一種新的抗惡性瘧原蟲表位以及含有它的疫苗的制作方法

專利名稱：：一種新的抗惡性瘧原蟲表位以及含有它的疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學高技術中的基因的開發與應用領域。具體而言，本發明涉及一種能被惡性瘧疾患者血清識別的具有多個表位的人工抗原的氨基酸序列以及編碼所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。本發明還涉及含有所述的氨基酸序列或所述的多核苷酸序列的疫苗。本發明進一步涉及所述的人工抗原在用于制備抗惡性瘧原蟲感染的免疫抑制劑中的應用。
背景技術：
：瘧疾是當今世界上最致命的流行病之一。全世界有近40億人生活在瘧疾流行區，每年大約有3-5億新的感染者出現，并且造成每年約2-4百萬人死亡。在感染人類的4種瘧原蟲中，惡性瘧原蟲是造成上述死亡的元兇，因此對惡性瘧疾的防治無論對流行區人口健康還是對該地區經濟發展都具有重大意義。瘧原蟲的生活史可簡單歸納為在人體內進行無性增殖、早期有性增殖和在蚊體內的有性增殖與孢子增殖。從雌性按蚊C4/2op力Wessp.)叮咬入血，到在肝細胞內發育成熟，大量裂殖子(merozoite)從破裂的肝細胞內逸出，進入血流，這時期稱紅前期(exoerythrocyticstage)。從血流中裂殖子侵入紅細胞在其內發育增殖，到下一代瘧原蟲經無性繁殖反復感染紅細胞，稱為紅(細胞)內期(erythrocyticstage)。部分進入紅細胞的裂殖子在紅細胞內不再進行無性分裂，而逐漸發育成為雌或雄配子體。如被雌性按蚊吸入胃內，則在蚊體內進行有性增殖，發育成熟為子孢子逸出，統稱為蚊期。瘧原蟲在上述不同生活周期表達多種不同的抗原蛋白。盡管研究證實減毒子孢子能夠引導產生免疫保護，由于瘧原蟲需通過宿主體內繁殖，因此沒有利用天然蟲體制備疫苗的條件。對己經篩選出的瘧原蟲抗原蛋白的研究已證實，它們的抗原性在宿主免疫系統的壓力下會不斷產生變異，因此目前沒有任何一種抗原的單獨使用能夠達到預期的保護效果。瘧疾的臨床癥狀只發生在紅內期，可引起周期性寒戰高熱，貧血，脾腫大，昏迷以致死亡。因此，針對紅內期研制的抗瘧疫苗被認為是最有效的預防途徑。惡性瘧原蟲生活周期的復雜性，以及惡性瘧原蟲抗原的高度多態性，使人們把研究重點放在對保守性多表位疫苗的研制上。因此，目前明顯需要一種具有高免疫原性、抗原識別多樣性、同時具有高抑制率的疫苗。
發明內容根據上述需要，本發明人構建出一種人工重組的核酸分子ES312，包含編碼SEQIDNo:2所示的323個氨基酸殘基的全長多肽。因此，本發明涉及一種具有SEQIDNO:l所示的堿基序列的多核苷酸。本發明還涉及具有由SEQIDNO:1所示的堿基序列編碼的如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。本發明進一步涉及含有所述的多核苷酸的載體。本發明進一步涉及含有所述的載體的大腸桿菌。其是于2004年10月9日在中國科學院微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1229的大腸桿菌。本發明進一步涉及它含有所述的多核苷酸或權利要求2所述的多肽的疫苗。本發明進一步涉及對所述的堿基序列特異的抗體。本發明進一步涉及對所述的多肽特異的抗體。本發明進一步涉及所述的多核苷酸用于制備抗惡性瘧原蟲感染的疫苗中的用途。本發明進一步涉及所述的多核苷酸免疫機體產生的抗體用于制備抗惡性瘧原蟲感染的免疫制劑中的用途。本發明進一步涉及所述的多肽用于制備抗惡性瘧原蟲感染的疫苗中的用途。本發明進一步涉及所述的多肽免疫機體產生的抗體用于制備抗惡性瘧原蟲感染的免疫制劑中的用途。根據本發明提供的含有抗惡性瘧原蟲的多表位人工抗原的ES312疫苗與現有技術的抗惡性瘧原蟲疫苗相比具有高免疫原性、抗原識別多樣性。另外，由所述的SEQIDNO:l所示的堿基序列的多核苷酸和所述的SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽所產生抗體對惡性瘧原蟲的體外生長具有很高的抑制效率。保藏信息本發明所用的重組工程菌株已于2004年10月9日在中國科學院微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1229和CGMCC1230。圖1示出抗惡性瘧原蟲多表位人工抗原ES312疫苗的基因核苷酸序列的975個堿基(即SEQIDNO:1)及其編碼蛋白的323個氨基酸序列(即SEQIDNO:2)。圖2多表位人工抗原ES312的結構組成分析。A:多表位蛋白ES312的不同種類表位的串聯方式；B:多表位蛋白ES312的氨基酸序列的二級結構預測。圖3多表位蛋白ES312對20種惡性瘧病人血清的識別。A:原核表達蛋白ES312的純化(1，鎳柱親合純化前的His融合蛋白；2，純化后的His融合蛋白；3，腸肽酶切割His融合蛋白；4，鎳柱親合純化的蛋白ES312);B:蛋白ES312能有效地識別瘧疾病人血清的酶聯免疫吸附實驗ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)實驗結果，其中系列1:蛋白ES312與病人血清識別的光吸收值;系列2:蛋白ES312與正常人血清識別的光吸收值。圖4兔抗ES312蛋白的IgG抗體對多種惡性瘧原蟲天然蛋白的識別。A:與天然蟲體蛋白的免疫共沉淀(Preimmune表示免疫前兔IgG抗體，Anti-ES312D表示免疫后IgG抗體)；B:免疫透射電鏡(RBC表示紅細胞，Tr表示滋養體，小黑點表示Anti-ES312D的IgG抗體與天然蛋白結合位點)。具體實施例方式本發明是在由相同申請人于2003年8月1日申請的申請號為PCT/CN03-00620中披露的方法，利用選用惡性瘧原蟲不同生活時期的抗原CPE，MSA-2，RESA，EBA-175，LSA-l,CST3/CSP,MSP-1,AMA-l和MAg-1的14個表位，以人類密碼子的偏愛性進行設計表位相應的基因序列ES312，從不同生活時期的惡性瘧原蟲保護性抗原中選出9種表位，它們是MSA-2，RESA，EBA-175，LSA-1，CST3/CSP，MSP-1,纖-1，CPE和MAg-1,通過人工合成抗原蛋白ES312的相應基因，合成篩選出SEQIDN0:1所示的核苷酸序列。另外，本發明SEQIDN0:1所示的核苷酸序列還可以通過本領域任何常規的方法產生，所產生的本發明序列都包含在本發明的范圍之內。用本發明SEQIDNO:1所示的核苷酸序列編碼具有323個氨基酸序列的蛋白質，如SEQIDNO:2所示，其相對分子量約為65kDa。編碼ES312蛋白的表位類型分析，發現在ES312蛋白的上游存在多個連續兩個的B細胞表位與Th細胞表位連接的組裝方式(圖2A)。其氨基酸序列二級結構預測，亦發現序列上游存在有連續數個的轉角-螺旋結構(即Coil-Helix,CH)，如圖2B所示。真核表達載體質粒VR1012連接后(VR1012為vical公司的真核表達載體)，感受態轉化大腸桿菌SKS383菌株，在終濃度為25pg/ml卡那霉素抗性的培養基篩選后，獲得含重組質粒工程菌ES312-VR1012/SK383。該重組工程菌株已于2004年10月9日在中國科學院微生物保藏中心保藏保藏，保藏號為CGMCC1229和CGMCC1230。但上述方法產生的如SEQIDNO:2的氨基酸序列并非限制本發明的目的，本領域技術人員可以理解的是，任何方法形成的SEQIDNO:2的氨基酸序列應該在本發明的保護范圍之內。根據本發明人發明的SEQIDNO:2的氨基酸序列，可以使用任何合適的方法制備疫苗，例如，通過免疫動物的方式獲得單克隆或多克隆抗體。例如，可以通過以下的方法制備疫苗。1.多克隆抗體的制備(1)抗原目前所知的載脂蛋白進入異種機體后，能致敏淋巴細胞，與抗體產生特異性結合復合物，即具備有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特異性兩方面的含義。載脂蛋白因具備抗原特異性和免疫原性，因此可稱為完全抗原，大多數動物的免疫系統是非常敏感的，用于免疫的抗原僅需要極微量。抗原應該是純化品，該純品在12.5。/。的PAG電泳后，僅出現一條區帶，即認為可用于免疫抗原純品。(2)免疫動物的選擇通常選擇壯年、成熟且健壯的豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動物，優選大白兔。作為批量生產，以采用山羊或綿羊，若需量再多，可考慮用馬作為免疫動物。因動物個體差異的關系，即使是用一種抗原去免疫多個白兔，所得抗血清特異性會有很大的差別。因此，為了得到比較一致的抗血清，常用能產生大量抗血清的羊或馬為免疫動物。佐劑佐劑是指與抗原混合注入機體后，能增加抗原的免疫性或者能改變免疫反應類型的一種物質。人們公認的佐劑是福氏佐劑(Freund，adguvant)，具有明顯的免疫剌激作用。福氏佐劑又可分為兩種，即不完全佐劑和完全佐劑，屬于一種油包水的乳劑，由羊毛脂或甘露糖醇單油酸酯(arlacela)為乳劑。油包水乳化劑有助于促進免疫反應的進行，還可起部分保護不穩定抗原的作用，使抗原在體內的吸收期延長，從而減少加強注射的次數。在不完全佐劑內加入殺死的分枝桿菌(如結核桿菌或卡介苗)制備成完全佐劑。分枝桿菌能增加局部淋巴結的炎癥反應，擴大免疫原性，從而促進最終高親和力抗體的形成。佐劑有成品購買，也可自行制備。佐劑制備方法是，取石蠟油6份、羊毛脂4份，再加5份不含抗原的抗原緩沖液(含O.1%SDS)，混勻，滅菌，分裝于小玻璃瓶中，08"C保存，此為不完全佐劑。在不完全佐劑中加入卡介苗(35mg/0.5ml)即為完全佐劑，均貯存于08"C。臨用時，取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份，混勻，振搖或研磨，使其成為乳化狀態，因為含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復合物，注射入動物體內時一定要保持乳化狀態。抗原用量視抗原分子量不同及免疫原性及免疫動物不同而有一定差異，無統一標準和固定模式。一般是每兔(約2kg重)或每羊(約20kg重)第1次注射抗原lmg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超過3mg。免疫途徑及方法免疫部位可分別選用皮內、皮下或淋巴結。第l次免疫釆用皮內結合皮下多點注射，常注射在背部或腿部。許多作者介紹在后足躕皮下或皮內注射，因為四足落地的關系很易造成感染，使第l次免疫失效，并使動物行走不便，造成傷害。整個免疫過程以23個月為宜。一般是第1次免疫后的34周再進行第2次免疫，不完全佐劑為乳化劑。2周后加強1次(不完全佐劑)，2周后又加強1次(不完全佐劑或完全佐劑)，l周后再免疫l次。待最后一次免疫后的710天，取靜脈血測試抗體效價(試血)，效價達到要求后即可一次性放血，采用頸動脈放血，得抗血清。筆者采用此法先后免疫成功ApoAI、AII、B100和E的抗血清。(3)抗血清的保存免疫成功的動物放血過程，所有用具均嚴格消毒，并按無菌操作方式進行放血。抗血清的防腐劑以0.05%疊氮鈉為宜；也可采用加入20%30%無菌甘油保存的方法。若時間較長，不用可采用-2(TC低溫保存。一般在08"C保存1年，抗體效價幾乎無改變，保存2年，其效價稍有降低。抗體切忌反復凍融，否則抗體效價很快降低，以頸動脈一次性放血為宜。2.單克降抗體的制備單克隆抗體是一種高度特異性的抗體。單克隆抗體與多克隆抗體有一定的差別。抗體含量比較，單克隆抗體濃度高，腹水中可達0.510mg/ml，而多克隆僅O.11.0mg/ml;結合特性，單克隆抗體僅與單個抗原決定簇結合，特異性和親和力高，多克隆抗體可與所有抗原決定簇結合，特異性和親和力比較差；含免疫球蛋白類型，單克隆抗體僅一種亞類，多克隆抗體為所有種類和亞類。單克隆抗體在腹水中含量較高，可以人工培養，專一性強等特性是多克隆抗體無法比擬的優點。(1)單克隆抗體產生機理單克隆抗體制備過程中需要兩種細胞和即骨髓瘤細胞和脾細胞。骨髓瘤細胞是一種惡變細胞，在體外有無限的增殖能力，并能分泌很多化學結構均一的免疫球蛋白，但特異性很差，當它與不同性質的動物脾細胞融合時，可形成雜交瘤細胞株。該細胞株在HAT培養基(內含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)中生長良好，而骨髓瘤細胞則在HAT培養基中不能生長。因為①缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶，不能利用次黃嘌呤合成嘌呤；②氨基喋呤可阻止細胞內噤噙和胸腺嘧啶的合成。經免疫的動力脾細胞，不能在體外增殖，但是能產生相應的特異抗體，可以與骨髓瘤細胞融合，并形成可分泌單克隆抗體的細胞株。操作過程，一般是先把骨髓瘤細胞和經免疫的脾細胞置在聚乙二醇(PEG)中進行融合，然后在HAT培養液中選擇培養，由此得到雜交瘤細胞，采用有限稀釋法，即能把產生單克隆抗體的雜交瘤細胞株篩選出來。該細胞再經人工培養，或注射到小鼠體內等亞克隆方法，即可得到單克隆抗體。在實驗中所證明的，本發明的全長ES312蛋白能被惡性瘧疾患者血清識別(代O.Ol)，也能被間日瘧患者血清識別。此外，本發明蛋白在免疫動物后獲得的多克隆抗血清也能夠有效識別多個天然蟲體蛋白，并可在體外有效地抑制惡性瘧原蟲的生長。因此，本發明還涉及ES312基因或其ES312蛋白在制備用于預防和治療瘧疾的免疫制劑中的應用。實施例1:抗惡性瘧原蟲多表位人工抗原蛋白ES312的基因合成與序列分析1、多表位人工抗原基因ES312的合成及其真核表達工程菌的構建選用惡性瘧原蟲不同生活時期的抗原CPE，MSA-2,RESA，EBA-175,LSA-1,CST3/CSP，MSP-1，AMA-1和MAg-l的14個表位，以人類密碼子的偏愛性進行設計表位相應的基因序列ES312，設計基因序列圖送至生物公司(上海生工)合成后(如圖1SEQIDNO:1所示)，經萬cJI和5aMH限制性內切酶雙酶切后，與真核表達載體質粒VR1012連接后(VR1012為w'c^公司的真核表達載體)，感受態轉化大腸桿菌SKS383菌株，在終濃度為25ng/ml卡那霉素抗性的培養基篩選后，獲得含重組質粒工程菌ES312-VR1012/SK383。該重組工程菌株已于2004年10月9日在中國科學院微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1230。2、多表位人工抗原基因ES312的序列分析針對ES312基因的基因序列進行分析，其具有975個堿基，其編碼的蛋白質含323個氨基酸(SEQIDNO:2)，其相對分子量約為65kDa。編碼ES312蛋白的表位類型分析，發現在ES312蛋白的上游存在多個連續兩個的B細胞表位與Th細胞表位連接的組裝方式(圖2A)。其氨基酸序列二級結構預測，亦發現序列上游存在有連續數個的轉角-螺旋結構(即Coil-Helix,CH)，如圖2B所示。實施例2:多表位人工抗原ES312蛋白與病人血清的識別實驗1、ES312-DS/BL21基因工程菌的構建與其編碼蛋白的表達純化將重組質粒VR1012-ES312的ES312基因片段經和II酶切后，連接到大腸桿菌表達載體pDS-ex(即由以下引物進行改造pET-30a載體獲得，N端與含有His位點序列融合p30aFl:5'-CGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGA-3'，p30aRl:3，TCGGGTCTGGACATGCTGCTGCTGCTGTTCCGGTACCG5,,p30aF2:5，CAAGGCCATGGC6GZ40i:GGATCCGAATTCGAGCTC3，，p30aR2:3，CTTAAGCTCGAGTGATCAGCTGTTCGAACTCTAGAGTGAGCTCGTGGT5，)，感受態轉化大腸桿菌BL21株，在終濃度為25嗎/ml卡那霉素抗性的培養基篩選后，獲得含重組質粒ES312-DS的原核表達工程菌ES312-DS/BL21。該重組工程菌株已于2004年10月9日在中國科學院微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1229。該重組工程菌株經37°CIPTG誘導3小時，得到ES312的融合重組蛋白(與His蛋白融合)，經特異吸附的鎳柱親和純化融合蛋白后，再由腸肽酶溶液過柱切割，最終獲得純化的ES312蛋白(圖3A)。具體步驟如下1)重組蛋白樣品準備a)在5mlLB培養基中接種含有表達目的蛋白的大腸桿菌工程菌，37"活化過夜。b)1/100接種量轉接到新鮮LB37。C培養到接近對數生長期，加終濃度為lmMIPTG誘導3小時。c)收集菌液4。C，5000rpmX5min。d)預冷的1XPBS重懸菌液，4"C，5000rpmX5min，去上清。e)加一定體積的預冷的1XPBS重懸菌液(每ml培養物加入50|4預冷的1XPBS)。f)冰上進行超聲波(電壓300V，10秒，間隔15秒，50次)。g)4°C，5000rpmX10min，上清轉入一新50ml離心管，重復一次。h)0.45Wn濾膜注射器過濾，上清可放-20。C保存備用。2)過柱前試劑準備儲存液(StockSolution)A(10X)200mMNaH2P04，5MNaCl.(13.8gNaH2P04，146.5gNaCl在500ml去離子水)儲存液(StockSolution)B(10X)200mMNa2HP04，5MNaCl.(14.2gNaH2P04，146.5gNaCl在500ml去離子水)Native結合緩沖液(50ml)2.9mlstocksolA(IX);47.1mlstocksolB(IX)調pH7.2—7.6SolA(1X)個，SolB(1X)|Native沖洗緩沖液(50ml)37mlstocksolA(IX);13mlstocksolB(IX)調p服.OSolA(1X)t,SolB(IX)4Native沖洗緩沖液(50ml)43.5mlstocksolA(IX);6.5mlstocksolB(IX)調pH5.5SolA(1X)t，SolB(1X)INativepH洗脫緩沖液(50ml)50mlstocksolA(IX)i周pH74.0SolA(IX)個，H3P04i回收柱床的處理自來水沖洗柱子，再蒸餾水洗凈，無水乙醇沖洗不掛壁，雙蒸水洗凈(一定去除乙醇干凈)，晾干。3)樣品過柱純化步驟a)0.5-lml重懸樹脂裝柱，垂直放置柱體靜置5-IO分鐘；b)7ml無菌去離子水過柱，輕柔避免氣泡，垂直放置柱體靜置5-10分鐘，放水,重復洗滌一次；c)7mlNative結合緩沖液洗滌柱子3次，并平衡柱子；d)加樣5ml細菌裂解液上柱；e)上下輕柔混勻Resin10分鐘，打開柱子閥門放掉液體；f)再加5ml細菌裂解液上柱，IO分鐘吸附，打開柱子閥門放掉液體；g)加4mlnative結合緩沖液輕柔混勻Resin2分鐘，打開柱子閥門放掉液體,重復一次。h)加4mlnative沖洗緩沖液(p朋.0)輕柔混勻Resin2分鐘，打開柱子閥門放掉液體，重復3次。i)加4mlnative沖洗緩沖液(Ph5.5)輕柔混勻Resin2分鐘，打開柱子閥門放掉液體，重復1次。j)加5mlnativepH洗脫緩沖液洗脫，lml分一管，待SDS-PAGE或濃度檢測。4)腸肽酶(Enterkinase)切割His融合蛋白按此酶的最適反應體系調整不同融合蛋白與腸肽酶的量，和改變25"C的不同作用時間。2、酶聯免疫吸附實驗ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)檢測ES312蛋白與病人血清的識別實驗1)包被根據所應用的抗原，用pH9.6的0.1M碳酸鹽包被緩沖液稀釋至所需的蛋白質濃度(200ng/100ul/孔)用加樣器每孔加入100ul，然后將平板置濕盒中，4。C過夜，或37。C4h，將平板小孔中液體傾盡，用PBST洗板5次。2)封閉每孔200ul1%BSA，37°Clh。3)用PBST洗板5次。4)加入一抗即病人和正常人血清將待檢血清用PBS溶液作以1:200稀釋，每孔100ul稀釋血清，4t:過夜5)PBST洗板5次。6)加入辣根過氧化物酶標記抗體即羊抗兔IgG-服P:每孔中加入100ul經PBST稀釋過的(1:1000)酶標抗體，置濕盒中37。C溫育2h。7)PBST洗板5次。8)顯色。每孔加入底物顯色緩沖液100ul，放入濕盒中，搖動，37t:溫育10min。9)利用LabsystemsGenesisV3.03系統(WellsacnMK3，LabsystemsDragon，USA)，讀取450nm吸光度值。10)利用生物統計學工具分析實驗結果，確定病人和正常人血清對重組蛋白的識別程度。(底物用顯色緩沖液(pH5.0)A液檸檬酸(無水)1.92g加DDW到100ml。B液Na2HP0"含12個結晶水)7.16g加DDW到100ml。將A液2.43ml，B液2.57ml及水5ml混合即成pH5.O的磷酸一檸檬酸緩沖液10ml。顯色反應前新鮮配制30%過氧化氫0.015mlTMB0.004g加入到10ml磷酸—檸檬酸緩沖液中，既可用于顯色反應。)(雙樣本方差分析結果表明病人和正常人血清對ES312蛋白的識別差異極其顯著，如圖3B)實施例3:多表位人工抗原ES312蛋白的多克隆抗血清對合成肽和天然蟲體蛋白的識別1.鼠抗血清的制備用實施例1中所得的重組質粒ES312-VR1012進行大提質粒DNA(詳細方法見Promega公司質粒大提試劑盒)。以生理鹽水將重組質粒稀釋成濃度為100yg/100ul的溶液進行肌肉注射的方法免疫Balb/c小鼠，每兩周加強一次，共加強2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。用實施例2中所得的表達蛋白ES312結合弗氏佐劑(Gibco公司)皮下免疫Balb/c小鼠，以磷酸鹽緩沖液稀釋，每次50pg/100ul的劑量進行免疫，第一次為完全弗氏佐劑，接下來為不完全弗氏佐劑，每兩周加強一次，共加強2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。2.兔抗血清的制備及其IgG抗體純化用實施例1中所得的重組質粒VR1012-ES312免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗血清。以生理鹽水將重組質粒稀釋成濃度為500yg/2ml的溶液進行肌肉注射的方法免疫大白兔，每兩周加強一次，共加強2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。用實施例2中所得的表達蛋白ES312結合弗氏佐劑(Gibco公司)皮下免疫大白兔，以磷酸鹽緩沖液稀釋，每次100yg/lml的劑量進行免疫，第一次為完全弗氏佐劑，接下來為不完全弗氏佐劑，每兩周加強一次，共加強2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。兔抗血清IgG用蛋白A親合層析純化(實驗步驟詳見pierce公司I腿unoPureImmobilizedProteinA試齊U盒產品說明)。3.酶聯免疫吸附實驗ELISA檢測多克隆抗血清與不同表位合成肽的識別具體實驗步驟同實施例2，其中包被抗原改為200ng/100ul/孔的合成肽。一抗分別為DNA免疫(或蛋白免疫)的鼠抗血清或兔抗血清，所得的抗體滴度為0D值大于3倍SD+對照0D值相應的抗體稀釋度。結果發現，無論是DNA免疫，還是蛋白免疫的鼠抗血清或兔抗血清，對包括的ll個表位合成肽均有較高的識別滴度，但同時我們亦發現，對于不包括的表位E8、E12和E13同樣也存在較高的識別滴度(如表1)。表l表位特異的抗體反應_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注意事項*在多表位抗原中沒有表位。El，E2至E14表位分別來自尸/a訓oc/Z"/n/ato》ar,娜原NKND,MSA-2，RESA,EBA-175,MSA-1，LSA-1，CST3/CSP，MSP-1，MSP-l,AMA-1，AMA-1AMA-l,MSP-1和MAg-l。4.免疫共沉淀檢測ES312蛋白的特異兔抗IgG抗體對天然蟲體蛋白的識別惡性瘧原蟲天然蛋白的提取1)10%惡性瘧感染紅細胞，用PBS洗滌后2X皂素處理，1800rpm離心。2)沉淀中加入100y1NETT(150mMNaCl，5mMEDTA，l%TritonX-100，50mMTris-HC1)和10p1proteaseinhibitorcocktail。3)用25G針頭重懸沉淀并反復抽吸20次，直至沉淀溶解。4)12000g，4。C離心7分鐘。5)上清轉入一個新管中，-2(TC貯存備用.免疫共沉淀實驗步驟1)用稀釋緩沖液調節每管抗原的體積至lml，加入50ul的蛋白A懸液，4"C緩慢滾動卜3小時；2)12，000g離心20秒，轉移上清至一新管；3)在上清中加入鼠抗血清(lyg/ixl)lul，4。C緩慢滾動l小時；4)在以上混合物中加入蛋白A50y1，4。C緩慢滾動過夜；5)12，000g離心20秒，輕輕移走上清，收集蛋白A;6)加入lml洗液l，重懸蛋白珠，4"緩慢滾動20分鐘；7)重復上述三步一次；8)如前收集蛋白珠，加入lml洗液2，重懸蛋白珠，4X:緩慢滾動20分鐘；9)重復上述操作一次；10)加入lml洗液3,重懸蛋白珠，4。C緩慢滾動20分鐘；11)收集蛋白珠，盡量移走痕跡量的洗液；12)加入25-75u1的上樣緩沖液；10(TC變性3分鐘，13)12，000g離心20秒，轉移上清至一新管；14)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。(結果如圖4A所示)。5.免疫透射電鏡檢測ES312蛋白的特異兔抗IgG抗體對天然蟲體蛋白的識別試劑準備1%多聚甲醛，0.2Q/q戊二酵的PBS固定液封閉液[1XPBS中含1%白蛋白和0.01%Tween-20]注應越干凈越好(超純水抽濾級)。樣品的固定較高瘧原蟲感染率(>8%)，多為大滋養體，2000rpmX10min離心，1XPBS洗幾遍，最后一次去上清，加lml固定液室溫30分鐘，送去切片。實驗步驟1)切好的片子用封閉液室溫孵育30分鐘；2)加一抗室溫孵育2小時(用封閉液稀釋不同濃度)；3)用PBS洗5次(每次5分鐘);4)加金顆粒標記的二抗，室溫孵育l小時(用封閉液稀釋)；5)PBS洗5次(每次5分鐘)；6)送電鏡下觀察。(結果如圖4B所示)。實施例4多表位人工抗原疫苗效果的驗證1、抗ES312抗原的兔多克隆抗體IgG的分離純化溶液配制飽和硫酸銨，(SAS)在900ml水中加入L21gTris堿，調校pH7.0，并定容終體積至IIL，配制成O.OlMTrisCl溶液。稱量767g(NH》2S04，通過攪拌和稍微加熱將其溶于1L0.OlMTrisCl中,調校至pH7.0，并于4。C貯存。在4"C貯存時應可見瓶底出現(NH4)2S04晶體。33。/。SAS溶液33mlSAS加67mlPBS，pH7.00.1MTOA液3.02gNaH2P042仏0溶于去離子水中配制成0.2MNaH2P04溶液。B液:35.85gNa2HP0412H20溶于500ml去離子水中。取A液92ml，B液305ml添加去離子水配制成400ml0.1MpH7.3的PB貯存液。0.OIMPB將O.IMPB稀釋IO倍既成O.01MPB,pH7.0.05MPB將O.1MPB稀釋2倍既成0.OIMPB，pH7.3用硫酸銨沉淀IgG:a)l份血清+l份生理鹽水+l份飽和硫酸銨，4。C攪拌過夜，以形成沉淀；b)5000rpm離心10分鐘，用33MSAS溶液洗兩遍；c)用0.01M的PB補足原體積后，裝入透析袋(麗C012000)，4°CPB中透析2-3天，每天換3-4次透析液；d)離心10000rpmIO分鐘，留取上清備用。用鎳柱親合層析純化兔血清的IgG:材料預熱蛋白A，柱子，緩沖液至室溫。準備樣品(抗血清，腹水，組織培養上清。必須用結合緩沖液1:1稀釋，以保證結合時離子強度和pH值)。a)打開蛋白A柱子(注意，去頂蓋時避免應氣泡)，灌入貯存液。b)平衡蛋白A柱子(用5倍體積的結合緩沖液或合適的緩沖液，如lOmMTris.pH7.5)c)加2ml稀釋抗血清樣品每毫升膠(gel)至柱子，并讓液體流入gel至液面與topdisc相平為止。d)用10-15倍柱體積的結合緩沖液洗滌柱子。收集1或2ml洗滌液，檢測未結合部分的0D280值。e)用3-5倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫。(ImmunoPure洗脫緩沖液或0.1M氨基乙酸緩沖液pH2-3x洗脫結合蛋白可用0D280檢測洗脫結果。)注意應立即用合適的高濃度緩沖液，如1.0MTris.pH7.5.調蛋白洗脫液的物理pH值(lml樣品加100ul緩沖液)。f)洗脫免疫球蛋白部分可去鹽或濃縮。g)再生柱子用6倍柱體積洗脫緩沖液或0.1M檸檬酸pH3.0(用NaOH調)。2、對惡性瘧原蟲的體外抑制1)以兩次山梨醇同步化的惡性瘧原蟲3D7(保藏號MRA-102)禾口Dd2蟲株(保藏號MRA-150)(本實驗室保存的來自美國ATCC(theAmericanTypeCultureCollection)的標準菌株)環狀體期細胞作為實驗細胞；2)用正常人血細胞和1640培養液配制10%懸液，分裝于96孔板內，0.lml/孔(每孔血細胞含量最終為5%，Thiazole0range染色流式細胞儀檢測起始感染率為3%);3)分別加入含不同濃度純化兔抗IgG抗體包括抗ES312基因免疫-IgG;抗ES312蛋白免疫-IgG;抗ES312基因免疫免疫前-IgG;抗ES312蛋白免疫免疫前-IgG;空白PBS對照。(終濃度為50ul/ml，100ii1/ml,200y1/ml等)，每個濃度3個復孔，每孔100yl;4)過濾無菌純化兔抗IgG抗體；5)37。C正常蠟燭缸中培養48小時后，流式細胞儀計數104個細胞。生長抑制率按下列公式計算生長抑制率=(對照IgG組感染率-待測IgG組感染率)/(對照IgG組感染率-起始背景感染率)X100%。數據由SPSS軟件計算平均值及標準差，并進行統計學分析。經數次實驗重復結果顯示了，抗ES312基因免疫或蛋白免疫的IgG在200u1/ml終濃度時對惡性瘧原蟲3D7或Dd2蟲株的生長抑制率可達90%以上(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>序列表<110>中國醫學科學院基礎醫學研究所<120>—種新的抗惡性瘧原蟲表位以及含有它的疫苗<130><160>2'<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211>975<212〉匿<213>人工合成<400〉1atggaattcggatcaaacaagaacgacaacaagaacgacggatcaggcaacgccgagaag60tacgacaagatggacgagccgcagcactacggcaagagcggatcagagcagcagagcgac120ctggagcaggagcgcctggccaaggagaagctgcagggccccggccccggatcaggcaac180gccgagaagtacgacaagatggacgagccgcagcactacggcaagagcggatcaaagaac240gagagcaagtacagcaacaccttcatcaacaacgcctacaacatgagcatccgccgcagc300atgggccccggccccggatcacagaccgacgagatcaagaacgaccacatccagaccgat360gaaattaaaaatgataatattggatcagaggagaacgtggagcacgacgccggatcagag420cgcgaggacgagcgcaccctgaccaaggagtacgaggacatcgtgctgaagggccccggc480cccggatcagacggcaactgcgaggacatcccgcacgtgaacgagttcagcgccatcgac540gcgtgttcaacgtgggccccacgagccgcagcactacggc151015AsnAlaGluLysTyrAspLysMetAspGluProGinHisTyrGlyLys202530SerGlySerGluGinGinSerAspLeuGluGinGluArgLeuAlaLys354045GluLysLeuGinGlyProGlyProGlySerGlyAsnAlaGluLysTyr505560AspLysMetAspGluProGinHisTyrGlyLysSerGlySerLysAsn600660ctgggatcaaagaagatcgccaagatggagaaggccagcaggccccggatcaggcaacgccgagaagtacgacaagatggaagagcggatcacagaccgacgagatcaagaacgaccacatccagaccgatgaaattaaa720aatgataatattgaggacagcggcagcaacggcaagaagatcacctgcgagtgcaccaag780ccggacagcggatcaaacaagaacgacaacaagaacgacggatcagacggcaactgcgag840gacatcccgcacgtgaacgagttcagcgccatcgacctgggatcactggacaacatcaag900gacaacgtgggcaagatggaggactacatcaagaagaacaagaagggccccggccccgga960tccgctagctaataa975<210>2<211〉323<212〉PRT<213>大腸桿菌<400>2MetGluPheGlySerAsnLysAsnAspAsnLysAsnAspGlySerGly65707580GluSerLysTyrSerAsnThrPhelieAsnAsnAlaTyrAsnMetSer859095lieArgArgSerMetGlyProGlyProGlySerGinThrAspGlulie100105110LysAsnAspHislieGinThrAspGlulieLysAsnAspAsnlieGly115120125SerGluGluAsnValGluHisAspAlaGlySerGluArgGluAspGlu130135140ArgThrLeuThrLysGluTyrGluAsplieValLeuLysGlyProGly145150155160ProGlySerAspGlyAsnCysGluAsplieProHisValAsnGluPhe165170175SerAlalieAspLeuGlySerLysLyslieAlaLysMetGluLysAla180185190SerSerValPheAsnValGlyProGlyProGlySerGlyAsnAlaGlu195200205LysTyrAspLysMetAspGluProGinHisTyrGlyLysSerGlySer210215220GinThrAspGlulieLysAsnAspHislieGinThrAspGlulieLys225230235240AsnAspAsnlieGluAspSerGlySerAsnGlyLysLyslieThrCys245250255GluCysThrLysProAspSerGlySerAsnLysAsnAspAsnLysAsn260265270AspGlySerAspGlyAsnCysGluAsplieProHisValAsnGluPhe275280285SerAlalieAspLeuGlySerLeuAspAsnlieLysAspAsnValGly290295300LysMetGluAspTyrlieLysLysAsnLysLysGlyProGlyProGly305310315320SerAlaSer權利要求1、一種多核苷酸，它具有SEQIDNO1所示的堿基序列。2、一種多肽，它具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3、含有權利要求l所述的多核苷酸的載體。4、含有權利要求3所述的載體的大腸桿菌。5、如權利要求4所述的大腸桿菌，其是于2004年10月9日在中國科學院微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC1229的大腸桿菌。6、一種疫苗，其特征在于它含有權利要求l所述的多核苷酸或權利要求2所述的多肽。7、對權利要求l所述的堿基序列特異的抗體。8、對權利要求2所述的多肽特異的抗體。9、如權利要求l所述的多核苷酸用于制備抗惡性瘧原蟲感染的疫苗中的用途。10、如權利要求l所述的多核苷酸免疫機體產生的抗體用于制備抗惡性瘧原蟲感染的免疫制劑中的用途。11、如權利要求2所述的多肽用于制備抗惡性瘧原蟲感染的疫苗中的用途。12、如權利要求2所述的多肽免疫機體產生的抗體用于制備抗惡性瘧原蟲感染的免疫制劑中的用途。全文摘要本發明涉及生物醫學高技術中的基因的開發與應用領域。具體而言，本發明涉及一種能被惡性瘧疾患者血清識別的具有多個表位的人工抗原的氨基酸序列以及編碼所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。本發明還涉及含有所述的氨基酸序列或所述的多核苷酸序列的疫苗。本發明進一步涉及所述的人工抗原在用于制備抗惡性瘧原蟲感染的免疫抑制劑中的應用。文檔編號C07K16/20GK101298615SQ20041008098公開日2008年11月5日申請日期2004年10月26日優先權日2004年10月26日發明者恒王,蔡啟良申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所