專利名稱：煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及昆蟲基因工程技術領域，特別是涉及一種煙夜蛾脂肪酸結合蛋白(Helicoverpa assulta Fatty Acid Binding Protein，縮寫為Hass-FABP)基因及其應用。
背景技術：
1972年Ockneir等在研究大鼠小腸脂肪酸吸收的調節時，在腸粘膜上發現了脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)，后來發現這種蛋白廣泛存在于動物的心肌、小腸、肝臟、脂肪組織、腦和表皮中，已發現的FABP包括心肌型(H-FABP)等9種。FABP大約由126-134個標準氨基酸組成，相對分子質量大約為11-16kDa。FABP的主要功能是參與細胞內脂肪酸及其他一些疏水配基的運輸，可將脂肪酸(優先結合長鏈脂肪酸)運輸到β氧化、甘油三酯或磷酸合成的位點，促進細胞合成脂肪酸，并在代謝內環境中起重要作用。近年來，已用大量的實驗方法對FABP的轉運功能進行了研究。這些方法包括分子水平的體內脂肪酸轉運模型；對脂肪酸的攝取和由基因控制的FABP不同種類、數量體內細胞轉運的研究；同時對缺乏特異FABP表達的動物組織細胞進行檢測。已經清楚知道FABP周圍包圍了大量的相關蛋白，一些除脂肪酸外，還結合了疏水的配體。近來，對FABP的組織分布，配體親和力和特異性，以及其結構特性進行了集中研究，結果均表明FABP參與細胞脂質代謝。目前，脂肪酸結合蛋白的研究主要在高等動物中進行，而對昆蟲研究較少，已報道的僅有煙草天蛾(Manduca sexta)、果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyxmori)和美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)等，研究表明FABP基因在昆蟲中存在一定的同源性。
煙夜蛾(Helicoverpa assulta)又名煙草夜蛾、煙青蟲、煙實夜蛾，是一種世界性的煙草害蟲。該蟲具有分布廣、食性較雜、繁殖力較強和兼性滯育等特點。在我國除西藏外，各省、市區均有發生，以危害煙草及辣椒最重。國內各煙區均有分布，其中以黃淮煙區、華中煙區、西南煙區的云南、貴州和四川等地煙草，發生世代多、發生量較大。由于使用化學防治方法引起的環境壓力以及害蟲產生的抗藥性等問題，利用其他方法控制此蟲已成為當前防治的熱點。
發明內容
本發明的目的提供一種煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因及其編碼的蛋白質。
本發明的技術方案是一種煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因的全長cDNA序列，具有如下所示的399bp的核苷酸序列1 atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc61 aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc121 aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt181 gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag241 accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac301 agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc361 aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因編碼的蛋白，編碼長為132個氨基酸殘基，其氨基酸序列為1 M A F F G K E Y K F E K Q E N F E D F V21 N A L G L T P E Q T Q G Y L A Y T P T L41 K F T Q D G D S Y T V I T I T P K T K S61 E V T F K S G V E F D D N N A N R H C K81 T T Y T V A G D T I T Q V Q K Y D D G N101 S L T I T R K F S G N E M V V T L A T S121 K W D G V A R R Y Y K A *煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在對煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲防治中的應用。
煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在煙夜蛾基因芯片中的應用。
煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在合成新的脂肪酸結合蛋白基因中的應用。
利用煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在獲得抗煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲轉基因植物中的應用。
獲得煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因的克隆過程包括如下步驟
(1)總RNA提取(2)引物設計，設計并合成的引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’。
(3)RT-PCR擴增(4)PCR產物的克隆和鑒定(5)序列測定和分析。
本發明的積極有益效果(1)提供了一種煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因及其編碼的蛋白質。
(2)對煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲防治的應用脂肪酸結合蛋白的主要作用是對脂肪酸及其衍生物的攝取、細胞內轉運、氧化、脂化或合成等一系列脂肪代謝中發揮作用。利用Hass-FABP基因對蛋白的調控，控制蟲體內脂肪酸的比例，從而控制昆蟲的生長和發育，達到控制蟲害的目的。
(3)基因芯片的制作可將Hass-FABP基因的克隆用于煙夜蛾基因芯片制作，應用與煙夜蛾及其他鱗翅目昆蟲等研究中。根據Hass-FABP基因cDNA序列設計PCR引物，在含本基因的克隆中擴增Hass-FABP基因的全長cDNA，或擴增編碼細胞外結構域的基因特異性強的區段，進行基因芯片的制作。
(4)煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在合成新的脂肪酸結合蛋白基因中的應用目前，昆蟲類的脂肪酸結合蛋白基因研究比較少，需要利用其他昆蟲的基因序列設計并合成引物。
(5)獲得抗煙夜蛾及鱗翅目害蟲轉基因植物利用基因工程技術，可以外導外源基因在植物表達的載體，將由干擾正常表達的基因導入植物細胞，可獲得抗蟲的轉基因細胞系及轉基因植株。
四.
圖1不同來源的FABP基因氨基酸序列比對。
使用Clustal W和Genedoc軟件對煙夜蛾FABP氨基酸與其它哺乳動物及昆蟲FABP的氨基酸進行多重聯配，結果表明，煙夜蛾的FABP延伸蛋白與鱗翅目近緣種美洲棉鈴蟲FABP的同源性高達96％，與煙草天蛾和家蠶的同源性分別達到了42％和40％。與雙翅目的果蠅、哺乳動物馬和牛的FABP同源性為32％，與人的FABP同源性為27％。
圖中英文含義H.assulta煙夜蛾H.zea美洲棉鈴蟲M.Sexta煙草天蛾B.mori家蠶E.caballus馬B.Taurus牛H.sapiens人D.melanogaster果蠅。圖中黑色代表100％同源性；灰色代表80％同源性。
圖2其他物種的FABP基因的進化關系。
進化樹分析更清晰的表明了Hass-FABP基因在進化過程中與其他昆蟲與動物的親緣關系，進化樹所需要的序列全部來自于NCBI中GenBank的基因數據庫。
五.
具體實施例方式實施例煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因的克隆過程1.實施例所用材料(1)供試昆蟲煙夜蛾由河南農業大學植物保護學院昆蟲實驗室用人工飼料單管飼養獲得。
(2)菌種及質粒pGEM-T Easy vector購自TaKaRa公司，大腸桿菌JM109均為本實驗室保存。
(3)主要試劑及工具酶總RNA抽提試劑RNAiso Reagent、用于RT-PCR的One Step RNA PCR Kit、質粒小樣快速抽提試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶HindIII和EcoR I，均購自TaKaRa公司，X-gal、IPTG試劑由Sangon公司生產，其它均為國產或進口分析純試劑。
2.實施例所采用的方法(1)總RNA提取選用5齡煙夜蛾幼蟲，取50mg脂肪體和血淋巴，在去除RNA酶的離心管中進行研磨，使用TaKaRa公司的RNAiso Reagent試劑，按照說明書進行總RNA的提取。
(2)引物設計根據GenBank中已登錄的美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)脂肪酸結合蛋白基因核苷酸序列(GenBank登錄號為AF074436)設計并合成引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’以上引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
(3)RT-PCR.以上述提取的總RNA為模板，按照One Step RNA PCR Kit說明書進行RT-PCR擴增。反應條件為50℃反轉錄30min；94℃變性2min；接著進行30個循環，循環條件為94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃延伸10min。擴增完畢后，用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化，并回收目的片段。
(4)PCR產物的克隆和鑒定按使用說明將回收的PCR產物克隆到pGEM-TEasy vector，然后轉化大腸桿菌JM109，藍白斑篩選，隨機挑取一白色菌落，培養后提取質粒(質粒提取使用TaKaRa公司質粒小樣快速抽提試劑盒)，用HindIII和EcoR I雙酶切方法，鑒定重組克隆pGEM/Hass-FABP。
(5)序列測定和分析DNA的序列測定在TaKaRa公司進行。
序列測定和結果分析表明，煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因開放式閱讀框架全長399bp，編碼為132個氨基酸殘基，預測分子量為15.0KDa，等電點為5.83(http//www.expasy.ch/)。該基因已在GenBank中登記，登錄號為DQ299942。
序列表<110>河南農業大學<120>煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因及其應用<160>2<210>1<211>399<212>DNA<213>煙夜蛾(Helicoverpa assulta)<400>1atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc 60aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc 120aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt 180gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag 240accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac 300agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc 360aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa399<210>2<211>132<212>PRT<213>煙夜蛾(Helicoverpa assulta)<400>2Met Ala Phe Phe Gly Lys Glu Tyr Lys Phe Glu Lys Gln Glu Asn15 10 15Phe Glu Asp Phe Val Asn Ala Leu Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr20 25 30Gln Gly Tyr Leu Ala Tyr Thr Pro Thr Leu Lys Phe Thr Gln Asp35 40 45Gly Asp Ser Tyr Thr Val Ile Thr Ile Thr Pro Lys Thr Lys Ser
50 55 60Glu Val Thr Phe Lys Ser Gly Val Glu Phe Asp Asp Asn Asn Ala65 70 75Asn Arg His Cys Lys Thr Thr Tyr Thr Val Ala Gly Asp Thr Ile80 85 90Thr Gln Val Gln Lys Tyr Asp Asp Gly Asn Ser Leu Thr Ile Thr95 100 105Arg Lys Phe Ser Gly Asn Glu Met Val Val Thr Leu Ala Thr Ser110 115 120Lys Trp Asp Gly Val Ala Arg Arg Tyr Tyr Lys Ala125 130 13權利要求
1.一種煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因，其特征是煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因全長cDNA序列，具有如下所示的399bp的核苷酸序列1 atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc61 aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc121 aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt181 gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag241 accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac301 agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc361 aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa。
2.根據權利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因，其特征是煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因編碼的蛋白，編碼長為132個氨基酸殘基，該蛋白的氨基酸序列為1 M A F F G K E Y K F E K Q E N F E D F V21 N A L G L T P E Q T Q G Y L A Y T P T L41 K F T Q D G D S Y T V I T I T P K T K S61 E V T F K S G V E F D D N N A N R H C K81 T T Y T V A G D T I T Q V Q K Y D D G N101 S L T I T R K F S G N E M V V T L A T S121 K W D G V A R R Y Y K A *。
3.含有權利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于為獲得煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因核苷酸序列，設計并合成的引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’。
4.權利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在對煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲防治中的應用。
5.權利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在煙夜蛾基因芯片中的應用。
6.權利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在合成新的脂肪酸結合蛋白基因中的應用。
7.利用權利要求1所述的煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因在獲得抗煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明涉及昆蟲基因工程技術領域，特別是涉及一種煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因及其應用。煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因全長cDNA為399bp，蛋白質編碼為長132個氨基酸殘基，預測分子量15.0kDa。煙夜蛾脂肪酸結合蛋白基因的發現，不僅對煙夜蛾及其他鱗翅目害蟲的防治具有重要意義，而且對其他昆蟲乃至動物的脂肪酸結合蛋白的研究也具有重要意義。
文檔編號C07K14/435GK1876816SQ200610017859
公開日2006年12月13日 申請日期2006年5月30日 優先權日2006年5月30日
發明者尹新明, 張濤, 安世恒 申請人:河南農業大學