專利名稱：：新型半胱氨酸減少的疏水蛋白融合蛋白、其生產和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及新型疏水蛋白融合蛋白、其生產和用途。
背景技術：
：疏7K蛋白是約ioo個氨基酸的小蛋白質，其為絲狀真菌的特征蛋白質并且不存在于其它生物體中。最近，在天藍色鏈霉菌(5^印to/^CMCO^'CO/or)中發現疏水蛋白類蛋白質，稱為"Chaplins"，而且其同樣具有高表面活性的性質。Chaplins可以在7K-空氣界面組裝形成淀粉樣原纖維(Classen等人2003GenesDev1714-1726;Elliot等人2003，GenesDev.17，1727-1740)。疏水蛋白以不溶于水的形式分布于多種真菌結構，例如氣生菌絲、孢子、子實體的表面。疏水蛋白的基因從子嚢菌(ascomycetes)、半知菌(deuteromycetes)和擔子菌(basidiomycetes)中分離而來。某些真菌含有多于一個的疏水蛋白基因，例如普通裂褶菌(5Wi/zop/^〃MWCo附/w朋e)、灰蓋鬼傘(C0/7/7VlW5""Viere"51)、構巢曲霉(ylspe/^7/M51fMV/M/flW51)。明顯地，多種疏7片蛋白涉及真菌發育的不同階段。推測所述疏水蛋白負責不同的功能(vanWetter等人，2000，Mol.Microbiol.，36,201-210;Kershaw等人1998，FungalGenet.Biol,1998，23，18-33)。除了為產生氣生菌絲減少水的表面張力以外，疏水蛋白的生物學功能還有使孢子疏水化(W6sten等人1999，Curr.Biol.，19,1985-88;Bell等人1992，GenesDev.,6，2382-2394)。此外，疏水蛋白^皮用于內村地衣子實體中的氣體通道，并且作為真菌病原體辨別植物表面系統的成分(Lugones等人1999，Mycol.Res.，103，635-640;Hamer和Talbot,1998，Curr.OpinionMicrobiol.,巻1，693-697)。互補實驗證明單個類型中的疏水蛋白在某種程度上可以在功能上相互取代。先前公開的疏水蛋白只能以中等產量制備，并且用常用的蛋白質化學純化和分離方法純化，目前在遺傳方法的輔助下供應更大量的疏水蛋白的嘗試尚未成功。發明主題本發明的主題是提供新的疏水蛋白及其生產方法，所述方法使能夠經濟地生產疏水蛋白并在多種
技術領域：
使用。發明詳述本發明涉及通用結構式(I)的多肽其中X可以是任何20種天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、甲疏氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸Lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，且在X的指數表示氨基酸數，指數n和m是0-500之間，優選在15-300之間的數，p是1-250之間，優選在1-100之間的數，并且C是半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸或蘇氨酸，其中至少4個由C指定的殘基為半胱氨酸，附帶條件是縮寫為Xn或Xm或Xp的肽序列的至少一個是長度至少為20個氨基酸的非天然連接于疏水蛋白的肽序列，該多肽在包被玻璃表面之后使接觸角改變至少20。。C1到<:8指定的#^酸優選為半胱氨酸，但是它們也可能被其它相似的大氨基酸(優選丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸)所代替。然而，C1到<:8位置的至少4個、優選至少5個、尤其優選至少6個且尤其至少7個應該包含半胱氨酸。本發明蛋白質中的半胱氨酸可以是還原形式或彼此形成二疏鍵。尤其優選形成分子內C-C橋，特別是具有至少1個、優選2個、尤其優選3個和特別尤其優選4個分子內二石克鍵的那些。當如上所述用相似的大氨基酸代替半胱氨酸時，那些彼此之間形成分子內二硫鍵的C位置的配對最好也被代替。如果在以X指定的位置也使用半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，可以相應改變通式中單個半胱氨酸位點的數量。尤其有利的多肽是那些具有通式(II)的多肽Xn-C、X3-25-G2國Xo-2畫C3誦X5-50-C4誦X2-35畫G5-X2-l5-C6曙Xo-2畫C7-X3-35-C!8-Xm(II)其中X可以是任何20種天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸Lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，在X的指數表示氨基酸數，指數n和m是2-300之間的數，并且C是半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，其中至少4個由C指定的殘基為半胱氨酸，附帶條件是縮寫為Xn或Xm的肽序列的至少一個是長度至少為35個氨基酸的非天然連接疏水蛋白的肽序列，該多肽在包被玻璃表面之后使接觸角改變至少20。。特別尤其有利的是那些具有通式(III)的多肽Xn隱C、X5-9-C2國C3畫Xii-39畫C4-X2-23-C5畫X5-9-C6-C7-X6—l8曙C8-Xm(HI)其中X可以是任何20種天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、組氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、異亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、蘇氨酸Thr、天冬酰胺Asn、賴氨酸Lys、纈氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，在X的指數表示氨基酸數，指數n和m是0-200之間的數，并且C是半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，其中至少6個由C指定的殘基為半胱氨酸，附帶條件是縮寫為Xn或Xm的肽序列的至少一個是長度至少為40個氨基酸的非天然連接疏水蛋白的肽序列，該多肽在包被玻璃表面之后使接觸角改變至少20°。所述本發明的優選實施方案是具有通用結構式(I)、(II)或(III)的多肽，該結構式包含至少一種I類疏水蛋白，優選至少一個dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2疏水蛋白，或其部分或4汙生物。下文的序列表對所述疏水蛋白進行了結構表征。也可能將多個(優選2個或3個)相同或不同結構的疏水蛋白彼此連接，并且連接于并非天然連接疏水蛋白的相應適宜多肽序列上。本發明尤其優選的實施方案是具有SEQIDNO:20、22、24所示的多肽序列的新蛋白質，及其編碼核酸序列，具體是SEQIDNO:19、21、23中定義的序列。尤其優選的實施方案還包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通過取代、插入或缺失至少1個至多10個、優選5個、更優選所有氨基酸的5%而產生的蛋白質，所述蛋白質仍然具有起始蛋白質至少50%的生物特性。此處蛋白質的生物學特性指上述接觸角的改變，如實施例10中所述。本發明的蛋白質中至少一個縮寫為Xn或Xm或Xp位置的多肽序列不是天然連接于疏水蛋白的，該多肽序列包含至少20個、優選至少35個、尤其優選至少50個、和尤其至少100個氨基酸(也指下文中的融合配偶體)。這是為了說明所述蛋白質可能由自然條件下并不以這種形式共同存在的疏水蛋白部分和融合配偶體部分組成。融合配偶體部分可能選自多種蛋白質。對于多數融合配偶體，其也可能連接于一個疏水蛋白部分，例如連接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(Xm)或中間(Xp)。然而，也可能例如兩個融合配偶體連接于本發明蛋白質的單個位置(Xn或Xm)。尤其優選的融合配偶體部分是能夠使本發明的蛋白質包被玻璃表面的多肽序列，并且其引起蛋白質處理的玻璃表面對去污劑處理具有抗性，這在實驗部分(實施例10)中有詳細描述(例如1%SDS在80。C處理10分鐘)。尤其合適的融合配偶體部分是在微生物、特別是大腸桿菌(五.co/,)或枯草芽孢桿菌(5fl"7/船s"6rifc)中天然存在的多肽。此類融合配偶體的實例是序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)和硫氧還蛋白。同樣高度適用的是所述序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、優選10-卯％、尤其優選25-75%。此處優選C末端缺失體，例如僅由N-末端前75個氨基酸組成的yaad片段，或其中與所述序列相比有單個氨基酸或核苷酸改變的序列。例如可以在yaad和yaae序列的C-末端附加另外的氨基酸，特別是2個另外的氨基酸(優選精氨酸、絲氨酸)。也可能優選與天然存在的序列相比，插入到yaae序列中另外的氨基酸，例如SEQIDNO:17和18中的第2號氨基酸(甘氨酸)。其它融合配偶體、尤其是那些在通式(I)的Xp位置的融合配偶體的實例是酶活性結構域、抗微生物結構域、作為受體興奮劑/拮抗劑的多肽序列、色素、調味劑和芳香劑、金屬結合結構域。還可能產生與多種活性化合物和效應子共價結合的特異性偶聯位點。例如，在該環中插入另外的賴氨酸，以便在技術人員所公知的異雙功能(heterobifunctional)連接的幫助下，通過伯氨基基團(primaryaminogroup)使活性化合物和效應子特異的連接于疏水蛋白分子主鏈。此外，也可能在兩個融合配偶體的連結點處插入另外的氨基酸，導致在核酸水平上新產生或鈍化限制性內切酶識別位點。本發明蛋白質的多肽序列還可能通過例如糖基化、乙酰化或通過其它與例如戊二醛化學交聯的方法加以修飾。本發明蛋白質的一個特性是當用所述蛋白質包^L4面時改變表面的性質。實驗上是通過在以蛋白質包被表面之前和之后測量水滴接觸角，并確定兩次測量的差別來確定所述表面性質的改變。用于測量接觸角的精確實驗條件在實施例10中的實驗部分說明。在這些條件下，本發明的蛋白質具有^f吏接觸角至少增大20。，優選25°，尤其優選30。的性質。目前已知的疏水蛋白中，疏水蛋白部分的極性和非極性氨基酸的位置是保守的，導致特征性的疏水性圖譜。根據生物物理學性質和疏水性的差異將目前已知的疏水蛋白分為兩類，I類和II類(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol"32,413-437)。I類疏水蛋白組裝的膜高度不可溶(即使是升高溫度在1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)中也是如此)，并且只能通過濃縮的三氟乙酸(TFA)或甲酸而再次解離。與之相反，II類疏水蛋白的組裝形式較不穩定。它們通過60%濃度的乙醇或1。/。SDS(在室溫)即可再次解離。這種對于溶劑和去污劑的高穩定性是疏水蛋白的特殊性質，并且其將本發明的多肽包被與表面上多種蛋白質形成的"非特異性"蛋白質包被區分開來。氨基酸序列的比較揭示，在II類疏水蛋白中C3和C4半胱氨酸之間區域的長度明顯小于I類疏水蛋白。此外，II類疏水蛋白比I類疏水蛋白具有更多帶電荷的氨基酸。本發明還涉及生產本發明蛋白質的方法。這些多肽可以通過肽合成的成熟技術化學制備，例如通過Merrifield固相合成。然而，尤其有用的是基因工程方法，其中兩個分別編碼融合配偶體和疏水蛋白部分的核酸序列(優選DNA序列)組合，從而通過組合核酸序列的基因表達在宿主生物體中產生所希望的蛋白質。此處用于所述構建方法的合適的宿主生物體(生產生物體)可以是原核生物(包括古細菌C4rc/mefl))或真核生物，尤其是細菌包括嗜鹽菌(/^&6a"^7Vi)和甲烷3求菌(附e^flwococc/)，真菌，昆蟲細胞，植物細胞和哺乳動物細胞，尤其優選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌08"7/附黑曲霉(/1^^^///船"&^)、巴斯德畢赤酵母(尸Zc/^Vi/7aston》、假單胞菌屬物種(jRseM^附owass/;ec.)、乳酸桿菌(/flcto^fl"7//)、多形漢遜酵母(/Tff"se/iw/fl/7(/j;附o/7^")、里氏木霉(7Wc/^&r附fl"ew/)、SF9(或相關細胞)等等。本發明還涉及表達構建體的用途，所述表達構建體包含在調控核^列的遺傳控制下編碼本發明的多肽的核酸序列，并且本發明也涉及包含至少一個所述表達構建體的載體。本發明的構建體優選包含特定編碼序列的5，上游啟動子和3，下游終止序列，適用的情況下還包含各自與所述編碼序列有效連接的其他常用調控元件。"有效連接，，指啟動子、編碼序列、終止子和適用情況下的其他調控元件的有序排列，從而使每個調控元件能夠實現其表達編碼序列所需的功能。有效連接序列的實例為尋靶序列以及增強子、多腺苷酸化信號等等。其它調控元件包含可選標記、擴增信號、復制起點等等。合適的調控元件在例如Goeddel，基因表達技術酶學方法185，學術出版社，SanDiego，CA(19卯)中描述。除這些調控序列以外，可能在實際結構基因的上游仍存在對這些序列的天然調控，且適用的情況下可對之進行遺傳修飾，從而通過關閉天然調控而增強基因表達。優選的核酸構建體最好還包含一個或多個與啟動子功能性連接的上述增強子序列，以增強核酸序列的表達。其他有利的序列，例如其他的調控元件或終止子也可插入到DNA序列的3，末端。在構建體中可能具有本發明的核酸的一個或多個拷貝。如果為篩選所述構建體所需，構建體也可能包含其他標記，例如抗生素抗性或營養缺陷型補償基因。例如，對本發明方法有利的調控序列存在于啟動子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、入-PR啟動子或啟動子中，這些啟動子最好在革蘭氏陰性菌中使用。其他有利的調控序列存在于例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02，和酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以^^用人工啟動子進行調控。為了在宿主生物體中表達，最好將核酸構建體插入例如能夠使基因在宿主細胞中最優表達的載體(例如質粒或噬菌體)。除質粒和噬菌體以外，載體也指技術人員所公知的任何其它載體，即例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)，轉座子，IS元件，噬粒，粘粒，和線性或環狀DNA，以及農桿菌系統。這些載體可以在宿主生物體中自主復制或隨染色體復制。這些載體構成本發明的其他實施方案。合適質粒的實例是大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III"3-Bl、tgtll或pBdCl，鏈霉菌(5^印to附yc^)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，桿菌的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌(Co/y"Wfl"e/7"w)的pSA77或pAJ667，真菌的pALSl、pIL2或pBB116,酵母中的2a、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23,或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述質粒是可能質粒的一小部分選擇。其它質粒是技術人員所公知的，并且能夠在例如《克隆栽體》(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。為了表達其它存在的基因，核酸構建體也最好包含3，-末端和/或5，-末端調控序列來增強表達，根據宿主生物和基因或所選基因對所述序列加以選擇，以達到最佳表達。這些調控序列旨在使基因和蛋白質特異性表達。這意味著取決于宿主生物體，例如基因只在誘導后表達或過表達，或者立即表達和/或過表達。在這點上，優選引入的調控序列或因子具有正面影響，并且增強其被引入的基因的表達。因此，使用強轉錄信號(例如啟動子和/或增強子)在轉錄水平增強調控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通過例如改良mRNA穩定性來增強翻譯。在載體的另一實施方案中，包含本發明核酸構建體或本發明核酸的載體也可能以線性DNA的形式被有利地引入微生物中，并通過異源或同源重組的方式整合到宿主生物體的基因組中。此線性DNA可能由線性化載體(例如質粒)組成，或僅由本發明的核酸構建體或核酸組成。為實現生物中異源基因的最佳表達，最好根據生物中特定的密碼子使用來修飾核酸序列。通過計算機分析所研究生物的其他已知基因，可以容易的確定密碼子的使用。將合適的啟動子與合適的編碼核苷酸序列和終止信號或多聚腺苦酸信號融合來制備表達盒。為此使用的常規重組和克隆技術見于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，現代分子生物學實驗方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。為了在合適宿主生物體中表達，重組核酸構建體或基因構建體最好插入宿主特異的載體，該栽體能夠使基因在宿主中最優表達。載體是技術人員所熟知的，并且能夠在例如"克隆載體"(PouwelsP.H.等人，編輯，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用本發明的載體制備例如由至少一個本發明的載體轉化的重組微生物，并且其可用于生產本發明所用多肽。最好將本發明的上述重組構建體引入合適的宿主系統并表達之。在此情況下，優選使用技術人員熟知的常用克隆和轉染方法，例如共沉淀、原生質體融合、電穿孔法、逆轉錄病毒轉染等等，以引起所述核酸在特定表達系統中表達。合適的系統在例如現代分子生物學實驗方法，F.Ausubel等人編輯，WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等人，分子克隆實驗室操作手冊，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述。也可以根據本發明制備同源重組微生物。為此，可制備包含至少一部分本發明的基因或編碼序列的載體，適用的情況下，所述編碼序列中引入至少一個氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代，從而修飾(例如功能性破壞)本發明的序列(敲除載體)。引入的序列可為例如相關微生物的同源物，或由哺乳動物、酵母或昆蟲來源衍生而來。或者，可設計用于同源重組的載體，從而使內源性基因在同源重組時發生突變或其他改變，但仍然編碼功能性蛋白質(例如改變上游調控區域由此改變內源性蛋白質的表達)。本發明所用的基因的改變的部分位于同源重組載體中。適合同源重組的載體的構建在例如Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.(1987)Cell51:503中描述。適合本發明的核酸或核酸構建體的重組宿主生物體原則上是任何原核或真核生物體。最好使用微生物例如細菌、真菌或酵母作為宿主生物體。革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，優選腸桿菌科(五rtten^flCte/7'flCefle)、假單月包菌科(i^e"flfo/wo"flw/ffceae)、才艮瘤菌科(i/w'zo6/ttceae)、鏈霉菌科(/5Vr印to附^cCflcefle)或諾卡氏菌科(iVocfl/^flfce"e)的細菌，特別優選4吏用的細菌為埃希氏菌屬(^^&r/c/h'a)、假單胞菌屬、鏈酶菌屬、諾卡氏菌屬、伯克霍爾德菌屬CB"rA:/^/^Wfl)、沙門氏菌屬(^Vz/mo/ie//")、農桿菌屬或紅球菌屬(i/ltfrf(7C^CC"S)的細菌。依據宿主生物體，按技術人員公知的方法生長或培養本發明方法中使用的生物體。卩敝生物通常生長在液體培養基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機氮源的形式例如酵母提取物，或例如硫酸銨等鹽類)、微量元素(例如鐵鹽、錳鹽和鎂鹽)、以及適用情況下的維生素，生長溫度在0'C到100。C之間，優選10'C到60。C，同時供以氧氣。此種情況培養液pH值可以維持或不維持在固定值，即在培養過程中可以調節或不調節。可以進行分批發酵、半分批發酵或連續培養。可以在發酵最初開始時引入營養素，或以半連續或連續方式進行隨后加料。可以通過實施例中所描述的方法從生物體中分離酶，或者在反應中使用酶粗提物。可以用重組方法制備本發明的多肽或其功能生物活性片段，通過培養產生多肽的微生物，適用的情況下誘導表達多肽，而且從培養液中分離所述多肽。如果需要，也可以通過此種方法在工業上生產多肽。可以通過已知方法培養和發酵重組孩史生物。例如細菌可以在20-40。C,pH6-9條件下，在TB培養基或LB培養基中繁殖。合適的培養條件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆:實驗室操作手冊，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中詳細描述。如果本發明使用的多肽并非分泌至培養基中，那么就要破壞細胞，通過已知的多肽分離方法從溶菌產物中獲得產品。正如所預期的，通過高頻超聲、高壓(例如在弗氏壓碎器中)、滲透、使用去污劑、水解酶或有機溶劑、勻漿等手段，或通過所列出的方法中的多個的組合來破壞細胞。多肽可以用已知的層析方法純化，例如分子篩層析(凝膠過濾法)，例如Q瓊脂糖層析，離子交換層析和疏水層析，以及使用其它常用方法，例如超濾、結晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法在例如Cooper，F.G"BiochemischeArbeitsmethoden，[originaltitle:Thetoolsofbiochemistry]，VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R"蛋白質純化，SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。最好通過使用載體系統或寡核苦酸分離重組蛋白質，所述寡核苷酸以特定核苷酸序列延伸cDNA,從而編碼例如有利于純化的改變的多肽或融合蛋白質。此類合適的修飾的實例是作為錨起作用的"標簽"，例如六組氨酸錨的修飾、或能夠作為抗原被抗體識別的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D"1988，抗體:實驗室操作手冊，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合適的標簽是例如HA、鉤調節蛋白-BD、GST、MBD;幾丁質-BD、鏈霉親和素-BD-avi-標簽、Flag-標簽、T7等等。這些錨可以用于將蛋白質附著在固體載體上，例如聚合體基質，例如其可填充到層析柱中，或用于微孔滴定板或其它載體。相應的純化方法可以從商品化的親和標簽供應商那里獲得。在顯微鏡下可以觀察到許多疏水蛋白包被的真菌表面(孢子、子實體、菌絲)，其特征結構稱為"小棒(rodlets)"。類似的厚度約為10nm的小棒也可以在疏水蛋白包被的親水表面檢測到(例如玻璃、云母等)(W6sten等人，1993，PlantCell,5，1567-1574)。由于包祐束面的疏水蛋白的特殊性質(例如抗去污劑，例如1%濃度的SDS溶液)，這些蛋白質具有用于許多工業應用的極大潛能。多種專利文件涉及此類應用的實例，此處引用其中關于疏水蛋白的應用。(^動f"說'^我#請乂<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>疏水蛋白(尤其是I類疏水蛋白)在工業上的利用至今還不成功，這是由于缺乏有效的生產和純化的方法。先前描述的從天然來源(孢子、真菌菌絲等等)提取的方法只能產生亳克級的材料量(例如WO96/41882)。通過重組生產多種生物生產者的途徑同樣被證明非常復雜，并且不是很令人滿意。本發明的疏水蛋白，其融合形式(即與融合配偶體部分一起)以及分離的形式兩者都具有所希望的疏水蛋白性質。因此本發明的蛋白質既可能直接用作融合蛋白，又可以在剪切后除去融合配偶體而用作"純化的，，疏水蛋白。當需要移除融合配偶體時，推薦在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶體部分之間摻入潛在的切割位點(蛋白酶的特定識別位點)。尤其合適的切割位點包括通過生物信息學工具能夠確定的那些否則將既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶體部分中的肽序列。尤其有用的是例如在甲硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介導的Xa因子切割、腸激酶切割、凝血酶、TEV切割(煙草蝕紋病毒蛋白酶)。實施例實施例1克隆yaad-His6/yaaE-His6的準備工作用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)進行多聚酶鏈式反應。所使用的模板DNA是枯草芽孢桿菌基因組DNA,獲得的PCR片段包含枯草芽孢桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，和在其末端的Ncol和BgIII限制性切割位點。純化PCR片段，并用限制性內切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到QiagenpQE60載體中，該栽體預先用限制性內切酶Ncol和BglII線性化。這樣獲得的載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可以分別用于表達由YAAD::HIS6和YAAE::HIS6組成的蛋白質。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實施例2ayaad-疏水蛋白DewA-His6的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417進行多聚酶鏈式反應。所使用的模板DNA是構巢霉菌基因組DNA。獲得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的編碼序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位點。純化PCR片段，并用限制性內切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到載體pQE60YAAD#2中，該載體預先用限制性內切酶BglII線性化。這才羊獲得的載體#508用于表達由YAAD::Xa::dewA::HIS6組成的融合蛋白質。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC實施例2b具有抗菌性質的嵌合體融合蛋白質的制備為了引入具有抗菌性質的肽序列，遵循以下克隆策略從我們的Yaad-DewA表達質粒"pQE60YaaddewAHis"開始，通過半胱氨酸3和4之間的融合PCR將抗菌肽序列插入。圖2la)PCR區域YaaD-dewA到半胱氨酸3，包括T7novispirin突出端模板pQE60YaaDdewA6His引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20-mer引物2AGGTTTTTGCAGCAAGCGATCGAGCCGA)74-merPCR條件55。C，1118bplb)PCR區域novispirin突出端到6His/終止模板pQE60YaaDdewA6His引物引物3引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR條件54°C，306bp2)退火PCR將PCRla和lb產物50pmol組合，用Pfu-聚合酶進行退火PCR(95°Cl分鐘，72'C5分鐘-10個循環)隨后加入外部引物(outsideprimers),進行通常的35個循環的PCR。引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20-mer引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR條件53。C，1404bp3)連接載體pQE60YaaDdewA6His用Ncol/Kpnl消化制備凝膠，分離3428bp的條帶插入片段退火PCR的產物用NcoI/Kpnl消化制備凝膠，分離1350bp的條帶4)轉化XL10/TG10化學感受態細胞(chemocomp.cells)圖3pQE60YaaDdewACys3GIO譜ispirinla)PCR區域YaaD國dewA到Cys3,包括GIOnovispirin突出端模板pQE60YaaDdewA6His引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20-mer引物5AGGTTTTTGCAGCAAGCGATCGAGCCGA)74-merPCR條件55。C,1118bplb)PCR區域novispirin突出端到6His/終止圖4模板pQE60YaaDdewA6His引物引物6引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR條件54°C，306bp-mer2)退火PCR將PCRla和lb產物50pmol組合，用Pfu-聚合酶進行退火PCR(95°Cl分鐘，72°C5分鐘-10個循環)隨后加入外部引物，進行普通的35個循環的PCR。引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20mer引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR條件53°C,1404bp3)連接載體pQE60YaaDdewA6His用Ncol/Kpnl消化制備凝膠，分離3428bp的條帶插入片段退火PCR的產物用Ncol/Kpnl消化制備凝膠，分離1350bp的條帶4)轉化XL10/TG10化學感受態細胞圖5蛋白質的純化和評估與實施例8-10類似。可以測定抗菌性質抗菌作用的測定在6-孔微量滴定板中進行，該滴定板填充相應生長所需的瓊脂(LB、YM)。然后將平板培養過夜。在測定中使用的微生物如下枯草芽孢桿菌巨大芽胞桿菌大腸桿菌XU必/weMi膝黃微球菌(M"/owoccm51/"teWS)泛菌(i^f"^a)庫特菌(ZTm,幼/fl)假單胞菌屬物種肉軒菌(Ow朋6a"e"'w附)白色念珠菌(CVm&V/fffl幼Zcfl"s)尖孑包錄刀菌(F"5W'"/fiftx^5/ww附)除肉桿菌和假單胞菌以外的所有微生物有機體(MO)都在20mlYPD培養基中培養過夜(30。C，200rpm);肉桿菌在TSB中培養，假單胞菌在CASO中培養。將20pl特定細菌或真菌的懸浮液應用于微孔滴定板的每個孔，并輕輕鋪平。使懸浮液在某種程度上浸入瓊脂。然后將疏水蛋白溶液(同樣20jtl)應用于孔的中央；在30。C培養箱中培養瓊脂平板。在過夜培養后已經可以〗見測到最初結果通過應用點周圍沒有生長物來揭示抗菌作用，而缺乏抗菌作用的孔被完全長滿。實施例3yaad疏水蛋白RodA-His6的克隆質粒#513的克隆類似于質粒#508,使用寡核苷酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實施例4yaad疏7JC蛋白BASF1-His6的克隆質粒然07的克隆類似于質粒弁508，使用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成的DNA序列，疏水蛋白BASF1(見附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例5yaad疏水蛋白BASF2-His6的克隆質粒#506的克隆類似于質粒#508，使用寡核普酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成的DNA序列，疏水蛋白BASF2(見附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實施例6yaad疏水蛋白SC3-His6的克隆質粒#526的克隆類似于質粒#508，使用寡核苷酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是Schyz叩hyllumcommunecDNA(見附件)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實施例7yaad疏水蛋白DewA-His6重組大腸桿菌菌抹的發酵將含有表達yaad疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林的3mlLB液體培養基接種于15mlGreiner管中。于37。C在振蕩器上以200rpm培養8小時。將1ml此預培養液各自接種于2個1升有塞子錐形瓶中的250mlLB培養基中(+100ng/ml氨千青霉素)，在37。C以180rpm振蕩培養9小時。將0.5升的預培養液(相對于水測量OD6。。肌1:10)接種于13.5升的LB培養基(+100jig/ml氨芐青霉素)中，置于20升的發酵罐。在OD6()。nm約3.5時添加140ml的100mMIPTG。3小時以后，將發酵罐冷卻到10°C，并通過離心除去發酵液。細胞沉淀用于進一步的純化。實施例8重組疏水蛋白融合蛋白的純化(帶有C-末端His6標簽的疏水蛋白融合蛋白的純化)100g的細胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸鈉緩沖液補足到總體積為200ml，并將沉淀重懸。懸浮液用T25型高速分散器Ultraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)處理10分鐘，隨后為了降解核酸，再與500單位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室溫培育1小時。在破壞細胞之前使用玻璃萃取柱(Pl)進行過濾。為了破壞細胞和剪斷剩余的基因組DNA，用勻漿器在1500巴進行2次處理(MicrofluidizerM畫110EH;MicrofluidicsCorp.)。4夸勻漿液離心(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心筒，60分鐘，4°C，12000rpm，23000g)，上清置于冰上，用100mlpH7.5的磷酸鈉緩沖液重懸沉淀。重復3次離心和重懸，在第3次重復時磷酸鈉緩沖液中包含1%SDS。重懸以后，將溶液攪拌l小時，然后進行最終離心(SorvallRC-5B，GSA轉子，250ml離心筒，60分鐘，4°C，12000rpm，23000g)。根據SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最終離心的上清液部分(圖1)。實驗顯示疏水蛋白可以以包涵體的形式存在于相應大腸桿菌中。50ml含疏水蛋白的上清液應用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液平衡的50ml鎳-瓊脂糖高性能17-5268-02柱(Amersham)。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗柱，隨后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液洗脫疏水蛋白。為了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液透析。圖1描述本發明疏水蛋白的純化1泳道應用于鎳-瓊脂糖柱的溶液(l:lO稀釋)2泳道流出液=清洗步驟的洗脫液3-5泳道洗脫級分的OD280峰圖1中本發明的疏水蛋白分子量約為53kD。一些較小條帶代表所述疏水蛋白的降解產物。實施例9具有疏水蛋白表面的包#7評估疏水蛋白或疏水蛋白融合蛋白的包被性質優選以玻璃和聚四氟乙烯(Teflon)分別作為親水和疏水表面的模型進行評估。標準包被實驗玻璃-疏水蛋白濃度1-100pg/mL-玻璃片在50mMpH4醋酸鈉+0.1%吐溫20中培育過夜(溫度80。C)-包蜂皮以后，在蒸餾水中清洗國然后于80。C在l。/oSDS中培育IO分鐘-在蒸餾水中清洗聚四氟乙烯(Teflon):-濃度1-100pg/mL-聚四氟乙烯(Teflon)平板在10mMpH8的Tris中培育過夜(溫度80。C)-包3皮以后，在蒸餾水中清洗-然后于80。C在1%吐溫20中培育10分鐘-在蒸餾水中清洗-然后于80。C在l。/oSDS中培育10分鐘-在蒸餾水中清洗樣品在空氣中干燥，測定5pl水滴的接觸角(單位為度)，得到如下值，例如根據實施例8以yaad-DewA融合蛋白進行實驗(對照無蛋白質；yaad-dewA-his6:100pg/ml融合蛋白西己4禺體)_80°C,ly。SDS處理之后聚四氟乙烯Teflon玻璃對照96.830yaad97.438.7100ng/ml77.776.850fig/ml85.977.910嗎/ml83.574.55fig/ml10470.31fig/ml104.973實施例10具有疏水妄白表面的包^L/評估玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Mannheim,Germany):-疏水蛋白濃度100嗎/mL畫玻璃片在50mMpH4的醋酸鈉+0.1%吐溫20中培育過夜(溫度80°C)-包^f皮以后，在蒸餾水中清洗-然后于80。C在1%SDS的蒸餾水溶液中培育10分鐘-在蒸餾水中清洗樣品在空氣中干燥，且測定5pl水滴的接觸角(單位為度)。接觸角的測量用Dataphysics接觸角系統OCA15十儀器，應用軟件為SCA20.2.0.(2002年11月)。根據制造商的說明書進行測量。未處理的玻璃接觸角為30±50，以根據實施例8(yaad-dewA-his6)的功能性疏水蛋白包被的玻璃接觸角為75±5。。序列表中DNA和多肽序列的序列命名<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權利要求1.通用結構式(I)的多肽Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-Xp-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm(I)其中X可以是任何20種天然存在的氨基酸，n和m是0-500之間的數，p是1-250之間的數，C是半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸，有至少4個由C指定的殘基為半胱氨酸，附帶條件是至少一個縮寫為Xn或Xm或Xp的肽序列是長度至少為20個氨基酸的非天然連接至疏水蛋白的肽序列，該多肽在包被玻璃表面之后使接觸角改變至少20°。2.根據權利要求l的多肽，其中結構式(I)包含I類疏水蛋白。3.根據權利要求l的多肽，其中結構式(I)包含的疏水蛋白選自dewA、rodA、sc3、hypA、hypB、basfl、basf2組成的組。4.根據權利要求1的多肽，其中結構式(I)包含選自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14的序列。5.根據權利要求l的多肽，其中Xn或Xm包含選自SEQIDNO:16、18的多肽序列。6.根據權利要求1的多肽，其中Xn或Xm或Xp是(His)w。序列。7.根據權利要求1的多肽，其中結構式(I)包含的多肽選自SEQIDNO:20、22、24組成的組。8.編碼權利要求1-7中定義的多肽的核酸。9.產生權利要求l-7中定義的多肽的方法，該方法是通過在宿主生物體中表達權利要求8中定義的核酸，并且，如果合適則在純化之后，分離由此獲得的蛋白質。10.根據權利要求9的方法，其中使用的宿主生物體是大腸桿菌。11.權利要求1-7中定義的疏水蛋白用于表面包被的用途。全文摘要本發明涉及通用結構式(I)的多肽及其生產和用途。文檔編號C07K14/37GK101193911SQ200680020577公開日2008年6月4日申請日期2006年6月9日優先權日2005年6月10日發明者C·博爾施韋勒,H·巴爾格,H-G·勒邁爾,M·考羅什,T·薩布科夫斯基申請人:巴斯福股份公司