，177(5)，1152-1158(1995))。并且，不是由gluABCD操縱子編碼的L-谷氨酸吸收系統也是已知的(Burkovski，A.et al.，FEMS Microbiol.Lett.136，169-173(1996))。盡管這些基因中的任一個都可以被破壞，優選由gluABCD操縱子編碼的吸收系統被破壞。
由于該操縱子的核苷酸序列是已知的(GenBank/EMBL/DDBJ登錄號X81191)，該操縱子或gluABCD操縱子中的每一個結構基因都可以使用基于核苷酸序列制備的引物通過PCR從棒狀細菌染色體中分離出來。可以利用一種或多種限制酶從獲得的基因片段中切除一定的區域，或者缺失編碼區或啟動子等表達調控序列的至少一部分，以制備缺失型基因。
此外，缺失型基因也可以通過PCR獲得，將引物設計成缺失基因的一部分。例如，使用具有序列表序列1和序列2所所示核苷酸序列的引物，可以獲得缺失了一部分5′序列的gluD基因。此外，使用具有序列3和序列4所示核苷酸序列的引物，可以獲得缺失了一部分3′序列的gluA基因。利用通過上述引物獲得的缺失型gluA或gluD基因進行基因置換，可以破壞gluA基因或gluD基因。并且，如果將這些缺失型gluA基因和缺失型gluD基因連接，將所獲得的融合基因用于基因置換，可以破壞gluA，gluB，gluC和gluD。此外，當使用含有gluA基因(使用具有序列3和序列5所示核苷酸序列的引物獲得)的質粒作為模板，具有序列6和序列7所示核苷酸序列的引物進行PCR，并且擴增產物環化時，可以獲得含有包括內部序列缺失和5′區和3′區框內連接的gluA基因的質粒。使用該質粒進行基因置換時，只有gluA基因被破壞。
并且，也可以通過本領域技術人員熟知的方法設計除上述實例以外的引物，使用這些引物破壞gluABCD操縱子中任何結構基因。或者，也可以通過缺失gluABCD操縱子的表達控制序列如啟動子使得基因無法表達，使吸收系統缺失。
盡管以下詳述的是gluABCD基因簇(以下稱為gluABCD基因)的基因置換，但任何結構或表達控制序列均可以類似方式缺失。
宿主染色體上的gluABCD基因可以用缺失型gluABCD基因取代，如下所述。即通過插入溫度敏感型復制起點、缺失型gluABCD基因和表達對藥物如氯霉素、四環素和鏈霉素抗性的標記基因構建重組DNA，用該重組DNA轉化棒狀細菌。然后在溫度敏感型復制起點沒有功能的溫度下培養轉化菌株，再在含有相應藥物的培養基中培養，獲得其中重組DNA已經整合到染色體DNA中的轉化菌株。
在這種菌株中，重組DNA如上所述整合到染色體中，引起本來位于染色體上的gluABCD基因序列的重組，染色體gluABCD基因和缺失型gluABCD基因的融合基因被插入到染色體中，在它們中間是重組DNA的其他部分(載體部分，溫度敏感型復制起點和藥物抗性標記)。因此，由于在這種狀態下，正常gluABCD基因占優勢，轉化子菌株表達L-谷氨酸吸收系統。
然后，為了在染色體上只留下缺失型gluABCD基因，通過兩個gluABCD基因的重組，從染色體DNA上消除一個拷貝的gluABCD基因和載體部分(包括所得敏感型復制起點和藥物抗性標記)。發生重組時，染色體DNA上可以留下正常gluABCD基因，缺失型gluABCD基因被切除，或染色體DNA上可以留下缺失型gluABCD基因，正常gluABCD基因被切除。在兩種情況下，如細胞在溫度敏感型復制起點有功能的溫度下培養，切除的DNA被保留在細胞內的質粒上。當細胞在溫度敏感型復制起點沒有功能的溫度下培養時，質粒上的這種DNA從細胞內消除。通過PCR、雜交等檢查染色體上的gluABCD基因結構，可以證實留在染色體DNA上的基因。
當這種gluABCD基因破壞的菌株在溫度敏感型復制起點有功能的溫度(如低溫)下培養時，gluABCD基因將會保留在細胞內。當它在溫度敏感型復制起點沒有功能的溫度(如高溫)下培養時，gluABCD基因將會從細胞中消除。
具有在棒狀細菌中有功能的溫度敏感型復制起點的質粒的實例包括pHS4，pHSC4，pHS22，pHSC22，pHS23，pHSC23(參見日本專利公開(Kokoku)7-108228)等。在棒狀細菌中的這些溫度敏感型質粒在約10到32℃的溫度下可以自主復制，但在約34℃或更高的溫度下不能自主復制。
如上所述破壞了染色體上的gluABCD基因后，優選基因破壞菌株中引入recA-，因為引入recA-可以防止低溫下培養時質粒上的gluABCD基因再次整合到染色體中。
本發明的棒狀細菌中，除了L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低外，催化L-谷氨酸生物合成的酶可以具有提高的活性。催化L-谷氨酸生物合成的酶的說明性實例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構酶等。
并且，在本發明的棒狀細菌中，通過從L-谷氨酸生物合成途徑分支催化產生非L-谷氨酸化合物的反應的酶可以減少或缺失。通過從L-谷氨酸生物合成途徑分支催化產生非L-谷氨酸化合物的反應的酶的說明性實例包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉移酶、乙酸激酶、乙酰羥肟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。
此外，通過向具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌中引入生物素活性抑制物如表面活性劑的熱敏突變，該細菌在生物素活性抑制物存在時在含有過量生物素的培養基中可以產生L-谷氨酸(參見WO 96/06180)。作為這種棒狀細菌，可以提到WO 96/06180中公開的乳發酵短桿菌AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在工業技術院生命工學工業技術研究所，保藏號為FERM P-14501。其后在1995年8月1日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-5189。
當具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌中L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低時，將其在合適的培養基中培養，培養基中可以積累L-谷氨酸。由于本發明的棒狀細菌中L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低，阻止了從細胞中分泌的L-谷氨酸再次被吸收進細胞中。因此，培養基中的L-谷氨酸積累量增加了。根據本發明的方法，當培養基中L-谷氨酸濃度高時，預期階段產率(interval yield)(一定的培養期間L-谷氨酸的積累量與糖的消耗量之比)會提高。具體來說，當使用發酵期間在培養基中積累高濃度L-谷氨酸的高產菌株時，可以獲得顯著的效果。
用來通過本發明的微生物生產L-谷氨酸的培養基是普通培養基，含有所需的碳源、氮源、無機鹽以及其他痕量有機營養等等。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等；醇，如乙醇、肌醇；或有機酸，如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸等。
氮源可以是無機銨鹽，如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，氨，有機氮，如胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿和大豆水解物，氨氣，氨水等。
加入的無機離子(或其來源)是少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。至于微量有機營養，需要以合適的量加入所需的物質如維生素B1、酵母提取物等。
優選通過振蕩、攪拌通氣在好氣條件下培養16到72小時。培養溫度控制在30℃到45℃，pH控制在5到9。可以加入無機或有機酸性或堿性物質、氨氣等調節pH。
從培養液中收集L-谷氨酸可以通過例如使用離子交換樹脂的方法、結晶等實現。具體來說，L-谷氨酸可以通過陰離子交換樹脂吸附或分離，或通過中和結晶。
圖1為破壞gluABCD基因的質粒pTΔAD的構建示意圖。
圖2為破壞gluA的質粒pTΔA的構建示意圖。
以下將參照具體實施例更具體地闡明本發明。
1.破壞gluABCD基因的質粒的構建為了使用溫度敏感型質粒通過同源重組創建gluABCD基因被破壞的棒狀細菌菌株，構建破壞gluABCD基因的質粒。
首先，通過克隆具有5′序列缺失的gluD基因并將其與具有3′序列缺失的gluA基因連接構建缺失型gluABCD基因。具體而言，由乳發酵短桿菌ATCC13869(棒狀細菌的野生型菌株)的染色體DNA，通過PCR擴增從gluD的BamHI位點到gluD下游約270bp的約300bp片段，使用具有序列1和2的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。該擴增片段用BamHI和XbaI消化，所得片段與BamHI和XbaI消化的pHSG299(TakaraShuzo)用T4連接酶(Takara Shuzo)連接，獲得質粒pHSGΔgluD。
然后，由乳發酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，通過PCR擴增從gluA上游約180bp的位點到gluA中的BamHI位點的約300bp片段，使用具有序列3和4的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。該擴增片段用BamHI和EcoRI消化，所得片段與BamHI和EcoRI消化的pHSGΔgluD用T4連接酶連接，獲得質粒pHSGΔgluAD。該質粒中缺失了gluB和gluC，部分gluA和gluD被連接在一起。
然后，為了使pHSGΔgluAD在棒狀細菌中自主復制，來源于在棒狀細菌中自主復制的質粒的溫度敏感型復制起點被引入到pHSGΔgluAD中的單一HincII酶切位點。具體而言，使用以下步驟。
含有溫度敏感型復制起點的質粒pHSC4(見日本專利公開(kokai)5-7491)用BamHI和KpnI消化。所得DNA片段的兩個末端用平端化試劑盒(Takara Shuzo)平端化，與KpnI接頭(Takara Shuzo)連接，然后使其自身連接獲得pKCT4。PHSC4是按以下方法獲得。即，含有復制起點的DNA片段被從質粒pAJ1844(見日本專利公開(kokai)58-216199)切除，該質粒具有來自pHM1519(K.Miwa et al.，Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)，日本專利公開(Kokai)58-77895)的復制起點，然后將片段與大腸桿菌質粒pHSG298連接，獲得穿梭載體pHK4。該pHK4質粒用羥胺處理，獲得修飾成溫度敏感型的質粒pHS4。該溫度敏感型復制起點被從pHS4中切除，連接到pHSG398獲得pHSC4。攜帶pHSC4的大腸桿菌AJ12571于1990年10月11日保藏在工業技術院生命工學工業技術研究所，保藏號為FERM P-11763。1991年8月26日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-3524。
如上所述制備的pKCT4中，來自pHM1519、被修飾成溫度敏感型的復制起點被插入pHSG399的KpnI位點。通過用KpnI消化pKCT4獲得含有溫度敏感型復制起點的片段，用平端化試劑盒(Takara Shuzo)平端化，然后與HincII消化的pHSGΔgluAD連接，獲得pTΔAD(圖1)。
2.破壞gluA基因的質粒的構建為了創建僅gluA基因被破壞的棒狀細菌菌株，構建破壞gluA基因的質粒。
由乳發酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA，通過PCR擴增含有gluA基因的約1500bp DNA片段，使用具有序列3和5的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。該擴增片段用EcoRI消化，然后與EcoRI消化的pHSG299(Takara Shuzo)用T4連接酶(Takara Shuzo)連接，獲得質粒pHSGgluA。
然后，通過PCR擴增除gluA基因內部區域以外的gluA基因的5′和3′區以及載體區段，使用具有序列6和7的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，pHSGgluA作為模板。上述引物被設計成含有BglII識別序列。該擴增片段用BglII消化，在T4連接酶存在時使其自身連接，獲得質粒pHSGΔgluA。該質粒含有gluA約730bp開放讀框中約250bp內部序列的缺失，并且其5′和3′區域框內連接在一起。
然后，為了使pHSGΔgluA在棒狀細菌中自主復制，來源于在棒狀細菌中自主復制的質粒的溫度敏感型復制起點被引入到pHSGΔgluA中的單一KpnI酶切位點。具體而言，用KpnI消化pKCT4，獲得含有復制起點的DNA片段，所獲得的片段被插入到pHSGΔgluA的KpnI位點，獲得pTΔA(圖2)。
3.創建gluABCD基因被破壞的菌株和gluA基因被破壞的菌株上述破壞基因的質粒pTΔAD和pTΔA被引入野生型菌株乳發酵短桿菌ATCC13869菌株，使用電脈沖法獲得ATCC13869/pTΔAD和ATCC13869/pTΔA。使用這些轉化菌株進行基因破壞。
具體而言，ATCC 13869/pTΔAD和ATCC 13869/pTΔA在CM2B肉湯中25℃下振蕩培養24小時，接種到含有25μg/ml卡那霉素的CM2B培養基中。34℃下形成菌落的菌株是導入了質粒的菌株，在該溫度下溫度敏感型復制起點沒有功能。然后，通過影印法獲得34°下對卡那霉素敏感的菌株。這些敏感菌株的染色體DNA以常規方式獲得。染色體上的gluABCD和gluA基因的結構通過PCR和測序檢查，證實這些基因已用缺失型基因取代，含有缺失型基因的菌株分別被稱為ΔAD菌株和ΔA菌株。
ΔAD菌株和ΔA菌株分別命名為AJ13587和AJ13588，于1999年3月23日保藏在工業技術院生命工學工業技術研究所(郵政編碼305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Tbaraki-ken，Japan)，保藏號分別為FERM P-17327和FERM P-17328，于2000年2月14日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，保藏號分別為FERM BP-7028和FERM BP-7029。
4.ΔAD菌株和ΔA菌株L-谷氨酸生成能力的評價生產L-谷氨酸的ΔAD菌株和ΔA菌株的培養如下進行。在CM2B平板培養基中復蘇的菌株在兩種培養基中于31.5℃下培養，一種培養基在1升去離子水(在pH8.0時用氫氧化鉀制備)中含有80克葡萄糖、1克磷酸二氫鉀、0.4克7水硫酸鎂、30克硫酸銨、0.01克7水硫酸鐵、0.01克7水硫酸錳、15毫升大豆水解物溶液、200微克鹽酸硫胺素、3微克生物素和50克碳酸鈣，一種培養基另外還含有50克/升L-谷氨酸。培養后，測定培養基中積累的L-谷氨酸量和培養基稀釋51倍后在620納米的稀釋值。未添加L-谷氨酸的培養基的結果見表1。添加了L-谷氨酸的培養基的結果見表2。
表1
表2
*產量中未包括加入培養基中的L-谷氨酸。
這些結果表明，培養基中含有高濃度的L-谷氨酸時，ΔAD菌株和ΔA菌株的L-谷氨酸的積累量和產率都提高了。并且，即使在不含L-谷氨酸的培養基中，ΔA菌株的L-谷氨酸產率也提高了。
序列表(110)Ajinomoto Co.，Inc.(120)生產L-谷氨酸的方法(130)OP948(141)2000-03-(150)JP11-81693(151)1999-03-25(160)7(170)PatentIn Ver.2.0(210)1(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)1gactggcagg atcctgatta taagg 25(210)2(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)2cgcgtctaga ggcgcttgag caaatcgacc30(210)3(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)3aggtgaattc cggacaggat cggagactac 30(210)4(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)4ttgacttgcc ggatccggat ggtcc 25(210)5(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)5tcatgaattc ctcaccgttt tgaatgaggg 30(210)6(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)6gatgagatct cgttccaaca ggctcatcgc 30(210)7(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述PCR引物(400)7aagcagatct tcgtgtgttg ttcatggcgg 30
權利要求
1.生產L-谷氨酸的方法，包括在培養基中培養具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌以便在培養基中產生和積累L-谷氨酸，由培養基中收集L-谷氨酸，其中棒狀細菌中的L-谷氨酸吸收系統缺失或活性降低。
2.權利要求1的方法，其中L-谷氨酸吸收系統由gluABCD操縱子編碼。
3.權利要求2的方法，其中棒狀細菌中缺失了gluABCD操縱子的至少一種表達產物。
4.權利要求3的方法，其中棒狀細菌中至少缺失了gluA。
5.權利要求4的方法，其中棒狀細菌中gluA、gluB、gluC和gluD均缺失。
全文摘要
本發明提供了更有效地生產L－谷氨酸的新方法,與常規方法比較費用更低,該方法包括在培養基中培養具有L－谷氨酸生成能力的棒狀細菌以便在培養基中產生和積累L－谷氨酸,然后由培養基中收集L－谷氨酸,其中所述棒狀細菌中的L－谷氨酸吸收系統缺失或活性降低。
文檔編號C07K14/345GK1271018SQ00104818
公開日2000年10月25日 申請日期2000年3月27日 優先權日1999年3月25日
發明者木村英一郎, 中松亙, 倉橋修, 大瀧博美 申請人:味之素株式會社