一種基因敲除瘧原蟲的建立方法
【專利摘要】本發明涉及基因敲除技術，尤指一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，具體包括以下步驟：(a)構建線性化的基因敲除質粒；(b)瘧原蟲成熟裂殖體的培養；(c)基因敲除質粒(線性化)轉染；(d)基因敲除瘧原蟲的鑒定。本發明采用基于PCR方法的三步法擴增獲得線性化的基因敲除質粒，比傳統的酶切連接方法更快速，尤其是對質粒中多片段的插入更有優勢。本發明的轉染技術，高效、省時，轉染效率可達到10-2-10-3。
【專利說明】一種基因敲除瘧原蟲的建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因敲除技術，尤指一種基因敲除瘧原蟲的建立方法。
【背景技術】
[0002]據估計，全球每年約有3億人感染瘧原蟲，100萬以上的患者死于瘧疾。由于受媒介按蚊對殺蟲劑的抗性、瘧原蟲對抗瘧藥耐藥性以及人口流動等社會因素的影響，全球性瘧疾控制計劃實施40年后的今天又面臨著新的挑戰。減毒的瘧原蟲作為一種有效的瘧疾預防性疫苗日益受到重視而傳統的放射方法制備的減毒蟲株因存在放射劑量不好控制，瘧原蟲子孢子需求量大，方法不穩定等缺點而受到限制。
【發明內容】
[0003]為解決上述技術問題，本發明提供一種基因敲除瘧原蟲的建立方法。
[0004]本發明是一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，包括以下步驟:
[0005](a)構建線性化的基因敲除質粒；
[0006](b)瘧原蟲成熟裂殖體的培養；
[0007](c)基因敲除質粒(線性化)轉染；
[0008](d)基因敲除痕原蟲的鑒定。
[0009]所述步驟(a)采用基于PCR方法的三步法擴增獲得線性化的基因敲除質粒:
[0010]第一步:根據目的基因的序列，設計兩對引物，分別為Pi/Pii或者Piii/Piv，分別從瘧原蟲的DNA中同源擴增出目的基因的5’和3’端大約500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在設計時在5’端分別加入EcoR V和Not I酶切位點，引物Pii和Piii在設計時在5’端引入與篩選標記序列互補的23bp核苷酸；
[0011]第二步:將第一步的產物和含有選擇標記dihydrofolatereductase-thymidylatesynthase, hdhfr或者二氫葉酸還原酶的線性化質粒混勻后,加入引物Pi和hDHFR反向引物進行PCR擴增，獲得線性化的同源重組質粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv進行PCR擴增，獲得線性化的同源重組質粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之間設計20個同源序列；
[0012]第三步:以第二步擴增得到的兩種產物為模板，加入引物Pi和Piv進行PCR擴增，得到完整的線性化的基因敲除質粒。
[0013]PCR體系:主要成分包括線性化的包含hDHFR的質粒DNA，50ng PCR I產物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR擴增條件:95°C 2min，35個循環，68°C延伸，延伸時間依據需要拼接的兩片段長度之和計算，lkb/min ;模板濃度為50ng，引物濃度應按IOpmol進行稀釋一般稀釋1/4獲得較特異的擴增產物。
[0014]所述步驟(b)包括如下步驟:
[0015]第一步、常規腹腔注射感染鼠瘧原蟲17XL、17XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原蟲血癥達到20%左右；[0016]第二步、摘眼球取感染瘧原蟲血，大約5-10 X IO7感染紅細胞加入到IOml含20%FCS的RPMI1640完全培養基中，所述完全培養基中含25mM Hepes, 40IUheparin, 50IUml-l,300g(1400rpm) X8min離心后沉淀用150ml RPMI1640完全培養基重懸，置37°C孵箱中培養，孵箱中的混合氣體:10%的02，5%的C02，85%的N2 ；
[0017]第三步、在培養12h后，取35ml加置IOml用60 % Nycodenz/PBS配制的梯離液的表面，300g(1400rpm) X25min離心，收集位于界面的裂殖體，加培養基重懸后，200g (1000rpm) X8min 離心洗滌，大約 100 μ I 沉淀用 300 μ I 含 0.2mM CaCl2 的 PBS 重懸，
并計算裂殖體的數量。
[0018]所述步驟(C)包括如下步驟:5ml感染瘧原蟲的紅細胞進行12小時的培養使瘧原蟲生長同步，用裂殖體進行電轉，電轉用T細胞緩沖液中程序U33，將得到的產物從尾部靜脈注射感染小鼠，瘧原蟲復制一個周期后，飲水中加入藥物處理5-6天。
[0019]所述一個周期的時間為24-30小時。
[0020]所述藥物為乙胺嘧啶藥物，所述乙胺嘧啶藥物的配制方法為:首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用IM HCl調節到ρΗ3.5-5的水稀釋到100倍。
[0021]所述步驟(d)包括如下步驟:在目的基因中間設計一對引物，正向引物b和反向引物c ;5’ UTR設計正向引物a ;3’ UTR設計反向引物d，若是敲除成功，野生型應用引物對a/c和b/d應能擴增出特異片段，而基因敲除型則不能。
[0022]本發明的有益技術效果在于:通過基因敲除的方法制備的減毒蟲株瘧原蟲子孢子的需求量遠少于放射減毒方法，而且遺傳性狀更穩定。本發明采用基于PCR方法的三步法擴增獲得線性化的基因敲除質粒，比傳統的酶切連接方法更快速，尤其是對質粒中多片段的插入更有優勢。本發明的轉染技術，高效、省時，轉染效率可達到10-2-10-3。
【專利附圖】
【附圖說明】`
[0023]圖1:基因敲除或轉基因痕原蟲原理。
[0024]圖2:基于PCR方法的三步法擴增獲得線性化的同源重組質粒流程示意圖。
[0025]圖3:基因敲除質粒的轉染流程。
[0026]圖4:基因敲除痕原蟲克隆的鑒定和篩選的不意圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖和實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0028]本發明是一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，所依據的基本理論是基因敲除或轉基因痕原蟲(knock-out OR knock-1n)原理:利用基因同源重組,包括單次雜交(homologoussingle cross-over)和兩次雜交(homologous doublecross-over),完成目的基因的插入、替換和缺失，如圖1所示。
[0029]本發明一種基因敲除瘧原蟲的建立方法包括以下步驟:
[0030](a)構建線性化的基因敲除質粒；
[0031](b)瘧原蟲成熟裂殖體的培養；
[0032](C)基因敲除質粒(線性化)轉染；[0033](d)基因敲除瘧原蟲的鑒定。
[0034]如圖2所示，所述步驟(a)采用基于PCR方法的三步法擴增獲得線性化的同源重組質粒:
[0035]第一步:根據目的基因的序列，設計兩對引物，分別為Pi/Pii或者Piii/Piv，分別從瘧原蟲的DNA中同源擴增出目的基因的5’和3’端大約500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在設計時在5’端分別加入EcoR V和Not I酶切位點，引物Pii和Piii在設計時在5’端引入與篩選標記序列互補的23bp核苷酸；
[0036]第二步:將第一步的產物和含有選擇標記hdhfr或者二氫葉酸還原酶的線性化質粒混勻后，加入引物Pi和hDHFR反向引物進行PCR擴增，獲得線性化的同源重組質粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv進行PCR擴增，獲得線性化的同源重組質粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之間設計20個同源序列；
[0037]第三步:以第二步擴增得到的兩種產物為模板，加入引物Pi和Piv進行PCR擴增，得到完整的線性化的基因敲除質粒。
[0038]PCR體系:主要成分包括線性化的包含hDHFR的質粒DNA，50ng PCRI產物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR擴增條件:95°C 2min，35個循環，68°C延伸，延伸時間依據需要拼接的兩片段長度之和計算lkb/min ;模板濃度為50ng，引物濃度應按IOpmol進行稀釋一般稀釋1/4獲得較特異的擴增產物。需要注意的是:引物濃度不能按太高否則容易出現非特異性擴增，模版的濃度一般控制在50ng左右可以得到較特異的擴增產物。
[0039]在上述步驟中 所需主要試劑:
[0040]1、pDEFhDHPEA ;2、Advantage 2 Polymerase Mix ;3、引物 Pi/Pii&Piii/Piv，hDHFR正向和反向引物；4、限制性內切酶Scal ;5、篩選藥物乙胺嘧唳(pyrimethamine)或WR99210
[0041]上述步驟獲得線性化的同源重組質粒:比傳統的酶切連接方法更快速，尤其是對質粒中多片段的插入更有優勢。
[0042]所述步驟(b)包括如下步驟:
[0043]第一步、常規腹腔注射感染鼠瘧原蟲17XL、17XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原蟲血癥達到20%左右；
[0044]第二步、摘眼球取感染瘧原蟲血，大約5-10 X IO7感染紅細胞加入到IOml含20%FCS的RPMI1640完全培養基中，所述完全培養基中含25mM Hepes, 40IUheparin, 50IUml-l,300g(1400rpm) X8min離心后沉淀用150mlRPMI1640完全培養基重懸，置37°C孵箱中培養，孵箱中的混合氣體:10%的02，5%的C02，85%的N2 ;
[0045]第三步、在培養12h后，取35ml加置IOml用60 % Nycodenz/PBS配制的梯離液的表面，300g(1400rpm) X25min離心，收集位于界面的裂殖體，加培養基重懸后，200g (1000rpm) X8min 離心洗滌，大約 100 μ I 沉淀用 300 μ I 含 0.2mM CaCl2 的 PBS 重懸，
并計算裂殖體的數量。
[0046]如圖3所示,所述步驟(C)包括如下步驟:5ml感染痕原蟲的紅細胞進行12小時的培養使瘧原蟲生長同步，用裂殖體進行電轉，電轉用T細胞緩沖液中程序U 33，將得到的產物從尾部靜脈注射感染小鼠，瘧原蟲復制一個周期后，飲水中加入藥物處理5-6天，具體根據陰性對照(未轉染瘧原蟲感染小鼠)的原蟲血癥歸零的時間進行調整。[0047]所述一個周期的時間為24-30小時。
[0048]所述藥物為乙胺嘧啶藥物，所述乙胺嘧啶藥物的配制方法為:首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用IM HCl調節到ρΗ3.5-5的水稀釋到100倍。
[0049]如圖4所示，所述步驟(d)包括如下步驟:在目的基因中間設計一對引物，正向引物b和反向引物c ;5’ UTR設計正向引物a ;3’ UTR設計反向引物d，若是敲除成功，野生型應用引物對a/c和b/d應能擴增出特異片段，而基因敲除型則不能。
[0050]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范 圍。
【權利要求】
1.一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)構建線性化的基因敲除質粒； (b)瘧原蟲成熟裂殖體的培養； (C)基因敲除質粒(線性化)轉染； (d)基因敲除瘧原蟲的鑒定。
2.根據權利要求1所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于， 所述步驟(a)采用基于PCR方法的三步法擴增獲得線性化的基因敲除質粒: 第一步:根據目的基因的序列，設計兩對引物，分別為Pi/Pii或者Piii/Piv，分別從瘧原蟲的DNA中同源擴增出目的基因的5’和3’端大約500bp左右片段；其中引物Pi和Piv在設計時在5’端分別加入EcoR V和Not I酶切位點，引物Pii和Piii在設計時在5’端引入與篩選標記序列互補的23bp核苷酸； 第二步:將第一步的產物和含有選擇標記hdhfr或者二氫葉酸還原酶的線性化質粒混勻后，加入引物Pi和hDHFR反向引物進行PCR擴增，獲得線性化的同源重組質粒前半段，加入hDHFR正向引物和Piv進行PCR擴增，獲得線性化的同源重組質粒的后半段，其中hDHFR的正向和反向引物之間設計20個同源序列； 第三步:以第二步擴增得到的兩種產物為模板，加入引物Pi和Piv進行PCR擴增，得到完整的線性化的基因敲除質粒。
3.根據權利要求2所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，PCR體系:主要成分包括線性化的包含hD HFR的質粒DNA，50ng PCR I產物和高保真DNA聚合酶混合物；PCR擴增條件:95°C 2min，35個循環，68°C延伸，延伸時間依據需要拼接的兩片段長度之和計算，lkb/min ;模板濃度為50ng,引物濃度應按IOpmol進行稀釋一般稀釋1/4獲得較特異的擴增產物。
4.根據權利要求1所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，所述步驟(b)包括如下步驟: 第一步、常規腹腔注射感染鼠瘧原蟲17XLU7XNL或265BY，17XL和265BY能在感染后5天原蟲血癥達到20%左右； 第二步、摘眼球取感染瘧原蟲血，大約5-10X IO7感染紅細胞加入到IOml含20% FCS的RPMI1640完全培養基中，所述完全培養基中含25mM Hepes, 40IUheparin, 50IU ml-1,300g(1400rpm) X8min離心后，沉淀用150ml RPMI1640完全培養基重懸，置37°C孵箱中培養，孵箱中的混合氣體:10%的02，5%的C02，85%的N2 ; 第三步、在培養12h后，取35ml加置IOml用60 % Nycodenz/PBS配制的梯離液的表面，300g (1400rpm) X 25mi η離心，收集位于界面的裂殖體，加培養基重懸后，200g (1000rpm) X8min 離心洗滌，大約 100 μ I 沉淀用 300 μ I 含 0.2mM CaCl2 的 PBS 重懸，并計算裂殖體的數量。
5.根據權利要求1所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，所述步驟(c)包括如下步驟:5ml感染瘧原蟲的紅細胞進行12小時的培養使瘧原蟲生長同步，用裂殖體進行電轉，電轉用T細胞緩沖液中程序U33，將得到的產物從尾部靜脈注射感染小鼠，瘧原蟲復制一個周期后，飲水中加入藥物處理5-6天。
6.根據權利要求6所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，所述一個周期的時間為24-30小時。
7.根據權利要求6所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，所述藥物為乙胺嘧啶藥物，所述乙胺嘧啶藥物的配制方法為:首先用DMSO溶解至7mg/ml，然后用IMHCl調節到pH 3.5-5的水稀釋到100倍。
8.根據權利要求1所述的一種基因敲除瘧原蟲的建立方法，其特征在于，所述步驟(d)包括如下步驟:在目的基因中間設計一對引物，正向引物b和反向引物c ;5’ UTR設計正向引物a;3’UTR設計反向引物d，若是敲除成功，野生型應用引物對a/c和b/d應能擴增出特異片段，而基因敲除型則·不能。
【文檔編號】C12R1/90GK103849641SQ201210595231
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月31日 優先權日:2012年12月31日
【發明者】劉權興, 譚章平, 戴紀剛, 徐文岳 申請人:徐文岳, 戴紀剛, 譚章平, 劉權興