專利名稱：一種連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物化學領域，特別是涉及一種連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法。
背景技術：
長春堿(Vinblastine，VLB)、長春新堿(Vincristine，VCR)是夾竹桃科植物長春花中的有效成分。硫酸長春堿(Vinblastine Sulfate)為國家基本藥物，主要適用于治療霍其金病及惡性淋巴瘤，亦可用于治療絨毛膜上皮癌與乳腺癌等癥。硫酸長春新堿(Vincristine Sulfate)，為國家基本藥物，主要適用于治療急性白血病及霍其金病、惡性淋巴瘤、小細胞肺癌及乳腺癌等，也可用于乳腺癌、支氣管肺癌、軟組織肉瘤，睪丸腫瘤、卵巢癌、消化道癌及惡性循環性黑色素瘤及神經母細胞瘤等。硫酸長春堿、硫酸長春新堿等已廣泛應用于臨床，是目前國際上應用最廣泛的天然植物抗癌藥物之一。
長春堿最早由RL.Noble等人于1958年從長春花中分離出來(RL.Nobleet alAnn N.Y.Acad.Sci.1958，76，P882)。
公開號為CN1152034C的中國專利介紹了從長春花中提取抗癌活性成分的工藝。在萃取溶劑中添加一定量的酒石酸或無機酸，從酸中分離到長春堿和長春新堿，從酸不溶物中分離到熊果酸。純化過程采用氧化鋁層析，苯-氯仿混合溶劑洗脫或硅膠柱層析，正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫。此法苯-氯仿洗脫劑毒性大，正己烷-乙酸乙酯洗脫劑效果欠佳。
公開號為CN1534038A的中國專利介紹了一種長春堿的高效生產方法。它是將長春花去除雜質后與醇或酸醇提取溶劑混合經勻漿固液萃取、空化混懸固液萃取、過濾、提取液濃縮、濃縮液調pH值、過濾、空化混懸液液萃取、濃縮、純化后得到長春堿成品。取代了傳統的物料干法粉碎、加熱提取或機械攪拌萃取及逆流萃取等方法，長春堿得率為0.07-0.12％，純度在98％以上。純化過程采用重結晶或硅膠分配層析法進行，所用的重結晶溶劑是濃度為75～95％的乙醇、甲醇或乙睛溶液，硅膠柱層析洗脫液為含有1～5％甲醇的二氯甲烷或三氯甲烷的溶液。此法的硅膠分配層析上樣量小，難以規模化生產。
公開號為WO8803135的專利將粗提的總生物堿粗品先過羥丙基交聯葡聚糖凝膠(Sephadex LH20)柱，二氯甲烷-甲醇或氯仿-甲醇作流動相，分段收集流分，含長春堿部分合并濃縮。然后過硅膠柱進一步純化，硅膠須經去活處理，用1％～10％甲醇-氯仿梯度洗脫，含長春堿部分蒸除溶劑，甲醇中結晶。此法的固定相Sephadex LH20價格較貴，且多次使用會造成不可逆吸附，分離效果變差。
劉佐仁等介紹了用逆流色譜技術分離長春花總生物堿中的長春堿(中國新醫藥，2004，3(8)，)，分離的長春堿為白色粉末，含量未報道。目前的逆流色譜技術難以得到含量大于98％的產品，且一次分離樣品量小，分離時間長，目前僅處于研究階段。
Atta-ur-Rahman等(A rapid procedure for the isolation of catharanthine，vindoline and vinblastine.PlantaMed，1983，47(4)246-247)將粗提的總生物堿先過氧化鋁柱，再過硅膠柱，然后用制備型HPLC分離，均用乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，得長春堿純品。此法步驟繁瑣，收率非常低，3次過柱總收率僅為0.3％，制備量也很少，不適合擴大制備。
發明內容
本發明的目的在于提供一種連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法。
為了達到上述目的，本發明采用的技術方案包括使用含量不低于50％的硫酸長春堿原料，制備純度98％以上的硫酸長春堿。本發明將硫酸長春堿粗品用去離子水溶解，然后加入氨水調節pH堿性，使硫酸長春堿轉變成長春堿，再用含氯溶劑萃取，分離有機相，將有機相用無水硫酸鈉干燥，干燥后的有機相減壓回收溶劑至干，得上柱樣品。使用中壓氧化鋁填充柱，將氧化鋁用烴溶劑分散后濕法裝柱，流動相溶樣，以烴溶劑和含氯溶劑的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，回收的洗脫劑經薄層層析校正后重復使用，濃縮物用乙醇溶解，加硫酸酸化，析出沉淀，沉淀用95％乙醇重結晶，結晶產物冷凍干燥，可獲得純度98％以上的硫酸長春堿純品。母液減壓回收甲醇后可做為柱層析原料再次純化。使用后的層析柱用含氯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用。
中壓氧化鋁填充柱柱長30～350cm，柱直徑5～50cm，填充氧化鋁粒徑為100～400目，柱壓為0.1～5MPa。
所用的烴溶劑為正己烷、正庚烷、環己烷、石油醚、6號溶劑油。所用的含氯溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷。
使用氨水調節堿性，pH 8～10，使用硫酸酸化，pH 2～4。
每次上柱所用的樣品質量與柱中氧化鋁質量之比在1∶15～1∶100之間。
洗脫劑中烴溶劑和含氯溶劑的的體積配比為1∶4～1∶7。
分段收集的流分含量高于92％的進入乙醇溶解硫酸酸化過程，含量低于92％的按照上述分離方法重新上樣分離。
洗脫劑的薄層層析校正是將回收的洗脫劑做為薄層展開劑，將長春堿對照品點于薄層層析板上展開，根據展開的Rf值，添加烴溶劑或含氯溶劑使與原始配比的Rf值相近。
再生劑用量為1～10Bv，平衡劑用量為5～20Bv。
本發明的優點是1.本發明改變了傳統的生產工藝，本法的層析柱可重復使用，使用次數達20次以上。
2、純化過程無污染，所有溶劑均可回收使用，便于工業連續化生產。
具體實施例方式下面對本發明實施作進一步詳細描述使用含量不低于50％的硫酸長春堿原料，制備純度98％以上的硫酸長春堿。本發明將硫酸長春堿粗品用去離子水溶解，然后加入氨水調節pH堿性，使硫酸長春堿轉變成長春堿，再用含氯溶劑萃取，分離有機相，將有機相用無水硫酸鈉干燥，干燥后的有機相減壓回收溶劑至干，得上柱樣品。使用中壓氧化鋁填充柱，將氧化鋁用烴溶劑分散后濕法裝柱，流動相溶樣，以烴溶劑和含氯溶劑的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，回收的洗脫劑經薄層層析校正后重復使用，濃縮物用乙醇溶解，加硫酸酸化，析出沉淀，沉淀用95％乙醇重結晶，結晶產物冷凍干燥，可獲得純度98％以上的硫酸長春堿純品。母液減壓回收甲醇后可做為柱層析原料再次純化。使用后的層析柱用含氯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用。
中壓氧化鋁填充柱柱長30～350cm，柱直徑5～50cm，填充氧化鋁粒徑為100～400目，柱壓為0.1～5MPa。
所用的烴溶劑為正己烷、正庚烷、環己烷、石油醚、6號溶劑油。所用的含氯溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷。
使用氨水調節堿性，pH 8～10，使用硫酸酸化，pH 2～4。
每次上柱所用的樣品質量與柱中氧化鋁質量之比在1∶15～1∶100之間。
洗脫劑中烴溶劑和含氯溶劑的的體積配比為1∶4～1∶7。
分段收集的流分含量高于92％的進入乙醇溶解硫酸酸化過程，含量低于92％的按照上述分離方法重新上樣分離。
洗脫劑的薄層層析校正是將回收的洗脫劑做為薄層展開劑，將長春堿對照品點于薄層層析板上展開，根據展開的Rf值，添加烴溶劑或含氯溶劑使與原始配比的Rf值相近。
再生劑用量為1～10Bv，平衡劑用量為5～20Bv。
下面，本發明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。
實施例1400g 65％硫酸長春堿粗品攪拌溶解于2L去離子水中，加入氨水調節pH8，用6L二氯甲烷分3次萃取，萃取液流過無水硫酸鈉柱脫水，然后減壓濃縮至干。將活度為II級的100～200目堿性氧化鋁8kg用正己烷混懸后，驅除氣泡，均勻加入到有效柱長120cm，內徑10cm的玻璃層析柱中，上述濃縮至干的硫酸長春堿粗品加入600mL正己烷∶二氯甲烷(1∶6)溶解，濾除不溶物后用柱塞式溶劑泵上于柱頭，然后泵入正己烷∶二氯甲烷(1∶6)洗脫，分段收集流分，TLC和HPLC監測，合并含量92％以上的流出液，減壓回收洗脫劑后得濃縮物168g，加入無水乙醇500mL溶解，加入10％硫酸乙醇調節pH3，沉淀過濾，加入95％乙醇8500mL回流溶解，冷卻析晶，結晶物再用95％乙醇重結晶1次，減壓過濾，冷凍干燥，得硫酸長春堿純品140g，純度98.5％，母液減壓回收溶劑后得濃縮物作為下次柱層析的原料。含量90％以下的流出液減壓回收洗脫劑后得濃縮物也作為下次柱層析的原料，回收的洗脫劑經薄層層析校正后下次重復使用，洗脫后的氧化鋁柱泵入40L二氯甲烷再生，然后再泵入60L正己烷平衡，平衡后的氧化鋁柱待下次直接使用。
實施例2除用實施例1已平衡好的氧化鋁柱外，其余依實施例1方法操作，得硫酸長春堿純品137.4g，純度98.2％。
實施例3將實施例1中所用正己烷改用石油醚(沸點60～90℃)，其余依實施例1方法操作，得硫酸長春堿純品139.5g，純度98.4％。
權利要求
1.一種連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，本方法使用含量不低于50％的硫酸長春堿原料，制備純度98％以上的硫酸長春堿，將硫酸長春堿粗品用去離子水溶解，然后加入氨水調節pH堿性，使硫酸長春堿轉變成長春堿，再用含氯溶劑萃取，分離有機相，將有機相用無水硫酸鈉干燥，干燥后的有機相減壓回收溶劑至干，得上柱樣品，使用中壓氧化鋁填充柱，將氧化鋁用烴溶劑分散后濕法裝柱，流動相溶樣，以烴溶劑和含氯溶劑的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，回收的洗脫劑經薄層層析校正后重復使用，濃縮物用甲醇溶解，加硫酸酸化，析出沉淀，沉淀用95％乙醇重結晶，結晶產物冷凍干燥，可獲得純度98％以上的硫酸長春堿純品，母液減壓回收甲醇后可做為柱層析原料再次純化，使用后的層析柱用含氯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用。
2.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于中壓氧化鋁填充柱柱長30～350cm，柱直徑5～50cm，填充氧化鋁粒徑為100～400目，柱壓為0.1～5MPa。
3.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于所用的烴溶劑為正己烷、正庚烷、環己烷、石油醚、6號溶劑油。
4.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于所用的含氯溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷。
5.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于氨水調節堿性，pH8～10，硫酸酸化，pH2～4。
6.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于每次上柱所用的樣品質量與柱中氧化鋁質量之比在1∶15～1∶100之間。
7.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于洗脫劑中烴溶劑和含氯溶劑的的體積配比為1∶4～1∶7。
8.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于分段收集的流分含量高于92％的進入乙醇溶解硫酸酸化過程，含量低于92％的按照上述分離方法重新上樣分離。
9.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于洗脫劑的薄層層析校正是將回收的洗脫劑做為薄層展開劑，將長春堿對照品點于薄層層析板上展開，根據展開的Rf值，添加烴溶劑或含氯溶劑使與原始配比的Rf值相近。
10.按照權利要求1所述的連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，其特征在于再生劑用量為1～10Bv，平衡劑用量為5～20Bv。
全文摘要
一種連續中壓柱層析制備高純度硫酸長春堿的方法，將硫酸長春堿粗品用去離子水溶解，加入氨水調節pH堿性，用含氯溶劑萃取，分離有機相，有機相干燥后回收溶劑至干，得上柱樣品。使用中壓氧化鋁填充柱，濕法裝柱，流動相溶樣，烴溶劑和含氯溶劑的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，收集含長春堿流分，回收洗脫劑后的濃縮物乙醇溶解，加硫酸酸化，析出沉淀，沉淀用95％乙醇重結晶，結晶產物冷凍干燥，可獲得純度98％以上的硫酸長春堿純品。使用后的層析柱用含氯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用，使用次數達20次以上。本方法的主要特點為純化過程無污染，所有溶劑均可回收使用，便于工業連續化生產。
文檔編號C07D471/16GK1724538SQ20051001017
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者祖元剛, 楊磊, 祖柏實, 羅猛, 付玉杰, 李慶勇, 張玉紅, 肖長文 申請人:東北林業大學, 祖元剛