專利名稱：檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑c的免疫比濁試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及免疫比濁的檢測方法，尤其涉及檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒及其制備方法。
背景技術：
半胱氨酸蛋白酶抑制劑C快速檢測試劑盒，可用于人尿液、血漿和血清檢測。血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C是一個比較接近理想的反映腎小球濾過功能的內源性標志物，研究資料已表明，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C是較血清肌酐(Scr)有更高的敏感性和特異性，較為理想的反映腎小球濾過率(GFR)的內源性標志物。在腎移植中的應用在腎移植術中，移植腎的GFR可作為觀察急、慢性排斥反應及免疫抑制劑的腎毒性指標之一，靠緩慢升高的Scr往往不能及時、準確反映移植腎的GFR等功能，而Cystatin C則可作為監測腎移植功能的良好指標。在糖尿病中的應用血Cystatin C是一個比較敏感和實用的檢出糖尿病腎病的指標，通過定期檢查糖尿病患者的血清Cystatin C,可及時發現GFR改變。在高血壓病中的應用40%以上的高血壓病患者在中、晚期可并發高血壓腎病。據臨床觀察研究發現高血壓致腎損害分為三個階段其中第一階段腎小球濾過率基本正常，而腎內壓增加；第二階段腎小管高壓性損傷，出現α-微球蛋白等，以及腎小球早期損傷,血Cystatin C升高；第三階段腎小球硬化，腎小管萎縮,血Cystatin C明顯升高。所以，臨床定期監測高血壓病患者的血清Cystatin C水平，可以及時發現高血壓病所導致的早期腎功能損傷，為開展早期預防、診斷和治療創造條件。顆粒增強免疫透射比池法(particle—enhancedturbidimetric immunoassay,PETIA)是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法，其基本原理是一定粒徑膠乳顆粒的表面交聯單克隆或多克降抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應體系的吸光度。這種改變與被測抗原的濃度有一定的相關性，在一定范鬧內可以反映被測抗原的濃度。此技術通過顆粒增強的方式，放大了抗原抗體反應，彌補了普通透射比濁法靈敏度不夠的缺點，同時又繼承了透射比濁法穩定性好、方便快速的優點，克服扎ELISA和RIA方法的缺點，已越來越廣泛應用于臨床上各種微量蛋白的定量檢測。日前，膠乳增強免疫透射比濁法區廣泛用于脂蛋白a、C反應蛋白、抗鏈球菌溶血素O的檢測，取得了良好的社會效益，但國內外至今尚未見有此類半胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測試劑盒問世。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒及其制備方法。本發明的目的通過以下技術方案來實現檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒，特點是包括盒體、應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶，所述應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶放置于盒體內，所述應用液瓶中裝有應用液，應用液的組分及其重量百分比為表面活性劑0.019Γ2%，防腐劑O. Of 1%，氯化鈉O. 1°/Γ20%，緩沖液l(T200mmol/L ;所述抗體懸浮液瓶中裝有包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠懸液，乳膠懸液的組分及其重量百分比為包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠O. 059Γ0. 5%，表面活性劑O. 01% ,防腐劑O. θΓ %,緩沖液l(T200mmOl/L ;所述標準品瓶中裝有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品。進一步地，上述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒，所述應用液中的表面活性劑為 Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80 ;所述應用液中的防腐劑為疊氮鈉或Proclin-300或兩者混合物；所述應用液中的緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。所述乳膠懸液中的表面活性劑為Triton-XlOO、Triton-X405> Tween-20、Tween-40或Tween-80 ;所述乳膠懸液中的防腐劑為疊氮鈉、Proclin-300或兩者混合物；所述乳膠懸液中的緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。·
本發明檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，包括以下步驟
a)制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存；
b)制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液；
c)配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為8mg/L。更進一步地，上述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，在步驟a)中，乳膠微球的粒徑為100nnT500nm ;所述磷酸鹽緩沖液的pH為7. 2^9. 2，質量比為2(T200mmOl/L ;所述清洗儲存液pH為7. 4^9. 0，清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑O. 01% 2%，防腐劑O. 01 1%，緩沖液10^200mmol/L,表面活性劑為 Triton-XlOO, Triton_X405、Tween-20, Tween-40 或 Tween-80,防腐劑為疊氮鈉、Proclin-300或兩者混合物，緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸；所述乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混合。更進一步地，上述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，步驟b)中，所述緩沖液pH為7. Γ9.0，緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。再進一步地，上述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，步驟c)中，所述緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。本發明技術方案突出的實質性特點和顯著的進步主要體現在
通過顆粒增強的方式，放大了抗原抗體反應，彌補了普通透射比濁法靈敏度不夠的缺點，同時又繼承了透射比濁法穩定性好、方便快速的優點，克服扎ELISA和RIA方法的缺點，實現人血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在生化儀上大批量定量檢測，操作簡單，靈敏度高，不易受人為因素干擾，檢測穩定性和重復性好，能真實反映被檢測物的含量，能利用生化分析儀進行檢測，容易實現自動化，適于臨床推廣應用。
具體實施例方式檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒，包括盒體、應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶，應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶放置于盒體內，應用液瓶中裝有應用液，應用液的組分及其重量百分比為表面活性劑O. 01°/Γ2%，防腐劑O. Of 1%，氯化鈉O. 1°/Γ20%，緩沖液l(T200mmOl/L ;抗體懸浮液瓶中裝有包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠懸液，乳膠懸液的組分及其重量百分比為包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠O. 059Γ0. 5%，表面活性劑O. 01% 2%，防腐劑O. θΓ %,緩沖液l(T200mmol/L ;標準品瓶中裝有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品。其中，應用液中的表面活性劑為Triton-X100、Triton_X405、Tween-20, Tween-40或Tween-80 ;應用液中的防腐劑為疊氮鈉或Proclin-300或兩者混合物；應用液中的緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。乳膠懸液中的表面活性劑為Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40 或 Tween-80 ;乳膠懸液中的防腐劑為疊氮 鈉、Proclin-300或兩者混合物；乳膠懸液中的緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備工藝步驟為
a)制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存；其中，乳膠微球的粒徑為100nnT500nm ;磷酸鹽緩沖液的pH為7. 2^9. 2，質量比為2(T200mmOl/L ;清洗儲存液pH為7. 4^9. 0，清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑0. 01% 2%，防腐劑0. 0Γ %,緩沖液l(T200mmol/L，表面活性劑為Triton_X100、Triton-X405>Tween-20>Tween-40 或 Tween-80,防腐劑為疊氮鈉、Proclin-300 或兩者混合物，緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸；乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混合；
b)制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液；其中，表面活性劑0. 01% 2%，防腐劑0. 0Γ %,氯化鈉0. 1% 20%，緩沖液l(T200mmol/L，表面活性劑為 Triton-X100、Triton_X405、Tween-20, Tween-40 或 Tween-80，防腐劑為疊氮鈉或Proclin-300或兩者混合物，緩沖液pH為7. 4^9. O,緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸；
c)配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為8mg/L ;其中，緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。實施例I
制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存；其中，乳膠微球的粒徑為120nm ;磷酸鹽緩沖液的pH為7. 2，質量比為30mmol/L ;清洗儲存液pH為7. 4，清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑0. 2%，防腐劑0. 05%，緩沖液30mmol/L，表面活性劑為Triton_X405，防腐劑為Proclin-300，緩沖液為甘氨酸；乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混合。
制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液；其中，表面活性劑O. 1%，防腐劑O. 05%，氯化鈉5%，緩沖液30mmol/L，表面活性劑為Tween-80，防腐劑為疊氮鈉，緩沖液PH為8. 0，緩沖液為甘氨酸。配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為8mg/L ;其中，緩沖液為三羥基氨基氨基甲烷。實施例2
制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存；其中，乳膠微球的粒徑為600nm ;磷酸鹽緩沖液的pH為9. 2，質量比為60mmol/L ;清 洗儲存液PH為9. 0，清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑O. 4%，防腐劑O. 2%，緩沖液60mmol/L，表面活性劑為Triton-XlOO，防腐劑為疊氮鈉，緩沖液為三羥基氨基氨基甲烷；乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混合。制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液；其中，表面活性劑O. 4%，防腐劑O. 2%，氯化鈉10%，緩沖液60mmol/L，表面活性劑為Tween-20，防腐劑為Proclin-300，緩沖液pH為8. 0，緩沖液為三羥基氨基氨基甲烷。配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為8mg/L ;其中，緩沖液為碳酸鹽。實施例3
制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存；其中，乳膠微球的粒徑為180nm ;磷酸鹽緩沖液的pH為8. 0，質量比為120mmol/L ;清洗儲存液pH為8. 4，清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑O. 6%，防腐劑
O.4%，緩沖液120mmol/L，表面活性劑為Tween-20，防腐劑為疊氮鈉和Proclin-300混合物，緩沖液為碳酸鹽；乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混
八
口 ο制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液；其中，表面活性劑O. 6%，防腐劑O. 4%，氯化鈉15%，緩沖液120mmol/L，表面活性劑為Tween-40，防腐劑為疊氮鈉，緩沖液PH為9. 0，緩沖液為碳酸鹽。配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為3. 2mg/L ;其中，緩沖液為三羥基氨基氨基甲烷。實施例4
制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存；其中，乳膠微球的粒徑為200nm ;磷酸鹽緩沖液的pH為8. 2，質量比為150mmol/L ;清洗儲存液pH為8. O,清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑O. 8%，防腐劑
O.8%，緩沖液180mmol/L，表面活性劑為Tween-80，防腐劑為疊氮鈉，緩沖液為磷酸鹽；乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混合。制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液；其中，表面活性劑O. 8%，防腐劑O. 8%，氯化鈉20%，緩沖液180mmol/L，表面活性劑為Triton-XlOO,防腐劑為疊氮鈉和Proclin-300混合物，緩沖液pH為7. 4，緩沖液為磷酸鹽。配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為8mg/L ;其中，緩沖液為甘氨酸。以下結合采用所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒在生化分析儀上進行半胱氨酸蛋白酶抑制劑C檢測的具體條件
在日立7080生化儀上的的設定參數
反應溫度37度
分析方法2點終點法主波長546nm,副波長800nm (可不選)
樣本量/應用液/包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的乳膠懸液3ul/240ul/60ul 反應方向上升 讀點分別為19點及31點
選擇多點定標后，僅器自動完成定標，定標OK后,進彳丁常規半胱;氣酸蛋白酶抑制劑C檢測。本發明通過顆粒增強的方式，放大了抗原抗體反應，彌補了普通透射比濁法靈敏度不夠的缺點，同時又繼承了透射比濁法穩定性好、方便快速的優點，克服扎ELISA和RIA方法的缺點，實現人血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在生化儀上大批量定量檢測，有以下幾個方面突出優點1)操作簡單；2)靈敏度高；3)不易受人為因素干擾，檢測穩定性和重復性好，能真實反映被檢測物的含量；4)能利用生化分析儀進行檢測，容易實現自動化，適于臨床推廣應用。需要理解到的是以上所述僅是本發明的優選實施方式，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒，其特征在于包括盒體、應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶，所述應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶放置于盒體內，所述應用液瓶中裝有應用液，應用液的組分及其重量百分比為表面活性劑0.01% ,防腐劑O. 0Γ %,氯化鈉O. 1°/Γ20%，緩沖液l(T200mmol/L ;所述抗體懸浮液瓶中裝有包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠懸液，乳膠懸液的組分及其重量百分比為包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠O. 059Γ0. 5%，O. 05°/Γ %，表面活性劑O. 01% ,防腐劑O. 0Γ %，緩沖液l(T200mmOl/L ;所述標準品瓶中裝有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品。
2.根據權利要求I所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒，其特征在于所述應用液中的表面活性劑為Triton-XlOO、Triton_X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80 ;所述應用液中的防腐劑為疊氮鈉或Proclin-300或兩者混合物；所述應用液中的緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
3.根據權利要求I所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒，其特征在于所述乳膠懸液中的表面活性劑為Triton-XlOO、Triton_X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80 ;所述乳膠懸液中的防腐劑為疊氮鈉、Proclin-300或兩者混合物；所述乳膠懸液中的緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
4.權利要求I所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 a)制備乳膠懸液在磷酸鹽緩沖液中將乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混勻，3(Γ40度旋轉反應過夜，用清洗儲存液進行清洗得到乳膠懸液，置于21度環境下保存； b)制備應用液將表面活性劑、防腐劑、氯化鈉和緩沖液同溶于水，得到應用液； c)配制半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品選用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品，由緩沖液稀釋成濃度為8mg/L。
5.根據權利要求4所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟a)中，乳膠微球的粒徑為120nnT600nm。
6.根據權利要求4所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其特征在于步驟a)中，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7. 2^9. 2，質量比為2(T200mmol/L。
7.根據權利要求4所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其特征在于步驟a)中，所述清洗儲存液pH為7. Γ9.0，清洗儲存液的組分及其重量百分比為表面活性劑O. 01% 2%，防腐劑O. 01 1%，緩沖液10^200mmol/L,表面活性劑為 Triton-XlOO、Triton_X405、Tween-20, Tween-40 或 Tween-80,防腐劑為疊氮鈉、Proclin-300或兩者混合物，緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
8.根據權利要求4所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其特征在于步驟a)中，所述乳膠微球與包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體混合是等體積混合。
9.根據權利要求4所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其特征在于步驟b)中，所述緩沖液pH為7. Γ9.0，緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
10.根據權利要求4所述的檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒的制備方法，其 特征在于步驟C)中，所述緩沖液為磷酸鹽、碳酸鹽、三羥基氨基氨基甲烷或甘氨酸。
全文摘要
本發明涉及檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫比濁試劑盒及制備方法，應用液瓶、抗體懸浮液瓶和標準品瓶放置于盒體內，應用液瓶中裝有應用液，其組分表面活性劑0.01%~2%，防腐劑0.01~1%，氯化鈉0.1%~20%，緩沖液10~200mmol/L；抗體懸浮液瓶中裝有包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠懸液，其組分包被半胱氨酸蛋白酶抑制劑C單克隆抗體的乳膠0.05%~1%，表面活性劑0.01%~2%，防腐劑0.01~1%，緩沖液10~200mmol/L；標準品瓶中裝有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C標準品。實現在生化儀上大批量定量檢測。
文檔編號G01N33/577GK102879569SQ20121034589
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者劉照關, 康英杰 申請人:蘇州照康生物技術有限公司