專利名稱：：多肽、抗體可變域和拮抗劑的制作方法多肽、抗體可變域和拮抗劑本發明涉及蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白(抗體)單可變域和包含這些的抗腫瘤壞死因子1(TNFRl，p55，CD120a，P60，TNF受體超家族成員1A，TNFRSF1A)拮抗劑。本發明進一步涉及含有該抗-TNFR1配體的用途、制劑、組合物和裝置。
背景技術：
：多肽和肽日益成為各種應用中的重要制劑，這些應用包括工業應用和用作醫學、治療和診斷試劑。然而，在特定的生理學情況中，如炎癥(例如，COPD)狀況和癌癥中，組織、器官或動物(例如，在肺中，在腫瘤中或鄰近腫瘤)中存在的蛋白酶含量將增加。這種蛋白酶的增加會導致內源蛋白質以及給藥來治療疾病的治療肽、多肽和蛋白質加速的降解和失活。因此，對體內使用(例如，用于治療、診斷或預防疾病)具有潛能的一些藥劑僅僅具有有限的功效，因為它們受到蛋白酶的快速降解和滅活。蛋白酶抗性多肽提供了若干優勢。例如，蛋白酶抗性多肽在體內能比蛋白酶敏感性藥劑保持更長時間的活性，因此，能將功能保持足以產生生物效應的時間段。對于選擇能抵抗蛋白酶降解并且還具有理想生物活性的多肽的改進方法還存在著需求。TNFR1TNFR1是一種跨膜受體，其含有結合配體的胞外區和缺少固有信號轉導活性但能夠結合信號轉導分子的胞內結構域。TNFR1與所結合的TNF的復合物含有三條TNFR1鏈和三條TNF鏈。(Banner等人，Cell，73(3)431-445(1993).)TNF配體作為被三條TNFR1鏈結合的三聚體而存在(同上)。在受體-配體復合物中，三條TNFRl鏈被緊密聚簇(cluster)在一起，而這種聚簇是TNFR1介導的信號轉導的先決條件。事實上，結合TNFR1的多價試劑例如抗-TNFR1抗體能夠在不存在TNF時誘導TNFR1聚簇和信號轉導，并且通常被用作TNFR1激動劑(參見例如，Belka等人，EMBO，14(6):1156-1165(1995);Mandik-Nayak等人，J.Immunol,167:1920-1928(2001).)。因此，結合TNFR1的多價試劑通常不是有效的TNFR1拮抗劑，甚至即使它們阻斷TNFa與TNFR1的結合時。TNFR1的胞外區包含十三個氨基酸的氨基末端區段(SEQIDNO:603(人)的氨基酸1-13;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸1-13)、結構域1(SEQIDN0:603(人)的氨基酸14-53;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸14-53)、結構域2(SEQIDN0:603(人)的氨基酸54-97;SEQIDNO:604(小鼠)的氨基酸54-97)、結構域3(8SEQIDN0:603(人)的氨基酸98-13;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸98-138)、和結構域4(SEQIDN0:603(人)的氨基酸139-167;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸139-167)，后面是近膜區(SEQIDNO:603_(人)的氨基酸168-182;SEQIDN0:604(小鼠)的氨基酸168-183)(參見Banner等人，Cell73(3)431-445(1993)和Loetscher等人，Cell61(2)351-359(1990).)。結構域2和3與所結合的配體(TNFP，TNFa)接觸(Banner等人，Cell,73(3)431-445(1993).)。TNFR1的胞外區還含有一個區域，其被稱為前-配體結合組裝結構域(pre-ligandbindingassemblydomain)或PLAD結構域(SEQIDNO:603_(人)的氨基酸1-53;SEQIDNO:604(小鼠)的氨基酸1-53)(美國政府，WO01/58953;Deng等人，NatureMedicine,doi:10.1038/nml304(2005))。在體內通過一種處理將TNFR1從細胞的表面除去，該處理包括在結構域4或在近膜區(SEQIDNO:603的氨基酸168-182;SEQIDNO:604的氨基酸168-183)中TNFR1的蛋白質水解，以產生可溶形式的TNFR1。可溶的TNFR1保持了結合TNFa的能力，進而能夠作為TNFa活性的內源性抑制劑。發明概述在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少93%同一性的氨基酸序列的多肽。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%。在一個實施方案中，多肽是DOMlh-131_206。本發明進一步提供了(基本上)純的DOMlh-131-206單體。在一個實施方案中，DOMlh-131-206為至少98、99、99.5%純或100%純的單體。在一個方面中，本發明提供了一種多肽是由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)為至少80%同一性的核苷酸序列編碼的。在一個實施方案中，同一性百分比為至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)為至少57X同一性的核苷酸序列編碼的多肽，并且其中該多肽包含與D0Mlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少93%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，核苷酸序列的同一性百分比為至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一個實施方案中，氨基酸序列的同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%或100%。例如，核苷酸序列可以是DOMlh-131-206核苷酸序列(顯示于圖19中)的密碼子優化形式。序列的密碼子優化是本領域已知的。在一個實施方案中，對于在細菌(例如，大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如，熒光假單胞菌(Pfluorescens))、哺乳動物(例如，CHO)或酵母宿主細胞(例如，畢赤酵母屬(Picchia)或酵母屬(Saccharomyces)，例如，巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)或釀酒酵母(S.cerevisiae))中的表達，將核苷酸序列優化。在一個方面中，本發明提供了含有本發明多肽的融合蛋白。在一個方面中，本發明提供了抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其包含與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少93%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了抵抗蛋白酶的抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其包含與DOMlh-131-206的氨基酸序列為至少90%同一性的氨基酸序列。在這些方面的一個實施方案中，同一性百分比為至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域在位置53包含天冬氨酸，其中編號是根據Kabat("SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，，(免疫學重要性蛋白的序列)，USD印artmentofHealthandHumanServices(美國衛生和人類服務部)，1991)。在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域在位置91包含組氨酸，其中編號是根據Kabat。在一個方面中，本發明提供了抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域，其包含與DOMlh-131-206的氨基酸序列相同的氨基酸序列。8在一個方面中，本發明提供了由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)為至少80X同一性的核苷酸序列編碼的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，同一性百分比為至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)為至少57X同一性的核苷酸序列編碼的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域，并且其中可變域包含與D0Mlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少93%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，核苷酸序列的同一性百分比為至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。在一個實施方案中，氨基酸序列的同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%或100%。例如，核苷酸序列可以是DOMlh-131-206核苷酸序列(顯示于圖19中)的密碼子優化形式。序列的密碼子優化是本領域已知的。在一個實施方案中，對于在細菌(例如，大腸桿菌或假單胞菌屬，例如，熒光假單胞菌)、哺乳動物(例如，CHO)或酵母宿主細胞(例如，畢赤酵母屬或酵母屬，例如，巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母)中的表達，將核苷酸序列優化。在一個方面中，本發明提供了由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)相同的序列編碼的抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個方面中，本發明提供了含有根據本發明的抗-TNFR免疫球蛋白單可變域的抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，拮抗劑包含第一和第二免疫球蛋白單可變域，其中每個可變域是根據本發明的。例如，其中拮抗劑包含所述單可變域的單體或所述單可變域的同型二聚體。在一個實施方案中，那個或每個單可變域的氨基酸序列與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列的氨基酸序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，CDR序列同一性為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列的氨基酸序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，CDR序列同一性為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗_TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，CDR序列同一性為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列的氨基酸序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12Ul、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12Ul、10、9、8、7、6、5、4、3、2或l個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12Ul、10、9、8、7、6、5、4、3、2或l個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同或在不超過25個氨基酸位置不同于DOMlh-131-206的氨基酸序列并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個或每個CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，CDR序列同一性為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR1序列為至少50%同一性的CDR2序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，CDR序列同一性為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR1序列為至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，CDR序列同一性為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個CDR的CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個CDR的CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述一種或更多種的蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個CDR的CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個或每個CDR的CDR序列同一性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了含有免疫球蛋白單可變域的抗-TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑，該免疫球蛋白單可變域含有D0Mlh-131-206(顯示于圖3中)的CDRl、CDR2和/或CDR3的序歹lj(例如，CDR1，CDR2，CDR3，CDR1和2，CDR1和3，CDR2和3，或CDRl、2和3)。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個方面中，本發明提供了與DOMlh-131-206競爭與TNFR1結合的TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑。因此，拮抗劑可以結合與DOMlh-131-206相同的表位或重疊的表位。在一個實施方案中，拮抗劑包含具有與DOMlh-131-206(顯示于圖3中)的氨基酸序列為至少93%同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個實施方案中，拮抗劑是抗體或其抗原結合片段，如具有TNFR1結合特異性的單價抗原結合片段(例如，scFv、Fab、Fab'、dAb)。拮抗劑的其他實例是本文所述的結合TNFR1的配體。配體可以包含具有TNFR1結合特異性的免疫球蛋白單可變域或結構域抗體(dAb)，或以合適形式的該dAb的互補性決定區。在一些實施方案中，配體是基本上由具有TNFR1結合特異性的免疫球蛋白單可變域或dAb組成或由具有TNFR1結合特異性的免疫球蛋白單可變域或dAb組成的dAb單體。在其他實施方11案中，配體是包含合適形式如抗體形式的dAb(或dAb的CDR)的多肽。本發明的某些TNFRl的拮抗劑不抑制TNFa與TNFRl的結合，而是抑制通過TNFRl介導的信號轉導。例如，TNFR1的拮抗劑能夠抑制在通過TNFRl的信號轉導之前的TNFa-誘導的TNFRl的聚簇。這些拮抗劑提供了某些優點。例如，在存在這類拮抗劑時，TNFa能夠結合在細胞表面上所表達的以及從細胞環境移除的TNFRl，但是TNFRl介導的信號轉導不能被激活。因此，TNFRl信號誘導的其他TNFa以及其他炎癥介質的產生將被抑制。類似地，結合TNFRl并抑制通過TNFRl所介導的信號轉導但不會抑制TNFa結合TNFRl的TNFRl拮抗劑，將不會抑制內源產生的可溶TNFRl的TNFa-結合并抑制活性。因此，為有此需要的哺乳動物給藥這類拮抗劑能夠補充抑制體內TNFa活性和TNFRl活性的內源調控途徑。本發明還涉及配體，所述配體(i)結合TNFRl(例如，在結構域1中)，(ii)拮抗TNFRl介導的信號轉導的激活，和(iii)不抑制TNFa與TNFRl的結合。這類配體結合可溶TNFRl而不防止可溶受體結合TNFa，進而為有此需要的哺乳動物給藥這類拮抗劑，能夠通過提高血清中可溶受體半衰期而補充體內抑制TNFa活性的內源調節通路。這些優點與一些配體特別相關，這些配體已經通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或通過綴合抗體結構域，而被格式化，以具有較大的流體動力學大小。例如，(i)結合TNFRl(如在結構域1中)，(ii)拮抗TNFRl介導的信號轉導活動和(iii)沒有抑制TNFa與TNFRl如dAb單體的結合的物質(例如，多肽、可變域或拮抗劑)可以格式化(formatted)成較大的抗體的抗原結合片段或格式化為抗體(例如，格式化成Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFv)。還可以通過將TNFRl結合劑(拮抗劑、可變域)綴合或連接結合提高體內半衰期的抗原或表位的結合域(例如，抗體或抗體片段)來提高配體的流體動力學大小及其血清半衰期，如本文所述的(參見，W02006038027的附錄l，在此將其整體引入作為參考)。例如，可以將TNFR1結合劑(例如，多肽，例如，dAb)綴合或連接抗_血清白蛋白或抗_新生兒Fc受體抗體或抗體片段，例如，抗-SA或抗新生兒Fc受體dAb、Fab、Fab'或scFv，或抗_SA親和體(affibody)或抗-新生兒Fc受體親和體。用于根據本發明的TNFRl-結合配體中的合適的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的實例描述于W02005/077042A2和W02006038027中，在此將其整體引入作為參考。在整個說明書中描述的本發明的其他實施方案中，替代本發明的拮抗劑或配體中"dAb"的使用，設想本領域技術人員可以使用含有結合TNFRl的dAb的CDR的結構域(例如，嫁接于合適的蛋白質支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為親和體、SpA支架、LDL受體A類結構域或EGF結構域)或可以是含有TNFR1結合位點的蛋白質結構域，例如，其中結構域選自親和體、SpA結構域、LDL受體A類結構域或EGF結構域。因此認為本文公開內容作為整體提供了使用這樣的結構域替代dAb的拮抗劑、配體和方法的公開內容。本發明的多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑可以抵抗以下的一種或更多種絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(caspase)(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋12)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻漿或生物制劑來提供蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是在痰液、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中發現的蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是在眼睛和/或眼淚中發現的。在一個實施方案中，蛋白酶是非細菌蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是動物蛋白酶，例如，哺乳動物蛋白酶，例如，人蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如，在人體中發現的GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶。在此所列的這些蛋白酶也可以用于本文所述的涉及蛋白酶庫組(r印ertoire)暴露于蛋白酶的方法中。在一個方面中，本發明提供了包含TNFaI型受體(TNFR1;p55)結合位點的蛋白酶抗性免疫球蛋白單可變域，其中與以下溫育時，可變域能抵抗蛋白酶例如胰蛋白酶(i)在37t:下用濃度(c)為至少10微克/ml的蛋白酶溫育至少一個小時的時間(t);或(ii)在3(TC下用濃度(c')為至少40微克/ml的蛋白酶溫育至少一個小時的時間a)，其中所述可變域包含與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少90%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與可變域的比例(以摩爾/摩爾為基礎)為8,000至80，000蛋白酶可變域，例如，C為10微克/ml時，比例為800至80，000蛋白酶可變域；或C或C'為100微克/ml時，比例為8，000至80，000蛋白酶可變域。在一個實施方案中，蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與可變域的比例(以重量/重量為基礎，例如微克/微克)為16，000至160，000蛋白酶:可變域，例如，C為10微克/ml時，比例為1，600至160，000蛋白酶可變域；或C或C'為100微克/ml時，比例為16，000至160，000蛋白酶可變域。在一個實施方案中，濃度(c或c')為至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一個實施方案中，濃度(c或c')為至少100或1000微克/ml蛋白酶。參照在此對使用肽或多肽的組或文庫工作時適于蛋白酶使用的蛋白水解活性的條件的描述(例如，w/w參數)。這些條件可以用于測定特定免疫球蛋白單可變域的蛋白酶抗性的條件。在一個實施方案中，時間(t)為或約為一、三或24小時或過夜(例如，約12-16小時)。在一個實施方案中，可變域在條件(i)下是有抗性的，并且濃度(c)為或約為10或100微克/ml蛋白酶，而時間(t)為1小時。在一個實施方案中，可變域在條件(ii)下是有抗性的，并且濃度(c')為或約為40微克/ml蛋白酶，而時間(t)為或約為3小時。在一個實施方案中，蛋白酶選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶。在一個實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是在痰液、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中發現的蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是在眼睛和/或眼淚中發現的。在一個實施方案中，蛋白酶是非細菌蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是動物蛋白酶，例如，哺乳動物蛋白酶，例如，人蛋白酶。在一個實施方案中，蛋白酶是GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如，在人體中發現的GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶。在此所列的這些蛋白酶也可以用于本文所述的涉及蛋白酶庫組暴露于蛋白酶的方法中。13在一個實施方案中，可變域能抵抗胰蛋白酶和/或選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶中的至少一種其他蛋白酶。例如，能抵抗胰蛋白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和leucozyme;或胰蛋白酶、胰酶和leucozyme。在一個實施方案中，在條件(i)或(ii)下溫育后，例如，在106至1013的噬菌體文庫大小，例如108至1012復制單位(傳染性病毒粒子)，在噬菌體上展示可變域。在一個實施方案中，在條件(i)或(ii)下溫育后，可變域特異性地結合TNFRl，例如，使用BiaCore或ELISA來測定，例如，噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA。在一個實施方案中，本發明的可變域特異性地結合蛋白A或蛋白L。在一個實施方案中，在條件(i)或(ii)下溫育后，存在與蛋白A或L的特異性結合。在一個實施方案中，例如，在條件(i)或(ii)下溫育后，本發明的可變域在ELISA中，例如，在噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA中，具有至少0.404的0D45。讀數。在一個實施方案中，例如，在條件(i)或(ii)下溫育后，本發明的可變域在凝膠電泳中(基本上)展示出單條條帶。在特定的實施方案中，本發明提供了為雙特異性配體的TNFRl拮抗劑，其含有根據本發明的結合TNFR1的第一dAb和具有與第一dAb相同或不同結合特異性的第二dAb。第二dAb可以結合選自ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養素-1、CEA、CD40、CD40配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受體、ENA_78、嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化蛋白-2、Exodus-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-堿性、成纖維細胞生長因子-10、FLT3配體、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-P1、人血清白蛋白、胰島素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-1a、IL-1P、IL-1受體、IL-1I型受體、IL_2、IL_3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-8(72a.a.)、IL_8(77a.a.)、IL_9、IL-IO、IL-ll、IL_12、IL_13、IL_15、IL_16、IL_17、IL-18(IGIF)、抑制素a、抑制素13、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦蛋白(L印tin)、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1a、MIP-1P、MIP-3a、MIP-3P、MIP-4、脊髓源祖細胞抑制劑因子-I(MPIF-1)、NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、P-NGF、NT_3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF_4、RANTES、SDF1a、SDF1P、SCF、SCGF、干細胞因子(SCF)、TARC、TGF_a、TGF_P、TGF_P2、TGF_P3、月中瘤壞死因子(TNF)、TNF_a、TNF_P、TNF受體I、TNF受體II、T肌-l、TPO、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、VEGF受體3、GCP-2、GR0/MGSA、GR0-P、GRO-y、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、血清白蛋白、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白a)、匪P12、PDK1、IgE、IL-13Ra1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL_16、IL-17R、IL_17、IL_18、IL-18R、IL_23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-l)、糜蛋白酶、FGF、Furin、內皮縮血管肽-1、嗜酸粒細胞趨化蛋白(例如，嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化蛋白_2、嗜酸粒細胞趨化蛋白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整聯蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、匪P、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-l、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、a4P7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、avP6、avp8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白a)、匪P12、PDK1和IgE的目標物。在一個實例中，雙特異性配體包含結合TNFR1上第一表位的第一dAb和結合不同目標上表位的第二dAb。在另一個實例中，第二dAb結合血清白蛋白上的表位。在其他實施方案中，配體是包含具有TNFR1結合特異性的第一表位結合域和至少一個具有不同于第一表位結合域的結合特異性的其他抗原結合域的多特異性配體。例如，第一表位結合域可以是結合TNFR1的dAb或可以是包含結合TNFR1的dAb的CDR(例如，嫁接于合適的蛋白質支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為親和體、SpA支架、LDL受體A類結構域或EGF結構域)的結構域或可以是結合TNFRl的結構域，其中結構域選自親和體、SpA結構域、LDL受體A類結構域或EGF結構域。在特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或抗-TNFRldAb單體的特征在于以下的一個或更多個1)與人TNFR1解離，具有50nM至20pM的解離常數(Kd)和5X10—1至1X10—7s—1的K。ff速度常數；如通過表面等離子共振所測定的；2)抑制腫瘤壞死因子a(TNFa)與TNFRl的結合，具有500nM至50pM的IC50;3)在標準L929細胞測試中中和人TNFRl，具有500nM至50pM的ND50;4)在標準細胞測試中對抗TNFRl的活性，具有《lOOnM的ND5。，并且在該測試中濃度<10iiM的dAb激動TNFRl的活性<5%;5)抑制在小鼠LSP/D-半乳糖胺誘導的敗血病性休克模型中的致死力；6)抵抗聚集；7)當在大腸桿菌或畢赤酵母屬種(例如，巴斯德畢赤酵母)中表達時，以至少約0.5mg/L的量分泌；8)可逆地去折疊(unfold);9)在選自小鼠膠原誘導的關節炎模型、小鼠AARE關節炎模型、小鼠AARE炎性腸病模型、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導的炎性腸病模型、小鼠煙草煙霧慢性梗阻性肺病模型和適當的靈長動物模型(例如靈長動物膠原誘導的關節炎模型)的慢性炎癥疾病的模型中具有功效；或10)在治療、抑制或預防慢性炎癥疾病中具有功效。對于適用于條件(1)至(10)的測定和測試以及參數的詳細內容，參考W02006038027，并且在此將其引入作為參考。在特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFR1解離，具有50nM至20pM的解離常數(Kd)和5X10—工至1X10—7s—^勺K。ff速度常數，如通過表面等離子共振所測定的；抑制腫瘤壞死因子a(TNFa)與TNFRl的結合，具有500nM至50pM的IC50;在標準L929細胞測試中中和人TNFRl，具有500nM至50pM的ND50。在其他特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數(Kd)禾P5X10—1至1X10—7s—'的K。ff速度常數；抑制腫瘤壞死因子a(TNFa)與TNFRl的結合，具有500nM至50pM的IC50;并且在選自小鼠膠原誘導的關節炎模型、小鼠AARE關節炎模型、小鼠AARE炎性腸病模型、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導的炎性腸病模型、小鼠煙草煙霧慢性梗阻性肺病模型和適當的靈長動物模型(例如靈長動物膠原誘導的關節炎模型)的慢性炎癥疾病的模型中具有功效。在其他特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數(Kd)和5X10—1至1X10—的K。ff速度常數，如通過表面等離子共振所測定的；在標準L929細胞測試中中和人TNFRl，具有500nM至50pM的ND50;并且在標準細胞測試中拮抗TNFRl的活性，具有《lOOnM的ND5。，并且濃度《10yM的dAb在測試中激動TNFRl的活性《5%。本發明的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑在哺乳動物例如人的疾病或病癥的治療、預防和診斷中具有實用性。特別地，由于給藥于患者如人時藥物很可能遇到蛋白酶，因此它們具有實用性。例如，給藥于GI道(例如，口服、舌下、直腸給藥)時，在該情況中，多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑可能遇到上GI道、下GI道、口、胃、小腸和大腸中的一個或更多個中的蛋白酶。因此，一個實施方案提供了口服、舌下或直腸給藥于患者GI道的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑，以治療和/或預防患者的疾病或病癥。例如，口服給藥于患者(例如，人患者)，用于治療和/或預防TNF-介導的病癥或疾病，如關節炎(例如類風濕性關節炎)、IBD、牛皮癬或克羅恩氏病(Crohn'sdisease)。[OOSO]在另一個實例中，給藥于(例如，通過吸入或鼻內)肺部組織(例如，肺或氣道)時，多肽、可變域或拮抗劑很可能遇到蛋白酶。因此，一個實施方案提供了通過吸入或鼻內將蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑給藥于患者(例如，人)的肺部組織，以治療和/或預防患者的疾病或病癥。這樣的病癥可以是哮喘(例如，過敏性哮喘)、C0PD、流感或W02006038027中公開的任何其他肺部疾病或病癥，在此引入作為參考。在另一個實例中，給藥于(例如，通過眼內注射或作為滴眼劑)患者眼睛時，多肽、可變域或拮抗劑很可能遇到蛋白酶。因此，一個實施方案提供了將蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑通過眼睛給藥于患者(例如，人)，以治療和/或預防患者的疾病或病癥(例如，眼睛的疾病或病癥)。給藥可以是局部給藥于眼睛，以滴眼劑的形式，或通過注入眼睛中，例如進入玻璃體中。根據本發明的拮抗劑、多肽和免疫球蛋白單可變域可以呈現出提高的或相對高的解鏈溫度(Tm)，提供提高的穩定性。高親和性目標結合也是或者是可替換地是拮抗劑、多肽和可變域的特征。這些特征中的一個或更多個，結合蛋白酶抗性，使得拮抗劑、可變域和多肽可以用作哺乳動物如人的藥物，其中，例如對于GI道或肺部組織給藥，很可能遇到蛋白酶。因此，在一個方面中，本發明提供了用于口服遞送的TNFR1拮抗劑。在一個方面中，本發明提供了用于遞送至患者GI道的TNFR1拮抗劑。在一個方面中，本發明提供了TNFR1拮抗劑在制造用于口服遞送的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供了TNFR1在制造用于遞送至患者GI道的藥物中的用途。在一個實施方案中，可變域能抵抗胰蛋白酶和/或至少一種選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶的其他蛋白酶。例如，能抵抗胰蛋白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和leucozyme;胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和leucozyme;或胰蛋白酶、胰酶和leucozyme。在一個方面中，本發明提供了用于肺部遞送的TNFR1拮抗劑。在一個方面中，本發明提供了TNFR1拮抗劑用于遞送到患者的肺。在一個方面中，本發明提供了TNFR1拮抗劑在制造用于肺部遞送的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供了TNFR1拮抗劑在制造用于遞送至患者肺部的藥物中的用途。在一個實施方案中，可變域能抵抗leucozyme。在一個方面中，本發明提供了口服遞送或遞送藥物至患者的GI道或至患者的肺或肺部組織的方法，其中該方法包括將藥物學上有效量的本發明的TNFR1拮抗劑給藥于患者。在一個方面中，本發明提供了本發明的TNFRl拮抗劑用于治療和/或預防炎癥。在一個方面中，本發明提供了TNFRl拮抗劑在制造用于治療和/或預防炎癥的藥物中的用途。在一個實施方案中，病癥選自關節炎、多發性硬化、炎性腸病和慢性梗阻性肺病。例如，所述16關節炎是類風濕性關節炎或幼年型類風濕性關節炎。例如所述炎性腸病選自克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎。例如，所述慢性梗阻性肺病選自慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎和肺氣腫。例如所述肺炎是細菌性肺炎。例如所述細菌性肺炎是葡萄球菌性肺炎。在一個方面中，本發明提供了TNFR1拮抗劑用于治療和/或預防呼吸道疾病。在一個方面中，本發明提供了TNFR1拮抗劑在制造用于治療和/或預防呼吸道疾病的藥物中的用途。例如，所述呼吸道疾病選自肺炎、慢性梗阻性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒細胞浸潤癥、環境性肺病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質性肺炎、原發性肺動脈高壓、肺血栓栓塞癥、胸膜病癥、縱隔病癥、橫膈膜病癥、肺換氣不足、換氣過度、睡眠窒息、急性呼吸窘迫綜合癥、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植對抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏癥、石綿沉著病、曲霉腫、曲霉病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜酸細胞性肺炎、特發性肺纖維化、入侵性肺炎球菌病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸腔積液、肺塵癥、肺孢子蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著癥、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺炎、肺組織細胞增生癥X、肺動脈高壓、肺諾卡菌病、肺結核、肺靜脈閉塞癥、類風濕性肺病、結節病和韋格內氏肉芽腫癥。例如，疾病是慢性梗阻性肺病(C0PD)。例如，疾病是哮喘。可以使用任何合適的方法將本發明含有抑制TNFR1的藥劑(例如，其中藥劑選自抗體片段(例如，Fab片段、Fab'片段、Fv片段(例如，scFv、二硫化物鍵合的Fv)、F(ab')2片段、dAb)、配體以及dAb單體和多聚體(例如，同型-或雜二聚體))的拮抗劑局部給藥于對象肺組織(例如，肺)。例如，可以通過吸入或鼻內給藥將藥劑局部給藥于肺部組織。對于吸入或鼻內給藥，可以使用噴霧器、吸入器、霧化器、煙霧器、彌霧器、干粉吸入器、計量吸入器、計量噴霧器、計量彌霧器、計量霧化器或其他合適的吸入器或鼻內遞送裝置來給藥TNFR1的拮抗劑。因此，在一個實施方案中，本發明提供了含有TNFR1拮抗劑的肺遞送裝置。在一個實施方案中，裝置是吸入器或鼻內遞送裝置。在一個方面中，本發明提供了含有TNFR1拮抗劑的口服制劑。該制劑可以是片劑、丸劑、膠囊、液體或糖漿。在一個方面中，本發明提供了用于遞送至肺的肺制劑，其中制劑含有本發明的拮抗劑、多肽或可變域，粒徑范圍小于5微米，例如，小于4.5、4、3.5或3微米(例如，在Britton-Robinson緩沖液中時，例如，在6.5至8.0的pH，例如在7至7.5的pH，例如在pH7或pH7.5)。在一個實施方案中，在6.5至8.0的pH下提供本發明的制劑和組合物，例如7至7.5，例如7，例如7.5。根據本發明任一方面的可變域可以具有至少5(TC的Tm，或至少55t:，或至少6(TC，或至少65t:，或至少7(rC。本發明的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑可以含有這樣的可變域。在本發明的一個方面中，本發明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或制劑在Britton-Robinson緩沖液中在37至50。C下溫育14天后(在lmg/ml的多肽或可變域濃度下)基本上是穩定的。在一個實施方案中，在37t:下這樣的溫育后，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在37t:下這樣的溫育后，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在5(TC下這樣的溫17育后，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在50°C下這樣的溫育后，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的溫育后，未看到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。在一個實施方案中，在37t:下在Britton-Robinson緩沖液中以lmg/ml的多肽或可變域濃度溫育后，多肽或可變域的pi保持未改變或基本上未改變。在本發明的一個方面中，本發明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或制劑在Britton-Robinson緩沖液在7至7.5的pH(例如，在pH7或pH7.5)在4"C下溫育7天后(在100mg/ml的多肽或可變域濃度下)基本上是穩定的。在一個實施方案中，在這樣的溫育后，至少95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在這樣的溫育后，至少95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的溫育后，未看到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。在本發明的一個方面中，本發明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或制劑在例如噴射噴霧器，例如在PariLC+杯中，例如，在室溫、20°C或37°C下噴霧1小時后(在40mg/ml的多肽或可變域濃度下)基本上是穩定的。在一個實施方案中，在這樣的噴霧后，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在這樣的噴霧后，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的噴霧后，未看到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。根據本發明任何方面的可變域可以在MRC-5細胞測試中中和TNFa剌激的IL_8釋放，其具有2nM50pM的ND50。本發明的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑可以包含這類可變域。在一個方面中，本發明提供了編碼含有根據本發明任一方面的免疫球蛋白單可變域的多肽或編碼根據本發明任一方面的多肽、拮抗劑或可變域的分離的或重組的核酸。在一個方面中，本發明提供了含有核酸的載體。在一個方面中，本發明提供了含有核酸或載體的宿主細胞。在一個方面中，本發明提供了生產含有免疫球蛋白單可變域的多肽的方法，該方法包括在適于所述核酸或載體表達的條件下維持宿主細胞，由此產生含有免疫球蛋白單可變域的多肽。該方法進一步包括分離多肽、可變域或拮抗劑，并任選產生比分離的多肽可變域或拮抗劑具有提高的親和性和/或ND50的變體，例如，突變體。用于提高免疫球蛋白單可變域的結合親和性的技術是本領域已知的，例如，用于親和性突變的技術。在一個方面中，本發明提供了含有本發明任一方面的免疫球蛋白單可變域、多肽或拮抗劑和藥物學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。在一個實施方案中，本發明任一方面的免疫球蛋白單可變域或拮抗劑含有抗體恒定域，例如，抗體Fc，任選其中Fc的N-端連接(任選直接連接)可變域的C-端。本發明的多肽或可變域可以是分離的和/或重組的。本文描述了用于選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多肽，在適于蛋白酶活性的條件下混合組和蛋白酶，并回收具有理想生物活性(例如特異性結合TNFR1)的肽或多肽，由此選擇蛋白酶抗性肽或多肽。通常將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何所需的蛋白酶，如以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶(actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻漿或生物制劑來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成溫育后將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白酶的混合物中。在一些實施方案中，基于結合活性回收具有所需生物活性的肽或多肽。例如，可以基于結合通用配體(如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收肽或多肽。結合活性還可以是對目標配體的特異性結合。示例性目標配體包括ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養素-1、CEA、CD40、CD40配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化蛋白_2、Exodus-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-堿性、成纖維細胞生長因子_10、FLT3配體、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-P1、人血清白蛋白、胰島素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-1a、IL-1P、IL-1受體、IL-1I型受體、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL_9、IL-IO、IL-ll、IL_12、IL_13、IL_15、IL_16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素a、抑制素P、IP-10、角化細胞生長因子_2(KGF-2)、KGF、瘦蛋白、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-1a、MIP-1P、MIP-3a、MIP-3P、MIP-4、脊髓源祖細胞抑制劑因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、P-NGF、NT_3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF_4、RANTES、SDF1a、SDF1P、SCF、SCGF、干細胞因子(SCF)、TARC、TGF_a、TGF_P、TGF—P2、TGF—P3、月中瘤壞死因子(TNF)、TNF_a、TNF—P、TNF受體I、TNF受體II、T肌-l、TP0、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、VEGF受體3、GCP-2、GR0/MGSA、GR0-P、GR0-y、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、血清白蛋白、vWF、淀粉樣蛋白(例如，淀粉樣蛋白a)、匪P12、PDK1、IgE、IL-13Ra1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL_16、IL-17R、IL_17、IL_18、IL-18R、IL_23、IL-23R、IL_25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Furin、內皮縮血管肽-l、嗜酸粒細胞趨化蛋白(例如，嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化蛋白_2、嗜酸粒細胞趨化蛋白-3)、GM-CSF、ICAM-1、IC0S、IgE、IFNa、I-309、整聯蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、匪P、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X_40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-l、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、a4P7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、av06、avP8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白19(例如，淀粉樣蛋白a)、匪P12、PDKl和IgE。在特定的實施方案中，通過淘洗來回收肽或多肽。在一些實施方案中，組包括展示系統。例如，展示系統可以是噬菌體展示、核糖體展示、乳液區室化(emulsioncompartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質粒上展示或共價展示。示例性展示系統與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關。在特定的實施方案中，展示系統含有可復制的遺傳包。在一些實施方案中，展示系統包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、入、MS2或T7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統是多價的。在一些實施方案中，作為pIII融合蛋白來展示肽或多肽。在其他實施方案中，該方法進一步包括擴增編碼具有所需生物活性的肽或多肽的核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應來擴增核酸。在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人輕鏈可變域。在另一個方面中，提供了從一組肽或多肽中選擇以高親和性結合目標配體例如TNFR1的肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多肽，在適于蛋白酶活性的條件下混合組和蛋白酶并回收結合目標配體的肽或多肽。通常將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何所需的蛋白酶，如以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶(actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻漿或生物制劑來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成溫育后將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白酶的混合物中。可以基于結合任何所需的目標配體如在此公開的目標配體(例如TNFR1)來回收肽或多肽。在特定的實施方案中，通過淘洗來回收肽或多肽。在一些實施方案中，組包括展示系統。例如，展示系統可以是噬菌體展示、核糖體展示、乳液區室化(emulsioncompartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質粒上展示或共價展示。示例性展示系統與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關。在特定的實施方案中，展示系統含有可復制的遺傳包。在一些實施方案中，展示系統包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、入、MS2或T7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統是多價的。在一些實施方案中，作為pIII融合蛋白來展示肽或多肽。在其他實施方案中，該方法進一步包括擴增編碼具有所需生物活性的肽或多肽的核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應來擴增核酸。在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人輕鏈可變域。在另一個方面中，本文描述了生產一組蛋白酶抗性肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多肽，在適于蛋白酶活性的條件下混合一組肽或多肽和蛋白酶，并回收多個具有所需生物活性的肽或多肽，由此產生一組蛋白酶抗體肽或多肽。在一些實施方案中，將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。例如，在該方法中所用的蛋白酶可以是以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶(actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或1eucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻漿或生物制劑來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成溫育后將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白酶的混合物中。在一些實施方案中，基于結合活性回收多個具有所需生物活性的肽或多肽。例如，可以基于結合通用配體(如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收多個肽或多肽。結合活性還可以是對目標配體的特異性結合，如本文所述的目標配體。在特定的實施方案中，通過淘洗回收多個具有所需生物活性的肽或多肽。在一些實施方案中，組包括展示系統。例如，展示系統可以是噬菌體展示、核糖體展示、乳液區室化(emulsioncompartmentalization)和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質粒上展示或共價展示。在特定的實施方案中，展示系統與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關。在特定的實施方案中，展示系統含有可復制的遺傳包。在一些實施方案中，展示系統包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、入、MS2或T7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統是多價的。在一些實施方案中，作為pIII融合蛋白來展示肽或多肽。在其他實施方案中，該方法進一步包括擴增編碼多個具有所需生物活性的肽或多肽的核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應來擴增核酸。在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人輕鏈可變域。在另一個方面中，本文描述了從組中選擇蛋白酶抗性多肽的方法，該多肽包括結21合目標配體例如TNFR1的免疫球蛋白單可變域(dAb)。在一個實施方案中，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統，該多肽含有免疫球蛋白單可變域，在適于蛋白酶活性的條件下，將噬菌體展示系統和選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰蛋白酶的蛋白酶混合，并回收展示了含有結合目標配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。在一些實施方案中，以lOOiig/ml來使用蛋白酶，并將混合的噬菌體展示系統和蛋白酶在約37t:下溫育過夜。在一些實施方案中，通過結合所述目標來回收展示了含有結合目標配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。在其他實施方案中，通過淘洗來回收展示了含有結合目標配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的分離的蛋白酶抗性肽或多肽。在特定的實施方案中，本文提供了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的分離的蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)抗性免疫球蛋白單可變域(例如，人抗體重鏈可變域，人抗體輕鏈可變域)。本文還描述了編碼通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶-、彈性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域)的分離的或重組的核酸，以及含有該核酸的載體(例如，表達載體)和宿主細胞。本文還描述了制備通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶-、彈性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域)的方法，包括在適于表達的條件下維持含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽的重組核酸的宿主細胞，由此產生蛋白酶抗性肽或多肽。本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶_或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域)用于藥物中(例如，用于治療或診斷)。本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶_或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域)用于制造治療疾病的藥物的用途。本文還描述了治療疾病的方法，包括將有效量的通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶-、彈性蛋白酶-或leucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域)給藥于需要的患者。本文還描述了用于測定樣品中是否存在TNFR1或樣品中存在多少TNFR1的診斷試劑盒，其含有本發明的多肽、免疫球蛋白可變域(dAb)或拮抗劑和使用說明書(例如，用于測定樣品中TNFR1的存在和/或含量)。在一些實施方案中，試劑盒進一步包括一種或更多種助劑，如合適的緩沖劑或合適的檢測劑(例如，結合本發明的多肽或dAb的可檢測標記的抗體或其抗原結合片段或與其連接或綴合的部分)。本發明還涉及包括固體表面的裝置，在該表面上固定了本發明的多肽拮抗劑或dAb，使得固定的多肽或dAb結合TNFR1。可以使用在其上可以固定抗體或其抗原結合片段的任何合適的固體表面，例如，玻璃、塑料、碳水化合物(例如，瓊脂糖珠子)。如果需要，支持物可以含有或將其修飾來含有所需的功能基團，以促進固定。裝置和或支持物可以具有任何合適的形狀，例如，片狀、棒狀、條狀、平板、載玻片、珠子、丸狀、圓板、凝膠、管狀、球狀、芯片、平板或圓盤等。在一些實施方案中，裝置是量桿。附圖簡述22圖1是pD0M13(akapD0M33)的多克隆位點的說明，其用來制備噬菌體展示組。圖2顯示了用來自用40ug/ml胰蛋白酶在30°C下溫育不同時間點的dAb的樣品進行的幾個Novex10-20%Tricene凝膠電泳。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入胰蛋白酶之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用lxSureBlue將蛋白質染色。凝膠說明DOM15-10和D0M15-26-501在用胰蛋白酶溫育的頭三個小時的過程中都得到了明顯消化。DOM15-26、DOM4-130-54和DOMlh-131-511的消化只在用胰蛋白酶溫育24小時后才變得明顯。圖3是D0Mlh-131-511和24個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標記)。用框顯示對應于CDRl、CDR2和CDR3的環。圖4是D0M4-130-54和27個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標記)。用框顯示對應于CDR1、CDR2和CDR3的環。圖5是D0M15-26-555和21個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標記)。用框顯示對應于CDR1、CDR2和CDR3的環。圖6是D0M15-10和16個選擇的變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標記)。用框顯示對應于CDR1、CDR2和CDR3的環。圖7A-7D是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶(從0至100iig/ml)在37。C溫育過夜后親本dAb，DOMlh-131-511(圖7A)和三個變體dAb，DOMlh-131-203(圖7B)、DOMlh-131-204(圖7C)和DOMlh-131-206(圖7D)與固定的TNFR1結合的BIAcore痕跡。結果表明所有三個變體對高濃度胰蛋白酶(100ug/ml)的蛋白水解的抗性比親本高。圖8A-8C是顯示了用彈性蛋白酶和leucozyme溫育過夜后dAbD0Mlh-131-511(圖8A)、DOMlh-131-202(圖8B)和DOMlh-131-206(圖8C)與固定的TNFR1結合的BIAcore痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗彈性蛋白酶和leucozyme的蛋白水解提高的抗性。圖9顯示了用胰蛋白酶溫育前dAbDOMlh_131_511、D0Mlh-131-203、DOMlh-131-204、D0Mlh-131-206、DOMlh_131_54、D0Mlh-131-201和DOMlh-131-202的樣品和用100iig/ml胰蛋白酶溫育1小時、3小時和24小時后的樣品進行的兩個4-12%NovexBis-Tris凝膠電泳。圖10A-10C是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶(從0至100iig/ml)在37。C溫育過夜后DOM4-130-54(圖10A)、DOM4-130-201(圖10B)和DOM4-130-202(圖10C)與固定的IL-1R1融合蛋白結合的BIAcore痕跡。結果顯示兩種變體對高濃度胰蛋白酶(100yg/ml)的蛋白水解的抗性都比它們的親本高。圖11A-11C是顯示了用彈性蛋白酶和leucozyme溫育過夜后D0M4-130-54(圖11A)、D0M4-130-201(圖11B)和DOM4-130-202(圖11C)與固定的IL-1R1融合蛋白結合的BIAcore痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗所測試的兩種蛋白酶的蛋白水解提高的抗性。圖12是D0M15-26-555和6個變體的氨基酸序列的說明。選定克隆中不同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標記)。圖13A和13B是顯示了親本dAb，D0M15_26_555(圖13A)和蛋白酶抗性最大的變體，DOMlh-131-206(圖13B)與固定的VEGF結合的BIAcore痕跡。在用濃度為200yg/ml的胰蛋白酶溫育后，在100nM的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結合。將反應在37t:下進行三小時或24小時。結果表明在胰蛋白酶處理24小時后，變體對蛋白水解的抗性比親本高。圖14是顯示了胰蛋白酶處理對D0M15-26-555變體的hVEGF結合的影響的圖。結果清楚地顯示出在胰蛋白酶處理24小時后，所有變體對蛋白水解的抗性比親本(D0M15-26-555)高。圖15顯示了裝載了15iig處理過的和未處理過的D0M15-26-555或D0Mlh-131-206樣品的兩個Novex10-20%Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入胰蛋白酶之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用lxSureBlue將蛋白質染色。凝膠說明DOMlh-131-206的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore實驗顯示的特征。圖16是D0M15-10和變體，D0M15-10-11的氨基酸序列的說明。變體中不同于親本序列的氨基酸是高亮顯示的(相同的那些用圓點標記)。圖17A禾口17B是顯示了親本，D0M15-10(圖17A)和變體，D0M15-10-11(圖17B)與固定的VEGF結合的BIAcore痕跡。在用濃度為200yg/ml的胰蛋白酶溫育后，在100nM的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結合。將反應在37。C下進行一小時、三小時或24小時。結果表明在胰蛋白酶處理24小時后，變體對蛋白水解的抗性比親本高。圖18顯示了裝載了15iigD0M15-10或D0M15-10-11樣品的兩個Novex10-20%Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然后在加入胰蛋白酶之后一小時、三小時和24小時時立即取樣。用SureBlue(lx)將蛋白質染色。結果表明BIAcore研究中看到的結合活性直接反映出蛋白質的完整性。圖19A-19L說明了編碼是D0Mlh-131-511或D0M4-130-54變體的dAb的幾個核酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖3和圖4中所示的氨基酸序列。圖20A-20E說明了編碼是D0M15-26-555或D0M15-10變體的dAb的幾個核酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖5和圖6中所示的氨基酸序列。圖21顯示了pD0M38的載體圖譜。圖22:顯示了Labchip上在3(TC下在25:1dAb:胰蛋白酶比例下用胰蛋白酶處理D0M10-53-474和DOMlh-131_206蛋白質不同時間點的凝膠電泳。箭頭顯示全長蛋白圖23:顯示了通過匪C色譜接著陰離子交換的純化后從每個樣品獲得的高水平純度的大小排阻色譜痕跡。在225nm下監控UV，并將柱子在含有10%乙醇(v/v)的lxPBS中運行。通過整合使用基線校準的峰面積來計算單體百分比。圖24:顯示了D0Mlh-131-511、D0M1H31-202和D0Mlh-131-206的蛋白酶穩定性數據。圖25:是SEC，其說明了D0Mlh-131-202、DOMlh-131-206和DOMlh-131-511在37和5(TC下在Britton-Robinson中的14天穩定性數據。對于所有dAb，蛋白質濃度為lmg/ml。SEC用來測定蛋白質在熱應力過程中是否發生了任何變化和相對于時間二0(T0)樣品溶液中殘余的單體含量。圖26A至I:顯示了SEC痕跡，其顯示了熱應力(37和50。C)對D0Mlh-131-511(A至C)，-202(D至F)和-206(G至I)的影響。還顯示了在給定時間點時相對于T=0溶液中殘余的單體含量。圖27:顯示了DOMlh-131-202、DOMlh-131-206和D0Mlh-131-511在24hr、48hr以及7和14天熱應力的IEF分析。樣品已經在Britton-Robinson緩沖液中在37或50°C下進行了溫育。圖28:TNFR-1BRA，顯示了DOMlh-131-202、DOMlh-131-206和DOMlh-131-511在5(TC下溫育14天的影響。假定蛋白質濃度為lmg/ml。還顯示了沒有結合抗原的陰性對照dAb(VH模型(dummy))。圖29:說明了將100mg/ml的A:DOMlh-131-202、B:D0Mlh-131-206和C:DOMlh-131-511在Britton-Robinson緩沖液中在+4"下存儲7天的影響。在280nm下監控UV。圖30:顯示了來自D0Mlh-131-202、DOMlh-131-206和D0Mlh-131-511在PariE-flow和LC+中的噴霧器測試的數據。在任一Britton-Robinson緩沖液中，蛋白質濃度為5mg/ml。圖31:說明了Britton-Robinson緩沖液中5mg/ml的D0Mlh-131-202、DOMlh-131-206和DOMlh-131-511在噴霧過程中單體濃度的相對百分比變化。圖32:顯示了Britton-Robinson緩沖液中DOMlh-131-206和D0M1H31-511從PariLC+噴霧后的SEC痕跡。圖33:顯示了PBS中40mg/ml的DOMlh-131-206在1小時的噴霧過程中的SEC痕跡。噴霧器杯和氣霧劑中的蛋白質對于噴霧過程中dAb經受到的剪切力和熱應力的影響都是高度抗性的。圖34:顯示了三種主要蛋白質(DOMlh-131-206和DOMlh-131-511和DOMlh-131-202)中每一種的沉淀速度曲線。對于DOMlh-131-206較低濃度的樣品觀察到的雙峰是由于該情況中樣品從室中泄漏出來造成的假象。圖35:顯示了緩沖液和裝置對GSK1995056A(D0Mlh_131_511)噴霧液滴大小的影響。圖36:顯示了GSK1995056A(D0Mlh_131_511)在各種裝置中噴霧后的穩定性，通過二聚體形成來測定，如通過SEC來測量。圖37:顯示了GSK1922567A(202)、GSK1995057A(206)和GSK1995056A(511)在PariE-flow和LC+中的噴霧器測試。A)在Britton-Robinson緩沖液中測試，B)在PEG1000/蔗糖緩沖液中測試。圖38:描繪了人TNFR1受體結合測試中的TNF_a劑量曲線。每個樣品重復四次進行測試。圖39:顯示了GSK1922567A(D0Mlh-131-202)、GSK1995057A(D0Mlh-131-206)和GSK1995056A(D0Mlh_131_511)在人TNFR1受體結合測試中的抑制作用。每個樣品重復四次進行測試。圖40:說明了DOM15-26和DOM15-26_593dAb在VEGFRBA中的功效。圖41:顯示了將5mg/mgDMS1529(D0M15-26-593)和DMS1545(DOM15-26-501)以單次濃注(bolus)劑量i.v.給藥于大鼠后的藥物動力學。圖42a:顯示了DMS1529Fc融合體(DOM15-26_593Fc融合體)的SEC-MALL(大小排阻色譜-多角度激光散射)分析，證實了單體的特征。顯示了兩個不同的批次，對于折射率(即，濃度；虛線)和光散射(實線)，證明了相似的特征。用箭頭標記的線條表示分子量計算。圖42b:顯示了DMS1529Fc融合體(DOM15-26_593Fc融合體)的AUC(分析超速離心)分析，證實了單體的特征。在三個不同的濃度下(PBS緩沖液中接近O.2、0.5&1.Omg/ml)測試一批材料。沉淀速率的分析證實了大約80kDa的分子量。圖43:顯示了DMS1529(DOM15-26-593)和DOM15-26-501的DSC痕跡。圖44:是對兩個不同批次的材料進行10次凍-融循環之前和之后，DMS1529(DOMlh-131-206)的VEGF結合ELISA。圖45:顯示了10次凍-融循環之前和之后，DOM15_26_593SEC特征的一致性。圖46:說明了DMS1529融合體(DOM15-26_593Fc融合體)的加速穩定性研究的結果；結合ELISA證明了在所示溫度下溫育7天后的活性。圖47A:顯示了在37。C溫育14&15天后，人獼猴中的DMS1529(D0M15-26-593)的穩定性。圖47B:顯示了在37。C溫育14&15天后，人血清中的DMS1529(D0M15-26-593)的穩定性。圖48:顯示了DOM15-26&D0M15-26-593dAb作為Fc融合體(各自為DOM1564&D0M1529)在VEGFRBA中的功效。圖49:說明了DMS1529融合體(DOM15-26-593FC融合體)對HUVEC細胞增殖的抑制作用。圖50:pDom33載體圖譜。圖51:描繪了結合血清白蛋白的dAb的序列(氨基酸和核苷酸序列)。發明詳述在本說明書中，已經參照實施方案，以使得說明書既清楚又簡明的撰寫方式來描述了本發明。但是打算并且應當理解，可以對這些實施方案進行各種組合和分開，而沒有脫離本發明。除非另外限定，在此所用的所有技術和科學術語都具有本領域(例如，細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員公知的相同含義。將標準技術用于分子、遺傳和生化方法(通常參見，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆，實驗室手冊)，第2版(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.禾口Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology(簡明分子生物學實驗方法)(1999)第4版，JohnWiley&Sons,Inc.，在此將其引入作為參考)和化學方法。如在此所用的，術語"腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的拮抗劑"或"抗-TNFR1拮抗劑"等指的是結合TNFR1并可以抑制(即，一種或更多種)TNFR1功能的物質(例如，分子，化合物)。例如TNFR1的拮抗劑能夠抑制TNFa結合TNFR1和/或抑制通過TNFR1介導的26信號轉導。因此，利用TNFRl的拮抗劑能夠抑制TNFRl介導的過程和細胞應答(例如在標準的L929細胞毒性測試中的TNFa誘導的細胞死亡)。如在此所用的，"肽"指的是通過肽鍵連接在一起的兩個至約50個氨基酸。如在此所用的，"多肽"指的是通過肽鍵連接在一起的至少約50個氨基酸。多肽通常包括三級結構并折疊成功能域。如在此所用的，"對蛋白酶降解抗性的"肽或多肽(例如，域抗體(dAb))是在適于蛋白酶活性的條件下用蛋白酶溫育時，基本上不受蛋白酶的降解。在適于蛋白酶活性的溫度下用蛋白酶溫育一小時后，不超過約25%、不超過約20%、不超過約15%、不超過約14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約11%、不超過約10%、不超過約9%、不超過約8%、不超過約7%、不超過約6%、不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不超過約2%、不超過約1%或基本上沒有蛋白質受蛋白酶降解時，多肽(例如，dAb)基本上是沒有降解的。例如37或5(TC。可以使用任何合適的方法來測定蛋白質降解，例如，如本文所述的。通過SDS-PAGE或通過功能測試(例如，配體結合)。如在此所用的，"展示系統"指的是其中基于所需特征(如，物理、化學或功能特征)易于選擇的多肽或肽的集合的系統。展示系統可以是合適的多肽或肽的組(例如，在溶液中，固定在合適的支持物上)。展示系統還可以是使用細胞表達系統(例如，在轉化的、感染的、轉染的或轉導的細胞中核酸文庫的表達和細胞表面上所編碼多肽的展示)或非細胞表達系統(例如，乳液區室化和展示)的系統。示例性展示系統與核酸的編碼功能以及由核酸編碼的多肽或肽的物理、化學和/或功能特征相關。使用這樣的展示系統時，可以選擇具有所需物理、化學和/或功能特征的多肽或肽，并可以容易地分離或回收編碼選定多肽或肽的核酸。與核酸的編碼功能以及多肽或肽的物理、化學和/或功能特征相關的各種展示系統是本領域已知的，例如，細菌噬菌體(bacteriophage)展示(噬菌體展示，例如噬粒展示)、核糖體展示、乳液區室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細菌展示、在質粒上展示、共價展示等。(參見，例如，EP0436597(Dyax)、U.S.專利No.6，172，197(McCafferty等)、U.S.專利No.6，489，103(Griffiths等))。如在此所用的，"組(r印ertoire)"指的是特征在于氨基酸序列多樣性的多肽或肽的集合。組的單個成員可以具有共同的特征，如共同的結構特征(例如，共同的核心結構)和/或共同的功能特征(例如，結合共同配體(例如，通用配體或目標配體，TNFR1)的能力)。如在此所用的，"功能性"描述了具有生物活性的多肽或肽，如特定的結合活性。例如，術語"功能性多肽"包括通過其抗原-結合位點結合目標抗原的抗體或其抗原_結合片段。如在此所用的，"通用配體"指的是結合給定組的絕大部分(例如，基本上全部)功能性成員的配體。通用配體(例如，共同的通用配體)可以結合給定組的許多成員，即使成員對于共同的目標配體不具有結合特異性。通常，多肽上功能性通用配體結合位點的存在(如通過結合通用配體的能力來表明)表明多肽是正確折疊的和功能性的。通用配體的合適實例包括超抗原、結合在組的絕大部分功能性成員上表達的表位的抗體等。"超抗原"是指在與這些蛋白的目標配體結合位點不同的位點與免疫球蛋白超家族的成員相互作用的通用配體的術語。葡萄球菌腸毒素是與T-細胞受體相互作用的27超抗原的實例。結合抗體的超抗原包括蛋白G，其結合IgG恒定域(Bjorck和Kronvall，J.Immunol.，133:969(1984));蛋白A，其結合IgG恒定域和VH結構域(Forsgren和Sjoquist，J.Immunol.，97:822(1966));和蛋白L，其結合VL結構域(Bjorck，J.Immunol.，140:1194(1988))。如在此所用的，"目標配體"指的是由多肽或肽特異性或選擇性結合的配體。例如，多肽是抗體或其抗原-結合片段時，目標配體可以是任何所需的抗原或表位。與目標抗原的結合取決于功能性的多肽或肽。如在此所用的，抗體指的是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(如Fab、F(ab')2、Fv、二硫化物連接的scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫化物連接的scFv、diabody)，不管是源自天然產生抗體的物種，或是通過重組DNA技術形成的；不管是分離自血清、B-細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌。如在此所用的，"抗體形式"指的是其中可以引入一個或更多個抗體可變域使得給予結構上抗原結合特異性的任何合適的多肽結構。各種合適的抗體形式是本領域已知的，如，嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結合片段(例如，Fv片段(例如，單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段)、單抗體可變域(例如，dAb、V^VHH、、)和之前任一項的修飾形式(例如，通過聚乙二醇或其他合適聚合物或人源化VHH的共價連接修飾的)。短語"免疫球蛋白單可變域"指的是與其他V區或域無關的特異性結合抗原或表位的抗體可變域(VH、Vhh、VJ。免疫球蛋白單可變域可以以帶有其他可變區或可變域的形式(例如，同型-或雜-多聚體)存在，其中其他區或域對于單免疫球蛋白可變域的抗原結合不是所需的(即，其中免疫球蛋白單可變域結合抗原與其他可變域無關)。"域抗體"或"dAb"與在此所用的術語"免疫球蛋白單可變域"相同。"單抗體可變域"或"抗體單可變域"與在此所用的術語"免疫球蛋白單可變域"相同。在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域是人抗體可變域，但還包括來自其他物種的單抗體可變域，如嚙齒動物(例如，W000/29004中公開的，在此將其內容作為整體引入作為參考)、護士鯊和CamelidVHHdAb。CamelidVHH是源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種的免疫球蛋白單可變域多肽，其產生天然缺少輕鏈的重鏈抗體。可以將V皿人源化。"結構域"是經過折疊的蛋白質結構，其具有與蛋白質其余部分無關的蛋白質三級結構。通常，結構域負責蛋白質的分離的功能特征，并且在許多情況下可以添加、去除或轉移給其他蛋白質，而不喪失該蛋白質和/或該結構域的其余部分的功能。"單抗體可變域"是指經過折疊的多肽域，包含抗體可變域的特征性序列。因此，其包括完整的抗體可變區和修飾的可變域，例如，其中一個或更多個環已經由不是抗體可變區特征性的序列替代，或已被截斷或包含N-端或C-端延伸的抗體可變域，以及保留全長結構域的至少結合活性和特異性的可變域的折疊片段。術語"文庫"指的是異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員具有單個多肽或核酸序列。就這點而言，"文庫"和"組"同義。文庫成員之間的序列差異造成文庫中存在的多樣性。文庫可以采用多肽或核酸的簡單混合物的形式，或者用核酸文庫轉化的生物體或細胞的形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等。在一個實施方案中，各個生物體28或細胞僅含有一個或數目有限的文庫成員。在一個實施方案中，將核酸摻入到表達載體中，以表達該核酸所編碼的多肽。因此，在一個方面中，文庫可以采用宿主生物體群的形式，每個生物體含有一個或更多個拷貝的表達載體，所述載體含有核酸形式的文庫的單個成員，所述核酸可以表達而產生其相應的多肽成員。因此，宿主生物體群具有編碼一大組不同多肽的潛力。"通用框架"是單抗體框架序列，對應于序列中的保守抗體區，如Kabat限定的("SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，，(免疫學重要性蛋白的序列)，USD印artmentofHealthandHumanServices(美國衛生和人類服務部))，或對應于人種系免疫球蛋白組或結構，如Chothia和Lesk限定的，(1987)J.Mol.Biol.196:910-917。文庫和組可以使用單個框架，或一組這樣的框架，已經發現其允許實質上任何結合特異性的產生，盡管變化僅在超變區內。如在此所用的，術語"劑量"指的是在一次給藥(單位劑量)，或在限定時間間隔內兩次或更多次給藥時給藥于患者的全部配體量。例如，劑量可以指的是在一天(24小時)(日劑量)、兩天、一周、兩周、三周或一個或更多個月(例如，通過單次給藥，或通過兩次或更多次給藥)的過程中給藥于患者的配體量(例如，含有結合目標抗原的免疫球蛋白單可變域的配體)。給藥之間的間隔可以是任何所需的時間量。短語"半衰期"是指配體的血清濃度在體內降至50%所需的時間，例如因為通過天然機制所致的配體降解和/或清除或螯合。本發明的配體在體內可以是穩定的，其半衰期因結合抗降解和/或清除或螯合的分子而延長。通常，這類分子是天然存在的蛋白質，它們本身在體內具有較長的半衰期。如果配體的功能活性在體內的持續時間比對延長半衰期的分子不具有特異性的類似配體更長的話，則配體半衰期延長。例如，將對人血清白蛋白(HAS)和靶分子具有特異性的配體，與對HSA無特異性且不結合HSA，而結合別的分子的相同配體進行比較。例如，它能結合細胞上的第三目標物。通常，半衰期延長10%、20%、30%、40%、50%或更多。半衰期延長范圍在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或以上是可能的。或者，或另外，半衰期延長范圍高達30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x也是可能的。如在此所用的，"流體動力學大小"指的是基于分子通過水溶液擴散的分子(例如，蛋白質分子，配體)的表觀大小。將蛋白質通過溶液的擴散或移動進行處理，以得到蛋白質的表觀大小，其中通過蛋白質顆粒的"Stokes半徑"或"流體動力學半徑"來給出大小。蛋白質的"流體動力學大小"取決于質量和形狀(構象)，使得具有相同分子量的兩個蛋白質基于蛋白質的整體構象可以具有不同的流體動力學大小。如在此所用的，術語"競爭"意思是第一目標與其同源目標結合域的結合在所述同源目標特異性的第二結合域的存在下受到抑制。例如，結合可以受到空間抑制，例如，通過結合域的物理阻斷或通過改變結合域的結構或環境，使其對目標的親和性或親和力降低。對于怎樣進行競爭ELISA和競爭BiaCore實驗來測定第一和第二結合域之間的競爭的詳細內容參見W02006038027。如下進行兩個序列之間的"同源性"或"同一性"或"相似性"(在此可將這些術語互換使用)的計算。為了優化比較目的，將序列比對(例如，為了比較目的，對于最佳比對，可以在第一個和第二個氨基酸或核酸序列中引入缺口，并且非同源序列可以忽略不計)。在一個實施方案中，為了比較目的，所比對的參考序列的長度占參考序列長度的至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，80%，90%，100%。然后，將相應氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。當第一序列中的某個位置由與第二序列相應位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據時，那么分子在該位置上是相同的(在此所用的氨基酸或核酸"同源性"等同于氨基酸或核酸"同一性")。兩個序列之間的同一性百分比是考慮了缺口數和每個缺口的長度后序列共有的相同位置數的函數，需要引入這些缺口以進行兩個序列的最佳比對。可以使用BLAST2Sequences算法，使用缺省參數，來準備和測定如在此所限定的氨基酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性(Tatusova，T.A.等，FEMSMicrobiolLett,174:187-188(1999))。選擇方法在一個實施方案中，本發明涉及通過選擇蛋白酶抗性肽和多肽的方法選擇的具有所需生物活性的多肽和dAb。在方法中使用了兩種選擇程序來產生有效的方法，用于選擇對蛋白酶降解高度穩定和抗性的并具有所需生物活性的多肽。如本文所述的，蛋白酶抗性肽和多肽通常保持生物活性。相反，在本文所述的方法中，蛋白酶敏感性肽和多肽受到蛋白酶的分裂或降解，并因此，失去其生物活性。因此，通常基于其生物活性如結合活性來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。本文所述的方法提供了幾個優點。例如，如在此公開的和例舉的，對能抵抗一種蛋白酶(例如，胰蛋白酶)的蛋白水解降解而選擇的可變域、拮抗劑、肽或多肽也能抵抗其他蛋白酶(例如，彈性蛋白酶、leucozyme)的降解。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與肽或多肽的較高解鏈溫度(Tm)相關。較高的解鏈溫度表示更穩定的可變域、拮抗劑、肽和多肽。在一個實施方案中，對蛋白酶降解的抗性還與對目標配體的高親和性結合相關。因此，本文所述的方法提供了選擇、分離和/或回收具有所需生物活性并且非常適于體內治療和/或診斷用途(因為這些是蛋白酶抗性和穩定的)的可變域、拮抗劑、肽、多肽的有效途徑。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與提高的PK相關，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、拮抗劑、肽或多肽。提高的PK可以是提高的AUC(曲線下面積)和/或提高的半衰期。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與可變域、拮抗劑、肽或多肽對剪切力和/或熱應力的提高的穩定性和/或噴霧過程中降低的聚集傾向相關，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、拮抗劑、肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與提高的存儲穩定性相關，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、拮抗劑、肽或多肽。在一個方面中，提供了一個、兩個、三個、四個或全部優點，優點是對蛋白酶降解的抗性、較高的Tm和對目標配體的高親和性結合。在一個方面中，提供了從肽和多肽的文庫或組(例如，展示系統)中選擇、分離和/或回收對蛋白酶(例如，一種或更多種蛋白酶)降解抗性的肽或多肽的方法。在一個實施方案中，該方法是從肽和多肽的文庫或組(例如，展示系統)中選擇、分離和/或回收對蛋白酶(例如，一種或更多種蛋白酶)降解抗性的多肽的方法。通常，該方法包括提供肽或多肽的文庫或組，在適于蛋白酶活性的條件下將文庫或組與蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液)混合，并選擇、分離和/或回收對蛋白酶降解抗性的并具有所需生物活性的肽或多肽。由于蛋白酶的活性，蛋白酶降解的肽或多肽通常具有降低的生物活性或失去其生物活性。因此，可以使用基于生物活性的方法來選擇、分離和/或回收對蛋白酶降解抗性的肽或多肽，生物活性如結合活性(例如，結合通用配體，結合特異性配30體，結合底物)、催化活性或其他生物活性。在適于蛋白酶的蛋白水解活性的條件下，將肽或多肽的文庫或組與蛋白酶(例如，一種或更多種蛋白酶)混合。適于蛋白酶的蛋白水解活性的條件以及含有蛋白水解活性的生物制劑或混合物是本領域公知的，并可以通過本領域普通技術人員容易地測定。如果需要，例如，可以通過測定一定范圍的pH條件、蛋白酶濃度、溫度下的蛋白酶活性和/或通過改變文庫或組與蛋白酶反應的時間量來鑒定或優化合適的條件。例如，在一些實施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽(例如，可變域)的比例(以摩爾/摩爾為基礎)為800至80，00(例如，8，000至80，000)蛋白酶:肽或多肽，例如，使用10微克/ml蛋白酶時，比例為800至80，000蛋白酶肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為8，000至so，ooo蛋白酶肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與肽或多肽(例如，可變域)的比例(以重量/重量為基礎，例如微克/微克)為1，600至160，000(例如，16，000至160，000)蛋白酶:肽或多肽，例如，使用10微克/ml蛋白酶時，比例為1，600至160，000蛋白酶肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為16，000至160，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方案中，使用至少IOO或1000微克/ml濃度的蛋白酶，并且蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽(例如，可變域)的蛋白酶肽比例(以摩爾/摩爾為基礎)為8，000至80，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方案中，使用至少10微克/ml濃度的蛋白酶，并且蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽(例如，可變域)的蛋白酶肽比例(以摩爾/摩爾為基礎)為800至80，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方案中，例如，c為10微克/ml時，蛋白酶(例如，胰蛋白酶)與肽或多肽(例如，可變域)的比例(以重量/重量為基礎，例如微克/微克)為1600至160，000蛋白酶肽或多肽；或C或C'為100微克/ml時，比例為16，000至160，000蛋白酶肽或多肽。在一個實施方案中，濃度(c或c')為至少100或1000微克/ml蛋白酶。對于測試單個或分離的肽或多肽(例如，免疫球蛋白可變域)，例如，已經從組或文庫中分離出來的，可以將蛋白酶加入合適緩沖液(例如，PBS)中的肽或多肽溶液中，以產生肽或多肽/蛋白酶溶液，如至少約0.01%(w/w)蛋白酶/肽或多肽的溶液，約0.01%至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，約0.05%至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，約0.1%至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，約0.5%至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，約1%至約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.01%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.02%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.03%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.04%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.05%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.06%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.07%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.08%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.09%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.1%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.2%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.3%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.4%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.6%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.7%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.8%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.9%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約1%(w/V)蛋白酶/肽或多肽，至少約2%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約3%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約4%(w/w)蛋白酶/肽或多肽，或約5%(w/w)蛋白酶/肽或多肽。可以在蛋白酶活性合適的溫度下(例如，室溫，約37°C)溫育混合物，并以(例如，1小時，2小時，3小時等)時間間隔取樣。使用任何合適的方法，如SDS-PAGE分析或配體結合，分析樣品的蛋白質降31解，并且結果可以用來建立降解的時間過程。在本文所述的方法中，可以使用任何所需的一種或更多種蛋白酶。例如，可以使用單種蛋白酶，不同蛋白酶的任何所需組合或含有蛋白水解活性的任何生物制劑、生物提取物或生物勻漿。所用一種或更多種蛋白酶的特性不必定是已知的。可以單獨或以任何所需組合來使用的蛋白酶的合適實例包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶(actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。合適的含有蛋白水解活性的生物提取物、勻漿和制劑包括痰液、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管肺泡灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚等。以適于發生蛋白水解降解的含量使用蛋白酶。例如，如本文所述的，可以使用約0.01%至約5%(w/w，蛋白酶/肽或多肽)的蛋白酶。將蛋白酶與包括肽或多肽組的展示系統(例如，噬菌體展示系統)混合時，例如，可以使用約10iig/ml至約3mg/ml濃度的蛋白酶，約10yg/ml，約20iig/ml，約30iig/ml，約40iig/ml，約50iig/ml，約60iig/ml，約70iig/ml，約80iig/ml，約90iig/ml，約100iig/ml，約200iig/ml，約300iig/ml，約400iig/ml，約500iig/ml，約600iig/ml，約700iig/ml，約800iig/ml，約900iig/ml，約1000iig/ml，約1.5mg/ml，約2mg/ml，約2.5mg/ml或約3mg/ml。在適于蛋白酶活性的溫度下將蛋白酶與肽或多肽的集合(文庫或組)一起溫育。例如，可以在約2(TC至約4(TC的溫度下溫育蛋白酶和肽或多肽的集合(例如，在室溫，約20。C，約21。C，約22。C，約23。C，約24。C，約25。C，約26。C，約27。C，約28。C，約29°C，約30°C，約3TC，約32°C，約33°C，約34°C，約35°C，約36°C，約37°C，約38°C，約39°C，約40°C)。將蛋白酶和肽或多肽的集合一起溫育一段足以發生蛋白水解降解的時間。例如，可以將肽或多肽的集合與蛋白酶溫育約30分鐘至約24或約48小時。在一些實施例中，將肽或多肽的集合與蛋白酶一起溫育過夜，或至少約30分鐘，約1小時，約1.5小時，約2小時，約3小時，約4小時，約5小時，約6小時，約7小時，約8小時，約9小時，約10小時，約11小時，約12小時，約13小時，約14小時，約15小時，約16小時，約17小時，約18小時，約19小時，約20小時，約21小時，約22小時，約23小時，約24小時，約48小時，或更長時間。通常理想的是，至少在較早的選擇輪次中(例如，使用展示系統時)，與沒有包括蛋白酶溫育的選擇相比，蛋白酶導致選擇的具有所需生物活性的克隆數量減少至少一個數量級。在特定的實施例中，方法中所用的蛋白酶含量和條件足以將回收的克隆數量減少至少一個對數(10倍)，至少約2個對數(100倍)，至少約3個對數(1000倍)或至少約4個對數(IO，OOO倍)。使用常規方法和/或在此提供的指導，可以容易地測定導致所需回收克隆減少的合適的蛋白酶含量和溫育條件。可以使用任何合適的方法(例如，體外、體內或離體(exvivo))來混合并溫育蛋白酶和肽或多肽的集合。例如，可以在合適的容器中將蛋白酶和肽或多肽的集合混合并在適于蛋白酶活性的溫度下保持靜止、搖晃、振蕩、渦旋等。如果需要，可以在體內或離體(exvivo)系統中混合蛋白酶和肽或多肽的集合，如通過將多肽的集合(例如，噬菌體展示文庫或組)引入合適的動物中(例如，小鼠)，經過對于蛋白酶活性而言足夠的時間后，回收肽或多肽的集合。在另一個實施例中，用多肽的集合(例如，噬菌體展示文庫或組)灌注器官或組織，經過對于蛋白酶活性而言足夠的時間后，回收多肽的集合。溫育后，可以基于所需生物活性如結合活性來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。如果需要，可以在選擇前加入蛋白酶抑制劑。可以使用基本上不干擾選擇方法的任何合適的蛋白酶抑制劑(或兩種或更多種蛋白酶抑制劑的組合物)。合適的蛋白酶抑制劑的實例包括，al-抗-胰蛋白酶、a2-巨球蛋白、阿嗎他定、抗凝血酶III、抑肽酶、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物氫氯化物(AEBSF)、(4-脒基-苯基)-甲烷-磺酰氟化物(APMSF)、貝他定、芐脒、抑凝乳蛋白酶素、3，4-二氯異香豆素、二異丙基氟磷酸鹽(DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸(EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑(elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來酰亞胺、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、抑胃肽、1，10-鄰二氮雜菲、膦酰二肽(phosphoramidon)、絲氨酸蛋白酶抑制劑、N-甲苯磺酰基-L-賴氨酸-氯甲基酮(TLCK)、Na-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮(TPCK)等。此外，許多含有幾類蛋白酶抑制劑的制劑是可購得的(例如，RocheCompleteProteaseInhibitorCocktailTablets(RocheDiagnosticsCorporation;Indianapolis，IN，USA)，其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰腺提取物和胰蛋白酶)。可以使用所需的生物活性選擇方法來選擇蛋白酶抗性肽或多肽，這種選擇方法可以使具有所需生物活性的肽和多肽與不具有所需生物活性的肽和多肽區分開來并進行選擇。通常，已經受到蛋白酶消化或分裂的肽或多肽失去了它們的生物活性，而蛋白酶抗性肽或多肽仍然保留功能。因此，對于生物活性合適的測試可以用來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。例如，可以使用合適的結合測試(例如，ELISA、淘選)來測定共同的結合功能(例如，結合通用配體，結合特異性配體或結合底物)。例如，可以通過淘選或使用合適的親和性基質來選擇、分離和/或回收結合目標配體或通用配體(如蛋白A、蛋白L或抗體)的多肽。可以通過將配體(例如，通用配體、目標配體)溶液加入合適的容器(例如，試管、培養皿)中并使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉并將多肽(例如，噬菌體展示文庫)加入容器中，并將容器維持在適于多肽結合固定化配體的條件下。將未結合的多肽洗掉，使用任何合適的方法(如刮下(scraping)或降低pH)來回收結合的多肽。使用噬菌體展示系統時，可以在噬菌體ELISA中測試結合。可以根據任何合適的程序來進行噬菌體ELISA。在一個實施例中，通過ELISA篩選每一輪選擇產生的噬菌體群與選定的目標配體或通用配體的結合，以鑒定呈現出蛋白酶抗性肽或多肽的噬菌體。如果需要，可以測試可溶性肽和多肽與目標配體或通用配體的結合，例如，通過ELISA，例如，使用對抗C-或N-端標記物的試劑(參見，例如Winter等(1994)，Ann.Rev.Immunology12，433-55以及其中引用的參考文獻)。還可以通過PCR產物的凝膠電泳(Marks等，1991，上文；Nission等，1994，上文)、探針檢測(Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.227,776)或通過載體DNA的測序來測定選定噬菌體的多樣性。除了對TNFR1的特異性，含有抗-TNFR1蛋白酶抗性多肽(例如，單抗體可變域)的拮抗劑或多肽(例如，雙特異性配體)可以具有通用配體或任何所需目標配體的結合特異性，目標配體如人或動物蛋白，包括細胞因子、生長因子、細胞因子受體、生長因子受體、酶(例如，蛋白酶)、酶的輔因子、DNA結合蛋白、脂質和碳水化合物。在一些實施方案中，蛋白酶抗性肽或多肽(例如，dAb)或拮抗劑結合肺組織中的TNFR1。在一個實施方案中，拮抗劑或多肽還結合肺組織中的其他目標物。在本文所述的方法中使用展示系統時(例如，與核酸的編碼功能和該核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關的展示系統)，常常能有利地擴增或提高編碼選定肽或多肽的核酸的拷貝數。這提供了一條獲得足量核酸和/或肽或多肽的有效途徑，以用于更多輪次的選擇，使用本文所述的方法或其他合適的方法，或用于制備其他的組(例如，親和性突變組)。因此，在一些實施方案中，該方法包括使用展示系統(例如，與核酸的編碼功能和該核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關的展示系統，如噬菌體展示)并進一步包括擴增或提高編碼選定肽或多肽的核酸的拷貝數。可以使用任何合適的方法來擴增核酸，如通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應。本文所述的方法可以用作計劃的一部分來分離蛋白酶抗性肽或多肽，例如，dAb，如果需要，可以包括其他合適的選擇方法。在這些情況中，可以在計劃的任何所需點使用本文所述的方法，如在使用其他選擇方法之前或之后。本文所述的方法還可以用來提供兩輪或更多輪的選擇，如本文所述和舉例說明的。在一個實施例中，方法用于選擇能抵抗彈性蛋白酶降解的肽或多肽，例如dAb，包括提供肽或多肽的文庫或組，在適于彈性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下將文庫或組與彈性蛋白酶(或含有彈性蛋白酶的生物制劑、提取物或勻漿)混合，并選擇、分離和/或回收能抵抗彈性蛋白酶降解并具有TNFR1結合活性的肽或多肽。在特定的實施方案中，提供了選擇能抵抗彈性蛋白酶降解并結合TNFR1的免疫球蛋白單可變域(dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了含有dAb的文庫或組，并在適于彈性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下與彈性蛋白酶(或含有彈性蛋白酶的生物制劑、提取物或勻漿)混合。選擇特異性結合TNFR1的彈性蛋白酶抗性dAb。例如，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04%(w/w)彈性蛋白酶溶液中在37t:下持續至少約2小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04X(w/w)彈性蛋白酶溶液中在37t:下持續至少約12小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04X(w/w)彈性蛋白酶溶液中在37t:下持續至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，提供了選擇能抵抗彈性蛋白酶降解并結合TNFR1的免疫球蛋白單可變域(dAb)的方法，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統，該多肽含有免疫球蛋白單可變域，將噬菌體展示系統與彈性蛋白酶(約100i!g/ml)混合并將混合物在約37t:下溫育，例如過夜(例如，約12-16小時)，然后選擇呈現出特異性結合TNFR1的dAb的噬菌體。在一個實施例中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解的肽或多肽(例如，dAb)的方法，包括提供肽或多肽的文庫或組，在適于leucozyme的蛋白水解消化的條件下將文庫或組與leucozyme(或含有leucozyme的生物制劑、提取物或勻槳)混合，并選擇、分離和/或回收能抵抗leucozyme降解并具有特異性TNFR1結合活性的肽或多肽。在特定的實施方案中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解并結合TNFR1的免疫球34蛋白單可變域(dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了含有dAb的文庫或組，并在適于leucozyme的蛋白水解消化的條件下與leucozyme(或含有leucozyme的生物制劑、提取物或勻漿)混合。選擇特異性結合TNFR1的leucozyme抗性dAb。例如，leucozyme抗性dAb在0.04%(w/V)leucozyme溶液中在37t:下持續至少約2小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，leucozyme抗性dAb在O.04%(w/w)leucozyme溶液中在37。C下持續至少約12小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，leucozyme抗性dAb在O.04%(w/w)leucozyme溶液中在37t:下持續至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解并特異性結合TNFR1的免疫球蛋白單可變域(dAb)的方法，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統，該多肽含有免疫球蛋白單可變域，將噬菌體展示系統與leucozyme(約100yg/ml)混合并將混合物在約37t:下溫育，例如過夜(例如，約12-16小時)，然后選擇呈現出特異性結合TNFR1的dAb的噬菌體。在另一個實施例中，提供了用于選擇對胰蛋白酶降解有抗性的肽或多肽(例如dAb)的方法，其包括提供肽或多肽的文庫或組，在適于胰蛋白酶蛋白水解消化的條件下將所述文庫或組與胰蛋白酶組合，以及選擇、分離和/或回收對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結合TNFR1的肽或多肽。在特定的實施方案中，提供了選擇對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結合TNFRl的免疫球蛋白單可變域(dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了包含dAb的文庫或組，并將其與胰蛋白酶(或包含胰蛋白酶的生物制劑、提取物或勻漿液)在適于胰蛋白酶蛋白水解消化的條件下組合。選擇結合TNFR1的胰蛋白酶抗性dAb。例如，在37t:下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約2小時的時間段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在一個實施方案中，在371:下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約3小時的時間段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在37°〇下在0.04%(w/w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約4小時、至少大約5小時、至少大約6小時、至少大約7小時、至少大約8小時、至少大約9小時、至少大約10小時、至少大約11小時、或至少大約12小時的時間段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在示范性的實施方案中，提供了用于選擇對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結合TNFR1的免疫球蛋白單可變域(dAb)的方法。該方法包括提供噬菌體展示系統(其包含一組含有免疫球蛋白單可變域的多肽)，將所述噬菌體展示系統與胰蛋白酶(100iig/ml)組合，并在大約37t:下溫育混合物例如過夜(例如大約12-16小時)，接著選擇展示特異性結合TNFR1的dAb的噬菌體。在另一個方面中，提供了一組產生蛋白酶抗性肽或多肽(例如，dAb)的方法。該方法包括提供一組肽或多肽；在適于蛋白酶活性的條件下將肽或多肽組與蛋白酶混合；并回收多個特異性結合TNFR1的肽或多肽，由此產生一組蛋白酶抗性肽或多肽。在此對于其他方法描述了適用于該方法中的蛋白酶、展示系統、用于蛋白酶活性的條件和選擇肽或多肽的方法。在一些實施方案中，使用了含有一組肽或多肽的展示系統(例如，與核酸的編碼功能和該核酸編碼的肽或多肽的功能性特征相關的展示系統)，并且該方法進一步包括擴增或提高編碼多個選定肽或多肽的核酸的拷貝數。可以使用任何合適的方法來擴增核酸，如通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應。在特定的實施方案中，提供了產生一組包含抗-TNFRldAb的蛋白酶抗性多肽的方法。該方法包括提供一組包含dAb的多肽；在適于蛋白酶活性的條件下將肽或多肽組與蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)混合；并回收多個包含具有TNFR1結合特異性的dAb的多肽。該方法可以用于產生天然組，或偏向所需結合活性的組，如基于具有TNFR1結合特異性的親本dAb的親和性突變組。多肽展示系統在一個實施方案中，提供用于本文所述方法中的肽或多肽的組或文庫包含合適的展示系統。該展示系統可以抵抗蛋白酶的降解(例如，單種蛋白酶或蛋白酶的組合，以及含有蛋白水解活性的任何生物提取物、勻漿或制劑(例如，痰液、粘液(例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液)、支氣管灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚等))。在一個實施方案中，展示系統以及展示系統與所展示肽之間的聯系至少抵抗蛋白酶能與組中最穩定的肽或多肽那樣。這使得可以容易地分離和/或擴增編碼選定的展示多肽的核酸。在一個實施例中，可以從溶液中或共價或非共價連接合適表面(如塑料或玻璃(例如，微滴定平板、多肽陣列，如微陣列))的一組肽或多肽中選擇、分離和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽，例如dAb。例如，可以使用在表面上的肽陣列，其排列方式使每個不同的文庫成員(例如，獨特的肽序列)處于陣列中分開的、預定的位置。可以通過陣列中的空間位置來決定該陣列中每個文庫成員的身份。可以測定在目標配體與例如反應性文庫成員之間發生結合作用的陣列中的位置，因此基于空間位置來鑒定反應性成員的序列。(參見，例如，U.S.專利No.5，143，854，W090/15070和W092/10092)。在一個實施方案中，該方法使用連接核酸的編碼功能和該核酸編碼的多肽的物理、化學和/或功能性特征的展示系統。這樣的展示系統可以包括多個可復制的遺傳包，如噬菌體或細胞(細菌)。在一個實施方案中，展示系統包括文庫，如細菌噬菌體展示文庫。已經描述了各種合適的細菌噬菌體展示系統(例如，多價展示和多價展示系統)。(參見，例如，Griffiths等，U.S.專利No.6，555，313B1(在此引入作為參考);Johnson等，U.S.專利No.5，733，743(在此引入作為參考)；McCafferty等，U.S.專利No.5，969，108(在此引入作為參考)；Mulligan-Kehoe，U.S.專利No.5，702，892(在此引入作為參考);Winter,G.等，A匪.Rev.Immunol.12:433-455(1994);So咖illionP.等，Appl.Biochem.Biotechnol.47(2-3):175-189(1994);Castagonoli，L.等，Comb.Chem.HighThroughputScreen,4(2):121-133(2001))。細菌噬菌體展示系統中展示的肽或多肽可以在任何合適的細菌噬菌體上展示，如絲狀噬菌體(例如，fd，M13，Fl)、溶菌噬菌體(例如，T4、T7、A)或RNA噬菌體(例如，MS2)。通常，產生或提供展示一組肽或噬菌體多肽的噬菌體文庫，作為與合適的噬菌體外殼蛋白(例如，fdpIII蛋白)的融合蛋白。融合蛋白可以展示在噬菌體外殼蛋白尖端的肽或多肽，或如果需要，在內部位置。例如，展示的肽或多肽可以存在于PIII結構域1的氨基端的位置。(PIII的結構域1也稱為N1)。展示的肽可以直接與pIII融合(例如，pIII結構域1的N-端)或使用連接物與pIII融合。如果需要，融合體可以進一步包括標記物(例如，myc表位、His標記物)。可以使用任何合適的方法來產生包括作為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白展示的一組肽或多肽的文庫，如通過將編碼展示的肽或多肽的噬菌體載體或噬粒載體的文庫引入合適的宿主細胞中，并培養所得到的細菌來產生噬菌體(例如，如果需要，使用合適的輔助噬菌體或補充質粒)。可以使用任何合適的方法從培養物中回收噬菌體文庫，如沉淀和離心。展示系統可以包含一組含有任何所需量多樣性的肽或多肽。例如，組可以含有具有對應于由生物體、一組生物體(例如，一組分離自Camelid的VHHdAb的序列)、所需組織或所需細胞類型表達的天然產生多肽的氨基酸序列的肽或多肽，或可以含有具有隨機或隨機化氨基酸序列的肽或多肽。如果需要，多肽可以共有共同的核心或支架。該組或文庫中的多肽可以包含隨機或隨機化氨基酸序列的限定片段或共同的氨基酸序列的片段。在特定的實施方案中，組中所有或基本上所有的多肽是所需類型的，如所需的酶(例如，聚合酶)或所需的抗體的抗原結合片段(例如，人Vh或人、)。在實施方案中，多肽展示系統包含一組多肽，其中每個多肽包含抗體可變域。例如，組中的每個多肽可以含有VH、、或Fv(例如，單鏈Fv)。可以使用任何合適的方法將氨基酸序列多樣性引入任何所需的肽或多肽或支架的片段中。例如，可以通過使用任何合適的誘變方法(例如，低保真度PCR、寡核苷酸-介導的或定向突變、使用NNK密碼子的多樣化)或任何其他合適的方法制備編碼多樣化多肽的核酸，將氨基酸序列多樣性引入目標片段中，如抗體可變域的互補性決定區或疏水性結構域。如果需要，可以將待多樣化的多肽片段隨機化。構成組的多肽的大小很大程度上是選擇的問題，并且不需要統一的多肽大小。在一個實施方案中，組中的多肽至少具有三級結構(形成至少一個結構域)。選擇/分離/回收可以使用任何合適的方法從組或文庫(例如，在展示系統中)中選擇、分離和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽(例如，一群蛋白酶抗性多肽)。在一個實施方案中，基于可選擇的特征(例如，物理特征、化學特征、功能性特征)來選擇或分離蛋白酶抗性多肽。合適的可選擇的功能性特征包括組中肽或多肽的生物活性，例如，結合通用配體(例如，超抗原)、結合目標配體(例如，抗原、表位、底物)、結合抗體(例如，通過肽或多肽上表達的表位)或催化活性。(參見，例如，Tomlinson等，W099/20749;WOO1/57065;W099/58655)。在一個實施方案中，選擇是基于與TNFR1的特異性選擇。在另一個實施方案中，選擇是基于能產生其中成員是蛋白酶抗性的第二組的選定功能性特征，接著從第二組中選擇特異性結合TNFR1的成員。在一些實施方案中，從其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共有共同的可選擇特征的文庫或組中選擇和/或分離蛋白酶抗性肽或多肽。例如，可以從其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽結合共同的通用配體、結合共同的目標配體、結合共同的抗體(或由其結合)或具有共同的催化活性的文庫或組中選擇蛋白酶抗性肽或多肽。這種類型的選擇對于基于具有所需生物活性的親本肽或多肽來制備一組蛋白酶抗性肽或多肽特別有用，例如，進行免疫球蛋白單可變域的親和性突變時。基于結合共同的通用配體的選擇可以產生含有為原始庫或組成分的全部或基本上全部蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽的集合或群體。例如，可以通過淘選或使用合適的親和性基質來選擇、分離和/或回收結合目標配體或通用配體(如，蛋白A、蛋白L或抗體)的肽或多肽。可以通過將配體(例如，通用配體、目標配體)溶液加入合適的容器中(例如，試管、培養皿)并使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉并將肽或多肽(例如，已經用蛋白酶溫育過的組)加入容器中，并將容器維持在適于肽或多肽結合固定化配體的條件下。將未結合的肽或多肽洗掉，使用任何合適的方法(如刮下(scraping)或降低pH)來回收結合的肽或多肽。合適的配體親和性基質通常含有固體支持物或珠子(例如，瓊脂糖)，配體與其共價或非共價連接。可以使用分批方法、柱方法或任何其他合適的方法，在適于肽或多肽與基質上的配體結合的條件下，將親和性基質與肽或多肽(例如，已經用蛋白酶溫育過的組)混合。可以將沒有結合親和性基質的肽或多肽洗掉，并使用任何合適的方法將結合的肽或多肽洗脫并回收，例如用較低pH的緩沖液、用溫和的去污劑(例如，脲)或競爭與配體結合的肽來洗脫。在一個實施例中，在適于組中的肽或多肽結合目標配體(TNFR1)的條件下，將生物素化的目標配體與組混合。使用固定化的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素(例如，在珠子上)來回收結合的肽或多肽，在一些實施方案中，通用配體是抗體或其表位。結合文庫或組的肽或多肽中基本上保守的肽或多肽的結構特征的抗體或抗原結合片段作為通用配體是特別有用的。對于分離、選擇和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽而適宜用作配體的抗體和抗原結合片段可以是單克隆或多克隆的，并可以使用任何合適的方法來制備。文庫/組在其他方面中，提供了蛋白酶抗性肽和多肽的組、編碼蛋白酶抗性肽和多肽的文庫以及產生該文庫和組的方法。可以使用任何合適的方法制備或獲得編碼和/或含有蛋白酶抗性肽和多肽的文庫。可以基于目標肽或多肽(例如，選自文庫的抗-TNFRl肽或多肽)將文庫設計來編碼蛋白酶抗性肽或多肽，或可以使用本文所述的方法選自另一個文庫。例如，可以使用合適的多肽展示系統來制備富含蛋白酶抗性多肽的文庫。在一個實施例中，如本文所述的，在適于蛋白酶活性的條件下，將含有一組展示多肽的噬菌體展示文庫與蛋白酶混合，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變域(例如，VH、Vk、V入)。基于所需的生物活性，如結合活性(例如，結合通用配體，結合目標配體)，來回收蛋白酶抗性多肽，由此產生富含蛋白酶抗性多肽的噬菌體展示文庫。在一個實施方案中，回收是基于結合通用配體，以產生富集文庫，接著基于與TNFR1的特異性結合來選擇文庫的抗-TNFR1成員。在另一個實施例中，首先篩選包含一組展示肽的噬菌體文庫來鑒定對所需目標抗原(例如，TNFR1)具有結合特異性的組成員，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變域(例如，VH、Vk、VA)。回收具有所需結合特異性的多肽集合，并如本文所述的，在適于蛋白水解活性的條件下，將集合與蛋白酶混合。回收具有所需目標結合特異性的蛋白酶抗性多肽的集合，產生富含蛋白酶抗性和高親和性多肽的文庫。如本文所述的，在一個實施方案中，該選擇方法中的蛋白酶抗性與高親和性結合相關。可以使用任何合適的方法容易地產生編碼所需類型多肽組的文庫。例如，可以獲得編碼所需類型多肽(例如，聚合酶、免疫球蛋白可變域)的核酸序列，并可以制備每個含有一個或更多個突變的核酸的集合，例如通過使用易出錯聚合酶鏈式反應(PCR)系統來擴增核酸，通過化學誘變(Deng等，J.Biol.Chem.269:9533(1994))或使用細菌突變體菌株38(Low等，J.Mol.Biol.，260:359(1996))。在其他實施方案中，為了多樣化，可以靶向核酸的特定片段。突變選定位置的方法也是本領域公知的，并包括，例如，使用錯配的寡核苷酸或簡并的寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，已經通過將突變靶向抗原結合環形成了合成的抗體文庫。已經將隨機或半隨機抗體H3和L3片段添加至種系免疫球蛋白V基因片段，以產生具有未突變框架片段的大文庫(Hoogenboom和Winter(1992)上文；Nissim等(1994)上文；Griffiths等(1994)上文；DeKruif等(1995)上文)。將這樣的多樣化延伸來包括一些或全部其他抗原結合環(Crameri等(1996)NatureMed.2:100;Riechmann等(1995)Bio/Technology，13:475;Morphosys，W097/08320,上文)。在其他實施方案中，對于多樣化，可以耙向核酸的特定片段，例如，通過兩步PCR策略，使用第一PCR的產物作為"mega-引物"。(參見，例如，Landt，0.等，Gene96:125-128(1990))。例如，還可以通過S0EPCR來完成耙向多樣化。(參見，例如，Horton，R.M.等，Gene77:61-68(1989))。可以通過改變編碼序列來獲得選定位置的序列多樣性，編碼序列限定了多肽的序列，使得可以在該位置引入各種可能的氨基酸(例如，全部的20個或其子集)。使用IUPAC命名，最通用的密碼子是NNK，其編碼所有氨基酸以及TAG終止密碼子。可以使用NNK密碼子，以引入所需的多樣性。實現相同目的的其他密碼子也是有用的，包括NNN密碼子，其導致其他終止密碼子TGA和TAA的產生。這樣的靶向方法使得可以在目標區域中開發所有的序列空間。文庫可以包含具有已知主鏈構象的蛋白酶抗性抗體多肽。(參見，例如，Tomlinson等，W099/20749)。可以在合適的質粒或載體中制備文庫。如在此所用的，載體指的是用于將異源DNA引入用于表達和/或其復制的細胞中的離散序列。可以使用任何合適的載體，包括質粒(例如，細菌質粒)、病毒或細菌噬菌體載體、人造染色體和游離基因載體。這樣的載體可以用于簡單克隆和誘變，或表達載體可以用于驅動文庫的表達。載體和質粒通常含有一個或更多個克隆位點(例如，多連接物)、復制起點和至少一個可選擇的標記基因。表達載體可以進一步含有用于驅動多肽轉錄和翻譯的元件，如增強子元件、啟動子、轉錄終止細胞、信號序列等。可以以可操作地連接克隆的編碼多肽的插入片段的方式來安置這些元件，使得在適于表達的條件下(例如，在合適的宿主細胞中)維持該表達載體時，表達和產生多肽。克隆和表達載體通常含有能夠使載體在一個或更多個選定的宿主細胞中復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列能夠使載體獨立于宿主染色體DNA而復制，并包括復制起點或自主復制序列。對于各種細菌、酵母和病毒，這樣的序列是公知的。來自質粒pBR322的復制起點適用于大部分革蘭氏陰性細菌，2微米質粒來源適用于酵母，而各種病毒來源(例如，SV40，腺病毒)適用于在哺乳動物細胞中克隆載體。通常，對于哺乳動物表達載體是不需要復制起點的，除非將這些用于能夠復制高水平DNA的哺乳動物細胞中，如COS細胞。克隆或表達載體可以含有也稱為選擇標記的選擇基因。這樣的標記基因編碼在選擇性培養基中生長的轉化宿主細胞的存活或生長需要的蛋白質。因此，沒有用含有選擇基因的載體轉化的宿主細胞在培養基中將不會存活。通常的選擇基因編碼給予抗生素和其他毒素(例如，氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環素)抗性、補充營養缺陷不足或提供生長培養基中不可獲得的關鍵營養素的蛋白質。合適的表達載體可以含有各種成分，例如，復制起點、可選擇標記基因、一種或更多種表達控制元件，如轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子、終止子)和/或一種或更多種翻譯信號、信號序列或前導序列等。表達控制元件和信號或前導序列如果存在，可以通過載體或其他來源來提供。例如，克隆的編碼抗體鏈的核酸的轉錄和/或翻譯控制序列可以用來指導表達。可以提供啟動子用于所需宿主細胞中的表達。啟動子可以是組成型或誘導型的。例如，啟動子可以可操作地連接編碼抗體、抗體鏈或其一部分的核酸，使得其指導核酸的轉錄。用于原核宿主(例如，用于大腸桿菌的P-內酰胺酶和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統、lac、tac、T3、T7啟動子)和真核宿主(例如，猿病毒40早期或晚期啟動子、勞斯肉瘤病毒長終止重復啟動子、巨細胞病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、EG-la啟動子)的各種合適的啟動子是可獲得的。此外，表達載體通常含有用于選擇攜帶載體的宿主細胞的選擇標記，并且在可復制表達載體的情況中，還含有復制起點。編碼給予抗生素或藥物抗性的產物的基因是常用的選擇標記，并可以用于原核細胞(例如，P-內酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、用于四環素抗性的Tet基因)和真核細胞(例如，新霉素(G418或geneticin)、gpt(霉酚酸)、氨芐青霉素或潮霉素抗性基因)。二氫葉酸還原酶標記基因使得可以用氨甲喋呤在各種細胞中選擇。編碼宿主營養缺陷標記的基因產物的基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵母中的選擇標記。還考慮了使用病毒(例如，桿狀病毒)或噬菌體載體和能夠整合至宿主細胞基因組的載體，如逆轉錄病毒載體。用于在原核細胞(例如，細菌細胞，如大腸桿菌)或哺乳動物細胞中表達的合適表達載體包括，例如，pET載體(例如，pET-12a、pET_36、pET_37、pET_39、pET_40，Novagen等)、噬菌體載體(例如，pCANTAB5E，Pharmacia)、pRIT2T(蛋白A融合載體，Pharmacia)、pCDM8、pCDNAl.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-l(Invitrogen，Carlsbad,CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXTl(Stratagene，LaJolla，CA)、pCDEF3(Goldman,L.A.等，Biotechniques，21:1013-1015(1996))、pSVSPORT(GibcoBRL，Rockville，MD)、pEF-Bos(Mizushima，S.等，NucleicAcidsRes.，18:5322(1990))等。適用于各種表達宿主如原核細胞(大腸桿菌)、昆蟲細胞(果蠅SchnideerS2細胞，Sf9)、酵母(P.methanolica、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母(S.cerevisiae))和哺乳動物細胞(例如，C0S細胞)中的表達載體是可獲得的。載體的實例是能夠表達對應于多肽文庫成員的核苷酸序列的表達載體。因此，可以通過分開的繁殖和表達多肽文庫成員的單克隆的表達來進行使用通用配體和/或目標配體的選擇。如以上所述的，選擇展示系統可以是細菌噬菌體展示。因此，可以使用噬菌體或噬粒載體。實例載體是具有大腸桿菌復制起點(用于雙鏈復制)以及噬菌體復制起點(用于生產單鏈DNA)的噬粒載體。這些載體的操縱和表達是本領域公知的(Hoogenboom和Winter(1992)上文；Nissim等(1994)上文)。簡而言之，載體可以含有給予噬粒上選擇性的P_內酰胺酶基因和表達盒的lac啟動子上游，該表達盒含有合適前導序列、多克隆位點、一個或更多個肽標記物、一個或更多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pIII。因此，使用各種抑制劑和大腸桿菌的非抑制劑菌株并添加葡萄糖、異丙基硫-P-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體如VCSM13，載體能夠作為沒有表達的質粒復制，只產生大量多肽文庫成員或40產物噬菌體，其中一些在其表面上含有多肽-pIII融合體的至少一個拷貝。本文所述的文庫和組可以含有抗體形式。例如，文庫和組內包含的多肽可以是完整的分開的VH或、結構域，其中任一個是修飾的或未修飾的。可以使用任何合適的方法，容易地產生scFv片段，以及其他抗體多肽。各種合適的抗體工程化方法是本領域公知的。例如，可以通過將編碼兩個可變域的核酸連接合適的編碼合適的連接肽的寡核苷酸來形成scFv，連接肽如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3或其他合適的連接肽。連接物橋接第一V區的C-端和第二V區的N-端。可以使用相似的技術，用于構建其他抗體形式，如Fv、Fab和F(ab)2片段。為了使Fab和F(ab)2格式化，可以將VH和、多肽與恒定域片段混合，恒定域片段分離自重排基因、種系C基因或從抗體序列庫合成的。本文所述的文庫或組可以使VH或、文庫或組。包含蛋白酶抗性可變域的多肽可以含有目標配體(例如，TNFR1)結合位點和通用配體結合位點。在特定的實施方案中，通用配體結合位點是用于超抗原(如蛋白A、蛋白L或蛋白G)的結合位點。可變域可以基于任何所需的可變域，例如，人VH(例如，VHla、VHlb、Vh2、Vh3、Vh4、Vh5、Vh6)、人V入(例如，VAI、VA11、V入III、VAIV、VAV、VAVI或VkI)或人Vk(例如，Vk2，Vk3，Vk4，Vk5，Vk6，Vk7，Vk8，Vk9或Vk10)或CamelidV膨任選已經人源化。核酸、宿主細胞和生產蛋白酶抗性多肽的方法本發明涉及分離的和/或重組的編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸，例如，通過本文所述的方法可選擇或已選擇的肽或多肽。在此稱為"分離的"核酸是已經與原始環境(例如，在細胞或在核酸混合物如文庫中)中的其他物質(例如，其他核酸，如基因組DNA、cDNA和/或RNA)分開的核酸。分離的核酸可以作為載體(例如，質粒)的一部分來分離。在此稱為"重組的"核酸是通過重組DNA方法產生的核酸，重組DNA方法包括依賴于人工重組的方法，如克隆至載體或染色體中，例如，使用限制酶、同源重組、病毒等，以及使用聚合酶鏈式反應(PCR)制備的核酸。本發明還涉及重組宿主細胞，其包括(一個或更多個)重組核酸或含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸的表達構建體，例如，通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的肽或多肽。還提供了制備蛋白酶抗性肽或多肽的方法，其包括在適于蛋白酶抗性肽或多肽表達的條件下，維持本發明的宿主細胞。如果需要，該方法可以進一步包括分離或回收蛋白酶抗性肽或多肽的步驟。例如，可以使用任何適于選定宿主細胞的方法(例如，轉化、轉染、電穿孔、感染)，將編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸分子(例如，一個或更多個核酸分子)，或含有該核酸分子的表達構建體(一個或更多個構建體)引入合適的宿主細胞中，以形成重組宿主細胞，使得核酸分子可操作地連接一個或更多個表達控制元件(例如，在載體中、在通過細胞中的加工形成的構建體中、整合至宿主細胞基因組)。在適于表達的條件下(例如，在誘導劑的存在下、在合適的動物中、在補充了適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑的合適培養基中等)，維持所得到的重組宿主細胞，由此產生編碼的肽或多肽。如果需要，可以分離或回收編碼的肽或多肽(例如，從動物、宿主細胞、培養基、乳)。該方法包括在轉基因動物的宿主細胞中的表達(參見，例如，W092/03918，GenPharmlnternational)。還可以在合適的體外表達系統中，通過化學合成或通過任何其他合適的方法，來產生通過本文所述的方法選擇的蛋白酶抗性肽或多肽。因此，本發明提供了蛋白酶抗性肽和多肽。多肽、dAb&拮抗劑如本文所述和舉例說明的，本發明的蛋白酶抗性dAb通常以高親和性結合它們的目標配體。因此，在另一個方面中，提供了選擇、分離和/或回收本發明的以高親和性結合TNFR1的多肽或dAb。通常，該方法包括提供肽或多肽(例如，dAb)的文庫或組，在適于蛋白酶活性的條件下，將文庫或組與蛋白酶(例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液)混合，并選擇、分離和/或回收結合配體(例如，目標配體)的肽或多肽。因為已經在蛋白酶敏感性肽或多肽將得到消化的條件下將文庫或組暴露于蛋白酶，因此蛋白酶的活性可以消除具有低結合親和性的不太穩定的多肽，并因此產生高親和性結合肽或多肽的集合。例如，本發明的多肽或dAb可以以1iim或更強，或大約500nM0.5pM的親和性(KD;KD=K。ff(kd)/K。n(ka)，如通過表面等離子共振所測定的)來結合TNFR1。例如，本發明的多肽或dAb能夠以大約500nM、大約100nM、大約10nM、大約lnM、大約500pM、大約100pM、大約10pM、大約lpM或大約0.5pM的親和力結合TNFR1。盡管我們沒有受到任何特定理論的束縛，認為能抵抗蛋白酶的肽或多肽具有較低的熵和/或較高的穩定能量。因此，蛋白酶抗性與高親和性結合之間的關聯可能與通過本文所述的方法選擇的肽和多肽和dAb表面的緊密性和穩定性相關。在一個實施方案中，本發明的多肽、dAb或拮抗劑抑制TNFa與TNFa受體1(p55受體)的結合，其具有為大約500nM50pM，或100nM50pM，或10nM100pM，或lnM100pM;例如50nM或更小，或5nM或更小，或500pM或更小，或200pM或更小，或100pM或更小的抑制濃度50(IC50)。在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1，并與人TNFR1分離，具有300nM至lpM的解離常數(KD)，或300nM至5pM，或50nM至lpM，或50nM至5pM，或50nM至20pM，或約10pM，或約15pM，或約20pM，如通過表面等離子共振所測定的。在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFRl，例如人TNFRl，并與人TNFR1分離，具有5X10—、—&1X10—'s—1或1X10—3s—卜1X10—'s—1或1X10—4s—卜1X10—'s—1或1X10—5s——1X10—7s—1或1X10—4s—1或1X10—5s—1的K。ff速度常數，如通過表面等離子共振所測定的。在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1，具有1X10—3M—V1至1X10—7M—、—1的K。n，或1X10—3M—、—1至1X10—6M—V、或約1X10—4M—、—1或約1X10—5M—V1。在一個實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1，并與人TNFR1分離，具有在該段落中限定的解離常數(KD)和K。『在一個實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1，并與人TNFR1分離，具有該段落中限定的解離常數(KD)和K。n。在一些實施方案中，多肽或dAb特異性地結合TNFR1(例如人TNFR1)，具有該段落中引用的KD和/或K。ff和/或K。n，并包括與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少或至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。可以在大腸桿菌或畢赤酵母屬種(例如，巴斯德畢赤酵母)中表達多肽、dAb或拮抗劑。在一個實施方案中，在大腸桿菌或畢赤酵母屬種(例如，巴斯德畢赤酵母)中表達時，以至少約0.5mg/L的量來分泌配體或dAb單體。盡管，在大腸桿菌或畢赤酵母屬種(例如，巴斯德畢赤酵母)中表達時，本文所述的配體和dAb單體是可分泌的，可以使用任何合適的方法來生產，如合成的化學方法或沒有使用大腸桿菌或畢赤酵母屬種的生物生產方法。在一些實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑不含有Camelid免疫球蛋白可變域，或一個或更多個框架氨基酸，這些氨基酸對于由Camelid種系抗體基因片段編碼的免疫球蛋白可變域是獨特的，例如，在位置108、37、44、45和/或47。根據本發明的TNFR1的拮抗劑可以是單價的或多價的。在一些實施方案中，拮抗劑是單價的并含有一個與TNFR1相互作用的結合位點，該結合位點是由本發明的多肽或dAb提供的。單價拮抗劑結合一個TNFR1并可以不誘導導致受體和信號轉導激活的細胞表面上的TNFR1的交聯或聚集。在其他實施方案中，TNFR1的拮抗劑是多價的。TNFR1的多價拮抗劑可以含有兩個或更多個用于TNFR1的特定結合位點的拷貝或含有兩個或更多個結合TNFR1的不同結合位點，至少一個結合位點是由本發明的多肽或dAb提供的。例如，如本文所述的，TNFR1的拮抗劑可以是二聚體、三聚體或多聚體，其含有兩個或更多個本發明的結合TNFR1的特定多肽或dAb的拷貝，或兩個或更多個本發明的結合TNFR1的不同多肽或dAb。在一個實施方案中，TNFR1的多價拮抗劑在標準的細胞測試中基本上不激動TNFR1(作為TNFR1的激動劑)(艮卩，當以lnM，10nM，100nM，1線10線100iiM，1000iiM或5，000iiM的濃度存在時，在測試中達到了不超過大約5%的TNFa(100pg/ml)誘導的TNFR1-介導的活性)。在特定的實施方案中，TNFR1的多價拮抗劑含有兩個或更多個用于TNFR1所需的表位或結構域的結合位點。例如，TNFR1的多價拮抗劑能夠包含兩個或者更多個結合位點，其結合TNFR1的結構域1中的相同的表位。在其他一些實施方案中，TNFR1的多價拮抗劑含有由本發明的多肽或dAb提供的兩個或更多個結合位點，其結合TNFR1的不同表位或結構域。在一個實施方案中，這些多價拮抗劑在如W02006038027所描述的標準L929細胞毒性測試或標準HeLaIL-8測試中以大約lnm或大約10nM或大約100nM或大約1yM或大約10yM的濃度存在時不會激動TNFR1。TNFR1的其他拮抗劑不會抑制TNFa與TNFR1的結合。這些配體(和拮抗劑)可以具有作為診斷劑的實用性，因為它們可以用于結合并檢測、定量或測量樣品中的TNFR1，并且不會與樣品中的TNF競爭與TNFR1的結合。因此，可以準確地測定樣品中是否存在TNFR1或存在多少TNFR1。在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，具有本文所述的KD，并抑制了標準小鼠LPS/D-半乳糖胺誘導的敗血病性休克模型中的致死率(例如，與合適對照相比，防止致死性或降低了至少約10%的致死率)。在一個實施方案中，以約5mg/kg或更多，例如，約lmg/kg給藥時，與標準小鼠LPS/D-半乳糖胺誘導的敗血病性休克模型中的合適對照相比，多肽、dAb或拮抗劑抑制至少約10%或至少約25%或至少約50%的致死率。在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑結合TNFR1并在標準細胞測試中拮抗TNFR1介導的活性，具有《100nM的ND5。，并且以<10yM的濃度，dAb在測試中激動<5%的TNFR1的活性。43在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑在標準細胞測試中基本上不激動TNFRl(作為TNFRl的激動劑)((即，當以lnM，10nM，lOOnM，1iiM，10iiM，100iiM，1000iiM或5，000iiM的濃度存在時，在測試中達到了不超過大約5X的TNFa(100pg/ml)誘導的TNFRl-介導的活性)。在特定的實施方案中，給予有效量時，本發明的多肽、dAb或拮抗劑在慢性炎癥疾病模型中是有效的。通常，有效量為約lmg/kg至約10mg/kg(例如，約lmg/kg，約2mg/kg，約3mg/kg，約4mg/kg，約5mg/kg，約6mg/kg，約7mg/kg，約8mg/kg，約9mg/kg或約10mg/kg)。本領域技術人員認為慢性炎癥的模型(參見W02006038027中所描述的)預示著在人體中的治療功效。在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑在標準小鼠膠原誘導的關節炎模型中是有效的(關于該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠降低在標準小鼠膠原誘導關節炎模型中四肢總和的平均關節炎評分，例如與適當的對照相比，降低大約1大約16，大約3大約16，大約6大約16，大約9大約16，或大約12大約16。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在標準小鼠膠原誘導的關節炎模型中延遲關節炎癥狀的開始，例如與適當的對照相比，延遲大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在標準小鼠膠原誘導的關節炎模型中得到0大約3，大約3大約5，大約5大約7，大約7大約15，大約9大約15，大約10大約15，大約12大約15，或大約14大約15的四肢總和的關節炎評分。在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠關節炎AARE模型中是有效的(關于該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關節炎AARE模型中降低平均關節炎評分，例如與適當的對照相比降低大約O.1大約2.5，大約0.5大約2.5，大約1大約2.5，大約1.5大約2.5，或大約2大約2.5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關節炎AARE模型中延遲關節炎癥狀的開始，例如與與適當的對照相比延遲大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約IO天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關節炎AARE模型中得到0大約0.5，大約0.5大約l，大約1大約1.5，大約1.5大約2，或大約2大約2.5的平均關節炎評分。在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠炎性腸病(IBD)AARE模型中是有效的(關于該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠IBDAARE模型中降低急性和/或慢性炎癥評分，例如與適當的對照相比降低大約0.1大約2.5，大約0.5大約2.5，大約1大約2.5，大約1.5大約2.5，或大約2大約2.5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠IBDAARE模型中延遲IBD癥狀的開始，例如，與適當的對照相比延遲大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑在小鼠IBDAARE模型中得到0大約0.5，大約0.5大約1，大約1大約1.5，大約1.5大約2，或大約2大約2.5的平均急性和/或慢性炎癥評分。在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的炎性腸病模型中是有效的(關于該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠IBD的DSS模型中降低平均嚴重程度評分，例如與適當的對照相比降低大約0.1大約2.5，大約0.5大約2.5，大約1大約2.5，大約1.5大約2.5，或大約2大約2.5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠IBD的DSS模型中延遲IBD癥狀的開始，例如與適當的對照相比延遲大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠IBD的DSS模型中得到0大約0.5，大約0.5大約1，大約1大約1.5，大約1.5大約2，或大約2大約2.5的平均嚴重程度評分。在特定的實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠煙草煙霧慢性梗阻性肺病模型(COPD)中是有效的(關于該模型的細節，參見W02006038027和W02007049017)。例如，與適當的對照相比，給藥有效量的配體能夠降低COPD癥狀或延遲COPD癥狀的開始。可以獲得一些動物模型系統，其能夠用于篩選TNFR1的拮抗劑(例如其配體、抗體或結合蛋白)在保護抵抗或治療疾病中的效率。用于在易感性小鼠中測試系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法是本領域中已知的(Knightetal.(1978)J.Exp.Med.，147:1653;Reinerstenetal.(1978)NewEng.J.Med.，299:515)。在SJL/J雌性小鼠中測試重癥肌無力(MG)，其通過利用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘導該疾病(Lindstrometal.(1988)Adv.Immunol.，42:233)。關節炎是在小鼠的易感株中通過注射II型膠原而誘導的(Stuartetal.(1984)Ann.Rev.Immunol.，42:233)。在易感大鼠中通過注射分枝桿菌熱休克蛋白而誘導佐劑關節炎的模型已經被描述(VanEdenetal.(1988)Nature,331:171)。甲狀腺炎是在小鼠中根據所描述的通過給藥甲狀腺球蛋白而誘導的(Maronetal.(1980)J.E鄧.Med.，152:1115)。胰島素依賴性糖尿病(IDDM)是自然出現的，或者可以在某些小鼠株中根據Kanasawaetal.(1984)Diabetologia，27:113.所描述的那些進行誘導。在小鼠和大鼠中EAE作為人中MS的模型。在該模型中，去髓鞘疾病是通過給藥髓鞘堿性蛋白而誘導的(參見Paterson(1986)TextbookofImm皿opathology，Mischeretal.，eds.，G進eandStratton，NewYork,pp.179-213;McFarlinetal.(1973)Science,179:478:andSatohetal.(1987)J.Immunol.，138:179)。通常，本發明的配體(例如，拮抗劑)將以純化的形式與藥物學上合適的載體一起使用。通常，這些載體包括水或醇/水溶液、乳液或懸浮液、任何包括鹽和/或緩沖的基質。非腸道載體包括氯化鈉溶液、Ringer's葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸化Ringer's。如果需要在懸浮液中保持多肽復合物，合適的生理學上可接受的佐劑可以選自增稠劑，如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。靜脈內載體包括流體和營養補充劑和電解質補充劑，如基于Ringer's葡萄糖的那些。防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體，也可以存在(Mack(1982)Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版)。可以使用各種合適的制劑，包括緩釋制劑。本發明的配體(例如，拮抗劑)可以用作分開給藥的組合物或結合其他藥劑。這些包括各種免疫治療藥物，如環孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素或順鉑和免疫毒素。藥物組合物可以包括各種細胞毒性或其他藥劑與本發明配體結合的"組合藥劑(cocktails)"，或甚至是根據本發明的具有不同特異性的配體的組合物，如使用不同目標抗原或表位選擇的配體，不管是否是在給藥之前混合。根據本發明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領域技術人員公知的那些。對于治療，包括但不限于免疫治療，根據標準技術將本發明選定的配體給藥于任何患者。給藥可以是任何合適的模式，包括非腸道、靜脈內、肌內、腹膜內、經皮、通過肺的途徑，或者其他，合適地，通過用導管直接灌輸。給藥的劑量和頻率將取決于患者的年齡、性別和狀況、其他藥物的同時給藥、禁忌和醫師將要考慮的其他參數。如所示的，給藥可以是局部(例如，通過肺部給藥局部遞送至肺，例如，鼻內給藥)或全身的。可以將本發明的配體凍干，用于存儲以及在使用前在合適的載體中重建。已經表明該技術對常規的免疫球蛋白是有效的，并可以使用本領域已知的凍干和重建技術。本領域技術人員將認識到凍干和重建可能導致抗體活性不同程度的損耗(例如，使用常規的免疫球蛋白，IgM抗體的活性損耗易于比IgG抗體高)，可以調節使用水平來補償。可以將含有本發明配體(例如，拮抗劑)或其混合物的組合物給藥來用于預防和/或治療處理。在特定的治療應用中，將實現選定細胞群的至少部分抑制、遏制、調節、殺滅或一些其他可測量參數的適當含量定義為"治療有效量"。實現該劑量需要的含量將取決于疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的一般狀況，但通常為0.005至5.0mg配體/kg體重，配體例如為dAb或拮抗劑，更常使用0.05至2.0mg/kg/劑的劑量。對于預防性應用，可以給藥相似或略低劑量的含有本發明配體或其混合物的組合物，以預防、抑制或延遲疾病的發作(例如，維持緩解或靜止，或防止急性期)。本領域技術人員能夠測定治療、抑制或預防疾病的合適給藥間隔。將TNFR1的配體(例如，拮抗劑)給藥來治療、抑制或預防慢性炎癥疾病時，可以給藥高達四次/天，每周兩次，每周一次，每兩周一次，一月一次或每兩月一次，例如，劑量為約10iig/kg至約80mg/kg，約100iig/kg至約80mg/kg，約lmg/kg至約80mg/kg，約lmg/kg至約70mg/kg，約lmg/kg至約60mg/kg，約lmg/kg至約50mg/kg，約lmg/kg至約40mg/kg，約lmg/kg至約30mg/kg，約lmg/kg至約20mg/kg，約lmg/kg至約10mg/kg，約10iig/kg至約10mg/kg，約10iig/kg至約5mg/kg，約10iig/kg至約2.5mg/kg，約lmg/kg，約2mg/kg，約3mg/kg，約4mg/kg，約5mg/kg，約6mg/kg，約7mg/kg，約8mg/kg，約9mg/kg或約10mg/kg。在特定的實施方案中，將TNFR1的配體(例如，拮抗劑)給藥來治療、抑制或防止慢性炎癥疾病，每兩周一次或一月一次，劑量為約10iig/kg至約10mg/kg(例如，約10iig/kg，約100iig/kg，約lmg/kg，約2mg/kg，約3mg/kg，約4mg/kg，約5mg/kg，約6mg/kg，約7mg/kg，約8mg/kg，約9mg/kg或約10mg/kg)。如果相對于治療前存在的癥狀，或相對于沒有用該組合物治療的個體(人或模型動物)或其他合適對照中的癥狀，一種或更多種癥狀得到減輕(例如，至少10%或臨床評價等級的至少一個點)，認為使用本文所述的組合物進行的處理或治療是"有效的"。癥狀將根據靶向的疾病或病癥而明顯不同，但可以通過普通醫師或技術人員來測量。例如，可以通過監控疾病或病癥的一個或更多個生化指示劑的水平(例如，酶或與疾病相關的代謝產物的水平、受影響細胞的數目等)、通過監控身體呈現(例如，炎癥、腫瘤大小等)，或通過公認臨床評價等級來測量該癥狀-例如擴展運動障礙狀態量度(對于多發性硬化)、歐文炎癥性46腸病調查表(32點評定評價關于腸功能、系統性癥狀、社會功能和情緒狀態的生活質量-評分在32到224的范圍內，評分越高說明生活質量越好)、類風濕性關節炎生活質量標準、或本領域中已知的其他認可的臨床評估標準。在給定的臨床標準上疾病或紊亂癥狀持續(例如一天或更多，或更長)降低至少10%或一個或更多個點是有效治療的指標。相似地，如果相對于未用組合物治療的相似個體(人或動物模型)中的癥狀，一種或更多種癥狀的發作或嚴重程度得到了延遲、減輕或消除，使用本文所述的組合物進行的預防是"有效的"。可以在預防或治療情況中使用含有根據本發明的配體(例如，拮抗劑)或其混合物的組合物，以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標細胞群。此外，本文所述的選定的多肽組可以離體地或在體外選擇性地從異源細胞集合中殺滅、耗盡或另外有效地除去目標細胞群。可以根據標準技術，將來自哺乳動物的血液在體外與配體混合，由此殺滅或另外從用于返回至哺乳動物的血液中除去不利的細胞。可以在預防或治療情況中使用含有根據本發明的配體(例如，拮抗劑)的組合物，以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標細胞群。可以將配體(例如，抗-TNFR1拮抗劑、dAb單體)給藥，和或與一種或更多種其他的治療劑或活性劑一起配制。配體(dAb)與其他的治療劑一起給藥時，可以在給藥其他藥劑之前、同時或之后，給藥配體。通常，以提供重疊治療效果的方法來給藥配體和其他藥劑。在一個實施方案中，本發明是用于治療、抑制或預防慢性炎癥疾病的方法，該方法包括將治療有效劑量或含量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑給藥于需要的哺乳動物。在一個實施方案中，本發明是用于治療、抑制或預防關節炎(例如類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、牛皮癬關節炎)的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑。在另一個實施方式中，本發明是用于治療、抑制或者預防牛皮癬的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。在另一個實施方式中，本發明是用于治療、抑制或者預防炎性腸病(例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎)的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑。在另一個實施方式中，本發明是用于治療、抑制或者預防慢性阻塞性肺病(例如慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎、肺氣腫)的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑。在另一個實施方式中，本發明是用于治療、抑制或者預防肺炎(例如細菌性肺炎例如葡萄球菌肺炎)的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑。本發明提供了用于治療、抑制或預防除了慢性梗阻性肺病和肺炎之外的其他肺病的方法。根據本發明可以治療、抑制或預防的其他肺病包括例如囊性纖維變性和哮喘(例如類固醇抗性哮喘)因此，在另一個實施方案中，本發明是用于治療、抑制或預防肺病(例如，囊性纖維變性和哮喘)的方法，其包括將治療有效劑量或含量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑給藥于需要的哺乳動物。在特定的實施方案中，通過肺部遞送，如通過吸入(例如，支氣管內、鼻內或口腔吸入、鼻內滴劑)或通過全身性遞送(例如，非腸道、靜脈內、粘膜內、腹膜內、皮下)來給藥TNFR1的拮抗劑。在另一個實施方案中，本發明是治療、抑制或預防敗血性休克的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑。在本發明進一步的方面中，提供了組合物，其包含根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑和藥物學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。此外，本發明提供了使用根據本發明的多肽、dAb或TNFR1的拮抗劑或組合物來治療疾病的方法。在一個實施方案中，疾病是癌癥或炎癥，例如，類風濕性關節炎、哮喘或克羅恩氏病。形式提高的半衰期在免疫球蛋白，特別是抗體，最特別是小尺寸的抗體片段的體內應用中是有用的。這樣的片段(Fv、二硫化物鍵合的Fv、Fab、scFv、dAb)能從體內快速清除；因此，盡管它們能夠快速地到達身體的大部分部位，并且能快速產生和更容易操作，但它們在體內的應用受到僅在體內短暫持續的限制。本發明的一個實施方案通過提供體內半衰期延長的配體并且隨后配體的功能活性在體內持續更長時間來解決了該問題。藥物動力學分析的方法和配體半衰期的測定是本領域技術人員熟知的。可以在Kermeth，A等ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists(藥物動力學的化學穩定性藥劑師手冊)和Peters等，Pharmacokinetcanalysis:APhacticalA卯roach(藥物動力學分析實踐方法)(1996)中找到詳細內容。還可以參考"Pharmacokinetics"(藥物云力力學)，MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版，第2次再版(1982)，其描述了藥物動力學參數，如ta和tP半衰期和曲線下面積(AUC)。可以從配體隨時間的血清濃度曲線確定半衰期(t1/2a和t1/213)和AUC。例如，可以使用WinNonlin分析包(從PharsightCorp.，MountainView，CA94040,USA獲得)來模擬曲線。在第一期中(a期)，配體主要經歷在患者中的分布，并有一些清除。第二期(13期)是配體已經得到分布的末期，血清濃度隨著配體從患者體內清除出去而降低。ta半衰期是第一期的半衰期，而tl3半衰期是第二期的半衰期。因此，在一個實施方案中，本發明提供了具有15分鐘或更長ta半衰期的配體或含有根據本發明的配體的組合物。在一個實施方案中，范圍的下限是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。此外，或可替換地，根據本發明的配體或組合物將具有高達并包括12小時的ta半衰期。在一個實施方案中，范圍的上限是11、10、9、8、7、6或5小時。合適范圍的實例是1至6小時，2至5小時或3至4小時。在一個實施方案中，本發明提供具有2.5小時或更長tl3半衰期的配體(多肽、dAb或拮抗劑)或含有根據本發明的配體的組合物。在一個實施方案中，范圍的下限是3小時，4小時，5小時，6小時，7小時，10小時，11小時或12小時。此外，或可替換地，根據本發明的配體或組合物將具有高達并包括21天的tl3半衰期。在一個實施方案中，范圍的上限是12小時，24小時，2天，3天，5天，10天，15天或20天。在一個實施方案中，根據本發明48的配體或組合物將具有12至60小時的tl3半衰期。在進一步的實施方案中，將是12至48小時。在仍然進一步的實施方案中，將是12至26小時。對于以上標準，另外或可替換地，本發明提供了具有lmg.min/ml或更高AUC值(曲線下面積)的配體或含有根據本發明的配體的組合物。在一個實施方案中，范圍的下限是5、10、15、20、30、100、200或300mg.min/ml。此外，或可替換地，根據本發明的配體或組合物具有高達600mg.min/ml的AUC。在一個實施方案中，范圍的上限是500、400、300、200、150、100、75或50mg.min/ml。在一個實施方案中，根據本發明的配體具有選自以下范圍的AUC:15至150mg.min/ml，15至lOOmg.min/ml，15至75mg.min/ml禾口15至50mg.mon/ml。例如，通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或通過綴合抗體結構域，將本發明的多肽和dAb以及含有這些的拮抗劑格式化，以具有較大的流體動力學大小。例如，將多肽dAb和拮抗劑格式化成較大的抗體的抗原結合片段或抗體(例如，格式化成Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFv)。可以使用本領域公知的方法來測定本發明配體(例如，dAb單體或多聚體)的流體動力學大小。例如，凝膠過濾色譜可以用來測定配體的流體動力學大小。用于測定配體的流體動力學大小的合適的凝膠過濾基質，如交聯的瓊脂糖基質，是公知的并容易獲得。配體形式的大小(例如，連接dAb單體的PEG部分的大小)可以根據所需的應用而改變。例如，在打算將配體離開循環并進入外周組織的情況中，希望保持低的配體流體動力學大小，以促進從血流中外滲。或者，在期望配體在全身循環中保持更長時間的情況中，可以提高配體的大小，例如，通過格式化成Ig樣蛋白。通過靶向提高體內半衰期的抗原或表位來延長半衰期如本文所述的，還可以通過將本發明的TNFR1結合多肽、dAb或拮抗劑綴合或連接結合提高體內半衰期的抗原或表位的結合域(例如，抗體或抗體片段)來提高配體的流體動力學大小及其血清半衰期。例如，可以將TNFR1結合劑(例如，多肽)綴合或連接抗-血清白蛋白或抗_新生兒Fc受體抗體或抗體片段，例如，抗-SA或抗新生兒Fc受體dAb、Fab、Fab'或scFv，或抗-SA親和體或抗-新生兒Fc受體親和體或抗-SAavimer，或抗-SA結合域，其包含選自但優選不限于CTLA-4、lipocallin、SpA、親和體、avimer、GroEl和纖連蛋白的支架(對于這些結合域的公開內容，參見，PCT/GB2008/000453，2008年2月8日申請，在此將結合域及其序列引入作為參考，并形成本發明文本公開內容的一部分)。綴合指的是將含有本發明的多肽、dAb或拮抗劑的組合物結合(共價或非共價)結合血清白蛋白的結合域。提高體內血清半衰期的合適多肽包括，例如，轉鐵蛋白受體特異性配體-神經藥劑融合蛋白(參見，U.S.專利No.5，977，307，在此將其教導引入作為參考)、腦毛細管內皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體(例如，可溶性轉鐵蛋白受體)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF2)受體、胰島素受體、凝血因子X、cil-抗胰蛋白酶和HNFla。合適的提高血清半衰期的多肽還包括a1-糖蛋白(血清類粘蛋白；AAG)、a1-抗凝乳蛋白酶(ACT)、al-微球蛋白(蛋白HC;AM)、抗凝血酶III(AT111)、阿樸脂蛋白A-l(ApoA-l)、阿樸脂蛋白B(ApoB)、血漿銅藍蛋白(Cp)、補體成分C3(C3)、補體成分C4(C4)、Cl彈性蛋白酶抑制劑(ClIHN)、C-反應性蛋白(CRP)、鐵蛋白(PER)、血液結合素(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖-結合蛋白(MBP)、肌紅蛋白(Myo)、前清蛋白(甲狀腺素運載蛋白(transthyretin);PAL)、視黃醇-結合蛋白(RBP)和類風濕因子(RF)。來自胞外基質的合適蛋白包括，例如，膠原蛋白、昆布氨酸、整聯蛋白和纖連蛋白。膠原蛋白是胞外基質主要的蛋白。目前已知約15種類型的膠原蛋白，在身體的不同部分發現，例如，在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內臟中發現的I型膠原蛋白(占身體膠原蛋白的90%)，或在軟骨、椎間盤、脊索和眼睛的玻璃體中發現的II型膠原蛋白。來自血液的合適蛋白包括，例如，血漿蛋白(例如，纖維蛋白、a-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原(例如，纖維蛋白原A、纖維蛋白原B)、血清淀粉狀蛋白A、結合珠蛋白、抑制蛋白、泛素、子宮球蛋白和P-2-微球蛋白)、酶和酶抑制劑(例如，血纖維蛋白溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)C、a-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑)、免疫系統的蛋白，如免疫球蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈(k/入))、轉運蛋白(例如，視黃醇結合蛋白、a-l微球蛋白)、防御素(例如，P-防御素l、嗜中性防御素1、嗜中性防御素2和嗜中性防御素3)等。在血腦屏障或神經組織中發現的合適蛋白包括，例如，黑皮素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運子等。提高體內血清半衰期的合適多肽還包括位于腎臟中的蛋白(例如，polycysticIV型膠原蛋白、有機陰離子轉運子Kl、Heyma皿's抗原)、位于肝臟中的蛋白(例如，醇脫氫酶、G250)、位于肺中的蛋白(例如，分泌成分，其結合IgA)、位于心臟中的蛋白(例如，HSP27，其與擴張型心肌病相關)、位于皮膚中的蛋白(例如，角蛋白)、骨特異性蛋白，如骨形態發生蛋白(BMP)，其是證明了骨形成活性的蛋白的轉化生長因子13超家族的子集(例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8)、腫瘤特異性蛋白(例如，滋養層抗原、herc印tin受體、雌激素受體、組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B，其可以在肝臟和脾臟中找到)。合適的疾病特異性蛋白包括，例如，只在激活的T-細胞上表達的抗原，包括LAG-3(淋巴細胞激活基因)、骨保護素配體(0PGL;參見Nature402，304-309(1999))，0X40(TNF受體家族的成員，在激活的T細胞上表達并在人I-型T細胞白血病病毒(HTLV-I)-產生細胞中特異性地上調；參見Immunol.165(1):263-70(2000))。合適的疾病特異性蛋白還包括，例如，金屬蛋白酶(與關節炎/癌癥相關)，包括CG6512果蠅、人截癱蛋白(par即legin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH;和血管生成生長因子，包括酸性成纖維細胞生長因子(FGF-1)、堿性成纖維細胞生長因子(VEGF/VPF)、轉化生長因子_a(TGFa)、腫瘤壞死因子_a(TNF-a)、血管生成素、白細胞間介素_3(IL_3)、白細胞間介素_8(IL_8)、血小板衍生內皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(P1GF)、中期因子(midkine)血小板-衍生生長因子-BB(PDGF)和fractalkine。提高體內血清半衰期的合適多肽還包括應激蛋白，如熱休克蛋白(HSP)。HSP通常在細胞內發現。在胞外發現時，它是細胞已經死亡并溢出其內含物的指示劑。作為創傷、疾病或損傷的結果時，發生這種非程序化細胞死亡(壞死)，胞外HSP引發了來自免疫系統的應答。結合胞外HSP可以導致將本發明的組合物定位于患病部位。涉及Fc轉運的合適蛋白包括，例如，Brambell受體(也稱為FcRB)。這種Fc受體具有兩個功能，對于遞送都是潛在有用的。功能是(1)通過胎盤將IgG從母體轉運至子女，(2)保護IgG免受降解，由此延長其血清半衰期。認為受體使來自核內體的IgG再循環。50(參見，Holliger等，NatBiotechnol15(7):632-6(1997))。結合血清白蛋白的dAb在一個實施方案中，本發明提供了多肽或拮抗劑(例如，雙特異性配體)，其含有結合TNFR1的抗TNFR1dAb(第一dAb)和結合血清白蛋白(SA)的第二dAb，第二dAb結合SA，具有通過表面等離子共振測定的lnM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400或500iiM(即，X10—9至5X10—4)的KD，或lOOnM至10iiM，或1至5iiM，或3至70nM，或10nM至1、2、3、4或5iiM。例如，30至70nM，如通過表面等離子共振所測定的。在一個實施方案中，第一dAb(或dAb單體)結合SA(例如，HSA)，具有通過表面等離共振測定的大約1、50、70、100、150、200、300nM或1、2或3iiM的K。。在一個實施方案中，對于含有第一抗-SAdAb和第二對TNFR1的dAb的雙特異性抗體，第二dAb對其目標的親和性(例如KD和/或K。ff，如通過表面等離子共振所測量的，例如使用BiaCore)為dAb對SA的親和性的1至100000倍(例如，100至100000，或1000至100000，或10000至100000倍)。在一個實施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。例如，第一dAb以大約lOyM的親和性結合SA，而第二dAb以100pM的親和性結合其目標。在一個實施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一個實施方案中，第一dAb以大約50，例如，70、100、150或200nM的KD結合SA(例如，HSA)。雙特異性配體的詳細內容可以在W003002609、W004003019和W004058821中找到。在一個實施方案中，本發明的配體包含結合血清白蛋白(SA)的dAb，具有通過表面等離子共振測定的lnM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400或500iiM(艮卩，X10—9至5X10—4)的Kd，或lOOnM至10iiM，或1至5iiM，或3至70nM，或10nM至1、2、3、4或5iiM。例如，30至70nM，如通過表面等離子共振所測定的。在一個實施方案中，第一dAb(或dAb單體)結合SA(例如，HAS)，具有通過表面等離共振測定的大約1、50、70、100、150、200、300nM或1、2或3yM的KD。在一個實施方案中，第一和第二dAb通過連接物連接，例如，1至4個氨基酸的連接物，或1至3個氨基酸，或多于3個氨基酸，或多于4、5、6、7、8、9、10、15或20個氨基酸。在一個實施方案中，可以使用較長的連接物(多于3個氨基酸)來提高功效(拮抗劑中一個或兩個dAb的KD)。在配體和拮抗劑的特定實施方案中，dAb結合人血清白蛋白并與選自以下的dAb競爭與白蛋白的結合MSA_16、MSA-26(對于這些序列的公開內容，參見W004003019,在此將該序列及其核酸對應物引入作為參考并形成本發明文本公開內容的一部分)，D0M7m_16(SEQIDNO:473)、D0M7m_12(SEQIDNO:474)、D0M7m_26(SEQIDNO:475)、D0M7r-l(SEQIDNO:476)、D0M7r-3(SEQIDNO:477)、D0M7r-4(SEQIDNO:478)、D0M7r-5(SEQIDNO:479)、D0M7r_7(SEQIDNO:480)、D0M7r_8(SEQIDNO:481)、D0M7h_2(SEQIDNO:482)、D0M7h_3(SEQIDNO:483)、D0M7h_4(SEQIDNO:484)、D0M7h_6(SEQIDNO:485)、D0M7h_l(SEQIDNO:486)、D0M7h_7(SEQIDNO:487)、D0M7h-22(SEQIDNO:489)、D0M7h_23(SEQIDNO:490)、D0M7h_24(SEQIDNO:491)、D0M7h-25(SEQIDNO:492)、D0M7h_26(SEQIDNO:493)、D0M7h-21(SEQIDNO:494)、D0M7h_27(SEQIDNO:495)、D0M7h_8(SEQIDNO:496)、D0M7r_13(SEQIDNO:497)、D0M7r-14(SEQIDNO:498)、D0M7r_15(SEQIDNO:499)、D0M7r_16(SEQIDNO:500)、D0M7r-17(SEQIDNO:501)、D0M7r-18(SEQIDNO:502)、D0M7r-19(SEQIDNO:503)、D0M7r-20(SEQIDNO:504)、D0M7r_21(SEQIDNO:505)、D0M7r_22(SEQIDNO:506)、D0M7r-23(SEQIDNO:507)、D0M7r_24(SEQIDNO:508)、D0M7r_25(SEQIDNO:509)、D0M7r-26(SEQIDNO:510)、D0M7r_27(SEQIDNO:511)、D0M7r_28(SEQIDNO:512)、D0M7r-29(SEQIDNO:513)、D0M7r_30(SEQIDNO:514)、D0M7r_31(SEQIDNO:515)、D0M7r-32(SEQIDNO:516)、D0M7r_33(SEQIDNO:517)(對于這些序列的公開內容，參見W02007080392，在此將其序列及其核酸對應物引入作為參考并形成本發明文本公開內容的一部分；該段落中的SEQIDNO是W02007080392公開的那些)，dAb8(dAblO)、dAblO、dAb36、dAb7r20(D0M7r20)、dAb7r21(D0M7r21)、dAb7r22(D0M7r22)、dAb7r23(D0M7r23)、dAb7r24(D0M7r24)、dAb7r25(D0M7r25)、dAb7r26(D0M7r26)、dAb7r27(D0M7r27)、dAb7r28(D0M7r28)、dAb7r29(D0M7r29)、dAb7r29(D0M7r29)、dAb7r31(D0M7r31)、dAb7r32(D0M7r32)、dAb7r33(D0M7r33)、dAb7r33(D0M7r33)、dAb7h22(D0M7h22)、dAb7h23(D0M7h23)、dAb7h24(D0M7h24)、dAb7h25(D0M7h25)、dAb7h26(D0M7h26)、dAb7h27(D0M7h27)、dAb7h30(D0M7h30)、dAb7h31(D0M7h31)、dAb2(dAbs4、7、41)、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2(dAb7ml2)、dAbl3(dAb15)、dAbl5、dAbl6(dAb21、dAb7ml6)、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25(dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAbs47、52禾卩56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl(DOM7rl)、dAb7r3(D0M7r3)、dAb7r4(D0M7r4)、dAb7r5(D0M7r5)、dAb7r7(D0M7r7)、dAb7r8(D0M7r8)、dAb7rl3(D0M7rl3)、dAb7rl4(D0M7rl4)、dAb7rl5(D0M7rl5)、dAb7rl6(D0M7rl6)、dAb7rl7(D0M7rl7)、dAb7rl8(D0M7rl8)、dAb7r19(D0M7r19)、dAb7hl(D0M7hl)、dAb7h2(D0M7h2)、dAb7h6(D0M7h6)、dAb7h7(D0M7h7)、dAb7h8(D0M7h8)、dAb7h9(D0M7h9)、dAb7hl0(D0M7hl0)、dAb7hl1(D0M7hl1)、dAb7hl2(D0M7hl2)、dAb7hl3(D0M7hl3)、dAb7hl4(D0M7hl4)、dAb7pl(D0M7pl)和dAb7p2(D0M7p2)(對于這些序列的公開內容，參見PCT/GB2008/000453，2008年2月8日申請，在此將其序列及其核酸對應物引入作為參考并形成本發明文本的公開內容的一部分)。dAb后括號中顯示了可替換的名稱，例如dAb8具有可替換的名稱dAb10，即dAb8(dAb10)。還在圖51a和b中列出了這些序列。在特定的實施方案中，dAb結合人血清白蛋白，并包含與選自以下的dAb的氨基酸序列具有至少約80%或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列MSA-16、MSA-26，D0M7m-16(SEQIDNO:473)、D0M7m_12(SEQIDNO:474)、D0M7m_26(SEQIDNO:475)、D0M7r_l(SEQIDNO:476)、D0M7r_3(SEQIDNO:477)、D0M7r_4(SEQIDNO:478)、D0M7r-5(SEQIDNO:479)、D0M7r_7(SEQIDNO:480)、D0M7r_8(SEQIDNO:481)、D0M7h_2(SEQIDNO:482)、D0M7h_3(SEQIDNO:483)、D0M7h_4(SEQIDNO:484)、D0M7h_6(SEQIDNO:485)、D0M7h_l(SEQIDNO:486)、D0M7h_7(SEQIDNO:487)、D0M7h-22(SEQIDNO:489)、D0M7h_23(SEQIDNO:490)、D0M7h_24(SEQIDNO:491)、D0M7h_25(SEQIDNO:492)、D0M7h_26(SEQIDNO:493)、D0M7h_21(SEQIDNO:494)、D0M7h--27(SEQIDNO:495)、D0M7h_8(SEQIDNO:496)、D0M7r_13(SEQIDNO:497)、D0M7r--14(SEQIDNO:498)、D0M7r-15(SEQIDNO::499)、D0M7r-16(SEQIDNO:500)、D0M7r--17(SEQIDNO:501)、D0M7r_18(SEQIDNO:502)、D0M7r_19(SEQIDNO:503)、D0M7r--20(SEQIDNO:504)、D0M7r-21(SEQIDNO::505)、D0M7r-22(SEQIDNO:506)、D0M7r--23(SEQIDNO:507)、D0M7r-24(SEQIDNO::508)、D0M7r-25(SEQIDNO:509)、D0M7r--26(SEQIDNO:510)、D0M7r-27(SEQIDNO:511)、D0M7r_28(SEQIDNO:512)、D0M7r--29(SEQIDNO:513)、D0M7r-30(SEQIDNO::514)、D0M7r_31(SEQIDNO:515)、D0M7r--32(SEQIDNO:516)、D0M7r-33(SEQIDNO:517)(該段落中的SEQIDNO是W02007080392中公開的那些)，dAb8、dAb10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、(1Ab7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7r19、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hl0、dAb7hl1、dAb7hl2、dAb7h13、dAb7hl4、dAb7pl和dAb7p2。例如，結合人血清白蛋白的dAb可以含有與以下序列具有至少約90X，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列D0M7h-2(SEQIDNO:482)、D0M7h-3(SEQIDNO:483)、D0M7h-4(SEQIDNO:484)、D0M7h-6(SEQIDNO:485)、D0M7h-l(SEQIDNO:486)、D0M7h-7(SEQIDNO:487)、D0M7h-8(SEQIDNO:496)、D0M7r-13(SEQIDNO:497)、D0M7r-14(SEQIDNO:498)、D0M7h-22(SEQIDNO:489)、D0M7h_23(SEQIDNO:490)、D0M7h_24(SEQIDNO:491)、D0M7h-25(SEQIDNO:492)、D0M7h_26(SEQIDNO:493)、D0M7h-21(SEQIDNO:494)、D0M7h-27(SEQIDNO:495)(該段落中的SEQIDNO是W02007080392中公開的那些)，dAb8、dAb10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7hl、(1Ab7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hl0、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7h13和dAb7hl4。在特定的實施方案中，dAb結合人血清白蛋白并含有與以下序列具有至少約80%或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列D0M7h-2(SEQIDNO:482)、D0M7h-6(SEQIDNO:485)、D0M7h-l(SEQIDNO:486)、D0M7h-7(SEQIDNO:487)、D0M7h-8(SEQIDNO:496)、D0M7h_22(SEQIDNO:489)、D0M7h-23(SEQIDNO:490)、D0M7h_24(SEQIDNO:491)、D0M7h_25(SEQIDNO:492)、D0M7h-26(SEQIDNO:493)、D0M7h_21(SEQIDNO:494)、D0M7h_27(SEQIDNO:495)(該段落中的SEQIDN0是W02007080392中公開的那些)，53dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7hl1、dAb7hl2、dAb7hl3和dAb7hl4。在更特別的實施方案中，dAb是結合人血清白蛋白的VKdAb，并具有選自以下的氨基酸序列D0M7h-2(SEQIDNO:482)、D0M7h-6(SEQIDNO:485)、D0M7h-1(SEQIDNO:486)、D0M7h-7(SEQIDNO:487)、D0M7h-8(SEQIDNO:496)(該段落中的SEQIDNO是W02007080392中公開的那些)，dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hl0、dAb7hl1、dAb7hl2、dAb7hl3和dAb7hl4。在更特別的實施方案中，dAb是結合人血清白蛋白的VHdAb，并具有選自dAb7h30和dAb7h31的氨基酸序列。在更特別的實施方案中，dAb是dAb7hl1或dAb7hl4。在其他實施方案中，dAb、配體或拮抗劑結合人血清白蛋白，并含有之前任一氨基酸序列的一個、兩個或三個CDR，例如，dAb7hl1或dAb7hl4的一個、兩個或三個CDR。合適的結合血清白蛋白的CamelidVHH包括W02004/041862(AblynxN.V.)和W02007080392中公開的那些(在此將其序列及其核酸對應物引入作為參考，并形成本發明文本公開內容的一部分)，如序列A(SEQIDNO:518)、序列B(SEQIDNO:519)、序歹ljC(SEQIDNO:520)、序列D(SEQIDNO:521)、序列E(SEQIDNO:522)、序列F(SEQIDNO:523)、序列G(SEQIDNO:524)、序列H(SEQIDNO:525)、序列I(SEQIDNO:526)、序列J(SEQIDNO:527)、序列K(SEQIDNO:528)、序列L(SEQIDNO:529)、序列M(SEQIDNO:530)、序列N(SEQIDNO:531)、序列0(SEQIDNO:532)、序列P(SEQIDNO:533)、序列Q(SEQIDNO:534)，這些序列編號對應于W02007080392或W02004/041862(AblynxN.V.)中引用的那些。在特定的實施方案中，CamelidVHH結合人血清白蛋白并含有與W0200708030392中公開的ALBl或SEQIDNO:518-534中任一個具有至少約80%，或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，這些序列編號對應于W02007080392或W02004/041862中引用的那些。在一些實施方案中，配體或拮抗劑含有與在此公開的任一抗_血清白蛋白dAb競爭與血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)結合的抗-血清白蛋白dAb。在可替換的實施方案中，拮抗劑或配體含有TNFR1(例如，人TNFR1)特異性的結合部分，其中該部分含有非免疫球蛋白序列，如2008年2月8日申請的共同未決申請PCT/GB2008/000453中所述的，這些結合部分、它們的生產和選擇方法(例如，來自不同的文庫)及其序列的公開內容在此引入作為參考，作為本發明文本的公開內容的一部分。與半衰期延長部分(例如，白g白)的綴合在一個實施方案中，將(一個或更多個)半衰期延長部分(half-lifeextendingmoiety)(例如，白蛋白、轉鐵蛋白及其片段和類似物)綴合或連接本發明的TNFR1-結合多肽、dAb或拮抗劑。對用于TNFRl-結合形式中的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的實例描述于W02005077042中，在此將其公開內容引入作為參考，并形成本發明文本的公開內容的一部分。特別地，以下的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體可以用于本發明中參SEQIDNO:1(如W02005077042中公開的，在此明確地將該序列引入本發明公開內容中作為參考)；參含有W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸1-387或由W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸1-387組成的白蛋白片段或變體；參白蛋白、或其片段或變體，含有選自以下的氨基酸序列(a)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸54-61;(b)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸76至89;(c)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸92至100;(d)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸170至176;(e)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸247至252;(f)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸266至277;(g)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸280至288;(h)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸362至368;(i)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸439至447;(j)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸462至475;(k)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸478至486;禾口(1)W02005077042中的SEQIDNO:1的氨基酸560至566。對用于TNFR1結合形式中的合適白蛋白、片段或類似物的更多實例描述于W003076567中，在此將其公開內容引入作為參考，并形成本發明文本的公開內容的一部分。特別地，以下的白蛋白、片段或變體可以用于本發明中參如W003076567中所述的人血清白蛋白，例如，圖3中(在此明確地將該序列信息引入本發明公開內容中作為參考)；參由具有66，500通式分子量的585個氨基酸的單非糖基化多肽鏈組成的人血清白蛋白(參見，Meloun等，FEBSLetters58:136(1975);Behrens等，Fed.Proc.34:591(1975);Lawn等，NucleicAcidsResearch9:6102-6114(1981);Minghetti等，J.Biol.Chem.261:6747(1986));參白蛋白的多態變體或類似物或片段，如Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.37:219(1973)中所述的；參如EP322094中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419之間的片段；參如EP399666中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA(1-177)和HA(1-200)以及HA(1-X)之間的片段，其中X是178至199的任何數字。在將(一個或更多個)半衰期延長部分(例如，白蛋白、轉鐵蛋白及其片段和類似物)用于格式化本發明的TNFR1-結合多肽、dAb和拮抗劑的情況中，可以使用任何合適的方法來綴合，如通過直接融合TNFR1-結合部分(例如，抗-TNFRldAb)，例如，通過使用編碼融合蛋白的單核苷酸構建體，其中將融合蛋白編碼為單多肽鏈，在位于TNFR1結合部分的N-或C-端具有半衰期延長部分。或者，可以通過在部分之間使用肽連接物來完成綴合，例如，W003076567或W02004003019中所述的肽連接物(在此將這些連接物的公開內容引入作為參考，以提供用于本發明中的實例)。通常，提高體內血清半衰期的多肽是在體內天然產生的多肽，并且能抵抗從生物體內(例如，人)除去不利物質的內源機制的降解或去除。例如，提高體內血清半衰期的多肽可以選自胞外基質的蛋白，血液中發現的蛋白，血腦屏障或神經組織中發現的蛋白，位于腎臟、肝臟、肺、心臟、皮膚或骨中的蛋白，應激蛋白，疾病特異性蛋白或涉及Fc轉運的蛋白。在整個公開內容中所述的本發明的實施方案中，替代本發明的拮抗劑或配體中的抗-TNFR1"dAb"的使用，考慮了本領域技術人員可以使用含有本發明的結合TNFR1的dAb的一個或更多個或全部3個CDR的多肽或結構域(例如，嫁接在合適蛋白支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為，親和體、SpA支架、LDL受體A類結構域或EGF結構域)。因此，認為該公開內容作為整體提供了使用這樣的結構域替代dAb的拮抗劑的公開內容。在這點上，參見2008年2月8日申請的PCT/GB2008/000453，在此將其公開內容引入作為參考)。因此，在一個實施方案中，本發明的拮抗劑包含具有TNFR1結合特異性的免疫球蛋白單可變域或結構域抗體(dAb)或該dAb合適形式的互補性決定區。拮抗劑可以是由該dAb組成的多肽，或基本上是由該dAb組成的多肽。拮抗劑可以是包含合適形式的dAb(或dAb的CDR)的多肽，如抗體形式(例如，IgG-樣形式，scFv、Fab、Fab'、F(ab')2)，或含有結合TNFR1的dAb和結合另一個目標蛋白、抗原或表位(例如，血清白蛋白)的第二dAb的雙特異性配體。可以將根據本發明的多肽、dAb和拮抗劑格式化成本領域已知的各種合適的抗體形式，如IgG-樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結合片段(例如，Fv片段(例如，單鏈Fv)(scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段)、單可變域(例如，VH、VJ、dAb和之前任一項的修飾形式(通過共價連接聚烷撐二醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適聚合物的修飾)。在一些實施方案中，本發明提供了為IgG-樣形式的配體(例如，抗-TNFRl拮抗劑)。這樣的形式具有IgG分子常規的四條鏈結構(2條重鏈和兩條輕鏈)，其中一個或更多個可變區(Vh和或、)已經由本發明的dAb替代。在一個實施方案中，每個可變區(2個VH區和2個、區)由dAb或單可變域替代，其中至少一個是根據本發明的抗-TNFRldAb。IgG-樣形式中包括的dAb或單可變域可以具有相同的特異性或不同的特異性。在一些實施方案中，IgG-樣形式是三價的，并可以具有一種(只抗-TNFRl)、兩種(例如，抗-TNFRl和抗-SA)、三種或四種特異性。例如，IgG樣形式可以是單價的，并含有具有相同特異性的4個dAb;是雙特異性的并含有3個具有相同特異性的dAb和另一個具有不同特異性的dAb;是雙特異性的并含有兩個具有相同特異性的dAb和兩個具有共同的但不相同特異性的dAb;三特異性的并含有具有相同特異性的第一和第二dAb，具有不同特異性的第三dAb和具有不同于第一、第二和第三dAb的特異性的第四dAb;或四特異性的，并含有四個具有各不相同特異性的dAb。可以制備IgG樣形式的抗原結合片段(例如，Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv)。在一個實施方案中，IgG樣形式或其抗原結合片段不與TNFR1交聯，例如，形式對于TNFRl可以是單價的。如果需要補體激活和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能，配體可以是IgGl-樣形式。如果需要，IgG-樣形式可以包含突變的恒定域(變體IgG重鏈恒定域)，以最小化與Fc受體的結合和/或固定補體的能力。(參見，例如，Winter等，GB2，209，757B;Morrison等，W089/07142;Morgan等，W094/29351,1994年12月22日)。本發明的配體(多肽、dAb和拮抗劑)可以格式化成融合蛋白，其含有與第二免疫球蛋白單可變域直接融合的第一免疫球蛋白單可變域。如果需要，該形式可以進一步包含半衰期延長部分。例如，配體可以包含與第二免疫球蛋白單可變域直接融合的第一免疫球蛋白單可變域，而第二免疫球蛋白單可變域與結合血清白蛋白的免疫球蛋白可變域直接融56通常，不管配體是否包含連接物，具有對目標有結合特異性的結合位點的多肽結構域的方向是設計選擇的問題。然而，一些方向，使用或不使用連接物，可以提供比其他方向更好的結合特征。本發明包括的所有方向(例如，dAbl-連接物-dAb2;dAb2-連接物-dAbl)是含有提供所需結合特征的方向的配體，該結合特征可以通過篩選容易地識別。根據本發明的多肽和dAb，包括dAb單體、二聚體和三聚體，可以連接抗體Fc區，包含CH2和CH3結構域中的一個或兩個，和任選鉸鏈區。例如，作為單個核苷酸序列連接Fc區的載體編碼配體可以用來制備這樣的多肽。此外，本發明提供了上述dAb單體的二聚體、三聚體和多聚體。密碼子優化序列如上所述，本發明的實施方案提供了編碼本發明的多肽和可變域的密碼子優化核苷酸序列。如以下說明中所示的，可以產生編碼相同可變域的約70%同一性的密碼子優化序列(在該情況中，可變域氨基酸序列與DOMlh-131-206相同)。在這種情況下，對于通過巴斯德畢赤酵母(密碼子優化序列1-3)或大腸桿菌(密碼子優化序列4和5)的表達，將序列優化。我們在考慮了遺傳密碼的簡并性之后進行了計算，并將通過D0Mlh-131-206(如顯示于圖19中)的核苷酸序列和理論核苷酸序列編碼的每個簡并密碼子內的核苷酸變化數量最大化，理論核苷酸序列仍然編碼與DOMlh-131-206相同的可變域。計算揭示了理論序列與顯示于圖19中的DOMlh-131-206的核苷酸序列只具有57%的同一性。密碼子優化序列1DNA序列gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctgcttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttcccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactetctccagagacaactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctttgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc相應的AA序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrq即gkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss參與WT序列74.1%的核苷酸序列同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>戰。效TCAATT效加i^ASGa3加0(3T3a^鵬啦Teft&GC卿加加TVC！QK0敏aCA6CX班加敏加C!T加(30(3&助C!f加效ACftGdC購0Oi3i3OVC！QAGOTCATOTTGGATC卵卵(30TTGOTCACCTGGGOTCSI100TT豕鵬敏TT卿c!加!t^T恥T加加啦卿狄cfTT!rc恥xa4c腳欲CTAcc豕ac啦cTat!ee^!P0^恥cxcc:a肚T^cA0cwT恥oaAT敏aAc:幼TOGTTCCT0TGCGCTCCGGTTACTTGCCA敏GACA101150!V鵬fG加0^^CC9CCAd0CACC^3iiGAAL的抑C狄鵬效胡效C7QACATTOOTTOGGT(3CAQGCCCAGGAA卵T見TGGOTTC151200AtTWCCC!G級tfOGfPCX(3恥TCec效CTAC(3GA扭apCiCOTGAft9aSCC3ATTCCCCQAT3OTCAOATCCTTCTACGCOACTCCOTAAQGGG2012S0251300ACTCCm鵬狄GC:TaftSeftT敏TOCTt3XTTACCAC加X(3CTTT9TTGCCAACCTOGOCGAGGAACSCGTTACACTGTGCTOTCC301350AftOftJ3A9敏CCTT朋X卿故TTAe7加SK3ACAG的戰CTT^抑XTACT卵AAt3秘QO加CCTT朋3!鄉戰C:TACT郞i30TC!AGi343AftGCCT郷CAGC卵AAGAOGOCCTTGOTTT見TACT卵GOCm。GGAACTGGTACGT351363c^戰od------密碼子優化序列2DNA序列g3g^皿g3g3ggttc^ttgcttg皿tctgg3gg3ggtttggtcc3gcc3gg3gggtcccttcg3cteagttgtgctgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtetgggtccgacaggcacctggtaaaggtcttgaatgggtttcacatatccctccagacggtcaagacccattttecgctgattccgtgaaaggcagatttacaatttcaegagateattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggacactgcagtttatcactgcgctttectaccaaaacgtggaccttggtttgattettggggccaaggtacgttagtgactgttagttct相應的AA序列ekrevqllesggglvqpggslrlsc皿sgftfd1etmvwvrq即gkglewvshippdgqdpfy3dsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss參與WT序列71.1%的核苷酸序列同一性僅畢赤酵母僅畢赤酵母僅畢赤酵母僅畢赤財母僅畢赤酵母僅畢赤酵母僅畢赤酵母50---------戰,GCAGCTl3TTG說GTCTa3GGC5AGOCTT鵬ACA(3CCGAGAAAAGA執郞TTCAATTCCTTGAA!fC!WSAe執如TTT鄉CCA6CCiGAGGTCATGTGATCTGGGGAGGTTGGTCAGCC51100TG恥郞STC:e!CTGOGTCTCTCCTOTGCAGCCTCCGC5ATTCACCrTTGCGCA0OAGe0TC!GCTTeOAClTAAGTTG加C;TSCCAGTSGGTTTAGGCTr。CTGGGGGGTCCCTCG6+TG士^CGCCTTACTTTGCC101150AT鎖GiW;幼TeCTG"r鄰GTCC5CCA(GCACCA卵GAAGG(5TCTAGAGT郎ATGAACATGGTTGG(5TCCGCAGGCACTCGGAAGGTCTGAT(5G151200GTCTGftCATATTCCCCGGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCClGTeTTTCACATATCCCTCCA站CG^TGAA站CC:GATTTTAC恥TGATTCGGTGTTCACATATCCCCGAGGTCAGACCTTTACGCGATCCGT201250fiftAAGGGAOATa^TAGAATTTCAdGAGATAATTCTAAAAAGACCTTGTACTGAAGGCGTTACTATTCCG(^AAATTCJ^AiVAG^CT1"A251300TGCftAA數;ftACAGCCTGCGTOCCGA0狄CAGA(5CGeTATATCACTGTGCGTC^aatg^ACT(3GGCgAgC3ACACGCGTTATCACTGGC301350CTGiSTTGJCJTiWVGAGfGOeGCCTTGOTrTGACTACTGGGOTCAGCJGAACCCTtctccaag&CCTTC5(3士irTGA士XtSgggckC5GAdt351367gtacgttgc密碼子優化序列3DNA序列g朋gtgcagcttcttgaEiEigtggtggEigggctEigtgCEigccaggggg;atcttt;a卿ttetcEitgcgctgccagtggatttacttttgctcacg卿cgEitggtctgggtg卿cEiEigctcctggEiEiEiEiggttt卿gtgggtttctcacattccacctgatggtca卿tcctttctacgc卿ttccgtcaaagga卿tttactetctcc卿g;ata;atEigtoEuaEuacactttgt;acctEic卿tgEiactcEictt.卿gccgEi卿tEiccgctgtgtaccactgcgccttgttgcc腿g卿ggtccttggttcgattectggggtcagggtectctggttgicEigtctcatct相應的AA序列evqllesggglvqpggslrlsc朋sgftfahetmvwvrq即gkglewvshippdgqdpfyEidsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss參與WT序列72.6%的核苷酸序列同一性1Domlh-131-206WT(1MFa206dAb(1共有序列(1Domlh-131-206WT(42MFa206dAb(51共有序列(51Domlh-131-206WT(92HFa206dAb(101共有序列<101Domlh-131-206WT(142MFa206dAb(151共有序列(1S1Domlh-131-206WT(192MFa206dAb(201共有序列(201Domlh-131-206WT(242MFa2D6dAb(251共有序列(251Domlh-l31-206WT(292MFa206dAb'《301共有序列(301Domlh-131-206WT(342MFa206dAb(351共有序列(35159Domlh-131-206WT僅畢赤酵母Pre206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅畢赤酵母pre206dAb共有序列Donah-131-206WT僅畢赤酵母pre206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅畢赤酵母Pre206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅畢赤酵母Pre206dAbDomlh-131-206WT僅畢赤酵母Pre206dAb共有序列僅畢赤酵母僅畢赤酵母Domlh-131-206WPre206dAb共有序列Domlh-131-206WPre206dAb共有序列(1uu(51(51(51(101(101(101(151(151(151(201(201(201(251(251(251(301(301<301(351<351(351150GAGTGCAGCTTGAT(5GGGAGGTGTCAGCCGGGGGTC51100CCTGCOTCTCTGC!PGTGGA(jeeETCCi3GA!rTCACCTTTSGGGAT戰狄C幼T6T&GCCbc;ATTACTT7TGCbAisicGA101150TGGTTGGGTGCAGCCCGGAAGGTTAGAGTGGGTTCCA151200ATTCCCCGATGGTCAGATCCTTCTACGCAGATCCGTAAGGG201250GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGAATTTACTATCTCCAGAGATAATAGTAAAAAGAGTTTCnACCTACA級TC5ATTACATCTCCGGAAATAAAACACTTACTCAATGA251300ACTCACTTAfiAOCCGAA戰TACCGCTG!TGTACCAC加CGCCT"rGT!rGCCAACCTGGCCGAGAACGCGTTACACTGGCTGTCC301350AAQAC5GGOGCCTTeGTTTGACTACT郎GOTCA03GAACCCT節!rCACC(5TAAG站AGCTCC;rrGGTTC幼TTAC:TG抑QTCAS卵TACTCT郞TTIwCAl5TAAGAGGGCCTTGGTTGATACTGGGGTCAGGGACCTGGTACGT351CTCAC密碼子優化序列4腿序列gaagtacaactgctgg卿gcggtggcggcctggttccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcggcatctggtttcaccttcgcacacg朋accatggtgtgggtt.cgccaagctccgggcEiEuaggcctggEi;atgggtaagccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatttctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgc卿tgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgt3CC3ttgtgCgCtgCtgCCt333CgtggCCCgtggttCg￡ltt3CtggggtC3gggt￡lCtctggtC3CCgtaagcagc相應的AA序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfy;adsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss參與WT序列76.5%的核苷酸序列同一性Domlh-131-206WT僅大腸桿苗sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸軒菌Sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌Sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿班Sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸扦菌Sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌Sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌sec206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸軒菌Sec206dAb共有序列密碼子優化序列5DNA序列u<i(i(51(51(51(101(101(101(151(151(151(201(201(201(251(251(251(301(301(301(351(351(351150(SAA做ACAAC!TcScr如iW3AGCGGTGGCG(5CC加GTTCAACCG郞TG6rj!CGAGTCACTGTGGAGGGGGGGCTGGTCACCGGGGTC51100CCTGC￡3TCTCTCCTGTGCAGCCTCC(GAT!rCACCTTT(5CGCATaAGACGACrCTGCGCCTGTCCTGTOC郎CATCT郎TTTCACC!TTCGCACACSAAACCACCTGCGCTTCCTGTGCGCTCGGTTCACCTTGCCAGAACA101150TGGTGTWTCCC5C;CAGGCACCA卵GWVG與TCTA鎖OT卵GTCTCACATTOGTGT05OTT。C5CGftAGCTCGG郞CAAA抑CCTGGAATe郎TAAGCCACTGGTGTGGGTCGCCAGCCCGGAAGGCTGATGGGTCA151200ATTCCCCCGGATG(STCAGGftTC;CClTCTACGCA(SACTCCGTGAACSGGCCGA士TC;CCCGATGGCAGGACCTTCTAGCGATCCGTAAGGGCG201250GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACAGGCTATATCT0CAAATGACTTTACGATTTCTCGT執TAACTCGMAAACACCCTGTACCiTGCAGA加ATTACCATTCCGGAAATCCAAAACACCTi"ACTGCAATGA251300ACAGCCTGCGTGCC幼OGACACA0C郞TA!TATCACTG1WCCTGCTTCCTACCCI"GCGGCCGAGgAACGCGGTTACATGTGCGCTGCTCCT301350AAGAGG恥GCCTTCM5TTr幼C!rAC;T郞GCJTCW5郞AACCCT(5GTCACCGTARACGTGOCCCGTCJCJTTC幼TTAC:T郞卵TCAGGGTACTCT(3GTCACC:(TAAGGGCCTGGTTGATACTGGGGTCAGGGACCTGGTCACCGT351AAGC^agccctctggtttcaccttcgctcatg卿ccatggtttgggt3cgccaggctccgggta肌ggcctggagtgggt肌gccatetccctcctgatggtcaggacccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatttctcgtgac朋cagc朋a朋cactctgtacctgc朋atg朋ctccctgcgtgcagaagacacggcggtttatcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgtatcttct相應的AA序列evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss參與WT序列78.4%的核苷酸序列同一性61Donilh-131-206WT僅大腸桿菌IC206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌IC206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌IC206dAb共有序列Doxnlh-131-206WT僅大腸軒菌IC2Q6^共有序列D。mlh-131-206WT僅大腸桿菌ic206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌IC206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸桿菌ic206dAb共有序列Domlh-131-206WT僅大腸扦菌IC206dAb共有序列UUu(51<51(51<101(101(101<151(151<151(201(201(201(251(251(251(301(301(301(351(351(351150戰卵TGCAGCTGTT卵AGTCT郞G郞AeGCTTOOTACAGCC;TGGGGaGTC說郞TTCAACTQCT郎AATCTSaTOeT卵TCTS0TACftACCGGGT(KiTTCGAGGTCACTGTGGATCTGGGGGGTGGTACACCGGGGTC51100CCTGCGTCTCTGTGCAGCCTCGGTTCACCTTGCCATGAGACA101150TGGTTGGGTCGCCAGGCCCGGAAGGCTGAGTGGGTCAT151200ATCCCCGATGGTCAGGACCTTCTAGCG義TCCGTAAGGCCG201250GTTCAGCftTCTCCOSOSACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGATTTTACCAXTTCTC。TGACARCAGCAAAAACACTCTGTACCTGGAAA加ATTACCATTCCGGAC:CAAAACACCTTACTGCAAATGA251300ACCCTGCGTGCGAGAcACdCGGTTATCACTGTGCCTGCTCC301350AAGASGGCJGCCTT郞TTTGWtACtG郞STCAflfiGAACCCTGGTeJACCGTAAGGGCCTTGGTTGACTACTGGGGCAGGGACCTGGTCACGT351A賴TTCTTC例證實施例A:人TNFR1的結構域抗體的前導選擇(leadselection)&表征結構域抗體從噬菌體文庫產生。根據相關標準方法進行被動吸收人TNFR1的可溶性選擇和淘選。從R&Dsystems(CatNo636-R1-025/CF)或P印rotech(Catno.310-07)購買人TNFR1作為可溶性重組蛋白，直接使用(在被動選擇的情況中)或在生物素化后使用，使用通過伯胺偶聯接著在生物測試中質量控制其活性以及通過質譜分析其麗和生物素化程度來生物素化。通常，利用每下一輪中降低水平的抗原來進行3輪選擇。[O440]對于抗-TNFRl結合克隆的存在，通過噬菌體ELISA來篩選來自選擇的結果。從這些噬菌體選擇中分離DNA并亞克隆至用于可溶性dAb片段表達的表達載體中。在96-孔平板中表達可溶性dAb片段，并將上清液用于篩選抗-TNFR1結合dAb的存在，使用直接結合ELISA，其使用抗-c-myc檢測，或使用抗生物素蛋白鏈菌素/生物素化TNFRlBIAcore芯片的BIAcoreTM，并根據解離速率(off-rate)來分級。以下所述的前導分子(leadmolecule)源自親本dAb，命名為DOMlh-131(公開于W02006038027中)。使用60nM生物素化抗原的3輪選擇后，從噬菌體展示文庫中選擇了該分子。將抗生物素蛋白鏈菌素或中性鏈親和素覆蓋的Dyna珠子替換為每輪選擇中的捕獲試劑，以防止對抗抗生物素蛋白鏈菌素或中性鏈親和素的粘合劑的選擇。該階段的前導DOMlh-131功效是低微摩爾范圍的，如通過MRC-5成纖維細胞/IL-8釋放細胞測試所測定的。通過BIAcoreTM測定的結合動力學通常呈現出快結合快解離速率(fast-on/fast-offrate)。該DOMlh-131前導分析的大腸桿菌表達水平，作為C_端myc標記的單體，在8mg/1的范圍中。前導的親和性成熟促使DOMlh-131親和性成熟，以產生具有較高功效和改進的生物物理特征的突變體(對于DOMlh-131產生的前導的氨基酸序列，參考圖3)。使用易出錯PCR聚合酶62(GenemorphII，Stratagene)產生易出錯文庫后(1個氨基酸變化/dAb序列的平均數，文庫大小8X100，利用這些易出錯文庫進行了七輪選擇。該策略導致克隆DOMlh-131-8的分離，這是其中有4個氨基酸變化的分子(一個在框架1中(FR1)、一個在CDR1中、一個在CDR3中和一個在FR4中)，獲得了大約100倍的功效提高，如通過MRC-5細胞測試所測量的(4nM)。在該測試中，用測試樣品將MRC-5細胞培養一小時，然后加入TNF-a(200pg/ml)。在過夜培養后，使用IL-8ABI8200細胞檢測測試(FMAT)測定IL-8釋放。在每個實驗中包括TNF-a劑量曲線。用于與dAb競爭與TNFR1結合的TNF-a濃度(200pg/ml)大約為該測試中最大TNF-a應答的70%。為了進一步提高功效，通過在易出錯前導共有序列信息建議的關鍵位置的寡_定向突變使單個氨基酸位置多樣化。在該方法的過程中，通過BIAcoreTM篩選分離DOMlh-131-8克隆的改進形式，D0Mlh-131-24(在校正之前最初命名為D0Mlh-131-8-2)，其具有單個K94R氨基酸突變(氨基酸編號根據Kabat)和200-300pM的RBA功效。產生更多基于該前導的易出錯文庫和源自其的NNS文庫，并接受三輪使用熱處理的噬菌體選擇(對于方法，參見JespersL等，Aggregation-resistantdomainantibodiesselectedonphagebyheatdenaturation(通過熱變性在噬菌體上選擇的抗聚集結構域抗體)，NatBiotechnol.2004年9月;22(9):1161-5)。在該選擇過程中，將文庫集合，并且源自兩輪選擇的克隆產生了dAb，如D0Mlh-131-53，認為其熱穩定性更高。推測這些克隆具有更好的生物物理特征。將克隆D0Mlh-131-53中的一些框架突變形成種系，以產生克隆D0Mlh-131-83。該克隆形成了進一步通過寡_定向單個CDR突變來多樣化的基礎，可以使用如上所述的噬菌體展示選擇或使用體外區室化技術，該技術使用乳液。噬菌體展示策略產生了前導D0Mlh-131-117和D0Mlh-131-151。體外區室化技術產生了DOMlh_131_151。在該階段，在生物物理和生物測試中比較了這三個前導，D0Mlh-131-511是具有最佳特征的分子。此外，測試了這些分子在胰蛋白酶或leucozyme的存在下對蛋白水解分裂的抵抗性丄eucozyme由來自囊性纖維化患者的集合痰液組成，并含有高水平的彈性蛋白酶和其他蛋白酶，并用作肺病體內狀況的替代品。該數據表明全部三種前導D0Mlh-131-117、DOMlh-131-151和DOMlh-131-511在胰蛋白酶或leucozyme的存在下快速降解。這種發現引起了對DOMlh-131-511在患者中時的體內持久性的關注，并且研發了一種策略來選擇對胰蛋白酶提高的抵抗性。推測這種提高的胰蛋白酶抗性對分子的其他生物物理特征具有有益作用。實際上，改進了標準噬菌體選擇方法，以允許在對抗原選擇之前在蛋白酶的存在下進行選擇。因此，工程化了一種新的噬菌體載體，其中檢測c-myc標記物，以允許在胰蛋白酶存在下的選擇而沒有分裂噬菌體展示的dAb。產生了基于易出錯文庫的DOMlh-131-511，并在pD0M33載體中克隆(對于pD0M33載體圖譜，參見圖50)。用lmg/ml或lOOiig/ml胰蛋白酶在37t:下將從該文庫產生的噬菌體備料處理24小時，隨后將RocheCompleteProteaseInhibitors(2x)的蛋白酶抑制劑加入，以在對相關抗原選擇之前阻斷胰蛋白酶活性。進行了四輪選擇。在胰蛋白酶(lOOiig/ml或lOOOiig/ml終胰蛋白酶濃度)的存在或不存在下在37t:下溫育一小時或過夜的過程中，使用BIAcoreTM測定可溶性表達的TNFR1結合dAb，測定其在蛋白酶存在或不存在下結合TNFR1的能力。這導致兩種前導分子DOMlh-131-202和DOMlh-13-206的分離，這證明了提高的蛋白酶抗性，如通過BIAcoreTM抗原結合實驗所顯示的。感興趣的是注意到與DOM63lh-131-511相比，DOMlh-131-202只在CDR2(V53D)中含有一個突變，所有氨基酸編號根據Kabat，而DOMlh-131-206只含有兩個突變第一突變與DOMlh_131_202中的相同(CDR2中的V53D突變)，第二突變是FR3中的Y91H突變(參見，圖3)。該FR3中的Y91H突變在3-20人種系基因中沒有發生，表明該殘基在人抗體中產生。三個克隆DOMlh-131-511、DOMlh-131-202和DOMlh-131-206具有如圖3中所示的氨基酸序列。如下測定分子的活性DOMlH-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-131-206與人TNFR1結合的BIAcoreTM結合親和性測定。通過BIAcore分析測定DOM1H-131-202、DOM1H-131-511和DOM1H-13-206對結合人重組大腸桿菌表達的人TNFR1的結合親和性。使用生物素化的人TNFR1進行分析。將1400RU生物素化的TNFR1覆蓋在抗生物素蛋白鏈菌素(SA)芯片上。使用弱酸洗脫條件將表面再生回基線。使用50iil/min的流速，將限定濃度的DOM1H-131-202、D0M1H-131-511和DOM1H-131-206通過該表面。在BIAcoreTM3000機器上進行工作，并分析數據和使其擬合i:i的結合模型。對于所有測試的分子，結合數據充分擬合i:i模型。從k。n和k。ff速率計算所有KD值。在25t:下進行BIAcore運行。從三個單獨的實驗產生以下的數據。在每個實驗中，通過平均擬合的數量來計算結果，對于kd，使用最高的dAb濃度，對于ka，使用較低的濃度。數據作為結果的平均和標準偏差(括號中)來呈現(表l)。表1:DOMlH-131-202、DOM1H-131-511禾PDOM1H-131-206結合人TNFR1的BIAcore數據konkoffKD(nM)D0M1H--131--5115.03E+055.06E-041.07(511)(1.07E+05)(1.01E-04)(0.44)D0M1H--131--2021.02E+065.42E-040.55(202)(2.69E+05)(3.69E-05)(0.11)D0M1H--131--2061.55E+067.25E-040.47(206)(3.57E+05)(1.95E-04)(0.06)DOM1H-131-202、D0M1H-131-511和DOM1H-13-206相似地結合，并對人TNFR1具有高親和性。DOM1H-131-202和DOM1H-13-206各自以0.55nM和0.47nM的平均親和性結合。與DOM1H-131-511相比(其具有1.07nM的平均親和性)，DOM1H-131-202和DOM1H-13-206兩者具有略高的親和性。受體結合測試在受體結合測試中測定dAb對抗人TNFR1的效力。該測試測量了TNF_a與TNFR1的結合和可溶性dAb阻斷這種相互作用的能力。在預先覆蓋山羊抗人IgG(服L)的珠子上捕獲TNFR1-FC融合體。在黑邊透明圓底384孔平板中用TNF-a(10mg/ml)、dAb、生物素綴64合的抗-TNF-a和抗生物素蛋白鏈菌素alexafluor647溫育受體覆蓋的珠子。6小時后，在ABI8200CellularDetection系統上閱讀平板，并測定珠子相連的熒光。如果dAb阻斷TNF-a結合TNFR1，熒光強度將降低。使用ABI8200分析軟件分析數據。使用Gr即hPadPrism和具有可變斜率的S形劑量應答曲線測定濃度效應曲線和功效(EC5。)值。對三種分開的情況重復測試。在每次實驗中包括TNF-a劑量曲線(圖38和39)。用于與dAb競爭結合TNFR1的TNF-a濃度(10ng/ml)大約為該測試中最大TNF-a應答的90%。代表性的圖顯示于圖39中，顯示了dAb抑制TNF-a結合TNFR1的能力。在所有三個實驗中，陰性對照樣品(HEL4，抗-雞蛋白lysozymedAb和VHdummy)在高濃度下微弱地抑制TNF-a和TNFR1之間的相互作用。對于測試樣品和陽性對照(獲自R&DSystems的抗-TNFRlmAb，mAb225)和Enbrel(etanerc^pt;由連接IgGl的Fc部分的TNFR2組成的二聚融合體；得到許可用于治療類風濕性關節炎)的平均功效(EC5。)值顯示于表2中。表2:在三次重復實驗的TNFR1受體結合測試中對DOM1H-131_202、DOM1H-131-206和DOM1H-13-511的功效(EC5。)值。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>在該測試中，DOM1H-131-206顯示出比其他兩個測試的dAb功效高，并具有與可購得的抗-TNFRlmAb，MAB225(R&DSystems)相似的功效。如下進行來自巴斯德畢赤酵母的前導克隆的表達將三個前導分子的一級氨基酸序列用來產生用于在巴斯德畢赤酵母中分泌表達的密碼子優化基因。在密碼子優化和非密碼子優化的DOM1H-131-206之間存在75X的序列同一性。將三個合成基因克隆至表達載體pPIC-Za中(來自Invitrogen)，然后轉化至兩個畢赤酵母菌株中，X33和KM71H。將轉化的細胞涂布于遞增濃度的Zeocin(100、300、600和900iig/ml)上，來選擇具有多個成分的克隆。對于每個細胞系和構建體，選擇大約15個克隆，用于表達篩選。因為高/低基因拷貝數和表達水平之間的相關性在巴斯德畢赤酵母中沒有完全理解，從Zeocin濃度范圍中選擇了幾個克隆。使用沒有對高生產力大范圍篩選的克隆來進行5L發酵罐運行。這使得生產了大量的材料用于進一步研究。用于蛋白質表征的材料生產基于蛋白A的色譜樹脂已經廣泛用于從微生物培養上清液中純化VHdAb。盡管這使得可以用單步驟純化方法用于生產高純度材料，但通常在>90%的大部分情況中，對于一些分子，低pH洗脫條件會導致聚集物的形成。還存在親和性樹脂對dAb能力有限的問題；這意味著需要使用大量樹脂來處理來自發酵罐的材料。為了產生高質量的材料用于表征以及進一步的穩定性和噴霧器研究，使用混合模型電荷誘導樹脂作為主要的捕獲步驟接著陰離子交換來設計下游純化方法。沒有明顯的優化，這使得回收了70%純度為95%的表達的dAb。對于混合模型電荷誘導樹脂上(來自GEHealthcare的C即to匪C)的捕獲步驟，使用50mM磷酸鈉p朋.0進行柱平衡，并且裝載上清液，而不需要稀釋或pH調節。柱子洗滌后，使用50mMTrispH9.0的洗脫緩沖液通過pH梯度洗脫蛋白質。特定的洗滌和梯度條件將根據待洗脫蛋白質的Pl而略有改變。然后使用流過步驟進一步純化洗脫物峰，使用陰離子交換色譜。這除去了殘余的HMW污染，如醇氧化酶和減少了內毒素。用PBS或不含鹽的磷酸鹽緩沖液pH7.4將樹脂平衡。將來自C即to匪C的洗脫物裝載在陰離子交換樹脂上時，dAb沒有結合，并從流過物中回收。內毒素和其他污染物結合樹脂。如果使用PBS緩沖液，鹽的存在將該步驟中的蛋白質回收提高至91%，而無鹽獲得了86%回收。然而，鹽的存在降低內毒素除去的有效性，使得與沒有鹽存在時獲得的水平<1.0EU/ml相比較，使用鹽的該步驟后的dAb的通常內毒素水平測量為58EU/ml。蛋白質表征將產自5L發酵罐運行的材料進行表征，使用電噴霧質譜進行同一性分析，氨基端測序和等電子聚焦，以及使用SDS-PAGE、SEC和Gelcode糖蛋白染色試劑盒(Pierce)測定純度。同一性每個蛋白的頭五個殘基的氨基末端序列分析與預期的相同(EVQLL…)。對蛋白質樣品進行了質譜分析，該樣品已經使用C4Zip-tips(Millipore)緩沖交換至50:50H20:含有O.1%冰醋酸的乙腈中。允許與內部二硫化物鍵的形成為_2的質量差異時，對于三個蛋白各自測量的質量在基于一級氨基酸序列的理論質量的0.5Da內(使用平均質量來計算)。IEF用來鑒定蛋白質，基于每種蛋白質各不相同的pl。純度將三種蛋白質以1yg和10iig的量裝載于非還原SDS-PAGE凝膠上，重復兩份。在所有情況中觀察到單個條帶。還進行了大小排阻色譜來證明了純度的水平。對于大小排阻色譜(SEC)，將100iig的各種蛋白裝載于T0S0HG2000SWXL柱上，以0.5ml/min流動。移動相為PBS/10%乙醇。對候選物選擇的dAb穩定性的研究對于COPD的指示，需要將dAb遞送至肺，例如使用噴霧器裝置。這將意味著蛋白質將可能經歷各種剪切和熱應激，這取決于所用的噴霧器類型，并將接受肺環境中蛋白酶的酶降解。測定了使用這種類型的裝置來遞送蛋白質，是否形成正確的顆粒大小分布并在噴霧器遞送后保持功能性。因此，研究了各個分子對各種物理應力的內在穩定性，來測定基線穩定性和最敏感穩定性指示測試。因為每種蛋白質的穩定性將取決于其溶解的緩沖液，因此需要一些預配制的工作。該信息，如緩沖液、pH，對于理解下游純化過程和隨后的存儲66過程中的蛋白質穩定性也是有用的。為了表征分子在暴露于各種物理應力過程中的變化，使用了各種分析技術，如分子排阻色譜(SEC)、SDS-PAGE和等電點聚焦(IEF)。DOM1H-131-202、D0M1H-131-511和DOM1H-131-206的蛋白酶穩定性測定通過在過量蛋白酶下預溫育限定的時間點后殘余結合活性的BIAcore分析來測定DOMlH-131-202、DOM1H-131-511和D0M1H-131-206的蛋白酶穩定性。將大約1400RU的生物素化TNFRl覆蓋抗生物素蛋白鏈菌素(SA)芯片。只用PBS或用100yg/ml胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme來溫育250nM的DOM1H-131_202、D0M1H-131-511和DOM1H-131-206，在3(TC下持續1、3和24小時。通過加入蛋白酶抑制劑的混合物來停止反應。然后使用參考細胞減少將dAb/蛋白酶混合物在TNFRl覆蓋的芯片上通過。在每個注射循環之間用lOiUO.1M甘氨酸pH2.2使芯片表面再生。相對于沒有蛋白酶的dAb結合，測定用蛋白酶預溫育的結合人TNFRl(在10秒時)的DOM1H-131-202、D0M1H-131-511和DOM1H-131-206的部分。在25。C下進行BIAcoreTM運行。從三個獨立的實驗產生數據。條形圖表示平均值，而誤差棒表示結果的標準偏差(對于結果，參見圖24)。發現DOM1H-131-202和D0M1H-131-206與DOM1H-131-511相比，顯示出對胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme的蛋白水解降解具有更高的抵抗力。用胰蛋白酶lhr后和用彈性蛋白酶或leucozyme3hr后，D0M1H-131-202和DOM1H-131-206與DOM1H-131-511相比之間的差異最明顯。使用DSC測定的熱穩定性為了測定分子具有最大穩定性的pH，使用差示掃描量熱法(DSC)來測量Britton-Robinson緩沖液中各種dAb的解鏈溫度(Tm)。因為Britton-Robinson是由三種成分的緩沖體系(醋酸鹽、磷酸鹽和硼酸鹽)制成的，因此可能在相同的溶液中產生3-10的pH范圍。從蛋白質一級氨基酸序列測定理論pl。從DSC，發現dAb具有最高內在熱穩定性的pH，對于DOMlH-131-202(202)為pH7，對于D0M1H-131-206(206)為pH7-7.5，和對于D0M1H-131-511(511)，為pH7.5。對于所有隨后的應力和穩定性工作，對于各種dAb，使用以下的pH;在Britton-Robinson緩沖液中，對于DOM1H-131-202(202)和D0M1H-131-206(206)為pH7.O，而對于DOM1H-131-511(511)為pH7.5。結果概括于以下的表3中表3:在Britton-Robinson緩沖液中，以lmg/ml通過DSC測定的D0MlH-131-202(202)、D0M1H-131-206(206)和DOM1H-131-511(511)的pH和Tm的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>內在穩定性測試在離心Vivaspin濃縮器(5K截留)中濃縮所有前導dAb，來測定最大的溶解性和濃縮時的回收水平。在Britton-Robinson緩沖液中在最穩定的pH下進行實驗。在整個時間過程中測量樣品體積和濃度，記錄與預期濃度的偏差以及樣品的回收百分比。發現將所有蛋白在Britton-Robinson緩沖液中濃度至超過100mg/ml。與DOM1H-131-511(511)相比，DOMlH-131-202(202)和DOM1H-131-206(206)顯示出低于預期的回收，但仍然在可接受的水平內。前導dAb的噴霧器遞送通過測試不同的噴霧器和配制緩沖劑，證明了使用各種噴霧裝置能有效地遞送dAb。更重要地，第一次表明了配制緩沖液中的dAb的噴霧產生了有效肺遞送所需的粒徑分布(使用〈5iim的液滴的百分比來比較)，同時維持了蛋白的功能性。以下將對這進一步描述。在不同裝置中的性能比較在六個噴霧器裝置中測試了DOM1H-131-511(511)，對于液體制劑的三個主要噴霧器組的每組，包括兩個裝置，三組噴霧器即超聲波噴霧器、噴射噴霧器和振動篩噴霧器。在每個裝置中，使用各種PEG濃度，測試5mg/ml的dAb。對于每個樣品，使用MalvernSpraytek裝置(MalvernlnstrumentsLimited,UK)測量液滴大小〈5iim的百分比，并且在圖35中顯示了結果。使用SEC測定噴霧后每個樣品的穩定性，以分析在杯子中剩余的材料中和在收集的氣溶膠中已經二聚的樣品量。在圖36中可看到結果。二聚物形成的程度越低，穩定性越高。大部分裝置可以遞送40%或更多的正確大小范圍中的液體制劑，但eFlow(振動篩噴霧器裝置)和PARILC(噴射噴霧器)裝置進行地較好，緩沖液中包括PEG時，PARILO(星號)裝置遞送超過80%。使用eFlow也觀察到了這種用PEG的遞送提高，而使用PARILC+，程度較低。重要地，還發現在噴霧后，保持了dAb的活性(參見圖8中的結果)。緩沖添加劑的作用由于D0M1H-131-511(511)較低的穩定性，50mM磷酸鹽配制緩沖劑含有PEG1000和蔗糖，并且具有限定為約等于含有1.2%(w/v蔗糖)的50慮磷酸鹽緩沖液中約2%至約10%PEG1000溶液粘度的范圍內的粘度，以幫助保護dAb免受剪切和熱應激。因為DOMlH-131-202(202)和DOM1H-131-206(206)都具有較高的Tm，并顯示出顯著提高的對熱應力的穩定性，在最初的配制緩沖液和Britton-Robinson緩沖液中(其具有低于配制緩沖液的粘度)測試了所有的分子。在E-flow和PariLC+裝置中測試了dAb，在5mg/ml的蛋白質濃度下使用3.5分鐘的運行時間，并使用MalvernSparytek裝置測定粒徑分布。作為比較，在其自身的配制緩沖液中測試了使用噴霧器裝置遞送的用于囊性纖維化的市售藥物(稱為標準蛋白質X)。結果顯示于圖37中。對于良好遞送和分布至深肺中，理想的粒徑為小于6微米，例如，<5iim。在Britton-Robinson緩沖液和配制緩沖液中(如之前所述的)，所有dAb獲得了低于5m的可比較的粒徑水平。然而，配制緩沖液較高的粘度對產生正確大小范圍內的顆粒特別有益，例如，顆粒<5iim。在噴霧之前和之后通過A，測量來測定裝置杯中的dAb濃度。發現了蛋白質濃度沒有顯著變化，表明在遞送過程中沒有優先將蛋白質或載體噴霧。68結論如上所述，已經證明了可以在各種可購得的噴霧器裝置中將多肽如dAb進行噴霧，重要的是在噴霧后保持穩定性和生物活性，并且在噴霧后不存在觀察到的明顯聚集。將提高粘度的賦形劑如PEG加入緩沖液制劑中時，可以提高粒徑分布和液滴大小小于5m的百分比，因此潛在地提高了將dAb遞送至深肺。還可以通過提高dAb的濃度和遞送時間來提高dAb至肺部的遞送，例如，高達約40mg/ml的濃度，而dAb穩定性或活性沒有任何降低。實施例1噬菌體載體oD0M13使用了絲狀噬菌體(fd)展示載體，pD0M13。該載體產生具有噬菌體外殼蛋白III的融合蛋白。圖1中說明了pD0M13的多個克隆位點。作為SalI/Notl片段來克隆編碼dAb的基因。實施例2扁鍾皿扁JI絲麵舶,'隨斜勾fe偏本畫測li式舶歸豐圣在pD0M13中克隆編碼dAbDOM4-130-54(其結合IL-1R1)、D0Mlh-131-511(其結合TNFR1)以及DOM15-10、D0M15-26和D0M15-26-501(這些結合VEGFA)的基因，并根據標準技術產生展示這些dAb的噬菌體。通過PEG沉淀來純化噬菌體，并重懸浮于PBS中和滴定。作為分離的蛋白測試時，以上的dAb展示了各種抵抗胰蛋白酶降解的能力。如下測定對降解的抵抗性用40iig/ml的胰蛋白酶在3(TC下溫育PBS中的dAb(lmg/ml)，獲得了25:1dAb:胰蛋白酶的分子比例。在加入胰蛋白酶之前，然后在T二l小時、3小時和24小時時，立即取樣(30iU)。通過加入RocheComplete蛋白酶抑制劑(2x)來中和蛋白酶活性，接著浸入液氮中，并儲存在干冰上。隨后通過在Novex10-20%Tricine凝膠上的電泳來分析15Pg的各種dAb樣品，并用SureBlue(lx)將蛋白質染色。在頭三個小時的過程中，D0M15-10和DOM15-26-501得到了明顯消化。DOM15-26、DOM4-130-54和DOMlh-131-511更穩定，dAb的消化只在24小時后變得明顯(圖2)。還在胰蛋白酶存在下溫育了噬菌體展示的dAb，以評價噬菌體展示的dAb的胰蛋白酶抗性是否與使用分離的可溶性dAb獲得的結果相關聯。測試了各種濃度的胰蛋白酶和溫育時間。在所有情況中，用RocheComplete蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶后，測試了噬菌體結合通用配體的能力，通用配體為蛋白A(其結合所有VH結構域抗體(例如，D0Mlh-131、DOM15-26、D0M15-26-501))或蛋白L(其結合所有Vk結構域抗體(例如，DOM4-130-54、D0M15-10))。還測試了噬菌體結合目標抗原。在兩種情況中，設想結合與dAb通過抵抗蛋白水解保持結構完整性相關。通過ELISA(使用對抗噬菌體的綴合抗體)或通過結合的噬菌體的洗脫和按指數生長的大腸桿菌TG1細胞感染后的滴定度分析來測量結合活性。用噬菌體上的DOM15-10、D0M15-26和DOM15_26_501進行測試在室溫下用各種胰蛋白酶濃度(100iig/ml、10yg/ml和0yg/ml)處理每種dAb一小時。用RocheComplete蛋白酶抑制劑(IX)阻斷胰蛋白酶活性，然后將噬菌體稀釋于PBS中的2%Marvell中，在室溫下用50nM生物素化的抗原(重組人VEGF(R&Dsystems))69溫育一小時。加入在室溫下用PBS中的2%Marvell預封閉一小時的抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的珠子(DynabeadsM-280(Invitrogen)，然后將混合物在室溫下溫育五分鐘。使用Dynabeads的所有溫育步驟在轉輪上進行。通過用1mlPBS中的0.1%吐溫-20將珠子洗滌八次來洗掉未結合的噬菌體。用0.5ml的0.1M甘氨酸pH2.2洗脫結合的噬菌體，并用lOOiUlMTris-HClpH8.0中和。使用洗脫的噬菌體來感染按指數生長的TGI細胞(在37t:下一小時)，并涂布于四環素平板上。將平板在37t:下培養過夜，并進行菌落計數(參見表4)。從用100iig/ml胰蛋白酶溫育的選擇觀察到最好的結果。與DOM15-10和DOM15-26-501相比較，D0M15-26的產量提高約10倍。在更嚴格的溫育條件下進行第二個實驗來進一步證實這些結果。伴隨攪拌(250rpm)將展示dAb的噬菌體在37"下處理1小時或2小時。從用100yg/ml胰蛋白酶溫育2小時的選擇觀察到最好的結果。D0M15-26的產量是DOM15-26-501產量的200倍，是DOM15-10產量的1000倍。在第三個實驗中，開始時將展示DOM15-26和DOM15-26-501的噬菌體以1:1混合。然后伴隨攪拌(250rpm)用胰蛋白酶(1000yg/ml)或沒用胰蛋白酶在37。C下溫育2小時，然后如上所述選擇抗原結合。來自每個選擇的十個克隆的測序揭示對于沒用胰蛋白酶的預處理的克隆混合群(DOM15-26:4/10;DOM15-26-501:6/10)，以及來自用胰蛋白酶選擇的編碼DOM15-26的所有克隆和預期一樣。這些實驗表明通過將蛋白酶加入展示dAb的噬菌體中可以獲得選擇壓力，使得(在通用配體或抗原上淘選后)優先選擇展示對蛋白水解最穩定dAb的噬菌體。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>用噬菌體上的DOM4-130-54講行測試用以上所述的相似實驗方案測試了DOM4-130-54。改變的參數如下胰蛋白酶的濃度、溫育的溫度和長度。對抗PBS中lnM濃度的IL-RI-Fc(IL-lRl和Fc的融合體)來進行生物淘選。只在37t:下用100iig/ml胰蛋白酶溫育噬菌體后觀察到噬菌體滴定度的顯著降低(參見表5)表5<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>用DOMlh-131噬菌體的測試在室溫下用0iig/ml、10iig/ml、100yg/ml禾P1000yg/ml胰蛋白酶處理DOMlh-131噬菌體(對于氨基酸序列，與DOMlh-131-511密切相關)一小時。通過加入25xComplete蛋白酶抑制劑(Roche)來抑制消化。沿著用lnMTNFRl覆蓋的ELISA平板進行噬菌體的連續2-倍稀釋，并用抗M13-HRP檢測結合噬菌體。結果顯示于以下的表6中。表6這些測試實驗清楚地表明了100iig/ml胰蛋白酶和37°C的溫度適于將選擇壓力施加于對胰蛋白酶的蛋白水解有不同程度抵抗性的展示dAb的噬菌體。如果需要，對于每種展示dAb的噬菌體，優化蛋白酶的溫育時間。實施例3廳斜勾驗嫩目柳翁鍾白勺舶歸豐圣使用以下dAb作為母體分子形成了四個組DOM4-130-54、D0Mlh_131_511、DOM15-10禾PDOM15-26-555。對于50ii1反應，使用StratageneMutazyme1I試劑盒、生物素化的引物和5-50pg的模板，通過PCR在基因中引入隨機突變。用Sail和Notl消化后，用抗生物素蛋白鏈菌素-覆蓋的珠子從未消化的產品中純化出插入片段，并在相應位點連接pD0M13。用純化的連接混合物轉化大腸桿菌TB1細胞，形成四環素抗性克隆的大組8.5X108(D0M4-130-54)、1.5X109(DOMlh_131_511)、6X108(D0M15-10)禾P3X1。9(D0M15-26-555)。通過用PEG雙重沉淀來制備噬菌體文庫，并重懸浮于PBS中。對于DOMlh-131-511和DOM4-130-54組，氨基酸突變的比例各自為2.3和4.4。通過使用蛋白A或蛋白L(以1g/ml)覆蓋的孔在噬菌體ELISA中測試96個克隆來測定功能性。在DOMlh-131-511和D0M4-130-54組中，各自有62.5%和27%的克隆呈現出dAb的功能性展示。對于DOM15-10和D0M15-26-555組，氨基酸突變的比例各自為2.5和4.6。通過使用蛋白A或蛋白L(以1g/ml)覆蓋的孔在噬菌體ELISA中測試96個克隆來測定功能性。在DOM15-10和DOM15-26-555組中，各自有31.3%和10.4%的克隆呈現出dAb的功能性展示。DOM4-130-54和DOMlh-131-511組用這些文庫進行了四輪選擇，來選擇具有提高的蛋白酶抗性的dAb。第一輪選擇是通過抗原結合(lnM或10nM抗原)，沒有使用蛋白酶處理來清理文庫，以除去任何不再以高親和性結合抗原的克隆。第i輪的結果為ios-io"范圍(與1011噬菌體的輸入相比)，表明大部分文庫以高親和性結合抗原。72在第2輪中，引入了使用lOOiig/ml胰蛋白酶的蛋白酶處理，并且結果如以下表7中所示。表7胰蛋白酶溫育條件DOMlh-131-511文庫D0M4-130-54文庫37t:過夜1.86X1062.1X10637°C2hrs4.8X1085.1X108室溫2hrs1.2X1094.62X109無胰蛋白酶1X1094X109無抗原1.8X104<6X103用胰蛋白酶在37t:下處理dAb過夜時，存在顯著的選擇。將該結果帶至第3輪，其中用lmg/ml或lOOiig/ml胰蛋白酶在37。C下將噬菌體處理24小時。第3輪的胰蛋白酶處理過的噬菌體的滴定度對于DOMlh-131-511組為105-106，對于DOM4-130-154組為107-108。來自第3輪的所有結果(用lmg/ml禾P100yg/ml的DOMlh-131-511和DOM4-130-154)經歷了對抗lnM抗原的第四輪選擇，使用100yg/ml胰蛋白酶。滴定度在106-108的范圍內，與第3輪中看到的相似。對于DOM1H-131-511組，看到一些富集，但對于DOM4-130-54組，沒有看到富集。D0M15-10和D0M15-26-555組用2nM生物素化的hVEGF(人血管內皮生長因子)濃縮物進行第一輪選擇，并且沒有使用蛋白酶處理來清理文庫，以除去任何不再以高親和性結合抗原的克隆。第1輪的結果為月1()8(對于D0M15-10，與10"噬菌體的輸入相當，對于DOM15-26-555，與101。噬菌體輸入相當)，表明大部分文庫以高親和性結合抗原。用2nM生物素化的hVEGF進行第二輪和第三輪選擇。在hVEGF淘選之前，在胰蛋白酶(100iig/ml)存在下，在搖床(250rpm)中37。C下培養噬菌體。對于D0M15-10組，溫育時間為一小時，對于D0M15-26-555組，為兩小時。結果如下對于使用DOM15-10組的第二輪和第三輪選擇，為1.5Xl(f和9X10s;對于使用DOM15-26-555的第二輪和第三輪選擇，為2.2X108和3.9X109。實施例4詵擇結果的分析DOM4-130-54和DOMlh_131_511組將來自第3輪和第4輪的所有結果亞克隆至pD0M5載體中，并轉化至JM83細胞中。pD0M5載體是基于pUC119的載體。通過Plac啟動子驅動蛋白質的表達。GAS1前導序列73(參見W02005/093074)確保了分離的可溶性dAb分泌至大腸桿菌JM83的周質和培養物上清液中。隨機挑選來自第3輪和第4輪的96和72個單獨的克隆，用于表達。將各自來自第3輪和第4輪結果的12-24個克隆測序。在兩個選擇中都觀察到了共有突變，并且選擇大約25個帶有共有基序的克隆用于進一步的表征。這些克隆的氨基酸序列顯示于圖3(D0Mlh-131-151選擇的變體)和圖4(D0M4-130-54選擇的變體)中，并作為DNA序列列于圖19A-19L中。將不同于選定克隆中親本序列的氨基酸高亮顯示(相同的那些用圓點來標記)。用框顯示對應于CDR1、CDR2和CDR3的環。這些克隆以較大的量表達，并在蛋白L(對于DOM4_130_54變體)和蛋白A(對于DOMlh-131-511變體)上純化，在胰蛋白酶(lOOiig/ml或1000yg/ml終濃度)存在或不存在下在37t:下溫育一小時或過夜后，在BIAcore上測試抗原結合。通常，來自DOM4-130-54選擇的結果更穩定，對于一小時，大部分克隆保持對胰蛋白酶的抗性，對于過夜，最佳克隆保持抗性。相反，對于一小時，來自DOMlh-131-511選擇的少量克隆能抵抗胰蛋白酶，對于過夜，沒有一個克隆有抵抗力。實施例5詵擇結果的分析DOM15-10和DOM15_26_555組首先在使用或沒有使用胰蛋白酶消化的單克隆噬菌體ELISA上測試了用胰蛋白酶預處理的選擇的有效性。挑選了每個文庫第二輪選擇的十八個克隆和第三輪選擇的24個克隆。將克隆D0M15-10、D0M15-26-501和D0M15-26用作對照。另外的對照包括第二輪和第三輪胰蛋白酶選擇后來自每個文庫的擴增并純化的噬菌體溶液。將每個噬菌體樣品分成兩個部分，第一個部分用100ug/ml胰蛋白酶處理，第二個沒有用胰蛋白酶處理。兩個部分的溫育在37t:下進行一小時，伴隨攪拌(250rpm)，并通過加入RocheComplete蛋白酶抑制劑(lx)阻斷。使用胰蛋白酶消化的和未消化的樣品進行噬菌體ELISA。用0.1M碳酸氫鹽緩沖液中濃度為1Pg/ml的中性鏈親和素覆蓋ELISA孔。用PBS的洗滌步驟和用PBS中的1%吐溫-20封閉抗原覆蓋的孔之后，用稀釋于PBS中1%吐溫-20中的生物素化hVEGF覆蓋孔，濃度為100ng/ml。接著，用PBS洗滌孔，并加入用1X吐溫-20/PBS1:1稀釋的處理過的或未處理過的噬菌體上清液。在37t:溫育30分鐘后，用1%吐溫-20/PBS洗滌孔，接著在37"下用抗-M13噬菌體-HRP綴合物(在1%吐溫-20/PBS中1/5000稀釋)溫育30分鐘。然后用PBS和過氧化物酶洗滌孔。通過加入SureBlue試劑啟動反應。約十分鐘后，用等體積的1MHC1停止反應，并在0D450慮閱讀孔。用胰蛋白酶處理的不穩定對照DOM15-10和DOM15-26-501的ELISA讀數獲得低于0.404的0D45。，并且確定該值為不穩定克隆的邊緣值。認為產生低于0.4040D的所有樣品是不穩定的。認為所有超過該值的樣品是穩定的。表874<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表8顯示了每個文庫第二輪和第三輪胰蛋白酶選擇后穩定克隆的百分比。在第三輪選擇后，可以看到兩個文庫中胰蛋白酶抗性克隆的富集。在胰蛋白酶消化后的每種情況中，含有擴增的純化噬菌體混合物的對照ELISA孔的值在每次選擇后都遠高于0.404。此外，將來自第三輪選擇的胰蛋白酶處理過的噬菌體與來自第二輪選擇的胰蛋白酶處理過的噬菌體相比較時，觀察到信號略有升高。D0M15-10噬菌體文庫顯示出起始值約14%的升高。D0M15-26-555噬菌體文庫顯示出表示約2%起始值的升高。所有這些結果表明用胰蛋白酶預處理的選擇能有效地從D0M15-10和D0M15-26-555組中選擇胰蛋白酶抗性噬菌體克隆。將來自第二和第三輪選擇(D0M15-26-555)以及只來自第三輪選擇(D0M15-10)的所有結果亞克隆至pD0M5載體中，并轉化至HB2151電感受態細胞中。pD0M5載體是基于pUC119的載體。通過Plac啟動子來驅動蛋白質的表達。GAS1前導序列確保分離的可溶性dAb分泌至大腸桿菌HB2151的周質和培養物上清液中。從每輪選擇(3和4)隨機挑選184個單獨的克隆，用于在lml培養物體積中表達。將細菌上清液稀釋于HBS-EPBIAcore緩沖液中(1:l體積比)并分成兩份。將20iig/ml終濃度的胰蛋白酶只加入一個瓶中。伴隨攪拌(250rpm)在37。C下進行溫育40分鐘。用RocheComplete蛋白酶抑制劑(IX)阻斷反應后，在BIAcore3000上測試胰蛋白酶處理過的或未處理的噬菌體上清液的抗原結合(SA傳感器芯片上2，000RU生物素化的hVEGF)。挑選克隆的標準是相對于未處理的dAb，<15%用胰蛋白酶處理過的dAb的抗原結合降低(基于選定時間點達到的最大RU)，這通常將反映出dAb對蛋白酶處理的穩定性；dAb從抗原分離的過程中，兩個時間點之間<40%的解離速率降低。基于這些值，將來自DOM15-26-555文庫的第二和第三輪選擇的60個克隆以及來自DOM15-10文庫的第三輪選擇的17個克隆測序。在兩個文庫的結果中觀察到共有突變，從每個帶有共有基序的文庫中選擇17個克隆，用于進一步的表征。這些克隆的氨基酸序列顯示于圖5(D0M15-26-555選擇的變體)和圖6(D0M15-10選擇的變體)中，并且作為DNA序列列于圖20A-20E中。將不同于選定克隆中親本序列的氨基酸高亮顯示(相同的那些用圓點來標記)。用框顯示對應于CDR1、CDR2和CDR3的環。在50ml表達培養物中表達這些克隆，在HBS-EP緩沖液中稀釋至100nM濃度的蛋白A(對于DOM15-26-555變體)或蛋白L(對于D0M15-10變體)上純化，并在胰蛋白酶(20iig/ml終濃度)存在或不存在下伴隨攪拌(250rpm)在37。C下溫育1.5小時后，在BIAcore上測試抗原結合。還使用實施例2中所述的方法測試了這些克隆的胰蛋白酶抗性。將蛋白質緩沖交換至PBS中，并濃縮至lmg/ml。將25iig蛋白質與liig胰蛋白酶(Promega)混合并在30°C下溫育0小時和24小時。該時間后，用RocheComplete蛋白酶抑制劑(IX)和DTT阻斷反應，并加入裝載劑。將樣品在IO(TC下變性五分鐘。然后，通過在Novex10-20%Tricine凝膠上電泳來分析15yg每種樣品，并且用SureBlue(lx)將蛋白質染色。通常，來自DOM15-26-555選擇的結果更穩定，在BIAcore上測試時，大部分克隆保持對胰蛋白酶的抗性持續1.5小時，在SDS-PAGE上運行時，持續過夜。相反，在SDS-PAGE上運行時，只有少量來自D0M15-10選擇的克隆對胰蛋白酶的抗性持續過夜。實施例6DOMlh-131-511變體的鑒定更詳細地分析DOMlh-131-203、D0Mlh-131-204和D0Mlh-131_206。用不同濃度的胰蛋白酶(0至100iig/ml)在37t:下溫育過夜后，在BIAcore上在500nM的dAb濃度下比較。BIAcore痕跡顯示于圖7中。結果清楚地顯示了兩種變體對高濃度胰蛋白酶(100yg/ml)的蛋白水解的抗性比它們的親本更高。還在上述條件下，與它們的親本一起，比較了兩種dAb，D0Mlh-131-202和D0Mlh-131_206，對抗各種其他蛋白酶，包括leucozyme、彈性蛋白酶和胰酶，使用lOOiig/ml的蛋白酶濃度。對抗所有測試的蛋白酶，與親本相比較，dAb顯示了提高的對蛋白水解的抗性。對于彈性蛋白酶和leucozyme的BIAcore痕跡顯示于圖8中。用lOOiig/ml測序級別的胰蛋白酶處理5yM的每種dAb0、1、3和24小時。用25XRocheComplete蛋白酶抑制劑抑制反應，并將反應在4-12%NovexBis-Tris凝膠上運行。凝膠顯示于圖9中。實施例7DOM4-130-54變體的鑒定更詳細地分析DOM4-130-201和DOM4_130_202。用不同濃度的胰蛋白酶(0至100iig/ml)在37t:下溫育過夜后，在BIAcore上在500nM的dAb濃度下比較。BIAcore痕跡顯示于圖10中。結果清楚地顯示了所有三種變體對高濃度胰蛋白酶(100g/ml)的蛋白水解的抗性比它們的親本更高。還在上述條件下，比較了DOM4-130-201和DOM4-130-202與它們的親本對抗各種其他蛋白酶，包括leucozyme、彈性蛋白酶和胰酶，使用100yg/ml的蛋白酶濃度。盡管結果沒有使用胰蛋白酶那么明顯，但對抗所有測試的蛋白酶，與親本相比較，前導dAb顯示了提高的對蛋白水解的抗性。對于彈性蛋白酶和leucozyme的BIAcore痕跡顯示于圖11中。用100iig/ml測序級別的胰蛋白酶處理5iiM的每種dAb0、1、3和24小時。用25XRocheComplete蛋白酶抑制劑抑制反應，并將反應在4-12%NovexBis-Tris凝膠上運行。凝膠顯示于圖9中。實施例8DOMlh-131-511和DOM4-130-54變體的進一歩表征首先使用差示掃描量熱法(DSC)分析dAb，以確定胰蛋白酶抗性提高是否與解鏈溫度(Tm)提高相關。胰蛋白酶穩定性的提高與Tm的提高相關(參見表9)。表976<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>還在基于MRC-5細胞的測試中比較了DOMlh_131_511衍生的dAb(參見表10)。在該測試中，測量了dAb中和TNFa剌激的IL_8釋放的能力，以確定胰蛋白酶穩定性的提高是否導致功效的降低。然而，該測試中胰蛋白酶抗性dAb的活性沒有受到明顯影響。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>在受體結合測試中測試DOM4-130-54衍生的dAb，以觀察它們是否具有相同的抑制IL-l與IL-RI結合的能力(參見表11)。在該測試中，胰蛋白酶抗性dAb的活性沒有受到影響。表lldAbIC50(nM)D0M4-130-54280pMD0M4-130-201257pMD0M4-130-202254pM實施例9DOM15-26-555變體的鑒定與它們的親本和兩種另外的dAb，DOM15_26_594和D0M15-26-595—起，更詳細地分析了DOM15-26-588、DOM15-26-589和DOM15-26-591和DOM15-26-593，這另外兩種dAb是通過突變形成的，以組合對功效和穩定性具有最大影響的突變(E6V和F100S/I)。序列顯示于圖12中。在用200iig/ml濃度的胰蛋白酶溫育后，以lOOnM的dAb濃度，在BIAcore上比較克隆對hVEGF的結合。伴隨攪拌(250rpm)，將反應在37。C下進行三小時和24小時。最佳克隆DOM15-26-593和親本的BIAcore痕跡顯示于圖13中。其他結果作為圖14中的圖表來表示。結果清楚地表明了所有變體在24小時的胰蛋白酶處理后，對蛋白水解的抵抗性高于親本。還通過將處理過的和未處理過的樣品在SDS-PAGE上跑膠檢測了DOM15-26-593和親本的胰蛋白酶抗性。簡而言之，將蛋白質緩沖交換至PBS中，并濃縮至lmg/ml。將25iig蛋白質與1Pg測序級別的胰蛋白酶(Promega)混合，并在3(TC下溫育0小時、1小時、3小時和24小時。該時間后，用RocheComplete蛋白酶抑制劑(lx)和DTT阻斷反應，并加入裝載劑。將樣品在10(TC下變性五分鐘。然后，通過在NovexlO-20XTricine凝膠上電泳來分析15yg每種樣品，并且用SureBlue(lx)將蛋白質染色。結果顯示于圖15中。該實驗中，DOM15-26-593的胰蛋白酶抗性特征不同于BIAcore實驗顯示的特征，表明反應條件的差異將影響胰蛋白酶分裂的最終結果。盡管如此，DOM15-26-593比其他選定的克隆具有更好的生物物理特性，以及親和性，如下所示。還在以下的表12中顯示了DOM15-26-555變體的特性概述。表1278<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>DOM15-10變體的鑒定與其親本DOM15-10—起，更詳細地分析了DOM15-10-11。序列顯示于圖16中。在用200iig/ml濃度的胰蛋白酶溫育后，以lOOnM的dAb濃度，在BIAcore上比較dAb對hVEGF的結合。伴隨攪拌(250rpm)，將反應在37。C下進行1小時、3小時和24小時。這些dAb的BIAcore痕跡顯示于圖17中。結果清楚地表明了選定的變體在24小時的胰蛋白酶處理后，對蛋白水解的抵抗性高于親本。還通過將處理過的和未處理過的樣品的SDS-PAGE跑膠檢測了前導和親本的胰蛋白酶抗性。簡而言之，將蛋白質緩沖交換至PBS中，并濃縮至lmg/ml。將25iig蛋白質與1Pg測序級別的胰蛋白酶(Promega)混合，并在3(TC下溫育0小時、1小時、3小時和24小時。該時間后，用RocheComplete蛋白酶抑制劑(lx)和DTT阻斷反應，并加入裝載劑。將樣品在10(TC下變性五分鐘。然后，通過在Novex10-20%Tricine凝膠上電泳來分析15yg每種樣品，并且用SureBlue(lx)將蛋白質染色。結果顯示于圖18中。在該情況中，胰蛋白酶抗性特征與BIAcore胰蛋白酶測試非常相關，顯示了結合活性直接反映出蛋白質的完整性。實施例11DOM15-26-555和DOM15-10變體的進一歩表征使用差示掃描量熱法(DSC)分析dAb，以確定胰蛋白酶抗性提高是否與解鏈溫度(Tm)提高相關。結果顯示于表13中。DOM15-26-593變體的蛋白酶抗性和解鏈溫度之間存在關聯。前導D0M15-26-588和D0M15-26-555顯示出提高的Tm，但其他克隆沒有。值得注意的是D0M15-26-555和D0M15-10親本分子(63.3-63.7°C)在開始時具有比D0M4-130-54和DOMlh-131-511親本分子(開始時的Tm:57.9-54.1°C)具有高得多的Tm，但整體上，蛋白酶抗性克隆達到了相似范圍的Tm(對于DOMlh-131-511/D0M4-130-54變體，平均Tm為65.rC，而對于DOM15-26-55/D0M15-10變體，平均Tm為64.9°C)。表13名稱Tm°CD0M15-26-55563.3D0M15-26-58870.1D0M15-26-58963D0M15-26-59163D0M15-26-59365D0M15-1063.7D0M15-10-1163.3還在受體結合測試中比較了dAb，測量BIAcore動力學來測定胰蛋白酶穩定性提高是否導致功效降低。然而，測試中dAb的活性基本上沒受影響，或甚至提高了。表14中呈現了該結果。表14克隆IDEC50(nM)KD(nM)D0M15-26-55511.726.1D0M15-26-5882759.1D0M15-26-5891.949.6D0M15-26-5911638D0M15-26-5930.3233.2D0M15-26-5944.0915.1D0M15-26-5950.8285D0M15-1010.2323.680<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>提高的Tm的優勢大部分蛋白_包括結構域抗體_以兩種狀態存在折疊狀態(這導致生物活性分子)和去折疊狀態(其不帶有功能性活性)。在所有溫度下，這兩種狀態共存，并且每種狀態的相對比例通常由常數K來決定，常數K是折疊和去折疊的動力學常數的函數。通常將解鏈溫度限定為K=1時的溫度，S卩，在該溫度下，折疊蛋白的部分等于去折疊蛋白的部分。通過使蛋白的分子內相互作用穩定和失去穩定來確定常數K，并且因此主要是通過蛋白質的氨基酸序列來決定。外部參數，如溫度、PH、緩沖液組成、壓力，影響著K，并因此影響解鏈溫度。對于降解機制，去折疊的蛋白是容易的目標(i)二硫鍵的暴露提高了取決于環境的氧化或還原的風險，(ii)提高的主鏈靈活性偏好自體蛋白水解反應，(iii)肽片段的暴露將目標提供給體內的蛋白酶、生產過程中的蛋白酶以及下游加工和長期儲存過程中的負載蛋白酶，和(iv)易聚集片段的暴露導致分子間聚集和蛋白沉淀。在所有情況中，發生了蛋白完整性、蛋白含量和蛋白活性的丟失，因此妥協了努力來(i)確保批次可再現性，(ii)確保貨架期的長期穩定性和(iii)體內功效。在自然界中，蛋白質通過進化得到了設計，以在體溫下足以進行任務，并且通過體內平衡機制容易地替換。通過生物技術方法制造的治療蛋白面對不同的環境通常在外源宿主中通過重組DNA技術來生產，在大的容器中以較高的含量表達，在整個下游加工過程中經歷非常重要的PH或緩沖液組成的變化，并且最終以高濃度存儲在非生理學緩沖液中延長的時間段。新的遞送技術(例如，吸入、sc貼劑、緩慢遞送的納米顆粒)還正在增加治療蛋白經受的應力。最終，蛋白質工程化技術的出現將導致提高的或完全新的治療蛋白的產生。因為大部分工程化技術是基于體外技術的，目的在于改變或形成新的氨基酸序列，沒有產生逐漸提高生物蛋白的進化方法，因此導致對于應激抵抗力次佳性能的蛋白。本發明的技術目的在于再現達爾文進化過程中蛋白質面對的條件之一。用在組織重塑和蛋白質體內平衡中起主要作用的蛋白酶浸漬肽或多肽，例如免疫球蛋白單可變域。還測試了任何可以形成對其功能具有提高適合度的蛋白質的特定突變，測試了在其執行功能的環境中適合的能力。在本發明的一個實施方案中，再現了該方法形成一組肽或多肽變體，并暴露于蛋白酶。在第二個步驟中，將該組變體接觸特定的目標。只有那些通過蛋白酶持續降解的蛋白質變體能夠嚙合目標，并因此例如通過稱為"生物淘選"的簡單親和性純化方法來回收。與體內方法相比，該系統給予了各種優勢蛋白質組可以面對多種條件，例如，各種蛋白酶、濃度較高、持續較長時間、在不同的緩沖液和pH中以及在不同的溫度下。因此，這種體外技術提供了一種設計蛋白質的方式，與產生它們的那些原始蛋白質相比，這些蛋白質可以在更多的環境中執行功能和保持穩定。顯然，這對于生物技術工業，并且特別是治療蛋白領域，提供了多個優勢。實施例12:對于蛋白酶抗性前導的PK相關性數據在體內進一步評價了四個dAb譜系中每個的親本dAb和蛋白酶抗性dAb(對于列表和詳細內容，參見以下的表15)表15<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>*:通過MRC5/IL-a生物測試測定的；卞:通過RBA測試測定的標注D0M15-26-501是本專利申請中以上舉例的D0M15-26-555的親本形式。D0M15-26-555在CDR1(134M)中具有一個種系氨基酸突變。D0M15-26-501具有比D0M15-26-555更低的解鏈溫度(52°Cv63.3°C)，和提高的對胰蛋白酶消化的敏感性。對于PK研究，優于D0M15-26-555，選擇了DOM15-26-501，因為其與DOM15-26-593相當，對于差的穩定性，是更好的代表。我們翻譯了抵抗性，如下l為低2為中等3為良好4為高5為非常高然后這表示親本分子的胰蛋白酶抗性為DOM4-130-54良好DOMlh-131-511良好DOM15-10低DOM15-26-501低同樣，對于選定的前導為DOM4-130-202非常高DOMlh-131-206非常高DOM15-10-11高DOM15-26-593高因為結構域抗體的大小小(12-15kDa)，iv或sc注射時，它們從循環中快速清除。實際上，腎小球過濾的截留為高于50kDa，并且因此小蛋白如dAb不能保持在循環中，因為它們能通過腎臟。因此，為了評價在體內對蛋白酶抗性的長期效果，我們用提高全身停留的部分標記了結構域抗體。文獻中已經報道了幾種針對延長半衰期的方法(例如，PEG、Fc融合體、白蛋白融合體等)。在本申請中，已經用人IgGl抗體的Fc部分標記(或格式化)結構域抗體。這種形式提供了兩個優點(i)所得到dAb-Fc的分子大小為75kDa，這已足夠大來確保保持在循環中，(ii)抗體Fc部分結合FcRn受體(也稱為"Brambell"受體)。該受體位于上皮細胞、內皮細胞和肝細胞中，并且涉及延長抗體和白蛋白的壽命實際上，在抗體和其他血清蛋白胞飲作用時，將蛋白質引向酸化內體，其中FcRn受體在通過內體之前中途阻止抗體(通過結合Fc部分)并將它們返回循環中。因此，通過將Fc部分標記在dAb上，確保dAb將長期暴露于至少兩個區室-血清和前-內體區室，其中每種含有特定組的蛋白水解酶。此外，FcRn受體介導轉胞吞作用，由此將帶有Fc的蛋白質轉移至血管外空間或從血管外空間轉移出來。通過將編碼VH和VKdAb的基因融合至編碼人IgGlFc的基因來完成用Fc的格式化，通過短的插入肽連接物(粗體)對于VHdAb(下劃線的):EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP…(hlgGlFc)...PGK*對于VKdAb(下劃線的)DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP…(hlgGlFc)...PGK*根據標準實驗方案使用293-fectin(Invitrogen)通過HEK293/6E細胞的瞬時轉染來產生材料。設計這些細胞用于結合pTT系列載體使用時的高水平瞬時表達(Durocher等，2002)。因此，將dAb基因克隆至改良的pTT5載體(pD0M38)中，以產生Fc融合表達載體(參見圖21)。在轉染后5天收集來自轉染細胞的上清液，通過離心和通過0.2iim濾器過濾來澄清。通過在蛋白A流線型樹脂(GEHealthcare)上捕獲來純化dAb-Fc融合蛋白。在10mM檸檬酸鈉pH3中從柱洗脫蛋白質，接著加入1M檸檬酸鈉pH6，來獲得100mM檸檬酸鈉pH6的終濃度。在大鼠中測試dAb-Fc分子的體內半衰期，將5mg/kg的目標劑量給予雌性Sprague-Dawley大鼠中(n=3/組)。應當注意到目標劑量大大超過大鼠中的目標濃度，因此預期親本dAb和胰蛋白酶抗性dAb之間的親和性差異(參見實施例11)將不會影響分子在體內的命運。因此，預期在抗原-無關性消除方法中反映出dAb之間的pK特征差異。在給藥后O.03、1、4、8、24、48、72、96、120和168小時采取血樣。血塊形成后，取出血清，然后在hIL-lR1、TNFR1或VEGF抗原捕獲測試中測試hIL-lRl抗原捕獲測試用4ug/mL抗-hlL-lRl覆蓋妾寸閉加入500ng/mLshlL-lRl加入樣品用抗人FcHRP檢測(il:10，000TNFR1抗原捕獲測試用0.lug/mLsTNFRl覆蓋83妾寸閉加入樣品用抗人FcHRP檢測(il:10，000VEGF抗原捕獲用0.25ug/mLVEGF覆蓋妾寸閉加入樣品用抗人FcHRP檢測(il:10，000將來自這些測試的原始數據轉化成每種血清樣品中的藥物濃度。然后使用非區室分析(NCA)在WinNonLin中分析每個時間點的平均yg/mL。每種dAb-Fc對的PK特征顯示于表16中，該表概括了測定的PK參數。表16:<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>結果清楚地表明_盡管dAb-Fc對4-130-54和lh-131-206的PK特征幾乎是鏡像(superimposable)的_特征與其他對變化很大。考慮AUC/D時，作用大部分是可見的15-10的AUC/D只是15-10-11的42%。15-26-501的AUC/D只是15-26-593的11%。這些重要的差異還影響了(程度較低)半衰期對于15-10和15-10-11，各自為43.2hvs.56.6h。使用DOM15-26世系時，看到了更大的差異對于15-26-501和15-26-593，各自為12.9hvs.86.2h。實際上，對于使用非區室分析的良好PK分析，應當存在至少4個用于擬合線性回歸斜率的數據點，并且估算半衰期的時間段應當為計算的半衰期的至少3倍。根據在此實施例中所述的生物物理特征，顯示出任何給定的dAb抵抗胰蛋白酶降解的能力與dAb-Fc融合體在大鼠血清中循環較長的時間段的能力相關。實際上，如實施例中所的，如實施例10，DOM15-10和DOM15—26—501是最可能降解的dAb:在lug胰蛋白酶存在下將25ugdAb在3(TC下溫育3h導致完全降解。在該研究中，所有其他dAb(不管它們是否已經用胰蛋白酶選擇(即，D0M15-10-11、D0M15-26-593、D0M4-130-202和D0Mlh-131-206)或和親本分子一樣(DOM4-130-54和DOMlh_131_511)已經具有一定的胰蛋白酶抗性)再次格式化成dAb-Fc分子時，在大鼠中具有相當的PK特征。因此，本發明的PK研究表明那些dAb具有非常低的蛋白水解抵抗性時，對蛋白水解的敏感性對dAb的體內穩定性具有最大的影響。還表明了-超過一定的水平-對胰蛋白酶降解的抵抗性進一步增加(例如，DOM4-130-206vD0M4-130-54)沒有顯著增加dAb-Fc分子進一步減緩體內消除的能力。在三種情況中，在胰蛋白酶存在下的選擇形成了具有提高的熱穩定性的新分子(通過解鏈溫度來限定)DOM4-130-202、DOMlh-13-206和DOM15-26-593。PK研究表明_在本發明的數據集中_解鏈溫度不是適當的參數來合理化觀察到的PK特征實際上，DOM15-10具有高于D0M15-10-11的Tm，并且也比DOM15-10-11更快地從循環中清除。在別處，DOM4-130世系的兩種dAb具有明顯不同的Tm(差l(TC)，并且在格式化成dAb-Fc分子時顯示出幾乎相同的體內穩定性。應當注意到沒有排除解鏈溫度本身作為關鍵參數來預測體內穩定性。它只在使用本發明的數據集時發生，大的Tm差異(從5fC及以上)對dAb的體內命運不具有顯著的影響。這沒有排除在低于54t:的解鏈溫度下，dAb的體內穩定性與熱穩定性相關的可能，或甚至可能與熱穩定性和對蛋白酶抗性都相關。實施例13對DOM10-53-474的胰蛋白酶詵擇純化的DOM10-53-474的胰蛋白酶穩定性DOM10-53-474是結合IL-13的結構域抗體，具有高的功效。為了測定該dAb在胰蛋白酶存在下的穩定性，用胰蛋白酶消化純化的dAb，持續提高的時間點，并在凝膠上跑膠來檢測任何可能的蛋白質降解。用1Pllmg/ml測序級別的胰蛋白酶在3(TC下溫育25y1lmg/ml純化的DOM10-53-474，形成25:1dAb:胰蛋白酶的分子比例。用胰蛋白酶溫育dAblh、4h和24h，并通過加入4iURochecomplete蛋白酶抑制劑來中和蛋白酶活性，接著在冰上溫育。通過將蛋白酶抑制劑加入沒有添加胰蛋白酶的dAb中來制備時間0樣品。隨后根據制造商的說明使用Labchip通過電泳分析2i！1的樣品。圖22顯示了用胰蛋白酶溫育提高時間點的D0M10_53_474的凝膠電泳。為了比較，還如上所述用胰蛋白酶處理了一種胰蛋白酶穩定的dAb，DOM15-26-593，并且在旁側跑膠。如圖中所示的，甚至在用胰蛋白酶溫育24h后，DOM15-26-593顯示是穩定的。然而，在24h后，DOM10-53-474降解至一定的程度，但在lh和4h時間點時顯示為穩定的。這些數據表明DOM10-53-474能在一定程度上抵抗胰蛋白酶的降解，但是沒有胰蛋白酶最穩定dAb之一的DOM15-26-593那樣穩定。噬菌體展示的DOM10-53-474的胰蛋白酶穩定性為了測定噬菌體展示的DOM10-53-474的胰蛋白酶穩定性，將編碼DOM10-53-474的基因克隆至pD0M33的Sal/Not位點中(圖50)，并根據標準技術產生噬菌體。通過PEG沉淀純化噬菌體，重懸浮于PBS中并滴定。用胰蛋白酶溫育噬菌體展示的dAb不同的時間點，以評價胰蛋白酶抗性。用胰蛋白酶溫育后，感染按指數生長的大腸桿菌TG1細胞后通過滴定分析來測量穩定性。在振蕩培養器中，在37C下用100iig/ml胰蛋白酶溫育100iU噬菌體lh、2h、854h和過夜。用Rochecomplete蛋白酶抑制劑(x2)阻斷胰蛋白酶活性，然后將噬菌體稀釋于PBS中的2%marvel中，在室溫下用10nM生物素化的IL-13溫育一小時。加入在室溫下用PBS中的2%marvel1預封閉一小時的抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的珠子(DynabeadsM-280(Invitrogen)，然后將混合物在室溫下溫育5分鐘。使用Dynabeads的所有溫育步驟在轉輪上進行。通過用lmlPBS中的O.1%吐溫_20將珠子洗滌八次來洗掉未結合的噬菌體。用0.5ml的0.1M甘氨酸pH2.2洗脫結合的噬菌體，并用100y11MTris-HClpH8.0中和。使用洗脫的噬菌體來感染按指數生長的TG1細胞(在37t:下lh)，并涂布于四環素平板上。將平板在37t:下溫育過夜，并進行菌落計數。用胰蛋白酶消化后的噬菌體結果概括于表17中。用胰蛋白酶溫育提高的時間點時，噬菌體滴定度降低。24h溫育后，所有噬菌體得到消化。表17.對噬菌體展示的DOM10_53_474親本進行的胰蛋白酶選擇的結果滴定<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>對胰蛋白酶抗性更大的dAb的選擇為了選擇對胰蛋白酶降解抗性更大的dAb，對于50iU反應，使用StratergeneMutazyme11試劑盒、生物素化的引物和5_50pg模板，通過PCR將隨機突變引入編碼DOM10-53-474的基因中。用Sail和NotI消化后，用抗生物素蛋白鏈菌素覆蓋的珠子從未消化的產物中純化插入片段，并在相應位點連接pD0M33。用純化的連接混合物轉化大腸桿菌TB1細胞，形成D0M10-53-474的易出錯文庫。文庫的大小為1.9X109，并且氨基酸的突變率為1.3。使用該文庫來進行三輪選擇來選擇具有提高的蛋白酶抗性的dAb。只使用沒有用胰蛋白酶處理的抗原進行第一輪選擇，以清除文庫，來除去任何不再以高親和性結合抗原的克隆。以10nMIL-13進行選擇。與6X1(T的輸入噬菌體相比，第一輪的結果為2X109，表明大部分克隆以高親和性結合抗原。用lnM生物素化的IL-13進行第二輪和第三輪選擇。在對IL-13淘選之前，用100iig/ml胰蛋白酶在搖床(250rpm)中在37。C下溫育噬菌體。對于第二輪選擇，在室溫下或在37t:下進行胰蛋白酶溫育lh。第2輪選擇的結果顯示于表18中。表18.第二輪選擇后的結果噬菌體滴定度<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>將來自37°CTlh胰蛋白酶處理的第2輪選擇的噬菌體結果用作第3輪選擇的輸入。對于第3輪選擇，用lOOiig/ml胰蛋白酶處理噬菌體，但持續了更長的時間點37°C2h，37°C4h，室溫下過夜或37t:下過夜。第3輪選擇的結果滴定度概括于表19中。表19:第三輪選擇后的結果噬菌體滴定度<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>將第1、2和3輪的每個選擇結果的幾個克隆測序，以測定序列多樣性。第一輪沒有使用胰蛋白酶處理后，50X的選擇結果具有親本D0M10-53-474序列。第2輪選擇后，親本的百分比提高至75%。第3輪選擇后，親本的百分比提高至80%。該數據表明DOM10-53-474已經能抵抗胰蛋白酶的降解，并且從這些胰蛋白酶選擇中沒有選擇出更多新的克隆。圖22顯示了用胰蛋白酶消化純化的蛋白時，即使在胰蛋白酶處理過夜后，DOM10-53-474也沒有完全消化。然而，為了觀察選擇結果中是否存在胰蛋白酶抗性比D0M10-53-474更高的任何新克隆，將其中用胰蛋白酶在37。C下處理過夜噬菌體的選擇3結果亞克隆至pD0M5中。然后將一百個克隆測序，以尋找任何胰蛋白酶抗性克隆。在分析的一百個克隆中，只有26個克隆具有新的序列，然而，這些克隆中沒有一個在胰蛋白酶分裂位點(賴氨酸或精氨酸)具有突變，表明這些克隆對胰蛋白酶的抗性沒有比D0M10-53-474更高。實施例14通過在胰蛋白酶存在下噬菌體選擇將存儲和生物物理改進引入前導DOMOlOl(抗TNFRl)dAb中為了提高前導分子DOMlh-131-511的蛋白酶抗性，如之前所述的，在胰蛋白酶存在下進行噬菌體選擇。該方法產生了多個與親本D0Mlh-131-511分子相比具有提高的胰蛋白酶穩定性的克隆。選擇了兩個克隆，DOMlh-131-202和D0Mlh-131-206用于進一步的表征，因為它們顯示出對胰蛋白酶的作用最顯著的提高。以下所述的更多工作表明對胰蛋白酶的作用具有提高的抵抗力，存在其他有益的作用，主要在于分子對剪切力和熱應力的穩定性。這兩個參數對提高生物藥物產品的存儲和貨架期穩定性是關鍵的。在巴斯德畢赤酵母中生產前導DOM0101dAb:將編碼三個前導分子的一級氨基酸序列的基因用于在巴斯德畢赤酵母中生產分泌的蛋白質。將三個合成基因(DOMlh-131-511、D0Mlh-131-202和D0Mlh-131-206)克隆至表達載體pPIC-Za中，然后轉化至兩個畢赤酵母株中，X33和KM71H。將轉化的細胞涂布于遞增濃度的Zeocin上(100、300、600和900yg/ml)，以選擇具有多個組分的克隆。然后在2L燒瓶中篩選幾個克隆，以鑒定高表達細胞系。然后將最佳表達的克隆用于在發酵罐中在5L規模下生產材料。蛋白質純化和材料表征為了生產用于表征和進一步穩定性研究的高質量材料，使用混合模型電荷誘導樹脂(C即to匪C)作為主要的捕獲步驟接著陰離子交換(QS印harose)來設計下游純化過程。沒有明顯優化，這使得可以回收70%純度為95%的表達的dAb。對于同一性，使用電噴霧質譜、氨基端測序和等電點聚焦來表征材料，對于純度，使用SDS-PAGE和SEC(大小排阻色譜)來表征材料。蛋白質同一性每種蛋白質的頭五個殘基的氨基端序列分析與預期一樣(EVQLL…)。對蛋白質樣品進行了質譜分析，該樣品已經使用C4Zip-tips(Millipore)緩沖交換至50:50H20:含有10%冰醋酸的乙腈中。允許與內部二硫化物鍵的形成為-2的質量差異時，對于三個蛋白各自測量的質量在基于一級氨基酸序列的理論質量的0.5Da內(使用平均質量來計算)。IEF用來鑒定蛋白質，基于每種蛋白質各不相同的pI。蛋白質純度將三種蛋白質以1yg和10iig的量裝載于非還原SDS-PAGE凝膠上，重復兩份。在所有情況中觀察到單個條帶。還進行了大小排阻色譜來證明了純度的水平。對于大小排阻色譜(SEC)，將100iig的各種蛋白裝載于T0S0HG2000SWXL柱上，以0.5ml/min流動。移動相為PBS/10%乙醇。基于曲線下的面積來計算單體的百分比(參見圖23)。DOMlh-131-511、-202和-206的穩定性比較蛋白酶穩定性的測定通過在過量蛋白酶下預溫育限定的時間點后殘余結合活性的BIAcore分析來測定D0Mlh-131-511、DOMlh-131-202和D0Mlh-131-206的蛋白酶穩定性。將大約1400RU的生物素化TNFR1覆蓋抗生物素蛋白鏈菌素(SA)芯片。只用PBS或用100yg/ml胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme來溫育250nM的DOMlh_131_511、DOMlh-131-202和DOMlh-131-206，在3(TC下持續1、3和24小時。通過加入蛋白酶抑制劑的混合物來停止反應。然后使用參考細胞減少將dAb/蛋白酶混合物在TNFR1覆蓋的芯片上通過。在每個注射循環之間用lOiUO.1M甘氨酸pH2.2使芯片表面再生。相對于沒有蛋白酶的dAb結合，測定用蛋白酶預溫育的結合人TNFR1(在IO秒時)的DOMlh-131_511、D0Mlh-131-202和DOMlh-131-206的部分。在25。C下進行BIAcoreTM運行。從三個獨立的實驗產生以下的數據。條形圖表示平均值，而誤差棒表示結果的標準偏差(圖24)。發現DOMlh-131-202和DOMlh-131-206與DOMlh-131-511相比，顯示出對胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme的蛋白水解降解具有更高的抵抗力。用胰蛋白酶lhr后和用彈性蛋白酶或leucozyme3hr后，DOMlh-131-202和DOMlhH-131-206與DOMlh-131-511相比之間的差異最明顯。存在這樣一種傾向在大部分測試的條件中，DOMlh-131-206比DOMlh-131-202略微更穩定些。使用DSC測定的dAb熱穩定性為了測定前導分子具有最大穩定性的pH，使用差示掃描量熱法(DSC)來測量Britton-Robinson緩沖液中各種dAb的解鏈溫度(Tm)。因為Britton-Robinson是由三種成分的緩沖體系(各自40mM的醋酸鹽、磷酸鹽和硼酸鹽)制成的，因此可能在相同的溶液中產生3-10的pH范圍。從蛋白質一級氨基酸序列測定理論pl。從DSC，發現dAb具有最高內在熱穩定性的pH，對于DOMlh-131-202為pH7，對于DOMlh-131-206為pH7_7.5，和對于DOMlh-131-511，為pH7.5。對于所有隨后的應力和穩定性工作，對于各種dAb，使用以下的pH;在Britton-Robinson緩沖液中，對于DOMlh-131-202和GSK1995057AD0Mlh-131-206為pH7.O，而對于DOMlh_131_511為pH7.5。結果概括于以下的表20中表20:在Britton-Robinson緩沖液中，以lmg/ml通過DSC測定的D0Mlh-131_202、DOMlh-131-206和DOMlh-131-511的pH和Tm的概括。溫度變化為180°C/小時。dAb獲得最大內在熱穩定性的pH給定pH下dAb的Tm(。C)DOMlh-131-2027.068.6DOMlh-131-2067.0-7.565.8DOMlh-131-5117.558.0兩周熱穩定性測試蛋白質在升高的溫度下能持續延長時間段的能力通常是穩定性的良好表現。在這些條件下，蛋白質可能經歷幾個物理過程，如聚集或化學變化。將dAb(lmg/ml)在Britton-Robinson緩沖液中在37和50。C下溫育14天。使用SEC來測定14天的時間段中溶液中剩下多少單體(圖25)。從圖25，可以看出DOMlh-131-202和DOMlh-131-206對熱應力的穩定性顯著高于DOMlh-131-511。將蛋白質暴露于升高的溫度下，如37和5(TC，通常用于獲得藥物長期貯存期的指示。將這些較高的溫度用于加速與室溫下長期存儲相關的正常過程，如脫酰胺、氧化或聚集。還可以使用SEC監控溶液中聚集形成的水平(圖26A至I)。在37t:下14天后，溶液中DOMlh-131-511的丟失歸因于沉淀和更高級別的聚集物形成，如通過SEC所測定的(圖26B)。在37。C下14天后，還看到了DOMlh-131-202和DOMlh-131-206顯著減少的蛋白質丟失，并且聚集物形成非常少或基本沒有增加，尤其是在DOMlh-131-206的情況中(圖26H)。在5(TC下，分子間的差異甚至更明顯，D0Mlh-131-206在較高溫度下14天89后顯示出高于DOMlh-131-202的穩定性，表明較高分子量聚集物的形成明顯減少(圖26)。相對于t二O，DOMlh-131-206在14天后只顯示了聚集物形成的少量增加(圖26I)，而D0Mlh-131-511全部從溶液中沉淀出來(圖26C)。這表明通過胰蛋白酶選擇引入dAb中的變化，例如，提高的熱穩定性，顯著提高了在37和50。C下的蛋白質存儲穩定性。DOMlh-131-202和更明顯的D0Mlh-131-206，清楚地在升高的溫度下具有提高的溶液穩定性和較低的形成聚集物的趨勢，這可以直接翻譯成在更相關的溫度下如+41:和室溫下提高的長期存儲穩定性。然后通過IEF分析從熱應激實驗的24hr、48hr、7天和14天時間點取樣，以觀察蛋白質是否經歷了將影響蛋白質整體電荷的任何生物物理變化(圖27)。再次，與DOMlh-131-511相比，DOMlh-131-202和D0Mlh-131-206在37。C下顯示出沒有明顯變化。使用DOMlh-131-511，在37t:下24hr后出現了微弱的第二條條帶。認為這條額外的條帶是由于蛋白質的二聚化引起的，因此遮掩了電荷并產生了兩個分子群。在5(TC下，分子間的差異更明顯，DOMlh-131-206清楚地顯示出在升高的溫度下沒有明顯變化，而DOMlh-131-202在24hr后顯示出一些變化的信號。Britton-Robinson中的大部分的DOMlh-131-511在48hr后由于沉淀而丟失。通過TNFR-1RBA分析5(TC下T=0、7和14天時間點，以確定蛋白質在暴露于高溫后的功能性(圖28)。該測試在檢測由于應力引起的分子細微變化中通常沒有SEC或IEF那樣靈敏，但可以使用來顯示dAb可以結合抗原。對于DOMlh-131-511，曲線轉移至左邊，反映出大部分的dAb由于沉淀而丟失的事實。溶液中留下的材料仍然能夠結合抗原。如圖25中所示的，即使在14天后，DOMlh-131-202和DOMlh-131-206中的大部分能夠維持在溶液中。RBA顯示所有可溶性蛋白質仍然是功能性的并能夠結合TNFRl。在高蛋白濃度下的存儲穩定性測試進行實驗來研究在非常高蛋白濃度下在4t:下的存儲穩定性，以觀察每種分子在這些條件下怎樣進行。將所有前導dAb在Britton-Robinson緩沖液中在其最穩定的pH下在離心Vivaspin濃縮器中(5K截留)濃縮至100mg/ml。然后將100mg/ml的樣品在fC下保持7天，然后通過SEC分析來觀察樣品在高濃度存儲過程中是否已經發生了任何其他物理變化(圖29)。在lxPBS10%乙醇(v/v)中的SEC柱上運行之前，將樣品稀釋至lmg/ml。從SEC痕跡，可以看出DOMlh-131-202和DOMlh-131-206在7天后都沒有顯示出聚集物形成的任何顯著增力B，其中對于D0Mlh-131-511，存在單體濃度2^的降低。前導dAb的噴霧器遞送對于早期毒理學和臨床工作，將dAb配制成液體，并通過噴霧裝置來遞送。根據裝置(例如，超聲波、噴射或振動篩)，dAb將經歷各種程度的剪切力和熱應力，因為將其噴霧來形成限定粒徑的氣溶膠。因為與DOMlh-131-511相比，DOMlh-131-202和-206都具有較高的Tm，并顯示出顯著提高的對熱應力的穩定性，在兩個噴霧器裝置中測試了所有dAb，以觀察它們怎樣應答噴霧過程中誘導的剪切力/熱應力。然后通過SEC分析來自噴霧氣溶膠的蛋白質和裝置中(即，杯中)剩余的dAb，以確定該處理過程中產生的聚集量。在其最穩定的pH下在Britton-Robinson緩沖液中測試所有分子。在E_flowR即id(振動篩)和PariLC+(噴射噴霧器)裝置中測試了dAb，在5mg/ml的蛋白質濃度下使用3.5分鐘的運行時間，并使用MalvernSparytek裝置測定粒徑分布。結果顯示于圖30中。對于良好遞送和分布至深肺中，理想的粒徑為<5iim。在Britton-Robinson緩沖液和配制緩沖液中，所有dAb獲得了低于5m的可比較的粒徑水平。在噴霧之前和之后通過A，測量來測定裝置杯中的dAb濃度(數據未顯示)。發現了蛋白質濃度沒有顯著變化，表明在遞送過程中沒有優先將蛋白質或載體噴霧。將Britton-Robinson緩沖液中噴霧的dAb樣品在SEC上運行，以確定在遞送的過程中蛋白質是否經歷了任何物理變化。圖31顯示了通過SEC測定的杯中或氣溶膠中的相對百分比變化。可以看到D0Mlh-131-202和D0Mlh-131-206相對于DOMlh_131_511，經歷了相對小的單體濃度變化。這證明了具有提高Tm的DOMlh-131-202和D0Mlh-131_206對噴霧過程中的聚集具有較低的傾向。圖32顯示了Britton-Robinson緩沖液中的DOMlh-131-206和D0Mlh_131_511在噴霧后的實際SEC痕跡，并證明了單體的相對損耗(圖31)是由于二聚體形成引起的。這再次給以下的理論提供了更多的支持證據由DOMlh-131-202和DOMlh-131-206顯示的更高熱穩定性可以防止明顯的聚集，即使是在未優化的配制緩沖液中。對于毒理學和安全性測定工作，需要將明顯高于給予患者的治療劑量的水平的dAb遞送至動物。這只能通過使用明顯較高的蛋白質濃度和/或在延長的時間段內遞送dAb來實現。因為已經表明DOMlh-131-511以5mg/ml在3.5min噴霧過程中形成聚集物，在PBS中測試了40mg/ml的DOMlh-131-206，并使用PariLC+噴霧高達1小時。在整個運行過程中的不同時間點從杯子和氣溶膠中取樣，以觀察延長的噴霧是否導致dAb由于通過SEC所測定的剪切力或熱應力以及蛋白質濃度(A280nm測量)而聚集。表21顯示了通過A280測定的杯子和氣溶膠中的dAb蛋白質濃度。表21:測量的使用PariLC+的40mg/ml的dAb噴霧過程中杯子和氣溶膠中的DOMlh-131-206的蛋白質濃度，通過A280吸光值讀數測定的。考慮到稀釋誤差和儀器誤差，在dAb噴霧lhr后，樣品濃度沒有變化。時間杯中樣品(Mins)(mg/ml)氣溶膠樣品(mg/ml)143.843.42944.543.55944.644.1從表21可以看出蛋白質濃度在運行過程中沒有明顯變化，證明不存在由于聚集引起的蛋白質明顯損耗。圖33顯示了在噴霧的1小時時間段中，D0Mlh-131-206沒有形成任何更高級別的聚集物，如二聚物，如通過SEC測定的。這清楚地證明了提高的生物物理特性，如通過胰蛋白酶選擇引入分子中的，顯著提高了dAb對剪切力和熱應力的抗性，并且這與提高的存儲貨架期以及將蛋白質噴霧的能力直接相關，使得不形成較高級別的聚集物。前導dAb的溶液狀態91因為對于所有三種前導dAb的主要降解途徑，顯示出自締合最初導致二聚化，接著更多的聚集，并且最終沉淀，通過分析性超離心(AUC)研究這三種前導分子，以測定自締合的程度。通過兩種方法，沉降平衡和沉降速度，來研究蛋白質。對于沉降平衡方法，在0.5mg/ml至5mg/ml范圍的三種不同濃度下運行三種樣品，使用三種不同的轉子速度而具有離心作用。通過該方法，測定了DOMlh-131-511是穩定的二聚體(26.1-34.4kDa)，DOMlh-131-202是單體/二聚體平衡(22.7-27.8kDa)，在測量的濃度下具有相對穩定的二聚體狀態，Kd=1.3iiM，DOMlh-131-206主要是單體的(15.4-17.9kDa)，具有360yM從單體至二聚體締合的Kd。通過沉降速度方法，所有樣品顯示出稀釋時一定程度的解離。從所獲得的結果，顯示于圖34中，對于D0Mlh-131-511觀察到的沉降系數表示了較高級別的聚集物，并且稀釋時的峰值位移表示了這些聚集物的解離。蛋白質聚集和解離相互抵償，這產生了形成穩定的二聚體的印象，如通過沉降平衡所觀察到的。對于DOMlh-131-202觀察到的沉降系數，表示了快速動態平衡，因此單體和二聚體峰沒有相互分開，產生了單峰，具有高于適于樣品質量的沉降系數。該結果與通過沉降平衡方法獲得的結果相一致，并且測量解離常數為1yM。測定DOMlh-131-206比其他兩種樣品單體更多，具有1.9s的沉降系數，與其他兩種樣品的2.5s相比較。該數據與沉降平衡數據非常一致。在測量的濃度下，低于360yM的KdIO倍，樣品主要是單體。實施例15DOM蛋白質dAb的功效增強圖40中顯示了DOM蛋白質dAb超過DOM15-26親本的VEGFR2受體結合測試中功效增強的實例。在該測試中，在基于平板的測試中測量了潛在抑制劑防止VEGF結合VEGFR2的能力。在該測試中，將VEGFR2-Fc嵌合體覆蓋在96-孔ELISA平板上，并且向其加入預定量的已經用連續稀釋的測試dAb預溫育的VEGF。洗掉未結合的蛋白質后，用抗-VEGF抗體檢測結合受體的VEGF的量，按比色滴定來測定其水平。按作為測試底物濃度函數的VEGF結合的抑制百分比將劑量應答效果作圖。因此，有效的抑制劑是證明了在低濃度下基本上阻斷了配體結合的那種。FC融合體功效和半衰期VEGF阻斷在腫瘤治療中的治療潛能已經實現了超過30年。癌癥的慢性性質決定了生物藥物需要長的血清半衰期來介導它們的作用，但這與通過腎過濾從循環中快速清除游離的dAb不相一致。為了測定VEGFdAb作為抗血管生成藥用于癌癥治療的實用性，通過雜交連接物將前導結構域抗體與野生型人IgGlFc格式化成融合體，使得形成二價分子，其通過使用FcRn介導的抗體補救途徑延長了血清半衰期。在該Fc融合體格式中，使用之前所述的測試將前導胰蛋白酶選定dAbDOM15-26-593的功效與最初的親本dAb(DOM15-26)&胰蛋白酶不穩定dAb(DOM15-26-501)相比較。結果顯示于以下的表22中表22.Fc融合體形式的DOM15_26前導的功效(RBA)&半衰期特征<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>從這些結果可以看出，二聚Fc融合體形式，由于抗體親抗原性(avidity)的作用，相對于游離dAb，提高了親和性&功效。清楚的是通過胰蛋白酶選擇獲得的DOM15-26-593功效增強在該Fc形式中得到維持，甚至更明顯。此外，熱和蛋白酶穩定性的增強翻譯成分子在體內的藥物動力學行為的明顯變化。DOM15-26-593與DOM15-26-501相比較的消除半衰期的提高(參見圖41)很可能是dAb提高穩定性的直接后果，使其對內體區室內發生的降解過程的抵抗性更大。因此，還預期了具有提高蛋白酶穩定性的dAb能夠在其他生物區室中持續更長的時間，其他區室如血清、粘膜表面和各種組織區室，其中蛋白水解是涉及生物分子翻轉的活性過程。藥物動力學清除特征以5mg/kg的濃度將DOM15-26-593和DOM15-26-501i.v.給藥于3只大鼠后，測量DOM15-26-593和DOM15-26-501的藥物動力學清除特征。然后使用直接VEGF結合標準ELISA測試和抗人Fc抗體測量了血清中DOM15-26-593和DOM15-26-501的水平，因此只檢測了血清樣品中的完整藥物。以下的表23中顯示了完整的藥物動力學特征表23.大鼠中DOM15-26&D0M15-26-593Fc融合體的藥物動力學參數概述<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>從這些結果可以看出DOM15-26-593具有顯著提高的藥物動力學特征，具有，例如，延長的半衰期和降低清除率。DOM15-26-593顯著提高的功效和藥物動力學特征導致化合物用于各種其他生物物理特性的分析。溶液狀態特征通過SEC-MALLs&AUC的分析如下利用D0M15-26-593進行實驗D0M15-26-593在高達2.5mg/ml的濃度下在溶液中，行為和單體一樣，具有計算的78-81KDa的分子量，與計算的大約76kDa的完整分子量相一致(圖42a&42b)。熱熔化特性通過DSC的分析如下進行實驗，使用DOM15-26-593:在Fc融合體(64.5t:，圖43，上圖)中維持了胰蛋白酶選擇的dAb提高的熱穩定性(65。C，圖43，中圖)。顯示了D0M15-26-501dAb(52°C，圖43，下圖)的Tm曲線，用于比較。對凍_融、溫度應力和血清成分的穩定性如下進行實驗，使用15-26-593:DOM15-26-593dAb的穩定性特征意味著DOM15-26_593dAb可以接受物理和生物應力，而對其結合VEGF的能力具有很小的影響(參見圖44-47(a和b))。例如，將分子從液氮(_196°C)反復凍融至體溫(37tO，循環10次，沒有損耗結合活性，如通過ELISA所測定的(圖44)。該處理還導致分子聚集狀態沒有明顯變化，如通過常規大小排阻色譜所測定的(圖45)。此外，測試證明了將分子置于從-8(TC至55t:的不同溫度范圍下，在168小時后，只在最高溫育溫度下，抗原結合活性中才有少量下降(圖46)。此外，用來自人或獼猴的血清在37t:溫育14天時，沒有引起抗原結合活性的損耗(圖47a和47b)，如通過VEGF結合ELISA所測定的。VEGFR2受體結合測試&HUVEC細胞測試中的功效如下進行受體結合測試。將以上所述的受體結合測試用于測定Fc融合體的功效(圖48)。發現了DOM15-26-593dAb在該測試中具有提高的功效，這確定了dAb在體外阻斷了VEGF與VEGFR2結合的能力。還在HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)測試中證明了匿S1529的功效，其中測量了VEGF拮抗劑阻斷VEGF剌激的HUVE細胞增殖的能力。在固定培養期結束時測定細胞數量，使用預定量的VEGF和不同含量的測試物質。觀察到拮抗劑功效越大，細胞增殖越低(圖49)。在下一段中列出了DOMlh-131-1511的核苷酸序列。DOMlh-131-1511的核苷酸序列GAGGTGCAGCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGTCCCTTCTACGCAGACTCCGCACGCTATATCTGCAAATGAGCTGCTTCCTAAGAGGGGGCTGTTGGAGTCCCTCCGGATTGTCTAGAGTGTGAAGGGCCGACAGCCTGCGTGGGGGAGGCCACCTTTGCGGGTCTCACATGTTCACCATCTGCCGAGGACTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCATGAGACGATGGTGTGGGTATTCCCCCGGTTGGTCAGGATCCCGCGACAATTCCAAGAAACAGCGGTATATTACTGTGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC權利要求抗-TNFαI型受體(TNFR1；p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOM1h-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少93％同一性的氨基酸序列。2.權利要求1的免疫球蛋白單可變域，其在位置53含有天冬氨酸，其中編號根據Kabat。3.權利要求1或2的免疫球蛋白單可變域，其在位置91含有組氨酸，其中編號根據Kabat。4.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與D0Mlh-131_206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列。5.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其是由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)具有至少80%同一性的核苷酸序列編碼的。6.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其是由與與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于圖19中)相同的序列編碼的。7.TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑，其含有根據前述任一項權利要求的抗-TNFR1免疫球蛋白單可變域。8.權利要求7的拮抗劑，其含有第一和第二免疫球蛋白單可變域，其中每個可變域是根據權利要求16任一項的。9.權利要求7或8的拮抗劑，其中所述拮抗劑包括所述單可變域的單體，或者所述單可變域的同型二聚體。10.權利要求7、8或9的拮抗劑，其中該單可變域或每個單可變域的氨基酸序列與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同。11.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列的氨基酸序列。12.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列的氨基酸序列。13.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列。14.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列的氨基酸序列。15.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列。16.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列。17.抗-TNFaI型受體(TNFR1;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)相同的氨基酸序列，或者在不超過25個氨基酸位置與DOMlh-131-206的氨基酸序列不同并具有與DOMlh-131-206的CDR1序列為至少50%同一性的CDR1序列和具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的氨基酸序列。18.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR1序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR1序列。19.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR1序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR2序列。20.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR1序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR3序列。21.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR1序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR1序列，和與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列。22.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR1序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR1序列，和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列。23.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR2序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR2序列，和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列。24.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其具有與DOMlh-131-206的CDR1序列(顯示于圖3中)為至少50%同一性的CDR1序列，與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列，和與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列。25.TNFaI型受體(TNFR1;P55)拮抗劑，其含有免疫球蛋白單可變域，該免疫球蛋白單可變域包含DOMlh-131-206的CDR1、CDR2和/或CDR3序列(顯示于圖3中)。26.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其與DOMlh-131-511-206競爭與TNFR1的結合。27.蛋白酶抗性免疫球蛋白單可變域，其含有TNFaI型受體(TNFR1;P55)結合位點，其中用以下條件溫育時，所述可變域能抵抗蛋白酶(i)在37t:下用濃度(c)為至少10微克/ml的蛋白酶溫育至少一小時的時間(t);或(ii)在3(TC下用濃度(c')為至少40微克/ml的蛋白酶溫育至少一小時的時間(t)，其中所述可變域包含與D0Mlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少90%同一性的氨基酸序列。28.權利要求27的可變域，其中濃度(c或c')為至少100或1000微克/ml的蛋白酶。29.根據權利要求27或28的可變域，其中時間(t)為一小時、三小時或24小時或過夜。30.權利要求27的可變域，其中可變域在條件(i)下是有抗性的，并且濃度(c)是10或100微克/ml的蛋白酶，時間(t)是1小時。31.權利要求27的可變域，其中可變域在條件(ii)下是有抗性的，并且濃度(c')是40微克/ml的蛋白酶，時間(t)是3小時。32.權利要求2731任一項的可變域，其中蛋白酶選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme禾口胰酶。33.權利要求2732任一項的可變域，其中蛋白酶是胰蛋白酶。34.權利要求2733任一項的可變域，其中可變域能抵抗胰蛋白酶，和至少一種選自彈性蛋白酶、leucozyme和胰酶的其他蛋白酶。35.權利要求2734任一項的可變域，其中在條件(i)或(ii)下溫育后，可變域特異性地結合TNFR1。36.權利要求35的可變域，在條件(i)或(ii)下溫育后，可變域在ELISA中具有至少0.404的0D45。讀數。37.權利要求2736任一項的可變域，其中在條件(i)或(ii)下溫育后，可變域特異性結合蛋白A或蛋白L。38.權利要求2737任一項的可變域，其中在條件(i)或(ii)下溫育后，可變域在凝膠電泳中基本上展示了單條條帶。39.TNFaI型受體(TNFR1;p55)拮抗劑，其含有根據權利要求2738任一項的可變域。40.權利要求39的TNFR1拮抗劑，其用于口服遞送。41.權利要求39或40的TNFR1拮抗劑，其用于遞送至患者的GI道。42.權利要求39的TNFR1拮抗劑在制備用于口服遞送的藥物中的用途。43.權利要求39的TNFR1拮抗劑在制備用于遞送至患者的GI道的藥物中的用途。44.權利要求39、40或41的拮抗劑，或權利要求42或43的用途，其中可變域能抵抗胰蛋白酶、彈性蛋白酶和/或胰酶。45.權利要求39的TNFR1拮抗劑，其用于肺部遞送。46.權利要求39或45的TNFR1拮抗劑，其用于遞送至患者的肺。47.權利要求39的TNFR1拮抗劑，在制備用于肺部遞送的藥物中的用途。48.權利要求39的TNFR1拮抗劑在制備用于遞送至患者的肺的藥物中的用途。49.權利要求45或46的拮抗劑，或權利要求47或48的用途，其中可變域能抵抗leucozyme。50.口服遞送藥物或將藥物遞送至患者的GI道或患者的肺或肺部組織的方法，其中所述方法包括為患者給藥藥物上有效量的權利要求39的TNFR1拮抗劑。51.權利要求39的TNFR1拮抗劑，其用于治療和/或預防炎癥病癥。52.權利要求39的TNFR1拮抗劑在制備用于治療和/或預防炎癥病癥的藥物中的用途。53.權利要求51的拮抗劑，或權利要求52的用途，其中所述病癥選自關節炎、多發性硬化、炎性腸病和慢性梗阻性肺病。54.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述關節炎是類風濕性關節炎或幼年型類風濕性關節炎。55.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述炎性腸病選自克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎。56.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述慢性梗阻性肺病選自慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎和肺氣腫。57.權利要求53的拮抗劑或用途，其中所述肺炎是細菌性肺炎。58.權利要求57的拮抗劑或用途，其中所述細菌性肺炎是葡萄球菌性肺炎。59.權利要求39的TNFR1拮抗劑，其用于治療和/或預防呼吸道疾病。60.權利要求39的TNFRl拮抗劑在制備用于治療和/或預防呼吸道疾病的藥物中的用途。61.權利要求59的拮抗齊U，或權利要求60的用途，其中所述呼吸道疾病選自肺炎、慢性梗阻性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸性粒細胞浸潤癥、環境性肺病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質性肺炎、原發性肺動脈高壓、肺血栓栓塞癥、胸膜病癥、縱隔病癥、橫膈膜病癥、肺換氣不足、換氣過度、睡眠窒息、急性呼吸窘迫綜合癥、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植對抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏癥、石棉沉著病、曲霉腫、曲霉病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、.嗜酸細胞性肺炎、特發性肺纖維化、入侵性肺炎球菌病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸腔積液、肺塵癥、肺孢子蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著癥、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺炎、肺組織細胞增生癥X、肺動脈高壓、肺諾卡菌病、肺結核、肺靜脈閉塞癥、類風濕性肺病、結節病和韋格內氏肉芽腫癥。62.肺部遞送裝置，其含有權利要求39、45、46或49的TNFR1拮抗劑。63.權利要求62的裝置，其中所述裝置是吸入器或鼻內給藥裝置。64.口服制劑，其含有權利要求39或40的TNFR1拮抗劑。65.權利要求64的制劑，其中制劑是片劑、丸劑、膠囊、液體或糖漿。66.權利要求710和3965任一項的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑，其中拮抗劑含有根據權利要求16、1117和2738任一項的可變域。67.權利要求710和3965任一項的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑，其中拮抗劑含有具有至少50°CTm的可變域。68.根據權利要求16、1117和2738任一項的可變域，其中可變域具有至少50。C的Tm。69.權利要求710和3965任一項的拮抗劑、用途、方法、裝置或制劑，其中拮抗劑含有可變域，該可變域在MRC-5細胞測試中中和TNFa剌激的IL_8釋放，具有2nM50pM的ND50。70.根據權利要求l6、1117和2738任一項的可變域，其中可變域在MRC-5細胞測試中中和TNFa剌激的IL-8釋放，具有2nM50pM的ND50。71.雙特異性配體，其含有根據權利要求16、1117、2738、68和70任一項的可變域。72.分離的或重組核酸，其編碼含有根據權利要求16、1117、2738、68和70任一項的免疫球蛋白單可變域的多肽。73.載體，其含有權利要求72的核酸。74.宿主細胞，其含有權利要求72的核酸或權利要求73的載體。75.生產含有免疫球蛋白單可變域的多肽的方法，該方法包括在適于所述核酸或載體表達的條件下維持權利要求74的宿主細胞，由此產生含有免疫球蛋白單可變域的多肽。76.權利要求75的方法，其進一步包括分離多肽，并且任選地產生變體，例如突變的變體，其具有比分離的多肽提高的親和力和/或ND50。77.藥物組合物，其含有根據權利要求16、1117、2738、68和70任一項的免疫球蛋白單可變域，或權利要求710、1826、3941、4446、49、51、5359、61、66、67和69任一項的拮抗劑，以及藥物上可以接受的載體、賦形劑或稀釋劑。78.多肽，其含有與D0Mlh-131-206的氨基酸序列(顯示于圖3中)為至少93%同一性的序列。79.多肽，其由與DOMlh-131-206的核苷酸序列(顯示于19中)的核苷酸序列為至少80%同一性的序列編碼。80.融合蛋白，其含有權利要求78或79的多肽。81.分離的或重組核酸，其編碼權利要求78或79的多肽，或者權利要求80的融合蛋白。82.權利要求16、1117、2738、68和70任一項的免疫球蛋白單可變域，或權利要求710、1826、3941、4446、49、51、5359、61、66、67和69任一項的拮抗劑，或權利要求78或79的多肽，其含有抗體恒定域。83.權利要求82的可變域、拮抗劑或多肽，其含有抗體Fc，任選地其中Fc的N-端連接(任選地直接連接)至可變域的C-端。全文摘要本發明涉及能抵抗蛋白酶降解的抗-TNFR多肽和抗體單可變域(dAb)，以及含有這些的拮抗劑。多肽、dAb和拮抗劑可作為可能在被給藥于患者時遇到蛋白酶的治療劑和/或預防劑，例如用于肺部給藥、口服給藥，遞送至患者的肺和遞送至患者的GI道，以及用于治療癌癥和炎癥，如關節炎或COPD。文檔編號C07K16/28GK101778865SQ200880102207公開日2010年7月14日申請日期2008年6月4日優先權日2007年6月6日發明者C·埃內弗,I·湯林森,L·耶斯珀斯,M·普佩卡申請人:杜門蒂斯有限公司