專利名稱：用Candida sp.CZMWL-3菌生產核黃素的制作方法
技術領域：
生物技術
背景技術：
核黃素(riboflavin)又名維生素B2，化學名稱為6， 7-二甲基-9-(r-D-ribityl)-異咯嗪，是人和動物自身不 能合成的低分子有饑化合物，其分子式為C17H2QN406，相對分子質量為376。核黃素是維持機體正常代謝 所必需的營養物質，是機體內許多酶系統的重要輔基--黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)與黃素單核苷酸(FMN) 的組成成分，參與機體的能量代謝和各種物質代謝。目前核黃素的生產方法主要有兩種 一種為化學合成 法，另一種微生物發酵法。由于化學合成法反應步驟多、工藝長、回收率低、成本高(要用到較貴的起始反 應物D-核糖)、耗能大，因此遠不能滿足工業需求，正逐漸被微生物合成法所取代。方尚玲等以阿舒假囊 酵母(^柳o^d鵬^ 一0為出發菌株，用蝸牛酶和纖維素酶處理，制備的原生質體用紫外線誘變后，得 到1株高產菌株，核黃素發酵由2040u g/mL提高到3360 u g/mL。李建國利用重組枯草芽孢桿菌24 / pMX45 發酵生產核黃素，以酵母粉為氮源時核黃素產量可達3200mg/L。 P. Buzzini利用藻酸鈣固定化的熱帶假絲 酵母連續發酵生產核黃素，第5天核黃素產量可達576mg/L。
這些核黃素發酵工藝所用的菌株均來自于陸地，而沒有利用從海洋環境分離到的酵母菌作為生產核黃 素的菌株，而且需要利用有機氮源如酵母提取物、蛋白胨等配制培養基，成本較高，培養往往需要去鐵， 匸藝復雜。
發明內容
本發明的目的是提供來源于海洋的酵母菌株Ow^'^ sp. CZMWL-3，并利用該菌株生產核黃素的方法。 本發明分離純化出一株來源f海洋的酵母菌株Ca"&c^sp.CZMWL-3，其具有產生核黃素的特性，保 藏單位簡稱CGMCC，保藏號為CGMCCNo.2332，保藏日期為2008年01月10日。
本發明的特點是首次從海洋環境中分離出產核黃素的Ca"c/Wasp.CZMWL-3菌株。經鑒定為假絲酵 母酵母(Caw/Wasp.)，經優化核黃素生產工藝，生產的核黃素可達21mg/L。所用的培養基為,4)2504 0.5%, KH2P04 0.1%, MgS04 7H20 0.05%, CaCl2 2H20 0.01%, NaCl 0.01%,蔗糖2%，酵母粉0.02%。溫 度為28。C，發酵時間為48小時。本發明所用的菌株CZMWL-3具有營養要求簡單，發酵周期短，培養基 不用出去鐵離子的特點，因此用該菌株生產核黃素具有很高的成本優勢和廣泛的應用前景。
具體實施例方式
1、 從東海表層海水采集樣品，選取在核黃素初篩液體培養基中產黃色物質的單菌落，通過測定 其核黃素產量進行復篩，得到具有高產核黃素的一株酵母菌株。該菌株通過形態觀察和生理 生化鑒定為Ca/7力'A sp.。菌株編號CZMWL-3。生產核黃素的液體培養基的組成為(NH4)2S04 0. 5%, KH2P04 0. 1%, MgS04 7H20 0. 05%, CaCl2 2H20 0. 01%, NaCl 0. 01%,蔗糖2%，酵母粉0. 02%。
么 核黃素的生產將菌株CZMWL-3接入上述的液體培養基中，170rpm, 28。C振蕩培養48h，將
培養基離心收集上清液，即為核黃素粗提液。 J、 核黃素產量的測定利用分光光度計測定上述粗提液在440nm的吸收值，參照標準曲線即可
計算出核黃素的含量。
4、 核黃素的純化和鑒定:將50ml0.1M的鹽酸加入50ml核黃素粗提液中，溶液混合均勻后100 。C 水浴30min。冷卻后用2.5M乙酸鈉溶液調節pH值至4.5，定容至100ml,過濾，濾液用MT 型樣品凈化富集柱(C18)富集，用甲醇洗脫即得核黃素純品，富集柱可反復使用。核黃素純 品經HPLC驗證純度高。利用標準品核黃素進行HPLC測定，根據標準品核黃素和純化的核 黃素相同的出峰時間進行鑒定。
權利要求
1、一種酵母菌Candida sp.CZMWL-3菌生產核黃素，其保藏號為CGMCCNo.2332。
2、 一種使用權利要求1所述的菌株制備核黃素的方法。
全文摘要
首次從海洋環境中分離出產核黃素的Candida sp.CZMWL-3菌株。經鑒定為假絲酵母(Candida sp.)，經優化核黃素生產工藝，生產的核黃素可達21mg/L。所用的培養基為(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 0.5％，KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.1％，MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.05％，CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.01％，NaCl 0.01％，蔗糖2％，酵母粉0.02％。溫度為28℃，發酵時間為48小時。冷卻后用2.5M乙酸鈉溶液調節pH值至4.5，定容至100ml，過濾，濾液用MT型樣品凈化富集柱(C18)富集，用甲醇洗脫即得核黃素純品，富集柱可反復使用。核黃素純品經HPLC驗證純度高。本發明所用的菌株CZMWL-3具有營養要求簡單，發酵周期短，培養基不用除去鐵離子的特點，因此用該菌株生產核黃素具有很高的成本優勢和廣泛的應用前景。
文檔編號C12N1/16GK101633895SQ20081013419
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月22日 優先權日2008年7月22日
發明者岳禮溪, 靜 李, 哲 池, 池振明, 麟 王, 王祥紅 申請人:中國海洋大學