專利名稱：水稻蔗糖輸送基因啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及以植物維管束組織，特別是單子葉植物維管束組織，更特別是維管束韌皮部為靶基因系統，更具體地說，本發明涉及具有蔗糖輸送基因啟動子活性的堿基序列DNA、表達盒以及通過它們進行轉基因的轉基因植物。
背景技術：
眾所周知，一般地，植物維管束是用來運輸光合作用產物或水分的器官但是維管束不僅僅具有這些功能，最近有報道說，維管束在植物個體水平上與信息傳遞或植物形態的形成有關。目前已知存在于維管束組織內的蛋白質有蔗糖輸送蛋白(以下，簡稱“SUT”)。通常認為該SUT在高等植物中是具有運輸蔗糖(Sucorse)功能的膜蛋白，它通過與膜上的H+-ATPase偶聯使質子(H+)作為主動運輸的原動力從而進行蔗糖的主動運輸。
所述SUT基因已經在以雙子葉植物為主的多種植物中得到分離。從植物中分離得到SUT的最早報道植物為菠菜(Riesmeier JW，WillmitzerL，Frommer WB(1992)Isolation and characterization of a sucrose carrier cDNAfrom spinach by functional expression in yeast.EMBO J 114705-4713)。
目前已經在雙子葉植物如馬鈴薯，證實了經分離的SUT在維管束韌皮部具有特異性的表達(Riesmeier JW，Hirner B，Frommer WB(1993)Potatosucrose transporter expressionin minor indicates a role in phloem loading.PlantCell 51591-1598)。有報道說，大車前(Gahrtz M，Stolz J，Saner N(1994)A phloem-specific sucrose-H+symporter from Plantago major L.supports themodel of apoplastic phloem loading Plant J.6697-706)、鼠耳芥(Saner N，StolzJ(1994)SUC1 and SUC2two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana；expression and characterization in baker’s yeast and identification of thehistidine-tagged protein.Plant J 667-77)，后來又在擬南芥屬、番茄、豌豆等植物中的韌皮部證實了其特異性表達。
關于上面所述的雙子葉植物擬南芥屬植物的啟動子已經得到了分離，同時又用「啟動子GUS」以及「啟動子GFP轉化體」分析了表達系(TruernitE，Saner N(1995)The promoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+symporter gene directs expression of b-glucuronidase to the phloemEvidencefor phloem loading and unloading by SUC2.Planta 196564-570Imalau A.，Truernit E.，Sauer N.(1999)Cell-to-cell and long-distance trafficking of the greenfluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein intosink tissues.Plant Cell 11309-322)。
另一方面，單子葉植物的SUT基因最早是在水稻中分離得到的(HiroseT，Imazumi N，Scofield GN，Furbank RT，Ohsugi R(1997)cDNA cloning andtissue specific expression of a gene for sucrose transporter from rice(Oryzasativa L.).Plant Cell Physiol 381389-1396)。后來，又在玉米等中分離得到(Aoki N.，Hirose T.，Takabashi S.，Ono K.，Ishimaru K.，Ohsugi R.(1999)Molecular cloning and expression analysis of a gene for a sucrose transporter inmaize(Zea mays L.)Plant Cell Physiol.401072-1078)。
至此，單子葉植物中已經在韌皮部確認有SUT基因表達的只有水稻(Matsukura C.et al.，2000，Plant Physiol.12485-94)。另有一篇報道雖然不是關于SUT的報道，但是RPP13-1基因已經分離并與其啟動子共同顯示韌皮部特異性的表達(Ishiwatari Y，Fujiwara T，Mcfarland KC，Nemoto K，Hayashi H，Chino M，Lucas WJ(1998)Rice phloem thioredoxin h has thecapacity to mediate its own cell-to-cell transport through plasmodesmata.Planta20512-22)。
除上述外，未見關于SUT基因啟動子的報道，但是關于控制韌皮部特異性表達的啟動子有若干報道(美國專利第5,495,007號、德國專利第4,306,832號、國際公開公報WO93/04177、WO92/22582、WO91/09050、WO00/11197)。
發明內容
近年來，在植物轉基因技術中，不是要求有關傳統的所有組織或正常表達系統，而是要求利用組織、器官、生長發育期特異性啟動子進行基因表達的系統。尤其是以病原菌、病毒感染途徑的維管束組織作為靶子建立一種可利用的基因表達體系，并期待著這種體系的建立可成為一種強有力的技術手段進行改善例如，賦予抗病性、因轉基因而改變維管束運輸能力、改良植物株型等。
特別是在重要農作物中，例如水稻，建立以殺蟲蛋白、抗病毒蛋白質抗病蛋白質等目的基因的維管束為靶子建立特異性表達系統是極為有意義的，另外，不僅如此，還希望以改善維管束介導的運輸糖類環境為目的，使糖代謝(蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶等)-糖類運輸(SUT、H+-ATPase等)體系的蛋白質或編碼糖類信號傳遞因子的基因在維管束內特異性表達，或者除此以外，通過篩管運輸物質并表達特定蛋白質。
鑒于上述，在高等植物水稻中，研究控制啟動子特性并以維管束組織作為靶組織構建一種能夠表達所需的基因的基因表達系統是工業上極為重要的。但是，此前并沒有分離得到單子葉植物SUT基因的啟動子，且在單子葉植物中在維管束韌皮部很少報道關于特異性啟動子。
因此，本發明的目的就是從主要的單子葉植物維管束組織，尤其是水稻維管束組織中特異地，特別是在其韌皮部分離一種具有特異活性的啟動子。本發明的另一目的是，應用該SUT基因啟動子的調控特性，提供一種施以上述改進方法的轉基因植物。本發明更進一步地，提供轉基因植物的培育方法和用于該方法的表達載體及表達盒。
圖1表示包含OsSUT1啟動子的GUS表達載體的構建說明。
圖2表示水稻葉片-葉鞘的維管束走向狀態。圖2a表示水稻葉子維管束走向的模式圖，圖2b為圖2a的部分組織放大照片，而圖2c為在葉的橫切面上看到的橫向維管束的放大照片。
圖3為通過GUS染色法顯示的OsSUT1-promoter-1活性照片。圖3a為葉表面放大照片，圖3b為根的放大照片，圖3c為葉的橫切面的放大照片，圖3d為根的橫切面的放大照片。圖中，L、M、T以及cc分別表示大的維管束(縱向)、小的維管束(縱向)、橫向維管束以及韌皮部的伴胞。
圖4為通過GUS染色法顯示的OsSUT1-promoter-2活性的照片。圖4a為葉表面放大照片，圖4b為根的放大照片，圖4c為葉的橫切面的放大照片，圖4d為根的橫切面的放大照片。圖中，L、M以及T分別表示大的維管束(縱向)、小的維管束(縱向)和橫向維管束。
圖5為通過GUS染色法顯示的OsSUT1-promoter-3活性的照片。圖5a為葉表面放大照片，上圖表示GUS表達但沒有表達維管束特異性的個體，下圖表示沒有GUS表達的個體。圖5b為圖5a的葉橫切面的放大照片，圖5c為根的橫切面的放大照片。圖中，L、M以及T分別表示大的維管束(縱向)、小的維管束(縱向)和橫向維管束。
圖6為通過GUS染色法顯示的在OsSUT1-promoter-1抽穗期的節和節間的活性。圖6a為抽穗期的節的橫切面照片。圖6b以及圖6c各自為圖6a中節的部分放大照片。圖6d為抽穗期節間表面的放大照片，左圖為分化帶，中央為伸長帶，右圖為成熟帶。圖6e表示節間中的分化帶、伸長帶、成熟帶位置的模式圖。圖中，VB為維管束，P為韌皮部，X為木質部。
圖7為通過GUS染色法顯示的在OsSUT1-promoter-1開花期的花器活性。圖7a和圖7b分別為開花前包括穎片在內的花器放大照片，圖7c和圖7d分別為開花后包括穎片在內的花器的放大照片。圖7e表示花器構造的模式圖。圖中，L為漿片，P為雌蕊。
圖8為通過GUS染色法顯示的在OsSUT1-promoter-1開花、成熟期的花器活性照片。圖8a為開花前的柱頭，圖8b為開花后第3天的子房，圖8c為開花后第10天的果皮維管束，圖8d為開花前的柱頭縱切面，圖8e為開花后第3天的子房壁的橫切面，圖8f為開花后第10天的果皮維管束韌皮部的橫切面。
圖9下劃線表示OsSUT1-promoter-1在SEQ ID NO1中所對應的堿基序列的位置。
圖10下劃線表示OsSUT1-promoter-2在SEQ IDNO1中所對應的堿基序列的位置。
圖11下劃線表示OsSUT1-promoter-3在SEQ ID NO1中所對應的堿基序列的位置。
具體實施例方式
本發明人經過悉心研究，在水稻(Oryza sativa L.；葵之風品種)的基因組文庫中首次鑒定出具有OsSUT1基因啟動子活性的DNA并證實了該DNA的堿基序列，同時，發現了該啟動子可以把連接于該啟動子下游的結構基因特異性地在植物維管束韌皮部或者在花期維管束內表達，又成功地制備出在所述啟動子下游連接外源結構基因的表達盒和包含該表達盒的載體以及通過它們確確實實地培育出轉基因植物，進而完成本發明。
同時，本發明人還發現，上述堿基序列5′端部分缺失的話，則失去了韌皮部特異性在整個維管束組織中的表達，以及基因表達期的特異性也發生了變化。由此預示，OsSUT1基因啟動子在5′端和3′端具有不同的性質，利用其性質的差異，可以構建能夠調控表達部位以及表達時期的表達系統。
啟動子總之，本發明提供一種DNA，該DNA包含存在于序列表SEQ ID NO1所示堿基序列中的啟動子序列。本說明書中所述“啟動子”，一般表示位于結構基因轉錄起始點的上游并司管該基因表達的堿基序列，例如還包括增強子等轉錄調節序列。
OsSUT1-promoter-1更具體地說，存在于序列表SEQ ID NO1所示堿基序列中的第一啟動子命名為“OsSUT1-promoter-1”，即一種DNA，該DNA片斷由如下堿基序列所組成在SEQ ID NO1中自“第285位上的T乃至第296位上的G”至“第1088位上的G乃至第1403位上的C”之間的堿基序列；或者是上述堿基序列中自5′末端至第947位上的G中有部分缺失的堿基序列，所述DNA具有很強的位點特異性啟動子活性，所述位點以植物維管束韌皮部作為靶子。所述啟動子的活性不僅在綠葉或根部，在抽穗期-開花期的節或節間以及花器中都具有維管束韌皮部特異性和時期性的啟動子活性。
本發明進一步地提供一種DNA，該DNA在高度嚴謹條件下與OsSUT1-promoter-1雜交，實質上與啟動子活性相同，特別是在維管束韌皮部組織內特異地保持啟動子活性。
本發明又進一步提供一種DNA，該DNA由在OsSUT1-promoter-1堿基序列中有1個至數個堿基被插入、添加、缺失或取代的堿基序列所組成，它實質上與啟動子活性相同，特別是在維管束韌皮部組織內特異地保持啟動子活性。
本發明又進一步提供一種DNA，該DNA與OsSUT1-promoter-1堿基序列同源性高且與OsSUT1-promoter-1實質上具有相同的啟動子活性，特別是在維管束韌皮部組織內特異地保持啟動子活性。所述DNA堿基序列的同源性至少為80％、優選至少85％、再優選至少95％。同源性的％可以通過，例如Altschul等的Nucl.Acids.Res.25.，p.338％3402(1997)記載的BLAST程序進行確定。BLAST程序也可通過互聯網檢索得到。
OsSUT1-promoter-2存在于序列表SEQ ID NO1所示堿基序列中的第二啟動子命名為“OsSUT1-promoter-2”，即一種DNA，該DNA由SEQ ID NO1中的“第948位上的T至第1403位上的C”的堿基序列組成，該DNA片斷具有植物維管束組織特異性啟動子活性。所述啟動子雖然在韌皮部特異性很低，但仍保持植物維管束組織的特異的啟動子活性，例如在綠葉或根部的維管束韌皮部、木質部、維管束薄壁細胞里都具有特異的啟動子活性。尤其是所述啟動子的維管束組織特異性活性與上述的第一啟動子比較，很少依賴于植物的發育期和其器官。
本發明進一步提供一種DNA，該DNA在高度嚴謹條件下與OsSUT1-promoter-2雜交，實質上保持相同的啟動子活性，特別是在維管束組織內保持特異的啟動子活性。
本發明又進一步提供一種DNA，該DNA由在OsSUT1-promoter-2堿基序列中有1個至數個堿基被插入、添加、缺失或取代的堿基序列所組成，它實質上與啟動子活性相同，特別是在維管束組織內特異地保持啟動子活性。
本發明又進一步提供一種DNA，該DNA具有很高的OsSUT1-promoter-2堿基序列同源性且與OsSUT1-promoter-2實質上具有相同的啟動子活性，特別是在植物維管束組織內特異地保持啟動子活性。所述DNA堿基序列的同源性至少為80％、優選至少85％、再優選至少95％。同源性的％可以通過，例如Altschul等的Nucl.Acids.Res.25.，p.3389-3402(1997)記載的BLAST程序進行確定。BLAST程序也可通過互聯網檢索得到。
另外，SEQ ID NO1中的第1119～1125位的TATTATA推測為TATAbox。因此，在本發明實施方式中優選OsSUT1-promoter-1及OsSUT1-promoter-2都涵蓋到SEQ ID NO1中第1125位上A的前后。
啟動子的合成有關本發明的OsSUT1啟動子的分離、純化、克隆、表達載體的構建、植物細胞的轉化以及再生等除了本說明書公開的實施例以外，通過參照基因工程學中已知的技術對于本領域普通技術人員來說，都可以實施。其詳細的實驗方法參照本說明書中引用的文獻等對于本領域普通技術人員來說，很容易理解。
本發明具有OsSUT1啟動子活性的DNA一個例子可通過如下獲得。自單子葉植物，優選自禾本科植物(Oryza sativa L.)的DNA基因組文庫，以SEQ ID NO1所示的堿基序列的適當部分、包括該啟動子活性部分的全部或一部分作為探針，采用集落雜交等方法，可以進行篩選。目的DNA可以從菌落中篩選，該菌落包含與探針雜交的，例如約1000bp左右長的DNA片斷。
雜交條件為“高度嚴謹條件”，也就是說，在雜交緩沖液(0.5MNa2HPO4，7％SDS，1％聚乙烯吡咯烷酮)中溫度約至少為63℃，優選約至少為65℃。通過在這樣一種雜交條件下至少重復2次篩選，優選重復至少3次，即可得到與上述OsSUT1-promoter-1或OsSUT1-promoter-2堿基序列相同的啟動子或具有很高同源性的啟動子，例如至少85％、優選至少95％的堿基序列，并實質上具有相同的啟動子活性。
另外，為了獲得包括上述OsSUT1-promoter-1或OsSUT1-promoter-2堿基序列的1個至數個堿基被插入、添加、缺失或取代的DNA堿基序列，自OsSUT1-promoter-1或OsSUT1-promoter-2中，或者自兩者的同源性DNA中，例如根據定位誘變法很容易獲得。這種突變體也可通過定位誘變法以外的，本領域普通技術人員已知的任意方法進行誘變。
將得到的DNA片斷通過已知PCR法擴增，確定堿基序列，然后比較SEQ ID NO1的堿基序列，由此可以確認目的啟動子。
為了直接確認DNA片斷啟動子活性，在該啟動子的3′端下游連接報道基因，并制備含有該報道基因的表達載體從而導入植物細胞中。在轉基因植物中可檢測基因表達的報道基因包括鑒定既簡單又可定量的GUS、LacZ、Cat基因、還包括可以進行組織特異性鑒定的所述GUS和GFP基因等，它們可適用于公知的檢測方法。活性研究結果表明，所述DNA片斷明顯具有表達特異性時，DNA序列可用作“啟動子活性特定區的堿基序列”之一用于篩選以后所需的表達特異性。
表達盒和載體本發明具有啟動子活性的DNA依其啟動子活性，可與外源基因一起用作表達盒，所述外源基因應使維管束韌皮部、維管束或者器官或發育期特異性地表達。
所述「外源基因」，在上述維管束中，尤其在維管束韌皮部里只要在本發明啟動子活性的DNA的調控下能夠表達的，除了OsSUT1基因，任何基因均可，典型例子有在維管束中編碼具有定位特異表達功能的蛋白質的基因。優選外源基因著眼于維管束成為感染途徑的基因，該基因賦予植物抗病性蛋白質，特別是抗害蟲蛋白質，抗細菌蛋白質或者抗病毒蛋白質。側重于維管束組織形成對植物個體水平的形態形成具有重要作用，優選以整個維管束作為靶子控制草高和草株等的基因并使之表達。特別優選基因的例子可舉例為有關赤霉素信息傳遞的GAI基因。
本領域普通技術員均曉得在啟動子區3′端連接目的外源基因構建表達盒的方法。構建而成的表達盒在適當的載體(如pBSII或與其同類的載體)中擴增。擴增的表達盒，例如通過用于重組的中間載體依據同源重組方法可重組到植物細胞的基因組中。如此構建的表達盒可導入大腸桿菌中，使之擴增。再進一步把這些表達盒根據農桿菌和2種大腸桿菌(其中一種大腸桿菌保持有表達盒的特性)的3系雜交法導入到農桿菌內。
上述表達盒可適當地包含增強子序列、外源基因5′端以及3′端的非翻譯區等。也可包含用于篩選轉化體的標記基因。所述標記基因包括，抗抗生物質基因如四環素、氨芐青霉素或卡那霉素或新霉素、潮霉素、大觀霉素等，除此以外，螢光素酶基因、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)、β-乳胺酶、氯霉素乙酰基轉移酶(CAT)等。
向植物細胞內導入表達盒本發明提供一種轉基因植物，該植物在通過上述表達載體轉化的植物基因組上重組上述表達盒，依其啟動子活性在維管束組織內，尤其是在其韌皮部內可特異地表達外源基因。
向植物細胞基因組內導入使用上述表達盒的外源基因的方法無需特殊限定，例如包括農桿菌法、電穿孔法、PEG法、微注射法、粒子槍法等。優選農桿菌法。其具體方法已經在例如PCT國際公開公報(WO92/13957)上公開。這正如后面實施例所給出的一樣，應用農桿菌自然轉化，優選將包含表達盒的中間載體轉入農桿菌內，使該農桿菌感染植物，該轉導是通過接合操作等完成的。所述農桿菌感染植物的方法作為本領域普通技術人員均曉得，包括例如植物體的一部分創傷，使細菌感染創傷部位的方法、在植物體的胚組織(包括未成熟胚)里感染細菌的方法、感染愈傷組織的方法、原生質體和細菌共培養的方法或者將葉片組織與細菌共同培養的方法(葉盤轉化法)。
所得到的轉基因細胞可將適當的標記作為標記物或者通過是否表達為所需的性狀而從其它細胞中進行篩選。把轉基因的植物細胞在再生培養基中培養成為一個完整的植物個體的方法，公開在例如Y.Hiei et al.，Plant J.6.271-2821984文獻上。
利用本領域普通技術人員周知的方法可對獲得的轉基因植物進行分析。例如，以導入基因的DNA序列為模板合成寡核苷酸引物，將該引物進行PCR擴增可分析轉基因植物的染色體DNA。同時還可分析與導入基因對應的，mRNA，或有無蛋白質表達。也可以根據植物體的外觀(如當導入編碼能產生局部壞死斑的蛋白質的基因時，局部壞死斑的有無或者局部壞死斑的大小、數目等)、抗病性(如病原菌接觸時其有無抗性或者其抗性程度)等分析轉基因植物。
因此，通過示例可根據以下步驟將外源基因與本發明啟動子一起導入植物細胞的基因組中。
(a)提供本發明的啟動子；(b)在上述啟動子的下游連接所需的結構基因，根據需要，在該結構基因連接選擇標記基因從而制備表達盒；(c)根據農桿菌法、電穿孔法、PEG法、微注射法或粒子槍法將上述表達盒導入植物的基因組中；(d)通過選擇標記篩選被轉化的植物細胞，進行愈傷組織培養；(e)將形成的愈傷組織用再生培養基培養直到長成完整的植物個體；(f)根據需要，通過給形成的植物進行自花授粉或異花授粉進行雜交育種培育出純合型的轉基因植物品種。
另外，本說明書中所說的“轉化體”包括，通過本發明方法獲得重組植物細胞，再通過把該植物細胞再生而成的植物轉化體，和只要其特定的表達特異性能夠維持并從該轉化體得到的后代植物。本說明書中所說的“植物”又包括，除了特別說明外，均表示植物體(個體)，種子(包括發芽種子、未成熟種子)，器官或部分器官(如葉、根、莖、花、雄蕊、雌蕊、以及它們的一部分)，植物培養細胞，愈傷組織，原生質體。
發明效果本發明提供一種在高等植物中極其有用的啟動子活性的DNA或含有該DNA的表達盒，還提供在維管束表達系中從來沒有過的新型基因表達體系。
特別是，通過使用OsSUT1-promoter-1作為啟動子，能使目的基因中在維管束韌皮部內進行特異性表達。再有OsSUT1-promoter-1以繁殖發育期(抽穗、開花的生殖器官以及節間、節)的維管束韌皮部伴胞作為靶子可有效地用作基因啟動子。
再者，通過使用OsSUT1-promoter-2作為啟動子，無論是生長發育期還是器官中在維管束組織內都可進行特異性表達。依此活性在植物個體水平上以維管束作為靶子進行的表達，例如有效地改善維管束的運輸能力或改變草株等的表達體系作為目的。
還有，通過利用上述一系列啟動子，過去很難篩選維管束特異啟動子，而現在在維管束中可篩選出顯微組織特異性(如韌皮部或木質部·維管束薄壁細胞)或發育期特異性并表達目的基因。
本發明所說的“維管束”包括具有運輸光合作用產物或水分的通道器官的韌皮部(包含韌皮部伴胞或篩管液)以及木質部的維管束鞘(包含維管束薄壁細胞)，當然還包括支配水稻葉子走向的葉鞘或葉片等的縱向維管束以及橫向維管束，還包括開花期或成熟期的各種器官，例如穎片、雌蕊(柱頭)、花絲、漿片以及子房壁(果皮)等中存在的維管束(但在成熟初期，開花后3天左右在整個子房壁組織內均表達的)。所述“維管束特異性”是指，幾乎在上述維管束鞘內的特異性，優選啟動子在維管束內，特別是在韌皮部組織內的特異性。所述“發育期特異性”是指，節間伸長時的節或節間，抽穗或開花期以及成熟期的特定時期。當所述“發育期特異性”時，有時也指節或節間韌皮部的特異性或抽穗期或開花期的器官特異性，因此，同時兼備部位特異性和時期特異性的實施方式也包含在本說明書中所述的“表達特異性”中。
本發明啟動子具有上面所述的特征，通過殺蟲蛋白質、抗病毒蛋白質、抗病蛋白質等表達有效地賦予植物抗病蟲害性。為了改善維管束介導的糖類運輸環境，在維管束內，可有效地使編碼糖代謝(蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶等)·糖類運輸(SUT、H+-ATPase等)體系的蛋白質或編碼糖信息傳遞因子的基因進行特異性表達。另外，為了通過篩管輸送物質，在表達蛋白質時啟動子仍具有意義的。
實施例OsSUT1基因組克隆的分離用基因組DNA提取試劑盒·ISOPLANT(Nippon gene)分離純化水稻(Oryza sativa L.)“葵之風”品種綠葉的基因組DNA。用限制酶Sau3AI(Pharmacia)部分分解100μg的DNA。用異丙醇沉淀濃縮后，進行20-5％(W/V)NaCl連續密度梯度離心，分別進行少量分級。經瓊脂糖電泳確認每個級分的大小，將23-15kbp的DNA連接到λBlueSTAR載體(商品名Novagen)的XhoI位點上，用Gigapack Glod(商品名Stratagene)包裝混和物制備基因組文庫。用OsSUT1cDNA序列的一部分即BamHI-EcoRI片斷(814bp)作為探針，根據常規方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)Molecular cloningA laboratoory manual，second ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY)篩選基因組文庫，得到3個陽性克隆。用任意5種限制酶分別消化所述克隆，以OsSUT1cDNA序列的BamHI-EcoRI片斷(814bp)作為探針，進行DNA雜交分析。其結果是，分離得到顯示最強信號的EcoRI片斷(4kbp)作為OsSUT1結構區域片斷。當利用ABI PrismTMBigdyeTMTerminator Cycle Sequencing Kit及373ADNA Sequencer(均為Applied Biosystems；現PERKIN ELMER)確定這些堿基序列時，表明OsSUT1結構區5′端以及翻譯起始點作為起點包含其上游1403bp(參照圖9)。
用于研究OsSUT1啟動子活性的載體的構建通過利用在兩端設計含有限制酶序列的合成引物和Takara EX Taqpolymerase(商品名寶酒造株式會社)，根據PCR法擴增OsSUT1啟動子區。合成引物序列如下[正向引物]1.5′-TCGGCG GCC GCGATA TCG AAT TCG CTA GGC GT-3′(下劃線NotI限制位點)2.5′-AGCTCT AGAGTT GGC AGG TGC ACC ACC CTT-3′(下劃線XbaI限制位點)[反向引物]3.5′-CTGGGA TCCGCC ATG GCG GAC GCG CCA CG-3′(下劃線BamHI限制位點)
設翻譯起始點為起點·+1時，通過上述引物1和引物3獲得-1119～+14bp(1133bp)，通過上述引物2和引物3獲得-315～+14bp(329bp)的2條擴增片斷。用限制酶XbaI切割1133bp擴增片斷，得到包含翻譯起始點的-455～+14bp(496bp)片斷。將這3種片斷用以下所示的各接頭對應的限制酶進行切割。
DNA片斷11133bp片斷NotI及BamHIDNA片斷2469bp片斷BamHIDNA片斷3329bp片斷XbaI及BamHI如圖2所示，分別將上述3個擴增片斷插入pBSII載體的該限制酶切位點上，將SmaI和EcoRI切割的GUS-NOS基因片斷(來自pBI121)連接至其下游。然后，利用ABI PrismTMBigdyeTMTerminator Cycle Sequencing Kit及373A DNA Sequencer(均為Applied Biosystems；現PERKIN ELMER)解讀該3種啟動子序列的兩端以及與GUS結構區相連的連接部分的堿基序列。其結果是，兩端序列與上述基因組序列一致，證明目的序列得到擴增。而且與GUS結構區相連的連接部分沒有發現移碼等異常現象。
自經過重組每個DNA片斷和GUS結構區而擴增的載體，得到的轉錄啟動子控制區，包括上述DNA片斷1(1133bp)，該片斷自翻譯起始點至1108bp上游區作為OsSUT1-promoter-1(參照圖9)；上述DNA片斷2(469bp)自翻譯起始點至456bp上游區作為OsSUT1-promoter-2(參照圖10)；上述DNA片斷3(329bp)自翻譯起始點至306bp上游區作為OsSUT1-promoter-3(參照圖11)。
在包含DNA片斷1乃至3的載體中，用限制酶NotI、HindIII切下，把啟動子；GUS-NOS序列作為表達盒，并插入中間載體pSB100的該限制酶切點上。把這些載體導入到大腸桿菌系LE392，通過與農桿菌LBA4404/pSB4和大腸桿菌HB101/pRK2031的3系雜交法與引入農桿菌進行同源重組(Komari，T.等Plant J.(1996)10165-174)。
通過農桿菌法培育轉基因水稻根據農桿菌法，按照Hiei，Y.等(1994)Plant J，6271-282的報道進行日本水稻“朝之光”品種轉基因。將得到的轉基因植物個體在空調控制的溫室內(日照16個小時，白天為28℃，夜間為23℃)培育。
GUS染色植物轉化后，將愈傷組織在含有潮霉素(50g/ml)的N6培養基中培養、再分化4～5個星期，將篩選得到的轉化體用于GUS染色。將再分化的幼小植物個體培育至5～6片葉時，按照Kosugi，S等(Plant Science(1990)70133-140)報道的方法將葉子和根進行GUS染色。分析組織特異性表達的切片制作按照村上等(植物細胞工程學(1992)4281-286)的方法使用DTK-1000(堂阪EM)顯微鏡片。
通過染色分析啟動子的表達(參照圖2～圖7)分別選出轉導有OsSUT1-promoter-1～3的30個植物個體，進行GUS染色，并對該染色陽性的個體進行詳細地組織特異性觀察。如圖2所示，水稻維管束組織內在葉片和葉鞘之間包圍小的維管束的大維管束呈縱向走向，而在縱向維管束上如連接橫的方向上存在著橫向走向的維管束。在照片中，符號VB表示縱向維管束，符號L表示縱向維管束中的大的維管束(縱向)，而符號TV及符號T為橫向維管束，符號M為縱向維管束中的小的維管束。
如圖3所示，在OsSUT1-promoter-1個體里，觀察到綠葉維管束韌皮部的強表達。在照片上的縱向維管束M或橫向維管束T中通過其中心部的韌皮部被選擇性地染色，呈現出濃淡相間圖像。該現象的出現認為與OsSUT1cDNA探針的原位分析(Matsukura，C.等Plant Physiol.(2000)12485-94)的結果一致，反映出OsSUT1本身的表達。
另一方面，如圖4所示，在OsSUT1-promoter-2個體里，沒有觀察到像OsSUT1-promoter-1個體在每個維管束韌皮部和包圍韌皮部的木質部之間出現濃淡相間的情況，幾乎整個維管束都被染色。也就是說，在OsSUT1-promoter-2個體里，在OsSUT1-promoter-1的5′端缺失了652bp，由此判斷，雖然在綠葉和根的維管束鞘內(韌皮部、木質部、維管束薄壁細胞)看到表達，但已趨于失去韌皮部特異性的表達。
還有，在OsSUT1-promoter-3個體里，在OsSUT1-promoter-1的5′端缺失了802bp，全部呈GUS染色陽性的個體減少，如圖5所示，即使在顯示陽性個體中，整個葉鞘趨于染色，沒有觀察到維管束特異性。
另外，為了弄清發育期的特異性，將OsSUT1-promoter-1個體培養在花盆里，通過GUS染色分析開花前的表達。結果發現，OsSUT1-promoter-1在節間伸長期的節及節間的維管束韌皮部(圖6)，開花期的穎片、雌蕊(柱頭)、花絲、漿片的維管束(由于是顯微結構，在本分析中不可能識別出韌皮部和木質部)有明顯的表達(圖7、8)。另外，在成熟初期，觀察到了整個子房壁(開花后第3天，特別是上表皮和下表皮)、果皮維管束韌皮部(開花后10天前后)的表達(圖8)。在所述部位和時期顯示特異性表達的結果，與在northern印跡分析得到的結果(Hirose，T.等(1997)Plant Cell Physiol.381389-1396)相一致。
從上述結果可以得出以下結論。
(1)OsSUT1-promoter-1(-1108～-1)在維管束韌皮部具有很強的部位啟動子特異活性。除了綠葉之外，在抽穗～開花～成熟期間的節或節間、花器都具有維管束韌皮部特異啟動子活性和時期啟動子特異活性。
(2)OsSUT1-promoter-2(-456～-1)在綠葉、根中的整個維管束鞘，包括維管束韌皮部、木質部以及維管束薄壁細胞都具有特異表達的啟動子活性。在維管束中雖然維持了特異性，但因缺失-1108～-457的缺失而導致失去韌皮部的特異性。因此，預測在-1108～-457片段上存在著負責韌皮部表達的啟動子序列。還有，對韌皮部特異性、時期特異性的了解不深，若利用在整個維管束鞘內具有表達的傾向，則在維管束薄壁細胞及木質部可有效地控制基因的過剩或抑制表達。(3)OsSUT1-promoter-3(-306～-1)在維管束內沒有顯示特異性表達，由此可以認為，司管OsSUT1表達特異性的啟動子序列存在-1108～-307片段上。
利用上述啟動子構建表達體系為了表達編碼實際有用蛋白質的基因，可以重組編碼所需蛋白質的結構基因取代上述GUS-NOS序列。在這種情況下，也可以按照本領域普通技術人員周知的技術進行如上所述的各種DNA的擴增及篩選、表達盒或表達載體的構建、基因轉化及其再生等。
序列表<110>日本煙草產業株式會社(Japan Tobacco Inc.)<120>水稻蔗糖輸送基因啟動子<130>YCT-682<160>4<210>1<211>1440<212>DNA<213>水稻(0ryza sativa L.)<400>1tgcgcggtaa cccaccatca acctcgccgc ggctttaaat gcgccgctac agggcgcgtc 60ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 120attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 180gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat acgactcact 240atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata agcttgatat 300cgaattcgct aggcgtacac cgtgaatgat ttgatgcgtt gattacgggt attcatattc 360ctttatgaaa ggttattgtc agactttttt tattccacaa gatcgatcat actacaaagt 420tattctacaa tagtttagaa cacttatcca gttgtgttag aatataataa tgatggatgg 480atatgtatgc catattaaac aatctaaatt ccccacaaaa catataaaag aacactataa 540taaactatgg tttatccaac atggacatat atttaaatga agtgcgatct ccggtgctct 600ttactggtag gatgaatgat gatagagata aaagcgttta acaaatatgg cctcaagcga 660aattcgttat attaattaaa tcaatgaaaa catttactgg attaataaaa ctccatgcta 720ctccattata aatgaacgca cacctatata tagcaaaatt cctatttgcc agtaggtcca 780atacttcgga tctgtttttt tttcttttaa atatccaaaa ttgattttgg ataactactc 840gacagtacaa acgaattaaa ccagctatta caacgtcgag tggatttaaa acactcctct 900attaaattca cctacagaaa gtcgttcccg ctgaaataat cgcaccgtct agaagctcgg 960caagcgtgtc gctaatccga tactaactcc attaattcca ttttcatttc aataattgtt 1020gaagttatta ctgcactgga aataataaag gcaggggggt gtaactgggt gtgtacaaag 1080tgttggtgag catagcagtt ggcaggtgca ccacccttta ttatattcct cctttctctc 1140tctctctctc tctctctccc cctcttcctc cctttaaatg cttcgcctct ctcgctcgtc 1200tctccaaaca caaacccacc acctcctcct cctcctccca tccagcacgc gcctcctctc 1260tcgcgcggct ttccatttcc atctccccct cctcctccta cgtctccgcc gctcctcact 1320tcctccactc gatttccttt cttggcctct cctcctctga cacaggggtg tgcaggtttg 1380tgtttgtgcg tggcgcgtcc gccatggctc gcggcagcgg ggccggagga ggcggcggcg 1440<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>2tcggcggccg cgatatcgaa ttcgctaggc gt 32
<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3agctctagag ttggcaggtg caccaccctt 30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgggatccg ccatggcgga cgcgccacg 29
權利要求
1.一種DNA，它具有存在于序列表SEQ ID NO1所示堿基序列中的啟動子序列。
2.一種DNA，它由SEQ ID NO1自第285位上的T乃至第296位上的G到第1088位上的G乃至第1403位上的C的堿基序列組成，或者由在該堿基序列的5′末端至第953位上的A之間有部分缺失的堿基序列組成，并在植物維管束組織的韌皮部內具有特異性啟動子活性；或一種DNA，它在高度嚴謹條件下與上述DNA雜交，并在植物維管束組織的韌皮部內具有特異性啟動子活性。
3.一種DNA，它由SEQ ID NO1自第285位上的T乃至第296位上的G到第1088位上的G乃至第1403位上的C的堿基序列組成，其中有1個或數個堿基被插入、添加、缺失或取代，該DNA在植物維管束組織的韌皮部內具有特異性啟動子活性。
4.一種DNA，它由SEQ ID NO1自第285位上的T乃至第296位上的G到第1088位上的G乃至第1403位上的C的堿基序列組成，在該堿基序列的5′末端至第953位上的A之間有部分缺失，其中1個或數個堿基被插入、添加、缺失或取代，該DNA在植物維管束組織的韌皮部內具有特異性啟動子活性。
5.一種DNA，它由SEQ ID NO1自第953位上的A至第1403位上的C的堿基序列組成，并在植物維管束組織內具有特異性啟動子活性；或一種DNA，它在高度嚴謹條件下與上述DNA雜交，并在植物維管束組織內具有特異性啟動子活性。
6.一種DNA，它由SEQ ID NO1自第953位上的A至第1403位上的C的堿基序列組成，其中有1個或數個堿基被插入、添加、缺失或取代，該DNA在植物維管束組織內具有特異性啟動子活性。
7.一種表達盒，其包括如權利要求1至6中任一項所述的DNA和在該DNA下游連接的外源基因。
8.如權利要求7所述的表達盒，其中進一步包括用于篩選基因轉化體的標記基因。
9.一種用于轉基因的載體，其中包括如權利要求7或8所述的表達盒。
10.一種轉基因植物細胞、源自該細胞的愈傷組織、源自該愈傷組織的轉基因植物或者它們的后代，其中所述轉基因植物細胞是將如權利要求1至6中任一項所述的啟動子DNA以及在該DNA下游將連接的外源基因重組到基因組上，并在維管束組織的韌皮部或維管束系組織中特異性表達外源基因。
11.如權利要求10所述的轉基因植物細胞、源自該細胞的愈傷組織、源自該愈傷組織的轉基因植物或者它們的后代，它們均為單子葉植物。
12.一種培育轉基因植物的方法，其中所述植物在維管束組織的韌皮部或維管束系組織中可特異性表達外源基因，培育方法包括如下(a)提供如權利要求1至6中任一項所述的啟動子；(b)在上述啟動子的下游連接所需的結構基因，根據需要，再進一步在該結構基因之后連接選擇標記基因，以便制備表達盒；(c)通過農桿菌法、電穿孔法、PEG法、微注射法或粒子槍法將上述的表達盒引入植物基因組中；(d)通過選擇標記篩選轉基因的植物細胞，進行愈傷組織培養；(e)在再生培養基中培養所述愈傷組織直到長成完整的植物體。
全文摘要
本發明提供一種具有OsSUT1基因啟動子活性的DNA；并提供將該DNA用作啟動子并把所需外源基因在植物維管束或其韌皮部組織內可進行特異性表達的轉基因植物。在本發明中，通過水稻(Oryzasativa L.)基因組文庫分離出具有OsSUT1基因啟動子活性的DNA。在所述DNA中存在著能夠表達序列表SEQ ID NO1所示堿基序列的韌皮部特異性以及植物發育期特異性的啟動子序列。在該啟動子下游連接所需外源基因并進行基因組重組，使韌皮部或維管束組織特異性表達外源基因并培育出所需的轉基因植物。
文檔編號C07K14/415GK1492925SQ02805219
公開日2004年4月28日 申請日期2002年1月4日 優先權日2001年1月5日
發明者山口淳二, 松倉千昭, 武田泰斗, 斗, 昭 申請人:日本煙草產業株式會社, 欣根塔有限公司