專利名稱：重組活禽痘病毒載體及其在抗丙型肝炎病毒的藥物組合物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學和病毒疫苗的分支，特別是表達丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白質的重組禽痘病毒和能夠誘導抗HCV的細胞免疫應答的藥物組合物。
現有技術于1989年第一次通過使用分子生物學技術將HCV鑒定為非甲、非乙型輸血后肝炎的主要致病因子(Choo Q-L.，Kuo G.，等人.(1989)Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome.Science.244359-62；EP0318216Chiron Corp)。目前全球有超過一億七千萬人感染了這種病毒性因子。85％的HCV感染是持久的，其常常引起肝硬化和肝細胞癌(CaselmannW.H.，Alt M.(1996)Hepatitis C virus infection as a major riskfactor for hepatocellular carcinoma.J.Hepatol.2461-66)。事實上，在感染25年后，每年有25％的HCV慢性攜帶者形成肝硬化，和他們中的1％至4％形成肝細胞癌(Prince A.M.，Shata M.T.(2001)Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection.Clin.Liver.Dis.51091-103)。
選擇用于HCV感染的治療基于以高強度的用藥方案來聯合施用PEG化的干擾素α(IFN-α)和病毒唑。但是，該治療具侵襲性，價格昂貴，且只在低于50％的案例中有效(Prince A.M.，Shata M.T.(2001)Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection.Clin.Liver.Dis.51091-103)。
已經作為疫苗接種的方法評價了以HCV抗原為基礎的蛋白質亞基、病毒樣顆粒、合成肽、重組活載體和用于DNA免疫接種的DNA構建體的各種不同的變體(US6635257，US6387662，US6235888，US6685944，US2003021805，Lechmann M.，Liang T.J.(2000)Vaccinedevelopment for hepatitis C.Semin.Liver.Dis.20211-26)。這些變體中的一些已被證實能引起針對HCV表位的特異性免疫應答，盡管所述免疫應答還不夠。目前，與抗HCV感染的保護相關的免疫學參數尚未完全確定。不過，有幾項研究提出，早期、強烈且多特異性的細胞毒性T細胞應答同CD4+Th1細胞一起，促進抗病毒的免疫和疾病的消除。相反，晚期的T細胞應答與慢性肝免疫病理學狀態的形成相關(Cerny A.，Chisari F.V.(1999)Pathogenesis of chronichepatitis Cimmunological features of hepatic injury and viralpersistente.Hepatology.30595-601；Cooper S.等人，(1999)Analysis of a successful immune response against hepatitis Cvirus.Immunity 10439-49；Lechner F.等人，(2000)Why docytotoxic T lymphocytes fail to eliminate hepatitis C virus？Lessons from studies using major histocompatibility complexclass I peptide tetramers.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.3551085-92；Takaki A.等人，(2000).Cellular immuneresponses persist and humoral responses decrease two decadesafter recovery from a single-source outbreak of hepatitis C.Nat.Med.6578-82)。
重組活載體是用于產生抗HCV的細胞免疫應答的很吸引人的候選手段。用重組有HCV核心和E1的腺病毒免疫小鼠引起針對這些抗原的特異性細胞毒性T細胞應答(Bruna-Romero 0.等人，(1997)Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis Cvirus structural antigens using a defective recombinantadenovirus.Hepatology 25470-7)。盡管這些研究結果一直都被抱以希望，但近來隨著將重組腺病毒用于基因治療而出現的問題使得產生了關于它們在人類中使用的置疑。當它們與基于DNA構建體的疫苗候選物相聯合時，依據所評估的抗原，使用包含不同HCV基因的重組痘苗和金絲雀痘病毒在小鼠中誘導了細胞毒性T細胞免疫應答，(Pancholi P.等人，2000)DNA prime-canarypox boost withpolycistronic hepatitis C virus(HCV)genes generates potentimmune responses to HCV structural and nonstructural proteins.J.Infect.Dis.18218-27；Pancholi P.等人，(2003)DNAimmunization with hepatitis C virus(HCV)polycistronic genesor immunization by HCV DNA priming-recombinant canarypox virusboosting induces immune responses and protection fromrecombinant HCV-vaccinia virus infection inHLA-A2.1-transgenic mice.J.Virol.77382-90)。事實上，沒有證據顯示，在個別施用重組有HCV結構抗原的金絲雀痘病毒后，在體內誘導了細胞免疫性，其例如在用重組痘苗病毒的攻擊模型中可以是有效的。禽痘病毒也屬于這一類群的病毒，禽痘病毒迄今未被用于誘導抗HCV抗原的免疫應答。禽痘病毒在哺乳動物細胞中不復制，但卻能在宿主細胞的細胞質中有效地感染和表達由其基因組所編碼的蛋白質。由于這些特性，比起其他活病毒載體，與在人類中使用重組禽痘病毒相關的調節風險得以降低。
目前，市場上沒有可獲得的抗HCV感染的疫苗，事實上，大部分的研究仍處在臨床前階段。因此，有效抗HCV感染的預防和/或治療性試劑的開發是沒有解決并迫切需要解決的問題。
發明內容
本發明跳過了限制和現有技術，通過提供在禽痘病毒基因組的非必需區中包含源自HCV的DNA片段的重組禽痘病毒而解決了上述問題，依據由禽痘病毒表達的相應于HCV抗原的氨基酸區域，所述重組禽痘病毒能夠誘導抗HCV的特異性細胞免疫應答。
根據本發明，病毒FPCoE1表達包含氨基酸79-338的蛋白質(SEQID No1)，其中包括一部分的核心蛋白和E1，而病毒FPBS包含嵌合蛋白(SEQ ID No2)，其中包括對于相應于不同HCV抗原的CD4+和CD8+T淋巴細胞來說特異的表位。在這些病毒中，編碼HCV抗原的序列來源于HCV古巴分離物的eDNA(Morales J等人，WO 98/25960)。
本發明的另一方面涉及用于誘導抗HCV的特異性細胞免疫應答的藥物組合物，其包含有效免疫量的重組禽痘病毒和藥學上可接受的賦形劑。
包括在本發明中的重組禽痘病毒能滲透進入人類細胞并在細胞質中表達HCV抗原。所述在人類細胞中的表達由基于禽痘病毒的早期/晚期合成啟動子的轉錄單元控制。這些病毒同樣也包含在痘苗病毒的7.5K啟動子控制之下的黃嘌呤鳥苷磷酸核糖轉移酶基因。這些病毒在人體內不能復制。
該組合物可通過肌內、腹膜內或皮下途徑施用。施用方法可以為通過使用注射器、基因槍、噴霧器或其他免疫接種設備。每個個體以確定的體積接受2.5×107至1×108PFU/劑的劑量。本發明還描述了以使用DNA構建體的引發(prime)/加強(boost)策略來施用重組禽痘病毒的過程。重組禽痘病毒也可以以使用蛋白質或其他重組有HCV抗原的病毒或者同時使用細胞因子和其他免疫刺激分子的引發/加強策略來施用。特別地，這些聯合使得能夠產生新的表位特異性或增強免疫應答的某個分支。
基于重組有HCV抗原的禽痘病毒的藥物組合物有如下優點-可能誘導有效的特異性細胞免疫性；-減少了為達到所希望的效果而需要的免疫次數；-可能使用這些組合物作為聯合疫苗的核心；-不需任何佐劑；-它們能與抗病毒劑聯合使用。
依照這種情況，所述藥物組合物可以在另一種療法或疫苗之前、同時或之后進行施用以誘導抗HCV的免疫性。可以施用這些藥物組合物從而誘導抗HCV感染的預防性免疫性，還從而在患有慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者中誘導免疫性。
附圖簡述
圖1重組禽痘病毒中相應于HCV抗原的區域的示意性圖示。
圖2使用不同重組禽痘病毒的進行免疫接種的圖表。抗體應答(A)。干擾素γ分泌應答(B)。針對使用重組有HCV結構抗原的痘苗病毒進行攻擊的應答(C)。
圖3通過不同的接種途徑使用FPCoE1和FPBS進行免疫接種的圖表。針對使用重組有HCV結構抗原的痘苗病毒進行攻擊的應答。
圖4使用不同量的FPCoE1和FPBS進行免疫接種的圖表。針對使用重組有HCV結構抗原的痘苗病毒進行攻擊的應答。
圖5基于FPCoE1和DNA疫苗制劑的聯合進行免疫接種的圖表。針對核心、E1和E2的抗體應答(A)。針對使用重組有HCV結構抗原的痘苗病毒進行攻擊的應答(B)。
實施例如在本發明中所理解的，術語“丙型肝炎病毒”或“HCV”以一般的方式描述該病毒，因此該術語不限于特定的病毒序列或HCV分離物。
同樣地，編碼序列被理解為核酸分子，當其位于精確調節序列的控制之下時通常經mRNA而被翻譯為多肽。在這種情況下，編碼序列可以包含但不僅限于cDNA和重組核苷酸序列。
本發明將通過下述實施例進行更詳細的說明，這些實施例是示例性的而并不限制本發明的目的。
實施例1FPCoE1c、FPCoE1和FPBS的評估為了評估重組有HCV抗原的禽痘病毒誘導特異性細胞免疫應答的能力，產生了病毒FPCoE1c、FPCoE1和FPBS。圖1顯示了相應于HCV抗原的序列的示意性圖示。如下獲取病毒用禽痘病毒感染雞胚胎成纖維細胞，并通過使用lipofectamine(Invitrogen，USA)用質粒pFPCoE1c、pFPCoE1或pFPBS進行轉染。這些質粒來源于質粒pFP67xgpt(Vázquez-Blomquist D.，González S.，Duarte C.A.(2002)Effect of promoters on cellular immune response induced byrecombinant fowlpox virus expressing multi-epitopepolypeptides from HIV-1.Biotechnol.Appl.Biochem.36171-9)，并且含有編碼包含氨基酸1-338、氨基酸79-338(SED ID No1)的區域的序列，或編碼在對于T淋巴細胞來說特異的表位基礎上的嵌合蛋白的序列(SED ID No2)(分別為質粒pFPCoE1c、pFPCoE1和pFPBS)。接下來在具有黃嘌呤、次黃嘌呤和霉酚酸的選擇培養基中進行幾輪病毒純化。然后，擴大來自感染平板的病毒產物，并通過聚合酶鏈式反應來確認相應于HCV序列的插入物的存在。
在以2.5×107PFU進行兩次腹膜內施用(間隔3周)之后，在八周齡的BALB/c雌性小鼠中研究病毒FPCoE1c、FPCoE1和FPBS的免疫原性。每個免疫接種組有十只動物。圖2A顯示只有用FPCoE1進行免疫才能夠誘導可檢測水平的針對核心和E1的抗體。可是，圖2B顯示，在用FPCoE1和FPBS免疫接種的動物中出現了分泌IFN-γ的淋巴細胞的陽性應答，其與在用陰性病毒即FP9免疫接種的動物中所檢測到的應答相比是統計學上顯著的(Student T檢驗，p＜0.05)。用FPCoE1c進行免疫不能誘導分泌IFN-γ的淋巴細胞的陽性應答。另外，如圖2C所示，相對于在用痘苗病毒對照(WR)而不是用重組有HCV抗原的痘苗病毒進行攻擊之后所觀察到的，來自用病毒FPCoE1和FPBS免疫接種的組的動物能夠顯著減少(Student T檢驗，p＜0.05)在用106PFU的重組有HCV結構抗原(HCV多蛋白的氨基酸1-650)的痘苗病毒(vvRE)進行攻擊之后卵巢中的病毒負荷。此外，相對于在用陰性禽痘病毒FP9進行免疫接種的動物中所檢測到的，在用FPCoE1和FPBS免疫接種的動物中的vvRE病毒負荷在統計學上更低(Student T檢驗，p＜0.05)。用FPCoE1c進行免疫不能顯著減少卵巢中的病毒負荷。在用禽痘病毒進行最后一次免疫之后2周，通過腹膜內接種來進行使用痘苗病毒的攻擊。卵巢的摘取在接種痘苗病毒5天后進行。用重組痘苗病毒進行攻擊已廣泛用于證實疫苗候選物在體內引起強烈的細胞免疫應答的能力。特別地，卵巢中病毒滴度的降低主要與強CD8+T淋巴細胞應答的誘導有關。
實施例2禽痘病毒的施用途徑(腹膜內、皮下和肌內)為了評估接種途徑對由重組禽痘病毒產生的免疫應答的影響，對八周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫接種。每個免疫接種組有十只動物。病毒(2.5×107PFU)通過腹膜內、肌內或皮下途徑進行施用，進行兩次免疫接種，間隔三周。圖3顯示，關于重組禽痘病毒FPCoE1和FPBS減少在用痘苗病毒vvRE攻擊之后卵巢中的病毒負荷的能力，在所述免疫接種途徑之間無顯著差異。這兩種重組病毒誘導了以相對于禽痘病毒陰性對照FP9來說病毒負荷減少(Student T檢驗，p＜0.05)為基礎的陽性應答。在用禽痘病毒進行最后一次免疫之后2周，通過腹膜內接種106PFU的痘苗病毒vvRE來進行使用痘苗病毒的攻擊。卵巢的摘取在接種痘苗病毒5天后進行。
實施例3劑量比較(0.9×107，2.5×107，5×107和1×108PFU)雌性BALB/c小鼠在第0周和第3周通過肌內途徑用不同量的重組禽痘病毒進行免疫接種。每個免疫接種組有十只動物。圖4顯示，關于在用禽痘病毒進行最后一次免疫之后2周，于用106PFU的vvRE進行攻擊之后在卵巢中檢測的病毒負荷，用0.9×107PFU免疫接種的小鼠沒有顯著差異。相反地，相對于在用相同量的禽痘病毒陰性對照FP9接種的動物中所檢測到的，施用2.5×107、5×107和1×108PFU的FPCoE1和FPBS明顯減少了卵巢中的vvRE病毒負荷(Student T檢驗，p＜0.05)。在所有情況下，卵巢的摘取在接種vvRE 5天后進行。
實施例4用DNA和禽痘病毒進行引發/加強免疫為了評估在將DNA疫苗候選物和重組有HCV抗原的禽痘病毒聯合在一起的引發/加強免疫之中所誘導的免疫應答，對八周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫接種。每個免疫接種組有十只動物。一個組(Co-pIDKE2)于第0、3、7和12周通過肌內途徑用100μg表達HCV多蛋白的前650個氨基酸的質粒即pIDKE2( -Carrera S.等人，(2004).Immunization with a DNA vaccine encoding thehepatitis-C-virus structural antigens elicits a specificimmune response against the capsid and envelope proteins inrabbits and Macaca irus(crab-eating macaque monkeys).Biotechnol Appl Biochem.39249-55)和10μg重組HCV核心蛋白即Co.120(Alvarez-Obregon J.C.等人，(2001)A truncated HCV coreprotein elicits a potent immune response with a strongparticipation of cellular immunity components in mice.Vaccine193940-46)的混合物進行免疫接種。一個組的動物(pAEC-K6)在相同條件下用陰性對照質粒pAEC-K6(Herrera A.M.等人，(2000).Afamily of compact plasmid vectors for DNA immunization in humans.Biochem.Biophys.Res.Common.279548-51)進行免疫接種。另一個組于第0周和第3周通過肌內途徑用2.5×l07PFU的FPCoE1進行免疫接種。另外，一組動物在相同條件下用陰性禽痘病毒FP9進行免疫接種。此外，一個組(Co-pIDKE2/FPCoE1)通過肌內途徑于第0周和第3周用混合物Co-pIDKE2，和于第9周和第12周用FPCoE1進行免疫接種。另一個組(Co-pIDKE2/FP9)以相似方式進行免疫接種，但在第6周和第9周的給藥是施用FP9。圖5顯示，在組Co-pIDKE2中誘導了最高水平的抗體(Student T檢驗，p＜0.05)。此外，相對于在僅用FPCoE1進行免疫接種的組中所檢測到的，聯合了Co-pIDKE2和FPCoE1的引發/加強施用誘導了更高水平的抗體(Student T檢驗，p＜0.05)。在圖5B中，可以觀察到，相對于用陰性對照進行免疫接種的組，用FPCoE1或Co-pIDKE2進行免疫接種的兩個組以及最初2劑用Co-pIDKE2、另2劑用FPCoE1進行免疫接種的組顯著減少攻擊后的vvRE病毒負荷。在最初2劑用Co-pIDKE2、另2劑用FPCoEl進行免疫接種的動物中檢測出最低的病毒負荷。在最后一次免疫之后2周，通過腹膜內接種106PFU的痘苗病毒vvRE來進行使用痘苗病毒的攻擊。卵巢的摘取在接種痘苗病毒5天后進行。
序列表<110>Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología<120>重組活禽痘病毒載體及其在抗丙型肝炎病毒的藥物組合物中的應用<130>Seq HCV<140>
<141>
<150>CU 2004-0174<151>2004-08-11<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>831<212>DNA<213>源自HCV編碼區的DNA片段(核苷酸237至1014)<400>1atgaggcctc ccgggtaccc ttggcccctc tatggtaacg agggcatggg atgggcagga 60tggctcctgt caccccgtgg ctctcggcct agttggggcc ccactgaccc ccggcgtagg 120tcgcgtaatt tgggtaaggt catcgatacc ctcacatgcg gcttcgccga cctcatgggg 180tacattccgc tcgtcggcgc ccccctaggg ggcgctgcca gggccctggc gcatggcgtc 240cgggttctgg aggacggcgt gaattatgca acagggaatc tgcccggttg ctctttctct 300ctcttccttt tggctttgct gtcctgtttg accatcccag tttccgccta tgaagtgcgc 360aacgcgtccg gggtgtacca tgtcacgaac gactgctcca actcaagcat tgtgtatgag 420gcagacgaca tgatcatgca cacccccgga tgcgtgccct gcgttcggga ggacaacacc 480tcccgctgct gggtagcgct cacccccaca ctcgcggcca ggaatgccag cgtccccacc 540acgacaatac gacgccacgt cgatttgctc gttggggcgg ctgctctctg ctccgctatg 600tacgtggggg atctctgcgg atctgttttc ctcgtttccc agctgttcac cttctcgcct 660
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1.能夠誘導抗HCV抗原的特異性細胞免疫應答的重組禽痘病毒，其在禽痘病毒基因組的非必需區中包含來源于HCV的DNA片段。
2.如權利要求1所述的重組禽痘病毒，其中所述來源于HCV的DNA片段為編碼包含氨基酸79-338的多蛋白核心-E1的序列(SEQ ID No1)。
3.如權利要求1所述的重組禽痘病毒，其中所述來源于HCV的DNA片段為編碼基于對T淋巴細胞特異的表位的嵌合蛋白的序列(SEQID No2)。
4.如權利要求1和2所述的重組禽痘病毒，其是FPCoE1。
5.如權利要求1和3所述的重組禽痘病毒，其是FPBS。
6.用于誘導抗HCV的特異性細胞免疫性的藥物組合物，其包含有效免疫量的如權利要求1至5所述的重組禽痘病毒和藥學上可接受的賦形劑。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其中有效免疫劑量為2.5×107至1×108PFU/劑。
8.如權利要求6和7所述的藥物組合物，其用于誘導抗HCV感染的預防性免疫性。
9.如權利要求6和7所述的藥物組合物，其用于在患有慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者中誘導抗HCV的免疫性。
10.如權利要求6和7所述的藥物組合物，其用于在其他療法或疫苗之前、同時或之后誘導抗HCV的免疫性。
全文摘要
本發明涉及用于基于丙型肝炎病毒抗原的蛋白質組合的重組禽痘病毒，和涉及其在藥物組合物中的應用，所述藥物組合物能在施用減少的劑量之后誘導抗丙型肝炎病毒的細胞免疫應答。根據本發明，所述藥物組合物可以用于在哺乳動物中預防和治療與丙型肝炎病毒有關的感染。
文檔編號C07K14/18GK101035560SQ200580034298
公開日2007年9月12日 申請日期2005年8月10日 優先權日2004年8月11日
發明者L·阿爾瓦茲-拉榮徹爾龐斯德里昂, S·杜納斯卡里拉, I·古拉艾茲普魯阿, N·埃克斯塔里維羅, A·姆薩池奧拉薩 申請人:遺傳工程與生物技術中心