專利名稱：特異性雜合啟動子控制組織表達的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，特別是基因表達調節的領域。本發明特別公開了用于基因定向強表達的新構建體和新載體。本發明可應用于許多領域，特別是用于生產重組蛋白、用于建立轉基因動物模型、用于建立細胞系、用于進行篩選試驗或用于細胞治療和基因治療。
能否調控和指導基因表達構成了生物技術發展中的很重要的賭注。體外，這允許利用特定細胞群改善重組蛋白生產的條件。在體外，該技術還使得能夠檢測或證明樣品中特定細胞群的存在，或檢驗某產品的特性或調節特定細胞群中的基因。基因表達的調控對于體內或離體基因治療也是很重要的，能否選擇性控制治療分子的生產在該療法中是至關重要的。實際上，根據不同的應用、根據待轉移的基因，能夠只定向于生物體的特定的組織或特定的部分以便集中療效、限制擴散和副作用是很重要的。
可以按不同的方法實現給定核酸的定向表達。第一種方法是例如利用具有給定細胞特定性的載體或轉移試劑。但由這種載體帶來的特異性一般相當粗放，不能定向于精確的細胞群。另一種方法是利用某種類型細胞特異的表達信號。對此，文獻中已報道了所謂的“特異性”啟動子，例如丙酮酸激酶、絨毛蛋白、GFAP編碼基因的啟動子，脂肪酸結合腸蛋白的啟動子，平滑肌細胞α肌動蛋白的啟動子，SM22啟動子，還有人白蛋白基因的啟動子。但是，如果說這些啟動子有組織特異性的話，它們的效力也相對較弱。例如，這些啟動子的大部分活性遠低于所謂的“強”啟動子，一般低至少10-100倍。另外，一般認為啟動子的特異性與其強度呈反比，強度越大，非特異性活性水平也越大。
因此，提供對組織特異而又強的啟動子是特別有利的。本發明的目的應是提供用于基因定向強表達的新構建體。
本發明特別公開了用于對平滑肌細胞特異的強基因表達的新的嵌合啟動子。本發明還公開了含有這種啟動子的載體和它們在體內、離體和體外向細胞轉移基因中的應用。本發明的構建體第一次允許將相反的特性結合起來，即高選擇性和高轉錄活性。因此，本發明提供了一種用于體內或體外在平滑肌細胞中定向基因表達并調節這種表達的特別有效的手段。
本發明更具體地在于構建了含有不同來源和功能之區域的嵌合(雜合)啟動子。更具體地講，本發明的第一個目的在于一種雜合啟動子，其包含-一種遍在型強啟動子/增強子的增強子區的全部或部分，和-允許在平滑肌細胞中特異性表達的啟動子區。
在現有技術中已報道過增強子區和啟動子區的聯合。例如，已知將CMV的增強子區與非特異性啟動子如雞β肌動蛋白基因的啟動子偶聯(WO96/13597)以提高它們的效力。但沒有描述或暗示這種構建體是用于試圖獲得在平滑肌細胞中特異性強表達的目的。本發明部分基于對特定“增強子”元件和特定“啟動子”元件的選擇和組合。本發明還基于證明了這種元件的組合能夠獲得高水平的表達，而不影響啟動子對平滑肌細胞的選擇性。本發明從而提供了特別有利的構建體，因為它們允許在平滑肌細胞中定向高水平生產一些分子。另外，本申請還證明這些構建體可用于體外也可用于體內。
在本發明的雜合啟動子中，增強子區和啟動子區功能性連接，即使得增強子區發揮對啟動子區活性的刺激作用。一般這兩個區域以遺傳工程方式連接，并且互相足夠接近以便增強子區能活化啟動子區。優選地，增強子區和啟動子區間的間距小于1kb，更優選小于500bp。在本發明特別優選的構建體中，這兩個區域的間距小于400bp，優選小于200bp。另外，如實施例中所示，兩個區域各自的方向不顯著影響本發明雜合啟動子的活性。因此，增強子區可以以相對啟動子區轉錄方向相同或相反的方向定位。
在一個優選的實施方案中，增強子區選自巨細胞病毒立即早期基因(CMV-IE)的增強子區、勞斯肉瘤病毒LTR(LTR-RSV)的增強子區、SV40病毒的增強子區、EF1α基因的增強子區。更優選地，在本發明的雜合啟動子中，增強子區是巨細胞病毒立即早期基因(CMV-IE)的增強子區，優選人巨細胞病毒的(hCMV-IE)。特定的增強子區例如由hCMV-IE基因的-522至-63片段構成，或由含該區至少一部分并具有增強子活性的任何片段構成。
至于啟動子區，為實施本發明有利地利用包含平滑肌細胞α-肌動蛋白編碼基因(SMact)啟動子或SM22基因啟動子全部或部分的區域。這些基因的啟動子對平滑肌細胞的特異性已有報道(特別見Ueyama H.等，Mol.Cell.Biol.，4(1984)1073-1078；SolwayJ.等，J.Biol.Chem.，270(1995)13460-13469)。
本發明第一個特別有利的方案由如下雜合啟動子構成，其包含-人巨細胞病毒立即早期基因(hCMV-IE)增強子區的全部或部分，及-平滑肌細胞α-肌動蛋白(SMact)編碼基因的、優選人Smact基因的啟動子全部或部分。
本發明第二個特別有利的方案由如下雜合啟動子構成，其包含-人巨細胞病毒立即早期基因(hCMV-IE)增強子區的全部或部分，及-SM22基因的、優選小鼠SM22α基因的啟動子全部或部分。
另外，在本發明的一個具體實施方案中，所用的啟動子區是含有基礎啟動子和帶來組織特異性之序列的嵌合區，所述序列來自SMact啟動子或SM22啟動子，或來自兩者。在此實施方案中，基礎啟動子可以是“最小”啟動子，即只含有啟動子轉錄活性必需的序列(如TATA盒)。該基礎啟動子可以是SMact或SM22基因的基礎啟動子本身，或者是異源的(如β-球蛋白、HSV-TK、SV40或EF1-α)。帶來組織特異性的序列有利地包含SMact啟動子序列(R.T.Shimizu等，J.Biol.Chem.270(1995)7634-7643)和/或SM22啟動子(L.Li等，J.Cell.Biol.132(1996)849-859；S.Kim等，J.Clin.Invest.100(1997)1006-1014；Kemp等，Bochen.J.310(1995)1037-1043)的一部分。
本發明雜合啟動子的一種具體類型包含-遍在型強啟動子/增強子的增強子區全部或部分，-基礎啟動子，和-含有SMact和/或SM22啟動子全部或部分的帶來組織特異性的序列。
為了構建本發明的雜合啟動子，可利用本領域技術人員已知的分子生物學技術。例如，增強子區和啟動子區(包括基礎啟動子和帶來組織特異性的序列)可按常規方法從核酸文庫或從全細胞DNA分離得到，例如通過用特異性探針擴增。這些片段還可以利用現有技術中現有的序列信息進行人工合成。當得到這些片段后，可利用連接酶或其他限制酶很容易在其之間連接，以產生本發明的雜合啟動子。另外，這些片段還可以經消化、突變、插入或添加堿基對而被修飾，以便于其克隆、或改變其功能特性。另外，如前所述，這些片段之間可以直接連接，或被不顯著影響雜合啟動子活性的堿基對間隔。
本發明的雜合啟動子具有在平滑肌細胞中特異性表達目的核酸的能力。表達的“特異”性指在平滑肌細胞中的啟動子活性顯著高出許多。雖然可能在其他細胞中存在非特異性表達，但相應的活性水平與在平滑肌細胞中觀察到的水平相比一般很低(可忽略)，一般低至少10倍。在實施例中給出的結果表明，表達差異可達140倍，這證明了本發明啟動子的強選擇性。對此，給出的結果還顯示對于平滑肌細胞的高特異性，因為在血管、尤其是動脈中與其相鄰的上皮細胞中沒有檢測到任何表達。實施例給出的結果還證明本發明啟動子的效力遠高于非雜合的特異性啟動子的效力，差異可達100倍以上。因此，這些因素說明了本發明雜合啟動子對于在平滑肌細胞中表達目標核酸在效力和特異性方面的出人意料的有利特性。
對此，本發明的另一個目標涉及含有處于上述雜合啟動子控制下的編碼目標RNA或多肽的核酸的表達盒。有利地，本發明的表達盒還含有處于核酸3’端的轉錄終止信號。
考慮到本發明表達盒所定向的細胞群，所述核酸可編碼例如選自如下的蛋白-細胞周期相關蛋白，如p21或任何其他細胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)抑制性蛋白，成視網膜細胞瘤(Rb)基因的產物，GAX，GAS-1，GAS-3，GAS-6，Gddd45，Gadd153，細胞周期蛋白A、B和D。
-誘導細胞凋亡的蛋白，如p53，細胞凋亡誘導蛋白家族的成員如Bas、Bcl-X6、Bad或Bcl2和Bcl-X1的任何其拮抗劑。
-能夠改變平滑肌細胞增殖的蛋白，如抑制參與細胞增殖之蛋白活性的細胞內抗體或ScFv，例如Ras蛋白，map激酶，或酪氨酸激酶受體或生長因子受體。
-用于進行增殖研究或診斷研究的標志蛋白(LacZ、GFP、Luc、分泌型堿性磷酸酶(SeAP)、生長激素(GH)等)。
-誘導血管生成的蛋白，如VEGF家族的成員，FGF家族的成員、特別是FGF1、FGF2、FGF4、FGF5，血管生成素，EGF，TGFα，TGFβ，TNFα，Scatter因子/HGF，血管形成蛋白(angiopoetine)家族的成員，細胞因子、特別是包括IL-1、IL-2、IL-8的白細胞介素，血管緊張肽-2，血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)，尿激酶(uPA)，參與活性脂合成的分子(前列腺素，Cox-1)。
-轉錄因子，例如含有DNA結合域、配體結合域和轉錄活化或抑制域的天然或嵌合的核受體，如融合蛋白tetR-NLS-VP16，來自雌激素受體的融合蛋白，來自類固醇激素受體的融合蛋白，來自孕激素受體的融合蛋白，Rivera等描述的CID系統(二聚化的化學誘導物)的蛋白(Rivera等(1996)，基因表達藥物控制的人源化系統，自然醫學(Nature Modecine)，21028-1032)。
應理解，本發明不限于這些蛋白或RNA的具體實例，本領域技術人員可利用本發明通過簡單的常規實驗操作在平滑肌細胞中表達任何核酸。
本發明的另一目的還涉及含有上述雜合啟動子或表達盒的任何載體。本發明的載體例如可以是質粒、粘粒或任何不被病毒衣殼化的DNA、噬菌體、人工染色體、重組病毒等，優選質或重組病毒。
在質粒型載體中，可以舉出本領域技術人員已知的一般帶有復制起點的克隆和/或表達質粒。還可以提到帶有例如按專利申請WO96/26270和PCT/FR96/01414中所述改進的復制起點和/或標記的新制備的質粒。
在重組病毒型載體中，優選重組腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒或腺伴隨病毒。這種類型的復制缺陷性重組病毒的構建在文獻中有大量報道，這些病毒的感染特性也是如此(特別見S.Baeck和K.L.March(1998)，Circul.Research vol.82，pp295-305)，T.Shenk，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等(1996)，腺病毒科病毒和其復制(病毒學)(Adenoviridaethe viruses andtheir replication(in virology))，pp211-2148，EDS-Ravenspublishers/Philadelphia，P.Yeh&M.Perricaudet(1997)，FASEB Vol.11，pp615-623。
用于實施本發明的特別優選的重組病毒是缺陷型重組腺病毒。
腺病毒是長約36kb(千堿基)的線性雙鏈DNA病毒，存在不同的血清型，其結構和特性略有不同，但具有相似的基因結構。更具體地講，重組腺病毒可以來自人或動物。對于人源的腺病毒，優選歸入C組的那些，特別是2型(Ad2)、5型(Ad5)、7型(Ad7)或12型(Ad12)腺病毒。在動物來源的各種腺病毒中，優選狗來源的腺病毒，特別是CAV2腺病毒的所有株[例如manhattan株或A26/61株(ATCC VR-800)]。在專利申請WO94/26914(引入本文作為參考)特別列舉了動物來源的其他腺病毒。
腺病毒基因組特別包含每個末端的反向重復序列(ITR)、衣殼化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。已知主要的早期基因處于E1、E2、E3和E4區中。其中，E1區中已知的基因尤其對病毒繁殖是必需的。已知主要晚期基因處于L1至L5區中。Ad5腺病毒的基因組已完全測序并可以在數據序中得到(特別見Genebank M73260)。其它腺病毒基因組(Ad2、Ad7、Ad12等)的部分甚至全部也已被測序。
為了作為重組載體，已制備了來自腺病毒的不同構建體，其含有各種治療基因。每種這些構建體中，腺病毒被修飾，使其不能在被感染細胞中復制。因此，現有技術中描述的構建體是E1區(為病毒復制所必需)缺失并在該部位插入了外源DNA序列的腺病毒(Levrero等，Gene 101(1991)195；Gosh-Choudhury等，Gene 50(1986)161)。另外，為了改善載體的特性，已提出在腺病毒基因組中建立其他缺失或修飾。例如，已在ts125變體中引入了一個熱穩定性點突變，使得72kDa的DNA結合蛋白(DBP)失活(Van der Vliet等，1975)。另一些載體在另一病毒復制和/或繁殖必需區即E4區中有缺失。E4區參與晚期基因表達的調節、晚期核RNA的穩定性、消除宿主細胞蛋白的表達和病毒DNA復制的效率。因此E1和E4區都缺失的腺病毒載體的病毒基因轉錄和表達的基底噪音很小。在例如專利申請WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中描述了這樣的載體。另外，在IVa2基因上有修飾的載體也有報道(WO96/10088)。
在本發明的一個優選實施方案中，重組腺病毒是C組人腺病毒，更優選腺病毒Ad2或Ad5。
本發明所用的重組腺病毒最好在其基因組中有E1區中的缺失，更優選缺失E1a和E1b區。作為一個具體的實例，可以缺失454-3328、382-3446或357-4020核苷酸(參照Ad5基因組)。
按照一種優選方案，本發明所用的重組腺病毒在其基因組中還有E4區中的缺失。優選該E4區中的缺失影響整個開放讀碼框架。例如具體的缺失可以是33466-35535或33093-35535。專利中請WO95/02697和WO96/22378(引入本文作為參考)中描述了E4區中的其他缺失。
表達盒可以插入在重組基因組的不同位點上，可插入在E1、E3或E4區中，替換缺失序列或添加在其中。也可以插入在病毒生產順式必需序列(ITR序列和衣殼化序列)之外的任何其他位點。
在衣殼化細胞系中生產重組腺病毒，即能夠反式補充重組腺病毒基因組一個或多個缺陷功能的細胞系。在本領域技術人員已知的衣殼化細胞系中，例如可提到293細胞系，其中已整合了腺病毒基因組的一部分。更具體地講，293細胞系是人胎腎細胞系，其含有腺病毒血清型5(Ad5)基因組左端(約11-12％)，包括左側ITR、衣殼化區、E1區(包括E1a和E1b)、pIX蛋白的編碼區和pIVa2蛋白的部分編碼區。該細胞系能夠反式補充E1區缺陷的重組腺病毒(即缺少E1區全部或部分)，并產生高滴度病毒原種。該細胞系在允許的溫度(32℃)下還能夠生產另外含熱穩定性E2突變的病毒原種。其他一些能夠補充E1區的細胞系也有報道，特別是基于人肺癌細胞A549的(WO94/28152)或基于人成視網膜細胞的(Hum.Gen.Ther.(1996)215)。另外也報道過能夠反式補充多種腺病毒功能的細胞系。具體可以舉出補充E1和E4區的細胞系(Yeh等，J.Viol.Vol.70(1996)，pp559-565；Cancer Gen.Ther.2(1995)322；Krougliak等，Hum.Gen.Ther.6(1995)1575)和補充E1和E2的細胞系(WO94/28152，WO95/02697，WO95/27071)。
重組腺病毒一般通過在衣殼化系中引入病毒DNA，然后約2-3后(腺病毒動力學周期為24-36小時)溶解細胞而產生。為了實施這一方法，引入的病毒DNA可以是轉染在細胞中的、任選地在細菌(WO96/25506)或在酶母(WO95/03400)中構建的、完全的重組病毒基因組。還可以是用于感染衣殼化細胞系的重組病毒。病毒DNA還可以以各帶有重組病毒基因組一部分和一個同源區的片段形式引入，在引入衣殼化細胞中后通過不同片段間的同源重組重建該重組病毒基因組。
細胞溶解后，通過氯化銫梯度離心分離重組病毒顆粒。專利申請FR9608164(引入本文作為參考)中描述了另一種方法。
本發明還涉及含有上述載體和化學或生化轉移試劑的組合物。術語“化學或生物轉移試劑”指有利于核酸穿透進入細胞的任何化合物(即不為重組病毒)。這可以是非病毒陽離子試劑如陽離子脂、肽、聚合物(聚乙烯亞胺，聚賴氨酸)、納米顆粒；或非陽離子非病毒試劑如非陽離子脂質體、非陽離子聚合物或納米顆粒。這種試劑是本領域技術人員已知的。
本發明還涉及含有如前所定義的重組病毒和生理可接受載體的組合物。
本發明還涉及含有如上所述載體的藥物組合物。本發明的藥物組合物可以配制成適于表皮、口服、腸胃外、鼻內、靜脈、肌內、皮下、眼內、透皮等途徑給藥的形式。
優選，本發明藥物組合物含有用于注射制劑、特別是靜脈注射或平滑肌組織注射液的藥學上可接受的載體，特別是無菌等滲鹽水(磷酸一鈉、二鈉鹽、氯化鈉、鉀、鈣或鎂等，或這些鹽的混合物)，或為干組合物，特別是凍干品，其在視情況加入無菌水或生理鹽水后可構制成注射液。也可以使用其他賦形劑如水凝膠。這種水凝膠可以用任何生物相容性無毒聚合物(均聚或雜聚)制成。這些聚合物已在例如專利申請WO93/08845中公開過。其中有一些是可購買到的，特別是從氧化乙烯和/或氧化丙烯獲得的那些。水凝膠的應用對于血管壁中、特別是血管壁的平滑肌細胞中的核酸轉移特別有利。注射劑量可以根據各種參數調節，特別是根據所用的給藥方式、所追求的目標(標記，病理，檢出等)、待表達的基因、或要求表達的時間長短。一般地講，本發明的重組病毒以104至1014pfu、優選106至1010pfu的劑量形式配制和給藥。pfu(空斑形成單位)相當于病毒溶液的感染能力，是通過感染適當的細胞培養物并測定被感染細胞的空斑數目來確定的。文獻中大量報道了病毒溶液pfu滴度的測定技術。對于體外或離體應用，本發明的表達盒、載體或組合物可以以常規劑量在所選細胞群存在下保溫。這種保溫可以在培養箱、燒瓶、發酵罐或所選擇的任何其他裝置中進行。
另外，本發明還涉及由如上所述表達盒或載體(特別是腺病毒)改造的任何細胞。“改造”的細胞指含有本發明構建體的細胞。這些細胞可體外生產重組蛋白。這些細胞還可用于植入生物體中，如按專利申請WO95/14785中所述方法。這些細胞優選是人平滑肌細胞。
本發明還涉及如上所述雜合啟動子用于體外、離體、體內在平滑肌細胞中特異性表達核酸的應用。
本發明還涉及如上定義的雜合啟動子在制備用于在平滑肌細胞中而不在動脈中相鄰的上皮細胞中表達核酸的組合物中的應用。
由于其對平滑肌細胞的特異性，本發明的構建體還可用于創建血管疾病的動物模型或用于進行標記研究或用于樣品中平滑肌細胞的檢測或檢出方法中。
本發明還涉及重組蛋白的生產方法，包括在細胞群中引入上述載體，培養所述重組細胞群，和回收產生的所述蛋白。為了實施本發明的方法，使用平滑肌細胞是有利的，這可以是已建立的細胞系或原代培養物。
借助于下面的實施例將更詳細地描述本發明，這些實施例應視為說明性的而非限制性的。
表I在兔平滑肌細胞原代培養物(兔SMC)、ECV304細胞、C2C12成肌細胞、HeLa細胞、NIH3T3細胞、TU182癌細胞、以及293腎細胞中體外暫時轉染測定的雜合啟動子(hSMα-肌動蛋白)的相對活性。每個啟動子的相對活性以相對pCMV-leadTK質粒所得螢光素酶活性的百分比表示。Enh-XhCMV-IE的增強子序列以其正常方向被克隆在X啟動子的上游。Hne-XhCMV-IE的增強子序列以相反方向克隆在啟動子X的上游。
表II在兔平滑肌細胞原代培養物(兔SMC)、ECV304細胞、C2C12成肌細胞、HeLa細胞、NIH 3T3細胞、TU182癌細胞、以及293腎細胞中體外暫時轉染測定的雜合啟動子(mSM22)的相對活性。每個啟動子的相對活性以相對pCMV-leadTK質粒獲得的螢光素酶活性的百分比表示。Enh-XhCMV-IE的增強子序列以其正常方向克隆在啟動子X的上游。HnE-XhCMV-IE的增強子序列以相反方向克隆在啟動子X的上游。
圖1質粒示意圖，其中表達盒含有hSMα-肌動蛋白雜合啟動子。
圖2質粒示意圖，其中表達盒含有mSM22α雜合啟動子。
圖3在兔平滑肌細胞原代培養物(兔SMC)、來自人臍帶癌的上皮細胞(ECV304)、小鼠成肌細胞(C2C12)、以及來自人宮頸癌的上皮細胞(HeLa)體外暫時轉染測定的雜合啟動子活性。每個啟動子的相對活性以相對pCMV-leadTK質粒所得螢光素酶活性的百分比表示。Enh-XhCMV-IE的增強子序列以其正常方向被克隆在X啟動子的上游。Hne-XhCMV-IE的增強子序列以相反方向克隆在啟動子X的上游。
圖4在小鼠胚成纖維細胞(NIH 3T3)、來自人ORL癌的細胞(TU182)、以及轉化的人胎腎細胞(293)中體外暫時轉染測定的雜合啟動子的活性。每個啟動子的相對活性以相對pCMV-leadTK質粒獲得的螢光素酶活性的百分比表示。Enh-XhCMV-IE的增強子序列以其正常方向克隆在啟動子X的上游。HnE-XhCMV-IE的增強子序列以相反方向克隆在啟動子X的上游。
圖5在C57BL6小鼠前脛骨肌中體內基因轉移評價的雜合啟動子的活性。每種啟動子的相對活性以相對pCMV-leadTK質粒獲得的螢光素酶活性的百分比表示。
材料和方法分子生物學中所用的常規方法如質粒DNA的制備性提取、質粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的電洗脫純化、鹽水中質粒DNA用乙醇或異丙醇沉淀、大腸桿菌中轉化是本領域技術人員已知的，在文獻中有大量描述(Sambrook等，″Molecular Cloning，a Laboratory Mannual″，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
用于克隆各種啟動子區的質粒pGL3-Basic是商業來源的(Promega Corporation)。質粒pCMV β(Clontech Laboratori esInc.)和pUC18(Boehringer Mannheim)也是商業來源的。
DNA片段的ACP法酶擴增(聚合酶鏈式擴增)可利用DNA熱循環儀(Perkin Elmer Letus)按制造商的說明進行。
質粒DNA的大腸桿菌電穿孔可以利用電穿孔器(Bio-Rad)按制造商的說明進行。
核苷酸序列的驗證可以按Sanger等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74(1977)5463-5467)利用Applied Biosystems提供的試劑盒按廠商說明來進行。
實施例實施例1雜合啟動子及含有它們的表達質粒的構建。
1.1雜合啟動子hSMα-肌動蛋白·質粒phSMact.按Sambrook等(Sambrook等，″MolecularCloning，a Laboratory Mannual″，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)所述方法從人主動脈平滑肌細胞原代培養物(Clonetics)制備了高分子量的基因組DNA。
該DNA用作模板，用下述引物進行第一次ACP擴增-引物6417(5’GATGGTCCCTACTTATGCTGCTA 3’)(SEQ ID 1)，從人特異平滑肌α-肌動蛋白基因的-1034位(啟動子區)開始(UeyamaH.等，Mol.Cell.Biol.，4(1984)1073-1078。Genbank號D00618)。
-引物6418(5’CTTCCATCATACCAAACTACATA 3’)(SEQ ID 2)，序列D00618的1974位，位于hSMact基因的第一個內含子之內。反應混合物包括1mg基因組DNA、10pmol每種引物(6417和6418)、100mM的各種脫氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、2mM MgCl2和5單位Taq DNA聚合物(Perkin Elmer)。反應體積用Perkin Elmer推薦的ACP緩沖液補至50ml，調至最佳濃度。
ACP擴增在MicoampTM試管中利用熱循環儀PTC-100TM(MJResearch，Inc.)進行。該擴增包括一步95℃2分鐘變性，然后是30個循環95℃變性15秒、60℃雜交30秒和72℃延伸1分鐘。這30個循環之后是額外延伸5分鐘，然后將ACP反應液保持在10℃。
從該第一個反應中取1微升反應液，用10ml水稀釋。然后1ml該稀釋液用于進行第二次ACP，條件與第一次(上述)相同，但引物對不同-引物6453(5’CTGCTAAATTGctcgagGACAAATTAGACAAA 3’)(SEQ ID 3)，該引物在啟動子hSMact上游(-680位)引入一個XhoI位點(下劃線的小寫字母)。
-引物6456(5’CCCTGACAaagcttGGCTGGGCTGCTCCACTGG 3’)(SEQ ID 4)，該引物在hSMact的+30位引入一個HindIII位點。
在瓊脂糖凝膠上分析、純化后，ACP擴增的DNA片段用XhoI和HindIII于37℃消化3小時，然后克隆在預先用這些相同的限制酶消化的載體pGL3-Basic(Promega)中，制得質粒phSMact(圖1)。·質粒pXL3130和pXL3131.相應于人巨細胞病毒IE基因(hCMV-IE)啟動子的增強子區的DNA片段包含在從復制起點計-522和-63位之間，用質粒pCMVβ作為模板和用寡核苷酸8557(5’ATC GAC GCGTGC CCG TTA CAT AAC TTA CGG 3’)(SEQ ID 5)和8558(5’ATCGAC GCG TCC GCT CGA GCG TCA ATG GGG CGG AGT TG 3’)(SEQ ID6)作為引物將其經ACP擴增。該片段用MluI消化，然后克隆在預先用MluI消化并用堿性磷酸酶處理的質粒phSMact中。根據片段的插入方向不同，得到了兩個不同的質粒pXL3130和pXL3131。這些質粒的示意圖示于附圖中(圖1)。這些質粒含有MluI-NcoI片段形式的雜合啟動子，其由hCMV-IE基因啟動子的增強子和hSMα-肌動蛋白基因的啟動子構成。
1.2雜合啟動子mSM22·質粒pmSM22.按已知方法(Sambrook等，″MolecularCloning，a Laboratory Mannual″，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)從Balbc小鼠的肝中制備了高分子量的基因組DNA。
以該DNA作為模板和下述引物進行ACP擴增-引物6517(5’CCAGGCTGCActcgagACTAGTTCCCACCAACTCGA 3’)(SEQ ID7)，該引物在小鼠SM22α基因啟動子(Solway J.等，J.Biol.Chem.，270(1995)13460-13469；Genbank號L41161)的-436位引入XhoI位點(下劃線的小寫字母)。
-引物6518(5’TCGTTTGaagcttGGAAGGAGAGTAGCTTCGGTGTC 3’)(SEQ ID8)，該引物在mSM22α的+43位引XHindIII位點。
用與hSMact所用相同的試劑和相同的濃度制備了含有1mg小鼠基因組DNA和10pmol各種引物(6517和6518)的反應混合物，然后在相同條件下進行ACP擴增(見實施例1.1)。
在瓊脂糖凝膠上分析和純化后，將該ACP擴增的DNA片段用XhoI和HindIII 37℃消化了3小時，然后克隆在預先用相同的限制酶消化的載體pGL3-Basic(Promega)中。形成的質粒稱為pmSM22(圖2)。
·質粒pXL3152和pXL3153.相應于hCMV-IE基因啟動子的增強子區包含于相對于轉錄起始點-522和-63位之間，用質粒pCMVβ作為模板、用寡核苷酸8557和8558作為引物對其進行ACP擴增8557(5’ATC GAC GCG TGC CCG TTA CAT AAC TTA CGG 3’)(SEQID 5)；8558(5’ ATC GAC GCG TCC GCT CGA GCG TCA ATG GGGCGG AGT TG 3’)(SEQ ID 6)。該片段用MluI消化，然后克隆在預先用MluI消化并用堿性磷酸酶處理的質粒pmSM22中。根據該片段的插入方向不同，得到了兩個不同的質粒pXL3152和pXL3153。這些質粒的示意圖示于圖2中。這些質粒含有MluI-NcoI片段形式的雜合啟動子，其由hCMV-IE基因啟動子的增強子和mSM22基因的啟動子構成。
1.3對照質粒pCMV-leadTK已由Tanaka等(Cell，60(1990)375-386)報道的表達載體pCGN含有與HSV tk基因的“leader”(前導序列)(+51/+101)融合的CMV啟動子(-522/+72)，位于血凝素表位的編碼序列的上游。用質粒pCGN(10ng)作為模板進行ACP擴增。在與hSMact及nSM22所用相同的條件下(實施例1.1和1. 2)進行ACP反應和擴增。所用引物如下-引物6718(5’CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG 3’)(SEQID9)，該引物與pCGN EcoRI位點下游8個核苷酸處-522位的CMV啟動子雜交。
-引物6719(5’gGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGGCCGAA 3’)(SEQID 10)，該引物雜交至tk“leader”的101位。第一個黑體核苷酸G用于修復pGL3-Basic的NcoI位點，下文將解釋這一點。
將如此獲得的ACP片段純化，然后用T4噬菌體多核苷酸激酶(NewEngland Biolabs)磷酸化。平行地，載體pGL3-Basic(Promega)用NcoI線性化、純化，然后用Klenow DNA聚合酶(BoehringerManhein)處理，以填平NcoI位點。該載體隨后用堿性磷酸酶(Boehringer Manheim)脫磷酸化，然后用于磷酸化的ACP片段的插入。這樣，只有當CMV-leader tk片段的定向為5’部分(引物6718，CMV的-522位)位于pGL3-Basic HindIII位點下游而其3’端(引物6719，leader tk)與pGL3-Basic的NcoI位點(螢光素酶的第一個ATG)連接時，引物6719的烏苷(G)得以修復NcoI位點。如此獲得的質粒被稱為pCMV-leadTK。
實施例2雜合啟動子的體外特異性本實施例說明本發明雜合啟動子的體外組織特異性特性。
2.1細胞培養兔的平滑肌細胞(SMC)培養在補有20％胎牛血清(SVF)的DMEMTM培養基(Life Technologies Inc)中。ECV304細胞培養在補有10％SVF的199TM培養基(Life Technologies Inc.)中。成肌細胞C2C12、HeLa細胞、NIH 3T3細胞以及TU182細胞培養在補有10％SVF的DMEMTM培養基中。293細胞培養在補有丙酮酸、非必需氨基酸和10％SVF的MEMTM培養基(Life Technologies Inc)中。所有培養在37℃孵箱中在大氣濕度和5％CO2分壓下進行。
2.2體外轉染在24孔板中進行轉染，每個轉染進行3次。在轉染前24小時，接種細胞(1)兔平滑肌細胞、ECV304、NIH3T3和HeLa細胞，每孔5x104個細胞，(ii)TU182細胞，每孔105個細胞，(iii)C2C12細胞，每孔3x104細胞，及(iv)293細胞，每孔2×105個細胞。
每孔中，500ng質粒DNA(250ng目標質粒和250ng pUC18)與陽離子脂RPR120535B(WO97/18185)以6nmol脂/μg DNA的比例混合于含150mM NaCl和50mM碳酸氫鹽的DMEMTM培養基中(終體積20μl)。室溫下20分鐘后，在無SVF存在下將20μl DNA/脂混合物與細胞接觸2小時。然后向培養基中補充SVF，以達到每種細胞培養所要求的百分數。
轉染后48小時，取出培養基，細胞用PBS(Life TechnologiesInc.)洗滌2次。然后用Luciferase Assay SystemTM(螢光素酶測定系統)試劑盒(Promega Corporation)按廠商的說明測定螢光素酶活性。
2.3雜合啟動子的特異活性在7種不同細胞中體外測定的雜合啟動子的相對螢光素酶活性(相對于pCMV-headTK啟動子)總結在圖3和4以及表I和II中。結果表明，hSMact(表I)和mSM22(表II)啟動子的相對活性值清楚地顯示其對于平滑肌細胞的特異性，這種特異性在文獻中已有報道(Skalli等，J.Histochem.Cytochem.，37(1989)315-321；Shimizu等，J.Biol.Chem.，270(1995)7631-7643；Li等，J.CellBiol.，132(1996)849-859)。實際上，在兔SMC中的相對活性是其他類型細胞中所觀察水平的至少5倍(i)hSMact啟動子為5-20倍(表I)；(ii)mSM22啟動子為5-25倍(表II)。
表I和II中所示結果清楚地表明，在平滑肌細胞中，本發明的4個雜合啟動子(Enh-hSMact、hnE-hSMact、Enh-mSM22和hnE-mSM22)的活性在強度上與CMV啟動子相當。而每種這些啟動子在其他類型細胞中的相對活性比在平滑肌細胞中觀察到的水平低至少10倍(對于hSMact雜合啟動子)和至少4倍(對于mSM22啟動子)(i)對hSMact雜合啟動子為10-140倍，(ii)對mSM22雜合啟動子為4-55倍。因而這些雜合啟動子保留了與特異性啟動子hSMact和mSM22相同的組織特異性。
這些結果另外還表明，本發明雜合啟動子中增強子區的方向不顯著影響其活性。
因而這4個雜合啟動子在體外平滑肌細胞中具有與CMV啟動子(以強啟動子而著稱)一樣強的活性，同時保留了與hSMact和mSM22啟動子相當的、甚至更高的組織特異性。
實施例3雜合啟動子的體內特異性本實施例證明本發明雜合啟動子的體內組織特異性特性。
3.1骨骼肌中的基因轉移將不同的質粒肌內注射到5周齡雌性C57BL6小鼠的前脛骨肌中。每種質粒稀釋在150mM(終濃度)的NaCl溶液中，以每塊肌肉10μg的量注射。注射后3天，將肌肉取樣放在2ml Cell Cultura lysisReagentTM(細胞培養物溶解試劑)緩沖液(Promega Corporation)中，用Diax勻漿器(Heioloph)粉碎，然后以4000g離心15分鐘。然后用Luliferase Assay SystemTM試劑盒(Promega Corporation)按廠商說明測定螢光素酶活性。
3.2雜合啟動子在骨骼肌中的體內活性還在小鼠前脛骨肌中轉移裸DNA后體內評價了兩個特異性啟動子(hSMact和mSM22)以及2個本發明的雜合啟動子的相對活性。圖5中所示結果表明Enh-hSMact啟動子的活性是CMV啟動子活性的100倍。同樣，Enh-mSM22啟動子的活性是CMV啟動子活性的17倍。因此，在體內觀察到體外所觀察到的組織特異性，尤其是在C2C12細胞中所見的，后者是與體內所用最接近的模型。
實施例4構建特異性雜合啟動子控制下表達GAX蛋白的重組腺病毒本實施例的目的是描述一種腺病毒載體，其帶有與本發明的雜合啟動子可操作連接的GAX蛋白的編碼基因，所述啟動子由CMV增強子和SMα-肌動蛋白啟動子構成(enh-hSMact)。
人gax基因包含912個堿基對，編碼參與細胞生長停滯(growth-arrest-specific homeobox，生長停滯特異性同源框)并對人平滑肌細胞的增殖有作用的303個氨基酸的轉錄因子。該同源域基因最初分離自主動脈，并特別在成人心血管組織中表達(Gorski等，1993)。
人gax基因的序列已用來自人gax基因的序列作為引物經PCR(聚合酶鏈式反應)從骨骼肌的cDNA文庫克隆出來，并由Walsh等人公布(Genomics(1994)，24，p535)。然后將該序列克隆在表達載體pXL3297中。該質粒來自質粒Bluescript(Stratagene)，含有人CMV IE增強子/啟動子(-522/+72)(Cell(1985)，41，p521)和SV40的polyA(2538-2759)(Genbank位置SV40CG)。
使用實施例1(圖1)中所述的質粒pXL3130進行構建，所述質粒中已預先引入SMα-肌動蛋白啟動子。質粒pXL3297是含有人gax基因的表達載體。將其用HindIII和AvrII消化以將人gax基因引入同樣用HindIII和AvrII酶消化的前述質粒pXL3282中，得到質粒pXL3300。如圖6中所示，其中詳細描述了上述質粒構建的各個步驟，最終質粒pXL3310含有一個表達盒，其由按本發明連接的CMV-IE增強子和SMα-肌動蛋白啟動子(pSMA)、和與其可操作連接的人GAX蛋白編碼基因以及SV40的終止信號polyA構成。
然后將該人gax基因表達盒通過帶有表達盒的質粒和腺病毒在衣殼化細胞中共轉染和同源重組，引入在缺失了E1和E3區的血清型5重組人腺病毒(Ad5)中。感染2或3天后溶解衣殼化細胞并在氯化銫梯度中離心重組病毒顆粒，得到含人gax基因表達盒的腺病毒原種。
然后將病毒顆粒用于研究人gax基因在本發明啟動子的控制下在平滑肌細胞中的表達。
用兔抗gax多克隆抗體進行免疫熒光或Western印跡在感染平滑肌原代細胞24小時后驗證明GAX蛋白的表達。
用gax基因中所存在序列的寡核苷酸進行點印跡和Northern印跡在感染平滑肌細胞后24小時分析信使RNA的表達。
按如下方式分析編碼gax基因的腺病毒的生物活性將指數生長期的平滑肌細胞在有或無125ng脂轉染試劑(1ipofectin)存在下用含有enh-hsMact啟動子控制下的GAX蛋白編碼基因的腺病毒感染(48孔板)。將腺病毒(各種稀釋度)和脂轉染胺在室溫下在無血清的培養基中保溫30分鐘。用此混合物或僅用病毒與細胞在37℃接觸1小時。在感染期結束時，取出含病毒的培養基，將細胞在含0.5％SVF的DMEM培養基中保溫。感染后每24小時用生長培養基更換一半培養基，繼續保溫48小時以得到進入S期的細胞。在另一半培養物中加入弱促有絲分裂培養基以維持細胞在靜止期。用Alamar法在感染后72小時對各種細胞計數。
表I
表II
序列表<110>RHONE-POULENC RORER<120>特異性雜合啟動子控制組織表達的應用<130>PCT申請的序列表<140><141><150>FR9812000<151>1998-09-25<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(23)<400>1gatggtccct acttatgctg cta23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(23)<400>2cttccatcat accaaactac ata23<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(32)<400>3ctgctaaatt gctcgaggac aaattagaca aa32<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(33)<400>4ccctgacaaa gcttggctgg gctgctccac tgg 33<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(30)<400>5atcgacgcgt gcccgttaca taacttacgg 30<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(38)<400>6atcgacgcgt ccgctcgagc gtcaatgggg cggagttg 38<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(36)<400>7ccaggctgca ctcgagacta gttcccacca actcga 36<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(36)<400>8tcgtttgaag cttggaagga gagtagcttc ggtgtc 36<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(30)<400>9cccgttacat aacttacggt aaatggcccg 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<220><221>misc_特征<222>(1)..(23)<400>10gggacgcgct tctacaaggc gctggccgaa 30
權利要求
1.一種雜合啟動子，其包含-遍在型強啟動子/增強子的增強子區全部或部分，和-允許在平滑肌細胞中特異性表達的啟動子區。
2.權利要求1的雜合啟動子，其特征在于增強子區選自巨細胞病毒立即早期基因(CMV-IE)的增強子區、勞斯肉瘤病毒LTR(LTR-RSV)的增強子區、SV40病毒的增強子區和EF1α基因的增強子區。
3.權利要求1的雜合啟動子，其特征在于增強子區是巨細胞病毒立即早期基因(CMV-IE)的增強子區，優選人巨細胞病毒立即早期基因(hCMV-IE)的增強子區。
4.權利要求1的雜合啟動子，其特征在于啟動子區包含平滑肌細胞α-肌動蛋白編碼基因(SMact)或SM22基因的啟動子全部或部分。
5.一種雜合啟動子，其包含-人巨細胞病毒立即早期基因(hCMV-IE)的增強子區全部或部分，和-平滑肌細胞α-肌動蛋白編碼基因(SMact)的啟動子全部或部分。
6.一種雜合啟動子，其包含-人巨細胞病毒立即早期基因(hCMV-IE)的增強子區全部或部分，和-SM22基因啟動子的全部或部分。
7.權利要求1的雜合啟動子，其特征在于啟動子區包含一個基礎啟動子和一個帶來組織特異性的序列，所述序列來自SMact啟動子和/或SM22啟動子。
8.一種表達盒，其包含處于權利要求1-7之一的雜合啟動子控制下的編碼目標RNA或多肽的核酸。
9.權利要求8的表達盒，其特征在于它另外還包含轉錄終止信號。
10.權利要求8或9的表達盒，其特征在于所述核酸編碼選自如下的蛋白參與細胞周期的蛋白、誘導細胞凋亡的蛋白、能夠改變平滑肌細胞增殖的蛋白、誘導血管生成的蛋白和轉錄因子。
11.包含權利要求1的雜合啟動子或權利要求8的表達盒的載體。
12.權利要求11的載體，其特征在于它是質粒、粘粒或任何不被病毒衣殼化的DNA。
13.權利要求11的載體，其特征在于它是重組病毒，優選來自腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒或腺伴隨病毒。
14.含有權利要求12的載體和化學或生化轉移試劑的組合物。
15.含有權利要求13的重組病毒和生理上可接受的載體的組合物。
16.由權利要求8的表達盒或權利要求11的載體改造的細胞。
17.權利要求1-7之一的雜合啟動子在制備用于在平滑肌細胞中選擇性表達核酸的組合物中的應用。
18.權利要求1-7之一的雜合啟動子在制備用于在平滑肌細胞中表達而不在血管中相鄰的上皮細胞中表達核酸的組合物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種雜合啟動子,其包含:遍在型強啟動子/增強子的增強子全部或部分,允許在平滑肌細胞中特異性表達的啟動子區;還涉及含有所述啟動子的載體或細胞,以及它們的應用。
文檔編號A61K35/76GK1326506SQ9981133
公開日2001年12月12日 申請日期1999年9月23日 優先權日1998年9月25日
發明者D·布拉尼萊克, R·達特爾, A·馬弗迪, D·舍曼 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司