專利名稱：瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥、獸藥和農藥中間體或原藥領域中瑞香狼毒的綜合利用，尤其是涉及一種瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法及其作為植物殺菌劑的應用。
背景技術：
瑞香狼毒(Stellera Chamaejasme L.)系瑞香科狼毒屬植物，別名有狼毒、斷腸草等，其根是傳統中藥狠毒的基質，具有散結逐水，止痛和殺蟲作用。早在1959年出版的《中國土農藥志》中就有將瑞香狼毒作為植物源農藥應用的記載，當時人們將狼毒根的粉末埋入地下用于防治田間地下害蟲，或將狼毒的水提液噴灑在植物葉面用于防除葉面豆蚜、菜蚜、葉銹病等。近年來，有研究者相繼開發出含狼毒粗提物的植物原農藥，有的已申請專利。但這些狼毒型植物源農藥均為殺蟲劑，少數幾個有明確的有效成分和含量，大部分專利中則不清楚其殺蟲活性成分。張潔等(專利申請號00116146)發明了由紫莖澤蘭、瑞香狼毒和魚藤制備廣譜性生滅蟲劑的方法，該法制備的滅蟲劑屬于復方制劑，其殺蟲有效成分不清，作用對象不含植物病原菌。張克杰等(專利申請號02133769)敘述了由狼毒根、莖制備生物農藥狼毒素水乳劑的工藝，該法制備的產品屬于單方制劑，殺蟲有效成分及其含量明確，為1.1％～5％。但同樣其作用對象僅為植物害蟲，不含植物病原菌。劉世貴等(專利申請號02133971)公開了由狼毒促提取物、印楝素和益母草生物堿等制備植物殺蟲劑的方法，該法得到的產品為復配制劑，其中狼毒提取物中的有效成分不清楚，作用對象同樣僅為植物害蟲。韓明理等(專利申請號02100771.3)敘述了由瑞香狼毒制備0.3％狼毒素植殺水劑的制備方法，該產品為單方制劑，有效成分為狼毒素，作用對象仍然為只是植物害蟲。其生產工藝中只涉及狼毒根的粗提物，而不涉及狼毒素的分離。綜上所述，可以看出，狼毒作為植物源農藥的應用主要為殺蟲劑，關于其殺菌劑的研究和開發還屬于空白。
Niwa等人(Tetrahydron Letters，1984，25(34)3735-3738)最早從瑞香狼毒根中分離鑒定出狼毒色原酮。隨后有馮寶民(中草藥，2001，32(1)14-15)等多人的研究相繼證實了Niwa等人的研究結果。這些研究具有共同的特點，即都是屬于植物化學或天然產物化學的基礎理論研究，其研究方法均為實驗室的常規方法，提取效率低，分離方法復雜繁瑣，根本不適宜于工業化規模生產。其次，所有關于狼毒色原酮的研究報道極少涉及其生物活性的研究，更沒有關于狼毒色原酮對植物病原菌即作為植物殺菌劑的研究。
發明內容
本發明為了解決上述背景技術中的不足之處，提供一種瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法及其應用。具體內容是從瑞香狼毒根中分離鑒定出一個對多種植物病原菌具有抑制和殺滅作用的廣譜性殺菌活性成分，即狼毒色原酮，研發出適合規模化從狼毒根中提取分離狼毒色原酮的生產方法，該生產方法和工藝簡便、經濟、合理，同時，提供狼毒色原酮作為廣譜性植物殺菌活性成分的應用。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特殊之處在于包括以下操作步驟 將狼毒根粉加入溶劑進行提取，然后進行第一次硅膠柱層析粗分，得一次粗分物，再進行第二次硅膠柱層析粗分，得二次粗分物，再對二次粗分物進行純化。
上述操作步驟包括以瑞香狼毒根為原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯與丙酮的混合物為溶劑，采用30℃～55℃超聲波常壓連續提取3次，每次提取時間30～50min。提取液經過濾、濃縮和柱色譜層析獲得60％～99％的狼毒色原酮。
上述操作步驟包括(1)將狼毒根粉碎至一定程度，按照狼毒根粉重量(kg)和溶劑體積(L)1∶4～1∶10的比例，采用間歇式超聲波提取，提取溫度30℃～55℃，每批原材料采用同種溶劑連續提取3次，每次提取時間為30～50min，超聲功率為1.8W，每次超聲時間為6s，兩次超聲之間的時間間隔為4s；(2)每次提取結束后，采用負壓或離心過濾，收集濾液，將3次提取液合并，負壓蒸除溶劑后，得粗提物，回收的溶劑可反復使用，總提取率根據溶劑的種類不同而不同，一般為7％～21％，粗提物中狼毒色原酮的含量為5％～25％，粗提物無需分離純化，可直接用于配制植物殺菌劑水乳劑，也可選用其他有機溶劑對該粗提物進行二次超聲提取，所得粗提物一次提取物或二次提取物用于狼毒色原酮的粗分；(3)用丙酮或甲醇或二者的混合物溶解粗提物，配成質量濃度約20％的溶液，在不斷攪拌下，加入相當于粗提物3～7偣質量的大約200目的柱層析硅膠，將拌樣后的硅膠在常溫下晾干，加到硅膠柱的頂端，進行干柱層析，依次采用氯仿、乙酸乙酯進行洗脫，收集乙酸乙酯流份，負壓蒸除溶劑后，得一次粗分物，該粗分物中的狼毒色原酮含量為45％～55％，可直接用于配制醫用或農用殺菌劑；(4)將一次粗分物采用與(3)類似的方法進行柱層析，所不同的是采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，以狼毒色原酮標準品為對照，采用TLC法或HPLC法對各流份進行檢測，合并含有狼毒色原酮的流份，負壓蒸除溶劑后，得二次粗分物，該粗分物中的狼毒色原酮含量為80％～90％，可直接用于配制醫用或農用殺菌劑；(5)用甲醇溶解二次粗分物，上sephadex LH-20柱進行純化，收集含有狼毒色原酮的流份，負壓蒸除溶劑后，得狼毒色原酮精品，含量為95％～99％，可作為標準樣品或分析純化學試劑使用。
上述步驟(1)中，提取溶劑選用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇中的一種，提取方案包括A.直接用乙酸乙酯或丙酮進行超聲提取，料(kg)/液(L)比控制在1∶4～1∶10，，提取溫度為30℃～55℃，所得粗提取物為淡黃色無晶形粉末，含有5％～10％的狼毒色原酮，直接用于柱層析分離。乙酸乙酯和丙酮的提取率分別為5％～6％和7％～8％；B.首先采用甲醇進行超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得粗提物可直接用于配制植物殺菌劑或二次提取，本次提取率為18％～25％，用丙酮對甲醇粗提物進行二次超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得丙酮粗提物相當于所用植物材料的10％～12％，為黃色無晶形粉末，含有5％～10％的狼毒色原酮，直接用于柱層析分離。
上述步驟(2)中，將粗提物用丙酮配成質量濃度約20％的溶液，加入3～7倍質量的柱層析用硅膠，室溫晾干拌樣后的硅膠或用40℃熱風常壓干燥，然后加到硅膠柱頂端進行第一次干柱層析粗分，硅膠柱的規格為高度/直徑10∶1，硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的1～3倍，首先采用氯仿進行洗脫，直到流出液幾乎無色為止，然后換用乙酸乙酯洗脫，直至TLC或HPLC檢測無狼毒色原酮流出，合并乙酸乙酯流份，蒸除溶劑后得一次粗分物，其質量約為上樣量的40％～50％。該粗分物的狼毒色原酮含量為45％～55％。
上述步驟(3)中，將一次粗分物用丙酮配成飽和溶液，加到硅膠柱頂端進行濕柱硅膠層析，硅膠柱的規格為高度/直徑20∶1。硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的50～100倍，以氯仿—丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，收集含有狼毒色原酮的主要流份，蒸除溶劑后得二次粗分物，黃色無晶形粉末，其質量約為上樣量的40％～50％，狼毒色原酮的含量為80％～90％。
上述步驟(4)中，將二次粗分物用甲醇配成飽和溶液，并事先用甲醇平衡過的sephadex LH-20進行純化，柱子的規格為高度/直徑10∶1，sephadex LH-20的粒度為200～400目，上樣量為柱中sephadex LH-20用量的50～100倍，以甲醇為洗脫劑，減壓濃縮含狼毒色原酮的流份，得狼毒色原酮精品，其質量約為上樣量的85％～90％，相當于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，純度為95％～99％。
上述狼毒色原酮的物理參數如下狼毒色原酮，為白色粉末，mp245℃(分解)，[α]D＝+127.434°(c0.076，MeOH)，UV(MeOH，nm)λmax296，260，212。IR(KBr)υmaxcm-13401(O-H)，1654(C＝O)，1630、1511(C＝C)，1238、1174、1070(C-O)。FAB MS e/z543([M+1]+，100)，344([M-HOC6H4CH2C6H4OH+1]+，38)，199([HOC6H4CH2C6H4OH]+，65)。1H NMRδ(CD3OD)4.64(1H，d，J＝12Hz，H-12)，5.80(2H，s，H-16，H-18)，6.13(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.36(1H，d，J＝12.0Hz，H-11)，7.94(1H，s，H-2).以下四組峰為H-21，H-22，H-24，H-25，H-27，H-28，H-30，H-316.75(1H，d，J＝7.0Hz)，6.64(1H，d，J＝7.0Hz)，7.07(1H，d，J＝7.0Hz)，7.20(1H，d，J＝7.0Hz).13C NMRδ(CD3OD)48.32(C-11)，54.09(C-12)，94.36(C-8)，96.04(C-16)，96.04(C-18)，99.78(C-6)，105.24(C-10)，106.17(C-14)，115.53(C-28)，115.53(C-30)，115.69(C-22)，115.69(C-24)，121.75(C-3)，129.61(C-25)，129.61(C-21)，130.51(C-27)，130.51(C-31)，134.68(C-26)，135.61(C-20)，156.36(C-29)，156.39(C-23)，156.94(C-2)，158.48(C-9)，163.22(C-5)，165.03(C-15)，165.03(C-19)，165.22(C-7)，165.73(C-17)，181.04(C-4)，204.22(C-13)；HPLC圖譜洗脫劑CH3OH/H2O(V/V)47∶5，Waters ALC/JPC-201高壓液相色譜儀，柱子為Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒徑4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外檢測器，檢測波長296nm。
一種瑞香狼毒中狼毒色原酮作為植物殺菌劑的應用，其特殊之處在于所述殺菌劑以瑞香狼毒根提取物為原料，以狼毒色原酮為主要殺菌有效成分，用于預防和治療由蘋果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等引起的植物病害。
上述狼毒色原酮為2200mg·L-1濃度。
與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下本發明首次采用生物活性跟蹤法和化學分離法，從瑞香狼毒根中分離鑒定出一個對多種植物病原菌具有抑制和殺滅作用的廣譜性殺菌活性成分，即狼毒色原酮(chamaechromone)。同時，開發出從狼毒根中提取分離狼毒色原酮的生產工藝，提取效率高，分離方法簡潔，適宜于工業化規模生產，并首次將狼毒色原酮作為植物殺菌劑應用。
四
圖1為本發明的工藝流程圖；圖2為狼毒色原酮的化學結構式；圖3為狼毒色原酮的HPLC圖譜。
五具體實施例方式1、參見圖1，本發明采用4步法來獲得不同含量的狼毒色原酮，即提取、第一次硅膠柱層析粗分、第二次硅膠柱層析粗分、sephadexLH-20純化，各步分離所獲得目標物中狼毒色原酮的含量分別為5％～25％，45％～55％，80％～90％，95％～99％。其工藝流程如下1.1、將狼毒根粉碎至一定程度，其細度無嚴格要求，一般為直徑1mm。按照狼毒根粉重量(kg)和溶劑體積(L)1∶8的比例，采用間歇式超聲波提取，提取溫度為40℃。每批原材料采用同種溶劑連續提取3次，每次提取時間為40min。超聲功率為1.8W，每次超聲時間為6s，兩次超聲之間的時間間隔為4s。如果以分離狼毒色原酮精品為最終目的，選用乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯/丙酮1∶1(V/V)為溶劑。如果以提取粗提取用于配制瑞香狼毒殺菌劑為最終目的，則選用甲醇為溶劑。
1.2、提取時的固液分離，可采用負壓過濾、離心過濾或壓榨過濾三種方法之一，最好采用離心過濾。濾液經水泵減壓，在38℃下蒸除溶劑后，得粗提物。回收的溶劑可反復使用。總提取率根據溶劑的種類不同而不同，乙酸乙酯、丙酮和甲醇的提取率分別為5.2％、6.4％和21％。三種粗提物中狼毒色原酮的含量大約分別為20％、6％和5％。三種粗提物無需分離純化，均可直接用于配制植物殺菌劑水乳劑。如果以分離狼毒色原酮精品為最終目的，則選用乙酸乙酯或丙酮提取物。
1.3、在對乙酸乙酯或丙酮粗提物進行第一次硅膠柱層析時，選擇丙酮溶解粗體物，配成質量濃度約20％的溶液。然后，加入相當于粗提物3～7質量的大約200目的柱層析硅膠，快速拌勻后，常溫晾干。加到相當于拌樣硅膠質量的1/8的硅膠柱的頂端，進行干柱層析。依次采用氯仿、乙酸乙酯進行洗脫。狼毒色原酮存在于乙酸乙酯流份中，水泵減壓蒸除溶劑后，得一次粗分物。該粗分物中的狼毒色原酮含量為45％～55％，可直接用于配制醫用或農用殺菌劑，亦可作為農用殺菌劑原藥出售。
1.4、在對一次粗分物進行硅膠柱層析時，采用常規干柱層析。采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑裝柱，同時又作為洗脫劑。以狼毒色原酮標準品為對照，采用TLC法或HPLC法對各流份進行檢測。合并含有狼毒色原酮的所有流份，負壓蒸除溶劑后，得二次粗分物。該粗分物中的狼毒色原酮含量為80％～90％，可直接用于配制醫用或農用殺菌劑。
1.5、對二次粗分物的純化采用sephadex LH-20凝膠色譜進行。柱子的規格為高度/直徑10∶1。sephadex LH-20的粒度為300目。上樣量為柱中sephadex LH-20用量的1/50倍。以甲醇為洗脫劑，收集合并僅含狼毒色原酮的流份，減壓濃縮后可獲得狼毒色原酮精品，其收率約為上樣量的85％～90％，整個工藝的總收率相當于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，純度為95％～99％。
2、狼毒色原酮作為植物殺菌劑的應用本發明首次發現了狼毒色原酮在植物殺菌方面的新作用和新用途，填補了狼毒和狼毒色原酮在植物殺菌方面的研究空白。研究結果證實，狼毒色原酮在2200mg·L-1濃度對蘋果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等植物病原菌的抑制率分別為81.1％，80.0％，77.3％，87.8％，98.5％，96.8％，81.0％。因此，狼毒色原酮有望成為新的植物源農用殺菌劑。
3、參見圖2，圖2為狼毒色原酮的化學結構式，物理參數如下狼毒色原酮，為白色粉末，mp245℃(分解)，[α]D＝+127.434°(c0.076，MeOH)，UV(MeOH，nm)λmax296，260，212。IR(KBr)υmaxcm-13401(O-H)，1654(C＝O)，1630、1511(C＝C)，1238、1174、1070(C-O)。FAB MS e/z543([M+1]+，100)，344([M-HOC6H4CH2C6H4OH+1]+，38)，199([HOC6H4CH2C6H4OH]+，65)。1H NMRδ(CD3OD)4.64(1H，d，J＝12Hz，H-12)，5.80(2H，s，H-16，H-18)，6.13(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.36(1H，d，J＝12.0Hz，H-11)，7.94(1H，s，H-2).以下四組峰為H-21，H-22，H-24，H-25，H-27，H-28，H-30，H-316.75(1H，d，J＝7.0Hz)，6.64(1H，d，J＝7.0Hz)，7.07(1H，d，J＝7.0Hz)，7.20(1H，d，J＝7.0Hz).13C NMRδ(CD3OD)48.32(C-11)，54.09(C-12)，94.36(C-8)，96.04(C-16)，96.04(C-18)，99.78(C-6)，105.24(C-10)，106.17(C-14)，115.53(C-28)，115.53(C-30)，115.69(C-22)，115.69(C-24)，121.75(C-3)，129.61(C-25)，129.61(C-21)，130.51(C-27)，130.51(C-31)，134.68(C-26)，135.61(C-20)，156.36(C-29)，156.39(C-23)，156.94(C-2)，158.48(C-9)，163.22(C-5)，165.03(C-15)，165.03(C-19)，165.22(C-7)，165.73(C-17)，181.04(C-4)，204.22(C-13)；參見圖3，HPLC圖譜洗脫劑CH3OH/H2O(V/V)47∶5，WatersALC/JPC-201高壓液相色譜儀，柱子為Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒徑4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外檢測器，檢測波長296nm。
權利要求
1.一種瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于包括以下操作步驟將狼毒根粉加入溶劑進行提取，然后進行第一次硅膠柱層析粗分，得一次粗分物，再進行第二次硅膠柱層析粗分，得二次粗分物，再對二次粗分物進行純化。
2.根據權利要求1所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于包括以下操作步驟以瑞香狼毒根為原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯與丙酮的混合物為溶劑，采用30℃～55℃超聲波常壓連續提取3次，每次提取時間30～50min，提取液經過濾、濃縮和柱色譜層析獲得60％～99％的狼毒色原酮。
3.根據權利要求2所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)將狼毒根粉碎，按照狼毒根粉重量(kg)和溶劑體積(L)1∶4～1∶10的比例，采用間歇式超聲波提取，提取溫度30℃～55℃，每批原材料采用同種溶劑連續提取3次，每次提取時間為30～50min，超聲功率為1.8W，每次超聲時間為6s，兩次超聲之間的時間間隔為4s；(2)每次提取結束后，采用離心過濾，收集濾液，將3次提取液合并，負壓蒸除溶劑后，得粗提物，回收的溶劑可反復使用，總提取率根據溶劑的種類不同而不同，一般為7％～21％，粗提物中狼毒色原酮的含量為5％～25％，粗提物無需分離純化，可直接用于配制植物殺菌劑水乳劑，也可選用其他有機溶劑對該粗提物進行二次超聲提取，所得粗提物一次提取物或二次提取物用于狼毒色原酮的粗分；(3)用丙酮或甲醇或二者的混合物溶解粗提物，配成質量濃度約20％的溶液，在不斷攪拌下，加入相當于粗提物3～7倍質量的大約200目的柱層析硅膠，將拌樣后的硅膠在常溫下晾干，加到硅膠柱的頂端，進行干柱層析，依次采用氯仿、乙酸乙酯進行洗脫，收集乙酸乙酯流份，負壓蒸除溶劑后，得一次粗分物，該粗分物中的狼毒色原酮含量為45％～55％，可直接用于配制醫用或農用殺菌劑；(4)將一次粗分物采用與(3)類似的方法進行柱層析，所不同的是采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，以狼毒色原酮標準品為對照，采用TLC法或HPLC法對各流份進行檢測，合并含有狼毒色原酮的流份，負壓蒸除溶劑后，得二次粗分物，該粗分物中的狼毒色原酮含量為80％～90％，可直接用于配制醫用或農用殺菌劑；(5)用甲醇溶解二次粗分物，上sephadex LH-20柱進行純化，收集含有狼毒色原酮的流份，負壓蒸除溶劑后，得狼毒色原酮精品，含量為95％～99％，可作為標準樣品或分析純化學試劑使用。
4.根據權利要求3所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(1)中，提取溶劑選用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇中的一種，提取方案包括A.直接用乙酸乙酯或丙酮進行超聲提取，料(kg)/液(L)比控制在1∶4～1∶10，提取溫度為30℃～55℃，所得粗提取物為淡黃色無晶形粉末，含有5％～10％的狼毒色原酮，直接用于柱層析分離，乙酸乙酯和丙酮的提取率分別為5％～6％和7％～8％；B.首先采用甲醇進行超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得粗提物可直接用于配制植物殺菌劑或二次提取，本次提取率為18％～25％，用丙酮對甲醇粗提物進行二次超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得丙酮粗提物相當于所用植物材料的10％～12％，為黃色無晶形粉末，含有5％～10％的狼毒色原酮，直接用于柱層析分離。
5.根據權利要求4所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(2)中，將粗提物用丙酮配成質量濃度約20％的溶液，加入3～7倍質量的柱層析用硅膠，室溫晾干拌樣后的硅膠或用40℃熱風常壓干燥，然后加到硅膠柱頂端進行第一次干柱層析粗分，硅膠柱的規格為高度/直徑10∶1，硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的1～3倍，首先采用氯仿進行洗脫，直到流出液幾乎無色為止，然后換用乙酸乙酯洗脫，直至TLC或HPLC檢測無狼毒色原酮流出，合并乙酸乙酯流份，蒸除溶劑后得一次粗分物，其質量約為上樣量的40％～50％，該粗分物的狼毒色原酮含量為45％～55％。
6.根據權利要求5所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(3)中，將一次粗分物用丙酮配成飽和溶液，加到硅膠柱頂端進行濕柱硅膠層析，硅膠柱的規格為高度/直徑20∶1，硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的50～100倍，以氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，收集含有狼毒色原酮的主要流份，蒸除溶劑后得二次粗分物，黃色無晶形粉末，其質量約為上樣量的40％～50％，狼毒色原酮的含量為80％～90％。
7.根據權利要求6所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于所述步驟(4)中，將二次粗分物用甲醇配成飽和溶液，并事先用甲醇平衡過的sephadex LH-20進行純化，柱子的規格為高度/直徑10∶1，sephadex LH-20的粒度為200～400目，上樣量為柱中sephadex LH-20用量的50～100倍，以甲醇為洗脫劑，減壓濃縮含狼毒色原酮的流份，得狼毒色原酮精品，其質量約為上樣量的85％～90％，相當于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，純度為95％～99％。
8.根據權利要求1、2、3、4、5、6或7所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法，其特征在于狼毒色原酮的化學結構特征和特征物理參數如下 狼毒色原酮(chamaechromone)狼毒色原酮，為淡黃色粉末，mp245℃(分解)，[α]D＝+127.434°(c 0.076，MeOH)，UV(MeOH，nm)λmax296，260，212。IR(KBr)υmaxcm-13401(O-H)，1654(C＝O)，1630、1511(C＝C)，1238、1174、1070(C-O)。FAB MS e/z543([M+1]+，100)，344([M-HOC6H4CH2C6H4OH+1]+，38)，199([HOC6H4CH2C6H4OH]+，65)。1H NMRδ(CD3OD)4.64(1H，d，J＝12Hz，H-12)，5.80(2H，s，H-16，H-18)，6.13(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.36(1H，d，J＝12.0Hz，H-11)，7.94(1H，s，H-2).以下四組峰為H-21，H-22，H-24，H-25，H-27，H-28，H-30，H-316.75(1H，d，J＝7.0Hz)，6.64(1H，d，J＝7.0Hz)，7.07(1H，d，J＝7.0Hz)，7.20(1H，d，J＝7.0Hz).13C NMRδ(CD3OD)48.32(C-11)，54.09(C-12)，94.36(C-8)，96.04(C-16)，96.04(C-18)，99.78(C-6)，105.24(C-10)，106.17(C-14)，115.53(C-28)，115.53(C-30)，115.69(C-22)，115.69(C-24)，121.75(C-3)，129.61(C-25)，129.61(C-21)，130.51(C-27)，130.51(C-31)，134.68(C-26)，135.61(C-20)，156.36(C-29)，156.39(C-23)，156.94(C-2)，158.48(C-9)，163.22(C-5)，165.03(C-15)，165.03(C-19)，165.22(C-7)，165.73(C-17)，181.04(C-4)，204.22(C-13)；HPLC圖譜洗脫劑CH3OH/H2O(V/V)47∶5，Waters ALC/JPC-201高壓液相色譜儀，柱子為Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒徑4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外檢測器，檢測波長296nm。
9.一種瑞香狼毒中狼毒色原酮作為植物殺菌劑的應用，其特征在于所述殺菌劑以瑞香狼毒根提取物為原料，以狼毒色原酮為主要殺菌有效成分，用于預防和治療由蘋果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等引起的植物病害。
10.根據權利要求9所述的瑞香狼毒中狼毒色原酮作為植物殺菌劑的應用，其特征在于所述述狼毒色原酮為2200mg·L-1濃度。
全文摘要
本發明涉及一種瑞香狼毒中狼毒色原酮的提取分離方法及其應用，其從瑞香狼毒根中分離鑒定出一個對多種植物病原菌具有抑制和殺滅作用的廣譜性殺菌活性成分，即狼毒色原酮，本發明包括以下操作步驟以瑞香狼毒根為原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯與丙酮的混合物為溶劑，采用30℃～55℃超聲波常壓連續提取3次，每次提取時間30～50min。提取液經過濾、濃縮和柱色譜層析獲得60％～99％的狼毒色原酮。
文檔編號C07D311/22GK1544426SQ20031010594
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月20日 優先權日2003年11月20日
發明者周樂, 周 樂 申請人:周樂, 周 樂