對核黃素進行純化的方法

專利名稱：對核黃素進行純化的方法
技術領域：
本發明涉及對核黃素(維生素B2)進行純化的方法，所述方法特別適于去除伴隨核黃素晶體存在的DNA。
雖然人們過去通過合成來生產核黃素，但出于經濟上的原因，用于生產核黃素的現代技術是基于發酵技術的。此類方法具有如下共同特征通過微生物來生產核黃素，再通過連續的純化步驟，從含有核黃素的粗反應漿體(發酵培養液)中獲得純凈的產物。
用于生產核黃素的發酵方法是現有技術中已知的。在該方面可以參考，例如，Takata，Ryohei；Nagata，Toshiomi，Shimamoto，Sumio；Solubility ofriboflavin obtained from cultured Eremothecium ashbyii(1949)27，pp.8-10and50-52；Sen Gupta，S.B.；Gupta，H N；Solubility of riboflavin(vitamin B2)inwater；J.Proc.Inst.Chemists(India)(1949)21，pp.1-4；Chemical Engineering，April 2002，p.23；van Loon R.P.G.M.et al.；Development of a FermentationProcess for the Manufacture of riboflavin；Chimia 50(1996)No.9 pp.410-412；EP-A 428 767；EP-A 464 582 and DE-A 2 920 592。
在發酵過程期間，發酵罐中核黃素的濃度穩定增加。但是，核黃素在水溶液中的溶解度相當低；在中性水溶液中，30℃至50℃的溫度下，溶解度已被報道為大約0.014％wt.-％至0.031wt.-％。因此，發酵過程中達到一定程度的過飽和后，核黃素就自發開始結晶。在發酵過程期間一旦形成了最初的微晶，通過連續發酵產生的核黃素就會連續結晶，直到發酵過程結束。
通常，含有核黃素晶體的反應漿體(發酵培養液)被轉移至該過程的下游部分。在第一步中，通常對反應漿體進行巴氏滅菌，即，在酸性條件和升高的溫度下殺死微生物。在第二步中，通過傾析將大部分的生物物質從反應漿體中移出。在第三步中，對反應漿體進行酸化，將其加熱至高達95℃至115℃，以使殘余的雜質(例如，生物物質、蛋白質、脂類、DNA)分解，并將其去除至某一程度，因此純化了核黃素晶體。在酸處理期間，核黃素晶體的純度通常會從大約85wt.-％上升至96wt.-％。在第四步中，對經過酸化的反應漿體進行過濾及洗滌。可選的進一步的步驟包括純化步驟和/或配方步驟，以獲得最終的產品形式。
在純化步驟(第三步)中，僅能將脂類、蛋白質、DNA和其它有機及無機化合物去除至某一程度。已有報道說，通過加入2wt.-％的硫酸或另外的無機酸，并將反應漿體加熱至95℃至105℃范圍內的溫度，可獲得高達97wt.-％的純度。
但是，在現有技術的發酵方法中生產出的核黃素的質量并不令人滿意，因為產物中仍含有相當數量的雜質，特別是DNA。一方面，核黃素的純度應盡可能的高，尤其是用于制藥或營養用途的。但是，另一方面，純化方法又應該相當地簡單、有效、可定量并溫和(例如，核黃素不應被暴露給高溫達到一定的時間，以防止形成變質的產物)。
本發明的一個目的是提供比現有技術的方法更好的用于純化核黃素的方法。
該技術問題已被本專利權利要求的主題方案所解決，即通過對核黃素進行純化的方法解決，所述方法包括如下步驟(a)沉淀核黃素的第一種晶體形式(crystalline form)，(b)分離出核黃素的第一種晶體形式，(c)在能使稀釋的DNA分解的條件下，將核黃素的第一種晶體形式轉化為核黃素的第二種晶體形式，以及(d)分離出核黃素的第二種晶體形式，前提條件是在環境溫度下，核黃素的第一種晶體形式在熱力學上較之核黃素的第二種晶體形式較為不穩定。
術語“環境溫度”指平均室溫，優選地，23℃。
我們驚奇地發現，通過所述方法，核黃素晶體的DNA含量可被顯著降低，即，優選地，降低至低于傳統PCR分析的檢測極限(大約0.2ppb)的程度。
所述對核黃素進行純化的方法可在比不將核黃素的第一種晶體形式轉化為核黃素的第二種晶體形式的現有技術方法的條件更為溫和的條件(溫度、駐留時間、酸濃度等)下進行。
本發明基于如下意料之外的發現取決于發酵罐中的條件，發酵期間核黃素的結晶會導致不同的晶體形式(修飾型，modification)。對發酵培養液中核黃素晶體的分析表明，在一些批次中，沉淀出了脫水形式(即，脫水核黃素I)，而在其它批次中，則沉淀出了水合物(即，二水合核黃素)。在其它批次中，還發現了兩種晶體形式的混合物。在一些情況下甚至還鑒定出了第三種晶體形式(即四水合核黃素)。這些晶體形式，即水合核黃素和脫水核黃素是通過X-射線粉末衍射(XRD)和動態蒸氣吸附(DVS)分析出的。通過Raman光譜對不同晶體形式的溶解度進行了研究。DVS和XRD的組合使得可對水合物的形成加以研究。
已經發現，三種不同的脫水晶體修飾型(脫水核黃素I、II和III)與不同的水合核黃素(單水合核黃素、二水合核黃素和四水合核黃素)達成平衡。
取決于溫度，下述晶體形式與另一種之間互相達成平衡，或者在給定的條件(例如，溫度、濕度等)下互相不可逆轉化脫水核黃素I與二水合核黃素及四水合核黃素；脫水核黃素II與單水合核黃素及二水合核黃素；脫水核黃素III與四水合核黃素。
在23℃，關于脫水核黃素I和二水合核黃素的狀況可由下述方程式闡述 在23℃，脫水核黃素I和二水合核黃素之間的平衡完全轉移至脫水核黃素I這邊，即，在此溫度下，二水合核黃素不可逆地轉化為脫水核黃素I。因此，在23℃，不能從純的脫水核黃素I中獲得二水合核黃素。此外，在較高的溫度，例如39℃下，二水合核黃素在熱力學上也比脫水核黃素I更為不穩定。
在23℃，二水合核黃素向脫水核黃素I轉化的反應相當緩慢。在23℃的溫度下，對含有純二水合核黃素的漿體進行攪拌在11天內能得到向脫水核黃素I的部分轉化(80％)(由Raman光譜測定)。在39℃，溶解度或化學勢的差異很小。因此，在該溫度下，二水合核黃素向脫水核黃素I的轉化緩慢。
在更高的溫度下，脫水核黃素I和二水合核黃素化學勢之間的差異就增加了。因此，轉化過程的速率顯著提高，80℃下二水合核黃素在20秒之內即完全轉化為脫水核黃素I。
但是，在4℃，熱力學狀況有所不同。在水性漿體中，脫水核黃素I可被轉化為二水合核黃素，后者可不可逆地獲得自四水合核黃素(尤其是在較高的溫度下) 在4℃，脫水核黃素I向二水合核黃素的轉化非常緩慢。在4℃的溫度下，對僅含有脫水核黃素I的漿體進行攪拌在56天內才能得到脫水核黃素I向二水合核黃素的部分轉化(80％)。
對各晶體形式(特別是脫水核黃素I、二水合核黃素和四水合核黃素)的溶解度的研究，令人驚奇地揭示在低于約40℃時，溶解度曲線互相接近。在4℃至23℃之間的范圍內的某一溫度處，脫水核黃素I和二水合核黃素的晶體形式的Gibbs自由能(ΔG)相等。在所述溫度范圍內的某一溫度處，脫水核黃素I和二水合核黃素的溶解度曲線相交。在高于交點的溫度下，脫水核黃素I是熱力學上更穩定的晶體形式(較低的Gibbs自由能)；在低于該交點的溫度下，二水合核黃素是熱力學上更穩定的晶體形式。
在23℃，在脫水核黃素II和單水合核黃素及二水合核黃素之間還有一種平衡，該平衡取決于相對濕度。此外，同樣取決于相對濕度，在23℃，脫水核黃素III可以可逆轉化為四水合核黃素
核黃素的各晶體形式的性質，尤其是溶解度和自發結晶情況，都已被仔細地研究過了(見實施例1)。結果被概括于

圖1和圖2中。對二水合核黃素在44℃至52℃范圍內的溫度下的溶解度，和核黃素在44℃至59℃范圍內的溫度下的自發結晶情況進行了研究。將過飽和曲線外推至39℃顯示，脫水核黃素I和二水合核黃素的過飽和曲線彼此相當接近。在另一項實驗中，在69℃的溫度下，將核黃素以0.7g l-1的濃度溶解。在3小時內將溶液持續冷卻至39℃，得到脫水核黃素I晶體。在39℃，二水合核黃素在熱力學上比脫水核黃素I更不穩定。39℃時脫水核黃素I的過飽和曲線的位置可被估計為高于0.6g l-1。因此，在過飽和曲線和溶解曲線之間的亞穩定區，通過用目標晶體形式的晶種進行接種，有可能對核黃素晶體形式的形成加以控制。
圖A-F中展示了脫水核黃素I、脫水核黃素II、脫水核黃素III、單水合核黃素、二水合核黃素和四水合核黃素的晶體形式的粉末衍射圖。
關于晶體學領域的術語(例如，“晶體形式(crystalline form)”、“多態性(polymorphism)”、“多晶型體(polymorph)”等)，可參見，例如，Solid State Chemistry of Drugs；Stephen R.Byrn，Ralph R.Pfeiffer，Joseph G.StowellSSCI Inc.West Lafayette；1999。
脫水形式是不含結晶水的晶體形式，尤其是在不含水的大氣環境下。脫水核黃素I是圖A中由X射線衍射圖所表征的核黃素多晶型體。在水蒸氣下，脫水核黃素II與單水合核黃素和二水合核黃素達到平衡。在水蒸氣下，脫水核黃素II與四水合核黃素達到平衡。
水合物是含有結晶水的晶體形式。在水蒸氣下，單水合核黃素(參見圖D)與脫水核黃素II和二水合核黃素達到平衡。二水合核黃素由圖E中的X射線衍射圖所表征。在水蒸氣下，四水合核黃素(參見圖F)與脫水核黃素III達到平衡。
結晶核黃素的多種修飾型都是本領域現有技術中已知的。在此方面可以參見，例如EP-A 995 749、US 2,324,800、US 2,603,633、US2,797,215、US 4,687,847和International Center of Diffraction Data(2002JCPDS；PCPDFWIN v.2.2；Data submitted by Eli Lilly and Company，Indiana，USA，1995)。
在現有技術中，對結晶核黃素的各種晶體形式(修飾型)命名并不統一，下表中對不同的術語進行了概括
在根據本發明的方法的步驟(a)中，沉淀出了(即，結晶出了)核黃素的第一種晶體形式。優選地，步驟(a)從發酵罐中微生物產生的粗反應漿體(發酵培養液)開始進行。合適的微生物包括未經過遺傳修飾的生物(非GMO)和經過遺傳修飾的生物(GMO)。發酵過程可以連續進行或作為分批過程進行，后者是優選的。通常，發酵罐中含有的水的量不足以令全部量的核黃素產物溶解。因此，僅有在發酵過程最開始時獲得的核黃素的量保留于溶液中，但是在后續發酵期間，達到一定程度的過飽和時，核黃素就自發開始結晶。通常，結晶在發酵過程終止之前就能很好地初始化。因此，在該過程的終點，產物中的大部分都已以結晶核黃素的形式(核黃素的第一種晶體形式)沉淀，僅有相當少量的核黃素保留于溶液中。
本發明的方法要求在環境溫度(優選為23℃或更高)下，核黃素的第一種晶體形式在熱力學上比步驟(c)中產生的核黃素的第二種晶體形式更不穩定。這并不意味著步驟(a)本身必須在環境溫度下進行，此處的溫度僅定義了在何種條件下對核黃素的不同晶體形式的熱力學穩定性進行比較。優選地，步驟(a)在低于40℃的溫度下進行。
一方面，必須防止步驟(a)中沉淀出的核黃素的晶體形式是環境溫度下結晶核黃素在熱力學上最為穩定的形式，因為在那種情況下，就不可能有向環境溫度下熱力學上更為穩定的任何第二種晶體形式的轉化。另一方面，核黃素的第一種晶體形式應是在受控沉淀條件下可獲得的，并且應可經受發酵以及可選的后續巴氏滅菌步驟。展示出這些性質的任何晶體形式都能令核黃素被有效純化，尤其是令在步驟(c)中，核黃素晶體含有的DNA的濃度顯著降低。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(a)中沉淀出的核黃素的第一種晶體形式包含水合核黃素，優選是單水合核黃素、二水合核黃素或四水合核黃素。最優選地，步驟(a)中沉淀出的核黃素的第一種晶體形式是二水合核黃素。
取決于步驟(a)中的反應條件，從發酵培養液中自發沉淀出的核黃素的第一種晶體形式并不一定是人們想要的核黃素的第一種晶體形式。因此，可能必須要對步驟(a)沉淀出的(即，發酵過程中優先產生的)結晶核黃素的沉淀形式加以控制。
已令人驚奇地發現，在步驟(a)中，可通過具有某種晶體結構的晶種來初始化結晶過程，對人們想要的發酵罐中核黃素的第一種晶體形式的形成加以控制。向發酵培養液中加入合適的晶種能使得核黃素的特定的第一種晶體形式沉淀出來。因此，可以通過擇出的合適晶種，來沉淀出優選的核黃素的第一種晶體形式(例如，單水合核黃素、二水合核黃素或四水合核黃素)，優選地，二水合核黃素。
通過晶種(接種)來初始化結晶過程是已知技術，由此可對結晶形成的產物的形式加以影響。在此方面，可以參見，例如CrystallizationTechnology Handbook；A.Mersmann；Marcel Decker，Inc.；1995。
在根據本發明方法的一種優選的實施方式中，步驟(a)中核黃素的第一種晶體形式的沉淀是由晶種來初始化的，優選是由核黃素的晶種來初始化的。優選地，晶種包含水合核黃素的晶種，更優選地，單水合核黃素、二水合核黃素或四水合核黃素的晶種。最優選地，核黃素的晶種包含單水合核黃素。
優選地，步驟(a)中沉淀出的核黃素的第一種晶體形式是由合適的晶種獲得的二水合核黃素或四水合核黃素。優選地，核黃素的第一種晶體形式是二水合核黃素，其沉淀過程優選由單水合核黃素的晶種所控制。
已令人驚奇地發現，單水合核黃素的晶種適于沉淀二水合核黃素。當將單水合核黃素的晶種引入，令其與水接觸時，溶解于過飽和水溶液(發酵培養液)中的核黃素就立即以二水合核黃素的晶體形式沉淀。對晶體形式的本質的研究揭示，在水性分散體系中，結晶的單水合核黃素會迅速轉化為結晶的二水合核黃素。
在本發明的一種優選的實施方式中，在2-10小時后，優選地，4-7小時后，將晶種加入到發酵培養液中。優選地，用接種針將晶種從滅菌瓶轉移到發酵罐中。
用于制備結晶單水合核黃素的方法是現有技術中已知的(參見EP-A995749-修飾型B/C)。
可通過將單水合核黃素的晶種加入到核黃素的過飽和水溶液中來制備結晶的二水合核黃素，優選地，在5-8的pH值之間，更優選地，在6.5-7的pH之間。本發明的一個方面涉及二水合核黃素。本發明的另一方面涉及制備結晶的二水合核黃素的方法，其中，將結晶的單水合核黃素加入到核黃素的飽和水溶液中。
可通過在真空下、大約40℃下將核黃素水溶液中的水蒸發出去來制備四水合核黃素。為獲得起始材料，即，核黃素的水溶液，優選地，將脫水核黃素I以大約0.07g l-1的濃度懸浮于去離子水中(參見實施例6)。然后通過過濾器系統(包括帶有玻璃纖維的預過濾器和5μm Teflon過濾器的組合)將飽和溶液與未溶解的晶體分開。將核黃素的飽和水溶液連續加入到旋轉式蒸發器中含有的核黃素溶液中。同時，令水蒸發，優選地，在30至60℃之間的溫度下進行，尤其是35至45℃之間，并且在10至100mbar的真空下，優選在20至25mbar的真空下。優選地，水浴溫度不應超過40℃。將核黃素的溶液連續轉移至蒸發器的燒瓶中，而通過蒸發使燒瓶中的溶液體積保持恒定。結晶過程在某個點初始化。蒸發終止之后，對漿體進行過濾。可通過XRD來對四水合核黃素的濕晶體進行分析。本發明的一個方面涉及四水合核黃素。本發明的另一方面涉及制備四水合核黃素的方法，其中，在真空下、大約40℃的溫度下，從核黃素的溶液中蒸發出水，并同時將核黃素的飽和溶液加入到旋轉式蒸發器中。
下面描述了獲得用于步驟(a)中的結晶單水合、二水合和四水合核黃素或其它合適的核黃素晶體形式的適用晶種的進一步的方法。
在根據本發明的方法的步驟(a)中，成功沉淀出人們想要的核黃素的第一種晶體形式需要晶種是人們想要的晶體形式，優選地，單水合核黃素、二水合核黃素或四水合核黃素，更優選地，單水合核黃素或二水合核黃素。此外，晶種應當是經過滅菌的，不會導致外來生物對發酵過程的污染。
可在種子發酵罐或其它合適的反應器中來制備核黃素的晶種。作為起始材料被引入到種子發酵罐中的核黃素必須被完全稀釋。任何雜質，即任何不想要的晶體形式的未溶晶體，在本方法的步驟(a)中通常稍后將導致同樣的不想要的晶體形式沉淀，因此產生不想要的中間產物(即，核黃素的第一種晶體形式)。具體而言，晶種中脫水核黃素I的任何雜質都會不可避免地導致發酵過程中脫水核黃素I的沉淀，因此應加以避免。
在本發明的一種優選的實施方式中，核黃素的晶種以單水合核黃素的形式存在。制備方法優選從單水合核黃素開始(參見EP-A 995749)。然后，在2℃至40℃之間的溫度下，優選在10℃至20℃之間，在單水合核黃素會轉化為二水合核黃素的條件下，將單水合核黃素的晶體懸浮于水中。將晶體濾出，并進行干燥，以去除表面的水。將晶體碾碎增加比表面積，稍后在步驟(a)中其被引入到發酵培養液中之后，能使晶核形成速率更高。然后用純乙醇或乙醇與水的混合物來洗碾細的晶體。
優選地，在將其用于根據本發明的方法的步驟(a)之前，先對核黃素的晶種進行滅菌。優選地，通過蒸汽滅菌或通過溶劑(優選地，乙醇與水的混合物，最優選地，＞70％的乙醇與水的混合物)來對晶種進行滅菌。
在通過蒸汽對晶種進行滅菌的情況下，將單水合核黃素或二水合核黃素的干燥晶體轉移至封閉系統中。在該系統中，將晶體加熱至110℃至150℃之間的溫度，優選在120℃至140℃之間，優選進行大約30分鐘。在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，通過蒸汽和溫度(優選為120-140℃)來對水合核黃素晶種，更優選地，單水合核黃素或二水合核黃素晶種進行滅菌。已經令人驚奇地發現，在這些條件下，晶種的晶體形式并未改變。
另一種可能性是通過溶劑進行滅菌。第二種滅菌過程可通過加入溶劑，例如醇或酮來進行，其中，加入乙醇或甲醇是優選的。因為核黃素晶種實際上是不溶于溶劑的，從而會形成漿體，然后再將溶劑從中過濾去除。用滅菌水來洗滌濕的晶體，以去除殘留的溶劑。在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，通過乙醇和水的混合物，優選地，含有70vol.-％至90vol.-％乙醇的混合物來對水合核黃素晶種，更優選地，單水合核黃素或二水合核黃素的晶種進行滅菌。已經吃驚地發現，在上述條件下，晶種的晶體形式不會改變。
此時，新鮮制備好的核黃素的晶種即可用于根據本發明的方法的步驟(a)中。XRD顯示，滅菌之后晶體形式并未改變。已經出人意料地發現，滅菌晶種在室溫下于含有80％醇和20％水的溶液中是穩定的。但是，更高的醇濃度會導致晶體形式的變化。
在根據本發明的一種優選的實施方式中，將蒸汽滅菌和通過溶劑滅菌組合起來。優選地，通過溫度高于100℃的蒸汽，優選大約140℃的蒸汽在烘箱中持續大約50分鐘來對晶種進行滅菌。然后，將晶種懸浮于0-1000重量當量、優選為5-100重量當量的乙醇中，進行10至200分鐘，優選為20至40分鐘。在用于步驟(a)之前，優選地，將0-100體積當量的滅菌H2O加入，以能更好地對液體進行操作。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，晶種包含水合核黃素，尤其是單水合核黃素或二水合核黃素。優選地，當稀釋的核黃素的濃度超過了較好的可溶晶體形式(其可能是二水合核黃素(取決于溫度))的溶解度極限時，在步驟(a)將晶種加入到發酵培養液中。在二水合核黃素和脫水核黃素I的溶解度極限之上，存在脫水核黃素I的亞穩態區域。
脫水核黃素I的自發結晶并不發生。優選地，接種進行于36℃和43℃之間的溫度、發酵培養液中核黃素濃度為0.16g l-1至0.23g l-1的條件下。
在根據本發明的方法的步驟(b)中，分離出核黃素的第一種晶體形式。這意味著，當步驟(a)已經從發酵罐中含有的粗反應漿體開始進行時，優選地，生物物質中的大部分都被從反應漿體中移出。優選地，通過清洗來分離核黃素的第一種晶體形式，即，通過將上層物質與沉淀物分離(生物物質分離)。根據本發明的方法的步驟(b)通常不會導致純核黃素的分離。通常，經過分離的核黃素的第一種晶體形式仍含有雜質，其必須在后續純化步驟中被分離。本發明特別涉及對這些雜質的去除。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，對在步驟(a)中沉淀出的和在步驟(b)中分離出的第一種晶體形式進行巴氏滅菌，優選地，在步驟(b)之后，但是優選在步驟(c)之前進行。優選地，通過加熱核黃素的第一種晶體形式來進行巴氏滅菌，所述第一種晶體形式是在步驟(b)中較早時候與反應物中含有的生物物質的量中的大部分分離的。在一種優選的實施方式中，在40℃至80℃范圍內的溫度、優選從60至75℃范圍內的溫度下來進行巴氏滅菌。優選地，巴氏滅菌進行于酸性條件下。優選地，巴氏滅菌進行于低于6的pH值下，更優選地，低于4的pH下。可加入到核黃素的第一種晶體形式的水性懸浮液中的優選的酸是無機酸，優選地，硫酸或硝酸；或有機酸，優選地，羧酸，最優選地，蟻酸或草酸。
在根據本發明的方法的步驟(c)中，在能使稀釋的DNA分解的條件下，將核黃素的第一種晶體形式轉化為核黃素的第二種晶體形式。在環境溫度(優選為23℃)下，核黃素的第一種晶體形式在熱力學上不如核黃素的第二種晶體形式穩定，這是根據本發明的方法的必要特征。優選地，在高于環境溫度的溫度下，核黃素的第一種晶體形式在熱力學上也不如核黃素的第二種晶體形式穩定。
通過在發酵罐中使用經過遺傳修飾的微生物，發酵培養液中可存在有重組DNA(rDNA)。取決于最終產物所需要的規格，重組DNA需在下游期間，以及，尤其是純化步驟期間，被完全去除或分解。在本說明書中，術語“DNA”包括被包括于核黃素晶體中的、被吸附于核黃素晶體表面的以及與核黃素晶體接觸被穩定的任何類型的DNA(例如，天然的或重組DNA)。
可通過標準PCR(聚合酶鏈式反應)來監測核黃素產物中DNA的含量。現有技術中基于PCR的分析工具可被用于檢測給定的rDNA的序列(例如，含有200個堿基對的生產株(production strain)的DNA的特定序列)與色譜分析方法(例如，氣相或液相色譜)相比，PCR的靈敏度高若干數量級。檢測極限取決于多種參數，例如，循環的數量、引物的類型、聚合酶的種類等。關于伴隨結晶核黃素的給定序列的rDNA而言，PCR的特異性檢測極限是大約0.2ppb。在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，核黃素晶體中，具有給定長度的堿基對(bp)(優選地，50至10000bp，更優選地，100至1000bp，最優選地，大約200bp)的DNA的含量被降低到大約0.2ppb的檢測極限之下。
能使稀釋的DNA分解的條件是本領域內已知的。在高于10-4至10-3mol l-1的濃度的酸存在的情況下，在升高的溫度下，稀釋的DNA可被迅速地完全分解(參見，DNA的分解對pH值的依賴性展示于Lindahl T.andNyberg B.；Rate of Depurination of Native Deoxiribonucleic Acid；Biochemistry，11，19(1972)3610-3618中)。已有報道，60℃時，濃度為大約10-3mol l-1的檸檬酸能使DNA在一小時內分解(參見，Schriftenreihe des Fonds derChemischen Industrie zu Forderung der Chemie und Biologischen Chemie imVerband der Chemischen Industrie e.V.；60329 Frankfurt；Karlstrasse 21；Heft32.Informationsband″Sicherheitsforschung in der Biotechnologie″)。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(c)中能分解DNA的條件是酸性條件。優選地，通過將酸加入到含有0.5-50wt.-％，優選2-10wt.-％核黃素的水性漿體中懸浮的核黃素的第一種晶體形式中來獲得酸性條件。在一種優選的實施方式中，酸是選自由硫酸、硝酸、磷酸、氫氯酸、氫溴酸所組成的組的無機酸或選自由乙酸、蟻酸和草酸所組成的組的有機酸。優選地，水性漿體中的酸濃度應高于10-4mol-1，優選在10-4至10-1mol l-1之間，最優選為大約5×10-4mol l-1。優選地，水性漿體的pH值應低于6，更優選地，低于5，最優選地，低于4。
在根據本發明的方法的另一種優選的實施方式中，步驟(c)中能分解DNA的條件是堿性條件。優選地，通過將堿加入到含有0.5-50wt.-％，優選2-10wt.-％核黃素的水性漿體中懸浮的核黃素的第一種晶體形式中來獲得堿性條件。在一種優選的實施方式中，堿是選自由NaOH、KOH和Ca(OH)2所組成的組的無機堿。優選地，水性漿體中的堿濃度應高于10-4mol-1，優選在10-4至10-1mol l-1之間，最優選為大約5×10-4mol l-1。優選地，水性漿體的pH值應高于8，更優選地，高于9，最優選地，高于10。
理論上，當含有DNA分子的水溶液被暴露給能分解DNA的條件時，DNA鏈能被迅速分解。但是，如果DNA沒有完全溶解的話，例如，如果DNA被吸附到表面上或被包括于晶格(包藏，occlusion)中時，DNA的分解會受到抑制。
已有報道，DNA可被表面吸附或被穩定于表面上。已進行了研究，以對能吸附DNA的不同載體加以評估。需要有足夠強的吸附以抵抗原子力顯微鏡尖端(tip)的引力。吸附的性質和強度還取決于存在的離子。具體而言，二價陽離子，例如Mg2+和Ca2+會影響到穩定性(參見，Bezanilla etal.；Adsorption of DNA to Mica，Silylated Mica，and MineralsCharacterizationby Atomic Force Microscopy；Langmuir 11(1995)655-659)。其它研究揭示，被吸附于表面上的來自bacillus subtilis的DNA可被穩定至甚至能抵抗核酸酶攻擊的程度。穩定作用的程度受周圍環境組分的影響，例如，受一價或二價離子濃度的影響。低pH值看上去具有更強的穩定作用(參見，Khanna M.；Yoder M.；Calamay L.and Stotzky G.；X-ray diffractometry andelectron microscopy of DNA from Bacillus subtilis bound on clay minerals；Sciences of soils(1998)31)。
已令人驚奇地發現，對DNA雜質(尤其是伴隨核黃素晶體的rDNA)的分解很大程度上依賴于核黃素的晶體形式的性質。發酵期間沉淀出脫水核黃素I的情況下對rDNA的分解是特別困難的，但是如果發酵期間形成二水合核黃素的話，在下游過程中分解rDNA就相當迅速了。不希望受限于任何理論，假設從獲得的細胞中釋放出的rDNA與核黃素晶體在很大程度上相關。
核黃素的晶體形式的性質對下游純化方法的效率有著巨大的影響，尤其是影響將重組DNA分解至低于分析方法(例如PCR)的檢測極限的過程。具體而言，在對核黃素的純化期間，當在純化條件下由于核黃素的第一種晶體形式的轉化破壞了晶格時，伴隨核黃素晶體的重組DNA可被迅速分解。令人吃驚地發現了核黃素的新的晶體形式，即二水合核黃素。二水合核黃素優選形成于發酵過程期間，在純化期間其可轉化為環境溫度下熱力學上更加穩定的核黃素的第二種晶體形式。建立起必要的數據，以控制想要的晶體形式的形成。在現有技術中的方法中，晶體形式不會改變。基于這些發現，發現了用于純化核黃素的更為有效的新方法，尤其是關于從晶體中去除重組DNA的方面。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(a)中沉淀出的核黃素的第一種晶體形式是二水合核黃素。在步驟(b)中，分離出沉淀的二水合核黃素，優選地，通過傾析出生物物質中的大部分，以及，可選地，巴氏滅菌。現在已觀察到，當將分離出的結晶二水合核黃素懸浮于水中，并將漿體加熱至高于70℃的溫度，粘度就會顯著增加。高速攪拌數分鐘后，高粘度可被降低。
通過X射線粉末衍射可對下述問題加以驗證通過所述處理，結晶二水合核黃素轉化為脫水核黃素I。此外，晶體修飾型從短針(10至20μm)變為長針(50至200μm)。長針的形成導致粘度顯著增加。懸浮液中二水合核黃素的轉化的結果是晶格的完全破壞，其后立即發生核黃素分子重結晶為結晶脫水核黃素I的過程。雜質，尤其是DNA獲得釋放，并被完全釋出，被稀釋至周圍培養基中。存在有小量酸的情況下(優選地，pH低于4)，DNA在相當低的溫度下迅速分解，至低于傳統PCR的檢測極限；在50至70℃和低于4的pH下，10至30分鐘內，核黃素晶體中就檢測不到DNA，尤其是rDNA了。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(c)中核黃素的第一種晶體形式向核黃素的第二種晶體形式的轉化在升高的溫度下進行，優選在60℃至75℃之間的溫度，最優選在大約70℃。優選地，轉化進行于酸性條件下，最優選進行于低于4的pH下。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(c)進行于60℃至75℃之間的溫度下，其中使用(i)無機酸，優選為H2SO4、HNO3、HCl、HBr或H3PO4；或(ii)堿，優選為NaOH、KOH或Ca(OH)2；或(iii)有機酸，優選為蟻酸、乙酸、草酸或檸檬酸。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(c)中，含有核黃素的第一種晶體形式的水性漿體被轉移至裝備有葉輪攪拌器的反應器中。然后，優選地，加入足夠量的無機酸或有機酸。升高溫度，優選通過夾套設備(jacket)進行，優選將溫度升高至60℃至75℃之間，最優選為大約70℃。葉輪攪拌器的攪拌速度設定為大約500rpm。一旦粘度增加，攪拌速度也增加，優選至多達大約2000rpm，以使漿體重新液化。經過約20分鐘的處理之后，對漿體進行過濾，通過XRD來分析獲得的晶體，通過PCR來分析rDNA的含量。
或者，生物物質分離和巴氏滅菌之后，可對含有核黃素的第一種晶體形式的漿體進行酸化，并將其不斷泵入攪拌多級提取器(stirred multistageextractor)中。在攪拌多級提取器中的駐留時間(其優選為5至20分鐘)可被泵入速率所確定。優選地，提取器可被夾套設備加熱至大約70℃的理想溫度。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，步驟(c)中，在進入攪拌多級提取器之前，先通過熱交換器將含有核黃素的第一種晶體形式的漿體預熱至大約70℃。熱交換器能在數秒內加熱漿體。優選地，核黃素的第一種晶體形式被連續泵過熱交換器，以迅速獲得需要的溫度，并且，優選地，進一步被泵過裝備有夾套加熱的管和多級攪拌系統，以施加足夠高的剪切力。裝備有靜態混合器的反應器管也可代替攪拌多級提取器使用。
轉化期間，核黃素晶體溶解，由此釋放出晶體包括的或伴隨晶體的DNA分子。但是，溶解的核黃素立即重新結晶為核黃素的第二種晶體形式，環境溫度下(優選地，23℃或更高)其在熱力學上比核黃素的第一種晶體形式更為穩定。
相反，當對含有脫水核黃素I的漿體的相應發酵液體進行加熱時，沒有觀察到粘度上的變化。由X射線衍射所確定的結晶結構沒有改變。因此，沒有誘導出晶體形式的轉化，也沒有伴隨核黃素的DNA被釋放到溶液中。對脫水核黃素I而言，只有通過將漿體完全稀釋于溶劑或酸化的水中才能釋放出DNA。但是，在這些條件下，只有通過在高于95℃的溫度下對核黃素漿體進行超過12小時的處理(或分別地，高于100℃，超過6小時；或高于120℃，超過2小時)才能使DNA分解至低于PCR檢測極限的程度。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，核黃素的第一種晶體形式是水合核黃素，優選地，二水合核黃素，核黃素的第二種晶體形式是脫水核黃素I。優選地，步驟(a)中核黃素的第一種晶體形式的沉淀是通過加入晶種來控制的，更優選地，通過水合核黃素的晶種，最優選地，通過單水合核黃素的晶種或二水合核黃素的晶種。
在根據本發明的方法的一種優選的實施方式中，在步驟(a)中沉淀出二水合核黃素(核黃素的第一種晶體形式)，其再在步驟(c)中轉化為脫水核黃素I(核黃素的第二種晶體形式)。在轉化期間，伴隨核黃素晶體的其它化合物和rDNA被釋放到周圍介質中。在溶液中，溶解的rDNA可被任何合適的條件或組分(例如，被能使溶解的DNA分解的無機酸或有機酸)容易地分解。
在根據本發明的方法的步驟(d)中，分離出核黃素的第二種晶體形式。優選地，通過過濾、離心和傾析分離出核黃素的第二種晶體形式。優選地，用冷的乙醇或乙醇與水的混合物來洗從步驟(d)獲得的晶體，然后進行干燥。
本發明涉及用于對核黃素進行純化和結晶的有效方法，其中，(重組)DNA被分解至低于傳統PCR的檢測極限。在一種優選的實施方式中，本方法包括合適晶種的形成和滅菌，優選地，單水合核黃素或二水合核黃素晶種。在一種優選的實施方式中，核黃素的第一種晶體形式，優選地，二水合核黃素的沉淀，在發酵罐中由所述晶種初始化。此外，本方法包括通過在能使稀釋的DNA分解的條件下，將核黃素的第一種晶體形式(優選地，二水合核黃素)轉化為核黃素的第二種晶體形式(優選地，脫水核黃素I)來除去伴隨核黃素的第一種晶體形式的DNA分子。優選地，核黃素的第一種晶體形式向核黃素的第二種晶體形式的轉化是通過在存在酸的情況下對懸浮的核黃素的第一種晶體形式加熱來進行的。酸的濃度優選大于10-4mol l-1，溶液的pH值優選低于6，更優選低于5，最優選低于4。
核黃素的不同晶體形式，特別是脫水核黃素II、脫水核黃素III、二水合核黃素和四水合核黃素可被用于人和動物營養以及動物健康和人類健康的領域。
下述實施例對根據本發明的方法進行了進一步的闡述。
實施例1通過DVS和X射線衍射進行分析通過組合的DVS-重量分析和組合的DVS-x射線衍射，來對修飾型B/C(如EP-A 995 749所述；相應于單水合核黃素)的樣品進行研究，如圖3所示。將樣品置于環境溫度和52％的相對濕度(水蒸氣)下。在兩種組合方法中，相對濕度(RH)不斷增長，直到達到大約96％的相對濕度。然后，相對濕度持續降低至0％。然后，濕度重新增加至52％，以達到起始點。循環第二次重復。
取決于水蒸氣的增加或減少的晶體結合水的吸收及釋放存在滯后。滯后可被解釋為在增加相對濕度期間動力學確定的吸收和降低相對濕度期間結晶水的延遲釋放。
下面列出了核黃素的晶體形式中包含的導致不同水合物產生的水的理論量從脫水核黃素到單水合核黃素4.79wt.-％從脫水核黃素到二水合核黃素9.57wt.-％從脫水核黃素到三水合核黃素14.36wt.-％從脫水核黃素到四水合核黃素19.15wt.-％平行掃描X射線衍射顯示，至少存在三種明顯不同的關于晶體形式的譜，其存在于不同的相對濕度范圍下范圍 晶體形式0％RH脫水核黃素II20＜RH＜75％ 單水合核黃素90-20％ 二水合核黃素脫水核黃素II顯示出不同于脫水核黃素I的X射線衍射圖。因此，其可被鑒定為脫水核黃素I的真實的多晶型體。通過增加相對濕度，結晶結構變為單水合核黃素。在相對濕度接近20％時，單水合核黃素的結構仍能被建立起來。如在幾乎全干的海綿中一樣，核黃素晶體晶格中僅有一些位置被水分子所占據。通過增加相對濕度來填充這些位置。超過大約75％的相對濕度時，晶體結構突然再次改變，變為二水合核黃素的結構，這發生于針對單水合核黃素的理論量的水被吸收之前。超過75％的相對濕度時，水被迅速包括進二水合核黃素的結構中。在大約92％的相對濕度下，水吸收達到9.57wt.-％的吸收值，其對應于二水合核黃素。
通過降低相對濕度使水不斷釋放。二水合核黃素的結構保持完整，直至達到20％的相對濕度。在20％的相對濕度處，二水合結構仍含有1.3mol水/mol核黃素。然后，結構直接變化為脫水核黃素II。
通過Raman光譜可以清楚地區分開三種不同的晶體形式。
按照與分析樣品“B/C”相同的方法，通過DVS，圖4來分析核黃素的晶體形式的第二份樣品。根據US 2603633，該樣品顯示出的晶體形式可被命名為C型。
在下列范圍中可以鑒定出兩種不同的晶體形式范圍 晶體形式0％＜RH 脫水核黃素III50％＜RH＜90％ 四水合核黃素四水合核黃素的結構已知為C型(修飾型)。脫水核黃素III是新的晶體形式，其是除了脫水核黃素I和脫水核黃素II之外的第三種脫水修飾型。其X射線衍射圖不同于其它所有核黃素的晶體形式的衍射圖。
實施例2測定溶解度和過飽和的方法實驗在熱流熱量器中進行。用濁度傳感器(turbidity sensor)來監測通過加熱進行稀釋和通過冷卻進行結晶的過程。將36mg脫水核黃素I的晶體或60mg單水合核黃素的晶體形式或120mg二水合核黃素的晶體分別懸浮于發酵溶液中，并以0.1℃/分鐘的速率加熱至80℃。溫度被保持60分鐘。然后將系統再冷卻至20℃，冷卻速率為0.1℃/分鐘。
在39℃，過飽和度的函數關系曲線僅是溫度的較弱的函數。因此，用另一種方法(方法B)來測定39℃時的過飽和通過加熱至69℃，令420mg四水合核黃素的晶體懸浮并完全溶解。核黃素的濃度為0.6mg ml-1。再次冷卻至39℃之后，溫度保持恒定。3小時后，結晶緩慢開始(參見圖2)。
用360mg四水合核黃素的晶體(相應于0.7mg ml-1)來進行同樣的實驗，仍在46℃時獲得了自發結晶。
由此可以推斷出，在39℃時，過飽和曲線低于0.6mg ml-1。
實施例3制備晶種、滅菌及接種在烘箱中于140℃對500mg單水合核黃素的晶體進行50分鐘的滅菌，將晶體懸浮于5ml乙醇中，10-200分鐘，優選為20-40分鐘，在誘導(induction)之前加入10ml滅菌水，用于更好地對液體進行操作。6小時后通過帶針的滅菌瓶將懸浮液加入到生物反應器中。二水合核黃素的晶體形成，在培養物中留下單水合的(monoseptic)。從上述實驗中可以推斷出，將晶體修飾型引導為二水合核黃素是可能的。
在經過誘導和未經過誘導的培養物中對核黃素的可溶部分進行的測量顯示了很大的區別在未經過誘導的培養物中，6-9小時后獲得過飽和的溶液。然后溶解度在1小時內顯著降低。在經過誘導的培養物的情況下未觀察到該現象。核黃素的溶解度(大約0.4gl-1)未過量。通過x射線衍射可對滅菌過程期間晶體晶體形式是否發生變化加以控制。
實施例4通過分批操作從二水合核黃素的核黃素晶體中去除DNA滅菌和將生物物質中的大部分傾析之后，通過加入無機酸(優選地，硫酸、硝酸、磷酸)和/或有機酸(優選地，乙酸、蟻酸、草酸)來處理剩下的核黃素漿體，其中含有6wt.-％的核黃素晶體。加入酸后，漿體中酸的濃度為5×10-4mol l-1。對經酸化的漿體進行劇烈攪拌。
將漿體加入到帶有葉輪攪拌器的1.5升反應器中。對漿體進行酸化，通過夾套設備將溫度升高至高達70℃。攪拌速度設置為500rpm。粘度一上升，就將攪拌速度增至高達2000rpm，以使漿體重新液化。處理20分鐘后，將漿體濾出。通過XRD對獲得的晶體進行分析。通過PCR來分析rDNA的含量(參見圖5)。
實施例5通過連續操作從二水合核黃素的核黃素晶體中去除DNA對按照實施例4進行生物物質分離和巴氏滅菌之后的漿體進行酸化，并將其持續泵入攪拌多級提取器中。通過泵入速率來確定在攪拌多級提取器中的駐留時間(5至20分鐘)。可通過夾套設備將提取器加熱至70℃的想要的溫度。。
在另外的實驗中，在漿體進入到攪拌多級提取器中之前，通過熱交換器將其預加熱至70℃。用熱交換器可在數秒內加熱漿體。裝備有靜態混合器的反應器管可以用來代替攪拌多級提取器。
實施例6在US 2,603,633中描述了用于制備四水合核黃素的方法。基本上，所述方法用溶劑來迅速沉淀核黃素，以獲得想要的四水合物“C型”(修飾型)。通過此方法制備出的樣品在95％的相對濕度下于大約10分鐘內轉化為二水合核黃素。
另一種制造小量四水合核黃素的方法基于對水溶液進行蒸發。下面對該過程進行了描述將500mg核黃素(化驗＞98wt.-％，通過化學方法制造的)溶于7升去離子水中。然后在Sartorius過濾器系統(由玻璃纖維過濾器和5μTeflon過濾器組成)上對溶液進行過濾。然后在Büchi旋轉瓶蒸發系統中令濾出液蒸發。在20-25mbar的真空和最高40℃的水浴溫度下，將溶液持續吸入到蒸發瓶中。同時，蒸發水分。瓶中體積保持為最大200ml。在該過程的末尾開始結晶。
最后，將所有7升都吸入蒸發瓶進行蒸發。蒸發瓶中的體積通過蒸發降低至大約100ml。然后對懸浮液進行過濾，不進行額外的洗滌，在高真空下(p＜0.05mbar)，于最高35℃進行干燥。然后通過x射線衍射來分析樣品，證實了四水合物的結構。然后將樣品用于進一步的實驗。
實施例7對照DNA用生產菌株的全基因組作為PCR擴增的陽性對照。使用的基因組的濃度為達到100ngμl-1。
PCR擴增使用兩種引物。如果樣品含有的生產菌株的DNA的濃度高于每十億0.2份(ppb)的話，用引物能擴增出200個堿基對(bp)的片段。
PCR程序-初始變性-45個如下循環94℃，40秒
55℃，60秒72℃，60秒-最后，將樣品置于72℃，600秒。
提取向50mg核黃素中加入含有1％去氧膽酸鹽(desoxycholate)的50mlTE-緩沖液(pH 8)。10分鐘振蕩之后，加入0.7ml苯酚(用TE飽和過)，再進行15分鐘的振蕩。相分離之后，通過色譜(MicroSpin S200，Amersham Pharmacia Biotech)對50μl水相進行純化，以除去剩余的苯酚、去氧膽酸鹽和核黃素。
鑒定用UV活性核酸系來標記DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定擴增出的產物。
權利要求
1.對核黃素進行純化的方法，所述方法包括如下步驟(a)沉淀核黃素的第一種晶體形式，(b)分離出核黃素的第一種晶體形式，(c)在能使稀釋的DNA分解的條件下，將核黃素的第一種晶體形式轉化為核黃素的第二種晶體形式，以及(d)分離出核黃素的第二種晶體形式，前提條件是在環境溫度下，核黃素的第一種晶體形式在熱力學上較之核黃素的第二種晶體形式更為不穩定。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)之后，所述方法包括對核黃素的第一種晶體形式進行巴氏滅菌的步驟。
3.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，所述的核黃素的第一種晶體形式是水合核黃素。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述水合核黃素是二水合核黃素。
5.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，所述的核黃素的第二種晶體形式是脫水核黃素I。
6.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，步驟(c)中，所述能使稀釋的DNA分解的條件是酸性或堿性條件。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述酸性條件是通過加入濃度在10-4至10-1moll-1之間的酸來獲得的。
8.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，所述的核黃素的第一種晶體形式的沉淀是通過晶種誘導的。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述晶種包含水合核黃素的晶種。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述水合核黃素的晶種是二水合核黃素的晶種或單水合核黃素的晶種。
11.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，步驟(c)在60℃至75℃之間的溫度下進行，其中使用(i)無機酸，(ii)堿，或(iii)有機酸。
12.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特征在于，步驟(c)中，將含有所述的核黃素的第一種晶體形式的漿體持續泵過熱交換器，以及，進一步泵過裝備有夾套加熱的管，以及多級攪拌系統或靜態混合器。
全文摘要
本發明涉及對核黃素進行純化的方法，所述方法包括如下步驟(a)沉淀核黃素的第一種晶體形式，(b)分離出核黃素的第一種晶體形式，(c)在能使稀釋的DNA分解的條件下，將核黃素的第一種晶體形式轉化為核黃素的第二種晶體形式，以及(d)分離出核黃素的第二種晶體形式，前提條件是在環境溫度下，核黃素的第一種晶體形式在熱力學上較之核黃素的第二種晶體形式較為不穩定。
文檔編號C07D475/14GK1826342SQ200480021148
公開日2006年8月30日 申請日期2004年7月20日 優先權日2003年7月22日
發明者阿諾德·格魯爾 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司