用于擴增t調節細胞的方法和組合物的制作方法

專利名稱：：用于擴增t調節細胞的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：本發明總地涉及免疫治療的領域。特別地，本發明提供了用于擴增T調節細胞的方法和組合物。該方法和組合物可用于例如預防和治療基于免疫的疾病，包括糖尿病，和預防外源移植排斥。
背景技術：
：T調節(Treg)細胞構成人和嚙齒動物中5-10%的CD4+T細胞，并組成型地表達CD25、CD28、CTLA-4、GITR、CD62L和4-1BB,以及轉錄因子FoxP3，其涉及它們的產生和功能。IL-2似乎在Treg細胞產生和體內平衡中起著重要作用，因為缺乏IL-2或其受體成分的動物產生T細胞過度增殖和自體免疫疾病，這些疾病通過來自天然動物的Treg細胞的獲得性轉移可以得到醫治。相似地，缺乏通過CD28/CD80相互作用的信號與降低的Treg細胞的數量和功能性相關，表明該受體/配體系統在Treg細胞的產生和功能中起著重要作用。天然出現的CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞是細胞的樹突細胞群體，這些細胞是在胸腺中的高親和性配體上陽性選擇的并已經顯示出在自我抗原的免疫耐受性的建立和維持中起著重要作用。這些細胞的產生和/或功能的缺乏與人和各種先天性或誘導的自體免疫性的動物模型中的劇烈自體免疫性相關。Treg細胞通過細胞與細胞間的接觸直接地或通過可溶性因子間接地呈現它們的耐受性作用。盡管這些細胞的抑制機制尚未得到充分地闡明，但效應T細胞(丁eff)中的IL-2表達的阻斷、Teff細胞的物理消除、通過CTLA-4/B7軸的耐受性樹突細胞(DC)的誘導以及通過TGF-(3和IL-10的Teff細胞的抑制是迄今為止已經涉及的一些機制。還已經表明了通過CTLA-4/CD80將信號逆向傳遞至Teff細胞在通過Treg細胞的抑制中起著重要作用。相似地，Treg細胞上的CTLA-4和DC上的CD80之間的相互作用可以導致逆向信號并上調巧I味胺加雙氧酶，該酶涉及通過調節色氨酸機制的耐受性。除了在建立和維持自我抗原耐受性的天然作用，還已經顯示出Treg細胞在由各種免疫調節方法誘導的外源抗原的外周耐受性中起著作用。例如，顯示出Treg細胞是涉及移植抗原外周耐受性的機制的共同點，與用來獲得耐受性的免疫調節方法無關。Treg細胞還涉及腫瘤和各種病原體的免疫逃避機制。Treg細胞在建立和維持自我抗原的耐受性和誘導的外源抗原的耐受性中的重要性已經對為治療目的而離體(exvivo)擴增Treg細胞的方法產生了濃厚的興趣。參見，例如，Tang等，2004，A/e《199:1455-65;Battaglia等，2005,S/ood105:4743-48;Earle等，2005，C//"./mww"o/.115:3-9;Godgrey等，2004，S/oocn04:453-61;Hoffmann等，2004,j5/ooc/104:895-903。因為Treg細胞產生借由通過T細胞受體(TCR)、CD28和IL-2的信號來發生，因此擴增Treg細胞的方法聚焦于提供這三種信號。參見，例如，Tang等，上文；Godfrey等，上文；Hoffimann等，上文。例如，Tang等，上文，報道了可以從nonobese糖尿病(NOD)動物擴增Treg細胞，通過在高劑量IL-2(2000IU/ml)的存在下用綴合抗CD3和CD28抗體的珠子刺激。擴增的自體抗原特異性的TCR轉基因Treg細胞的獲得性轉移防止了獲得性轉移模型中的糖尿病并逆轉了新的糖尿病NOD小鼠中的糖尿病。最近產生了基于該實驗方案的有限數量的其他擴增實驗方案，在擴增嚙齒動物和人的Treg細胞中取得了一些成功。參見，例如，Earle等，上文；Godfrey等，上文。例如，Godfrey等報道了使用作為珠子替換方案的FcyRII(CD32)表達細胞系來擴增人Treg細胞，該細胞系通過Fc受體將對抗CD3和CD28的抗體固定于細胞表面上。幾乎所有報道的離體擴增實驗方案是基于相似的方案，并且需要使用高劑量的IL-2,使其有效。盡管這些進展，仍然存在需要用于離體擴增Treg細胞的方法和組合物。對不需要使用固體支持物的方法存在著特別的需要。對不需要為了功效的高劑量的IL-2的方法也存在著特別的需要。對用于體內擴增Treg細胞的方法和組合物也存在著特別的需要。I型糖尿病仍然是全世界超過百分之一人群中長期發病率和死亡率的主要原因。盡管胰島素治療和胰島移植是目前最有效的治療方案，但這兩種方法都存在著嚴重的缺陷。因此，仍然存在需要誘導胰島特異性的自體、異源和外源耐受性的方法，用于I型糖尿病的有效和持久治療。如上所迷，Treg細胞在自我反應性應答的控制以及外源抗原耐受性的建立和維持中起著重要作用。因此，Treg細胞呈現了重要的治療目標，用于預防和治療各種自體免疫疾病，包括1型糖尿病，實體器官、組織、千細胞、骨髓細胞、造血干細胞的排斥，和移植對宿主疾病(GVHD)。仍然存在需要Treg細胞的受控且有意的體內擴增方法，用于治療這些病癥。發明概述本發明總地提供了用于擴增T調節細胞的方法和組合物。根椐一個方面，本發明提供了一種組合，其包括(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-1BBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(c)笫三綴合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的笫一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(B)—個或多個選自以下的綴合物U，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員。在一個特定的實施方案中，結合對的第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(如核心鏈霉抗生物素蛋白)，而結合對的第二個成員包括生物素。在另一個特定的實施方案中，第一、第二或第三綴合物中的至少一個包括融合多肽，該融合多肽包括第一個和第二綴合物成員。在進一步的實施方案中，第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過第一個和第二個結合對成員之間的結合與第四、第五、第六或第七綴合物中的至少一個結合。在一個特定的實施方案中，細胞因子選自IL-2和IL-4。在另一個特定的實施方案中，抗原是自體抗原。在另一個特定的實施方案中，抗原選自胰島素、膠原、髓磷脂堿性蛋白和MHC/抗原復合物。在進一步特定的實施方案中，抗原選自谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原NRP-A7。根據另一個方面，本發明提供了擴增Treg細胞的方法，包括將Treg細胞群體接觸(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(B)一個或多個選自以下的綴合物(a，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成口貝。在一個特定的實施方案中，Treg細胞包括第一、第二或第三綴合物中至少一個的受體，并且第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過第一綴合物成員和受體之間的結合與Treg細胞綴合，而第四、第五、第六和第七綴合物中的至少一個通過第一個和第二個結合對成員之間的結合與Treg細胞綴合。在進一步的實施方案中，Treg細胞群體包括選自CD4+細胞、CD25+細胞和FoxP3+細胞的Treg細胞。在進一步的實施方案中，Treg細胞群體包括CD4+CD25+FoxP3+細胞。在一個實施方案中，該方法進一步包括將Treg細胞接觸游離的IL-2。在另一個實施方案中，該方法進一步包括將Treg細胞接觸游離的抗CD抗體。在一個實施方案中，該接觸離體實現。在進一步的實施方案中，該方法進一步包括將擴增的Treg細胞給予患者。在另一個實施方案中，通過將綴合物給予患者在體內實現接觸。在進一步的實施方案中，患者患有自體免疫疾病或處于自體免疫疾病的風險中，自體免疫疾病如I型糖尿病。在另一個實施方案中，患者是外源移植患者。在一個實施方案中，該方法進一步包括將雷帕霉素給予患者。在另一個實施方案中，該方法包括將包括展示TGF-卩的外源細胞的組合物給予患者。在一個特定的實施方案中，外源細胞選自脾細胞、胰島組織和骨髓細胞。在另一個特定的實施方案中，通過以下方法獲得外源細胞，該方法包括(a)將外源細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的外源細胞和(b)將修飾的外源細胞接觸包括TGF-卩和第二個結合對成員的綴合物來形成展示TGF-卩的外源細胞。根椐另一個方面，本發明提供了獲得脈沖的展示TGF-卩的樹突細胞的方法，該方法包括(a)用抗原脈沖未成熟的樹突細胞來獲得脈沖的樹突細胞；(b)將脈沖的樹突細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的脈沖樹突細胞；和(c)將修飾的脈沖樹突細胞接觸包括TGF-p和第二個結合對成員的綴合物來形成脈沖的展示TGF-卩的樹突細胞。在一個實施方案中，該方法進一步包括驅使脈沖的樹突細胞成熟。在一個實施方案中，抗原是致糖尿病的自體抗原，如谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)或自體抗原NRP-A7。在另一個實施方案中，抗原是膠原。在另一個實施方案中，抗原是髓磷脂堿性蛋白。根據另一個方面，本發明提供了抗原脈沖的展示TGF-卩的樹突細胞群體，如通過上述方法制得的那些。根據另一個方面，本發明提供了在患者中擴增Treg細胞的方法，包括給予包括抗原脈沖的展示TGF-(3的樹突細胞群體的組合物，如通過上述方法制得的那些細胞群體。在一個實施方案中，該方法進一步包括將雷帕霉素給予患者。根據另一個方面，本發明提供了獲得展示TGF-卩的造血干細胞或骨髓細胞的方法，包括將造血干細胞或骨髄細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞和(b)將修飾的細胞接觸包括TGF-卩和第二個結合對成員的綴合物來形成展示TGF-p的細胞。根據另一個方面，本發明提供了在患者中擴增Treg細胞的方法，包括給予含有展示TGF-p的造血干細胞或TGF-p的骨髄細胞的組合物，如通過上述方法制得的那些細胞。在一個實施方案中，該方法進一步包括將雷帕霉素給予患者。在特定的實施方案中，患者需要對自體抗原、異源抗原或外源抗原的耐受性誘導；卩細胞再生；防止外源移植排斥；或遺傳性造血疾病的治療。根據另一個方面，本發明提供了展示TGF-J3的造血干細胞群體或骨髓細胞群體，如通過上述方法制得的那些。附困簡述圖IA和1B列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和鼠LIGHT蛋白胞外結構域的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。核心鏈霉抗生物素蛋白序列是下劃線的。圖2A和2B列出了包括人CD80胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:3)和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。核心鏈霉抗生物素蛋白序列是下劃線的。圖3A和3B列出了包括鼠4-1BBL胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:5)和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。核心鏈霉抗生物素蛋白序列是下劃線的。圖4列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和人4-lBBL胞外結構域的融合蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。核心鏈霉抗生物素蛋白序列是下劃線的。圖5A和5B列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和人B7.2胞外結構域的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:8)和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:9)。圖6A和6B列出了包括IL-2的活性片段和核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:10)和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。在圖6B中，IL-2的序列是斜體的，并且核心鏈霉抗生物素蛋白序列是下劃線的。圖7A和圖7B列出了包括核心鏈霉抗生物素蛋白和成熟TGF-卩的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:12)和編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:13)。在圖7B中，TGF-卩序列是斜體的，并且核心鏈霉抗生物素蛋白序列是下劃線的。圖8A-D說明了嵌合CSA-4-1BBL融合蛋白的構建和表征。(A)將小鼠4-1BBL的胞外結構域在C端克隆至PMT/BiP/V5-HisA栽體中的核心鏈霉抗生物素蛋白(SA)。(B)純化的嵌合4-lBBL蛋白(CSA-4-1BBL)在變性(泳道2)和天然(泳道3)條件下的蛋白質印跡分析。4-1BBL在變性條件下顯示為37kDa的單體，在天然條件下顯示為四聚物和〉150kDa的高階結構。(C)嵌合4-1BBL(CSA-4-1BBL)與4-1BB受體的結合。用CSA-4-1BBL(200ng/lxl()6細胞)或等摩爾量的對照CSA蛋白(灰色填充的)孵育BALB/c靜息或ConA激活的脾細胞，并通過流式細胞術使用抗4-1BBLAb來檢測CD4+和CD8+T細胞上的4-1BBL結合(黑線)。用抗CD137孵育一些激活的細胞來阻斷受體。(D)用CSA-4-1BBL刺激T細胞。在所示濃度(ng/ml)的可溶性CSA-4-1BBL或等摩爾量的CSA存在下，使用抗CD3Ab(0.5pg/ml)和照射過的脾細胞刺激分選的CD4+T細胞。將5pg/ml的抗CD3Ab用作陽性對照。相互比較并與對照CSA蛋白比較，*/7<0.05。C和D的數據(平均土SD)表示3個獨立的具有相似結果的實驗。圖9.使用4-1BBL的Treg細胞的離體擴增。圖9說明了根據本發明的Treg細胞的長期體外擴增，在APC、抗-CD3抗體和IL-2的存在下使用CSA-4-BBL。從天然BALB/c小鼠的脾臟和淋巴結分選CD4+CD25+Treg細胞，并在6-孔平板中在0.5pg/ml可溶性抗CD3Ab、"106個照射過的同源脾細胞和25U/mlIL-2的存在下培養，使用或不使用lpg/ml可溶性4-lBBL。每3-4天，用補充IL-2的新鮮培養基并以lxl(^細胞/ml的濃度涂布來分裂細胞。(A)分選前和用或沒用4-1BBL擴增后，CD4+CD25+群的流式細胞術分析。(B)對于用(□)或沒用(■)4-lBBL培養的細胞，天然Treg細胞離體的成倍擴增。描繪了來自最后3個獨立擴增的結果。箭頭表示用抗CD3、IL-2、4-1BBL和APC(第二和第三激活劑)細胞激活沒用CSA-4-1BBL的作為具有最小擴增的對照。圖10說明了根據本發明離體擴增的Treg細胞上4-1BB受體的表達。將維持于培養物中18-24天的Teff和Treg細胞用4-1BB的抗體染色并通過流式細胞術分析。黑色填充的群是同型對照。圖11證明了根椐本發明通過evvivo擴增的Treg細胞防止異體移植排斥。在植入異源C57BL/6胰島前一天，給通過單次注射鏈脲霉素引起糖尿病的天然BALB/c小鼠獲得性轉移5-8xl(^個擴增的Treg細胞(0)。對照動物沒有接受Treg細胞，但植入了異源胰島()。通過超過300mg/dL的兩次連續血糖讀數證實了排斥。使用Kaplan-Meier對數級測試(p<0.05)來比較存活。圖12A-B。擴增的Treg細胞抑制離體Teff細胞的多克隆或抗原特異性增殖。(A)在lpg/ml4-lBBL的存在或不存在下，使用擴增的Treg細胞(Exp-DP)，按照圖9中所迷的進行多克隆(抗CD3Ab)抑制測試。(B)同種抗原抑制測試。將來自天然BALB/c小鼠的脾臟和外周淋巴結細胞(應答劑)與來自天然C57BL/6小鼠的照射過的脾細胞(刺激劑)和擴增的Treg細胞(Exp-DP)以所示的比例共培養5天。相互比較并與對照相比較，*/<0.05。數據(平均士SD)對于A,是4個獨立實驗的表示，對于B,是2個獨立實驗的表示，具有相似的結果。圖13A-C。TCR、4-1BB和IL-2R信號對Treg細胞擴增的協同作用。圖13A&13B說明了根椐本發明刺激信號1、2和3通過TCR、4-1BB和IL-2R對Treg細胞擴增的協同作用。(A)在0.5ng/mlCD3Ab的存在下，將分選的天然DPTreg細胞與照射過的同源脾細胞共同培養3天。如所示的，給培養物補充25U/ml1L-2和/或lpg/ml4-lBBL。(B)培養分選的天然DPTreg細胞，使用或不使用照射過的脾細胞，使用或不使用可溶性CD3Ab、4-lBBL和IL-2,如所示的。相互比較并與對照相比較，*/<0.05。數據(平均士SD)表示2個獨立的實驗，具有相似的結果。(C)未處理或在IL-2和/或APC的存在下，將分選的DP和SP細胞培養2天。將一些細胞與APC和IL-2培養2天，洗滌來除去IL-2，并再培養2天，將一些細胞未處理培養2天，并加入IL-2，并再培養2天。與同型對照(灰色填充的)，使用流式細胞術分析4-lBB的表達(黑線)。圖14顯示了TGF-P-CSA融合蛋白在體外抑制了同種應答。用CFSE標記ACI脾細胞并與等量的照射過的WF細胞培養，使用(B)或不使用(A)TGF-(3。在第5天，收集細胞并通過流式細胞術分析，用于CFSE稀釋測試。圖15A-B。通過4-lBB受體的信號抑制了Treg細胞的抑制功能并驅動兩種細胞群體的增殖。(A)從天然BALB/c小鼠的脾臟和外周淋巴結分選CD4+CD25-(SP)Teff細胞和CD4+CD25+(DP)Treg細胞，單獨或以1:1比例培養3天。給培養物補充照射過的脾細胞、抗CD3Ab(0.5^g/ml)和所示濃度(pg/ml)的4-1BBL或等摩爾對照SA蛋白。(B)測定SP和DP細胞增殖的CFSE測試。用CFSE標記SP或DP細胞，并用于如上所迷的抑制測試中。每個直方圖顯示了分裂細胞的百分比。相互比較，*/<0.05。數據(平均士SD)表示3個獨立的實驗，具有相似的結果。圖16A-C。擴增的Treg細胞的表型表征。(A)在用或沒用4-1BBL擴增的細胞上分析對于Treg細胞功能重要的細胞表面標記的表達。插入任意的垂直線作為使用或沒用4-lBBL樣品之間的相對比較的參照。(B)RT-PCR，顯示了通過擴增的Treg細胞的FoxP3的標記(M,標記；H-HPRT，F=FoxP3;SP=CD4+CD25、，DP-CD4+CD25+;Exp-DP=擴增的Treg細胞)(C)胞內染色，顯示通過用(虛線)或沒用(實線)4-1BBL擴增的Treg細胞的胞內FoxP3表達水平。用于FoxP3的同型對照用作對照(填充線)。數據表示3個獨立的實驗，具有相似的結果。發明詳述本發明提供了通過刺激三種涉及Treg細胞產生的信號中的至少一種擴增Treg細胞的方法和組合物。信號1涉及TCR，并可以用抗體如抗-OD3抗體刺激，或用通過TCR發出信號的抗原來刺激。可以通過幾個不同的分子來介導信號2，包括免疫共刺激分子，如CD80和4-lBBL。信號3通過細胞因子來轉導，如IL-2或TGF-P。本發明提供了可以離體或在體內實現擴增Treg細胞的方法，還提供了用于進行該方法的組合物。在一個實施方案中，該方法和組合物刺激這些信號中的兩種。在另一個實施方案中，該方法和組合物刺激這些信號中的三種。在另一個方面中，本發明提供了擴增Treg細胞的方法和組合物，使用用抗原脈沖并修飾來展示TGF-卩的DC，和使用修飾來展示TGF-卩的造血干細胞或骨髄細胞。人或其他動物中的許多自體免疫疾病與少量Treg細胞和/或缺乏調節功能相關。因此，患有自體免疫疾病(如1型糖尿病)患者中Treg細胞超過丁eff細胞的擇優擴增保證了基本的治療益處。因此，本發明的方法和組合物可用于例如預防和治療基于免疫的疾病，包括1型糖尿病，并且可用于預防異體移植排斥。出于本申請的目的，以下的術語具有這些定義如在此所用的，"一個"或"一種"意思是一個或多個，除非特意指出只表示一個。如在此所用的"給予"包括所有給患者提供物質的合適方式。常用的途徑包括口服、舌下、經粘膜、經皮、直腸、陰道、皮下、肌內、靜脈內、動脈內、鞘內、通過導管、通過植入等。"結合對，，指的是通過任一種分子力相互作用的兩個分子，分子力包括，例如，離子、共價、疏水、范德華和氫鍵，使得該結合對具有相互特異性結合的特性。特異性結合的意思是在沒有結合另一個分子的條件下，結合對成員呈現出相互結合。結合對的實例是生物素-抗生物素蛋白、激素-受體、受體-配體、酶-底物、IgG-蛋白A、抗原-抗體等。如在此所用的"患者，，包括任何脊推動物，包括馬、羊、公山羊、牛、豬、烏類、狗、貓和靈長類物種。在一個實施方案中，患者是人。本領域技術人員將認識到特定的免疫共刺激分子、信號分子、細胞標記、細胞類型、傳染劑等，關于一個物種討論時，在不同的物種中具有相應的類似物，并且本發明包括這樣的類似物及其在相應和相關物種中的用途。根據一個方面，本發明提供了包括至少一個共刺激部分的綴合物，該共刺激部分刺激信號l、信號2或信號3中的至少一個。在一個特定的實施方案中，綴合物包括共刺激部分和結合對成員。任何刺激信號之一的部分可以根據本發明來使用，任何結合對成員同樣如此。以下將更詳細地討論示例共刺激部分和結合對成員。除非在此指定為"全長"，在此關于共刺激部分包括全長部分(例如，全長多肽)及其呈現出共刺激功能的片斷或部分，包括但不限于，以下特意指出的那些片斷和部分。因此，例如，關于4-lBBL意味著包括全長4-1BBL呈現出共刺激功能的片斷或部分的多肽，如4-1BBL的胞外結構域或全長4-1BBL蛋白。信號1用于刺激信號1的示例共刺激部分包括對抗CD3的抗體或CD3以及TCR復合物、抗原/MHC復合物和通過TCR發出信號的藥劑，如ionomycin和佛波醇肉豆蔻酸鹽醋酸鹽(PMA)的任何成分的抗體。用于免疫治療方法中的抗-CD3抗體是本領域已知的。參見，例如，Eeale等，2005,//wmmo/.115:3-9。示例的合適抗-CD3抗體包括人或鼠抗體、人源化抗體、重組產生的抗體、單鏈抗體和CD3-結合抗體片段。通過本領域已知的方法可獲得這樣的抗-CD3抗體。如上所述，還可以使用對抗TCR復合物的任何成分的抗體，如對抗TCRa或TCRp鏈的抗體，和對抗CD3成分的抗體。參見，例如，Niederberger等，2005，丄腸/.77:830-41;Hamano等，2000,丄/Amww"o/.164:6113-19。再者，可以使用任何類型的抗體(人、鼠、重組、單鏈等)。用作刺激信號1的共刺激部分的抗原包括與目標疾病或病癥相關的抗原。例如，自體抗原和胰島素(特別是適于治療1型糖尿病)、膠原(特別適于治療類風濕性關節炎)、髄磷脂堿性蛋白(特別適于治療多發性硬化)和MHC(用于治療和預防外源移植排斥)。可以作為包括結合對成員的綴合物的一部分來給藥抗原。任選，作為MHC/抗原復合物的一部分來提供抗原。在該實施方案中，MHC和抗原可以單獨地為外源或同源的。例如，可以使用供體MHC和異源或同源抗原。根據本發明的一個方面，抗原是自體抗原。例如，抗原是谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)或自體抗原NRP-A7(源自胰島特異性葡萄糖-6-磷酸酶催化性亞基相關的自體抗原，并且最近表明在糖尿病中是重要的)。這些抗原表示了胰島特異性自體抗原全部成員中的相當一部分，因此，在提供其他潛在的自體抗原的耐受性中可能是有效的，通過抗原決定部位分布或Treg占優勢的免疫調節機制。在一個特定的實施方案中，自體抗原是GAD65、ICA512或NRP-A7。根據一個實施方案，本發明提供了包括如上所述作為共刺激部分的抗-CD3抗體或抗原/MHC復合物和作為結合對成員的生物素的綴合物。可以通過本領域已知的方法通過生物素化抗-CD3抗體或抗原/MHC復合物制得這樣的綴合物，并在以下的實施例中舉例說明。或者，可以將抗體或抗原鏈接結合對成員如核心鏈霉抗生物素蛋白或將抗體或抗原表達為含有結合對成員如核心鏈霉抗生物素蛋白的融合蛋白，以形成可根椐本發明使用的另外的綴合物。信號2用于刺激信號2的示例共刺激部分包括B7和TNF家族的成員，包括但不限于以下列出的那些。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>材這些是B細胞相關的<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>UGHTMauriD.N.,EbnerR.，MontgomeryR.I.，KochelK.D.,CheungT.C.,YuG,L.，RubenS.，MurphyM.，EisenbergR.丄，CohenG.H.,SpearP.G.，WareC.F.LIGHT,anewmemberoftheTNFsuperfamily，andlymphotoxinalphaareligandsforherpesvirusentrymediator(LIGHT,TNF超家族的新成員，并且淋巴毒素a是皰滲病毒進入介質的配體)Immunity8:21-30(1998)。GITRLGurneyA.L.，MarstersS.A.，HuangR.M.，PittiR.M.,MarkD.T.,BaldwinD.T.,GrayA.M.,DowdA.D.，BrushA.D.,HeldensA.D.，SchowA.D.，GoddardA.D.，WoodW,I.,BakerK.P.，GodowskiP.J.,AshkenaziA.Identificationofanewmemberofthetumornecrosisfactorfamilyanditsreceptor,ahumanorthologofmouseGITR(腫瘤壞死因子家族及其受體的新成員的鑒定，鼠GITR的人ortholog)。Curr.Biol.9:215-218(1999)。BLySMooreP.A.,BelvedereO.，OrrA.，PieriK.，LaFleurD.W.，FengP.,SoppetD.,ChartersM.,GentzR.，ParmeleeD.,LiY.，GalperinaO.，Giri丄,RoschkeV.,NardelliB.，CarrellJ.，SosnovtsevaS,，GreenfieldW.，RubenS.M.,HilbertD.M.,Lys:memberofthetumornecrosisfactorfamilyandBlymphocytestimulator(Lys:腫瘤壞死因子家族的成員和B淋巴細胞刺激劑)。Science285:260-263(1999)。AP肌HahneM.，KataokaT.，SchroeterM.，HofmannK.,IrmlerM.,BodmerJ-L.,SchneiderP.,BomandT.,HollerN.，FrenchLE.,SordatB.，RimoldiD.,TschoppJ.，APRIL,anewligandofthetumornecrosisfactorfamily,stimulatestumorcellgrowth(APRIL,腫瘤壞死因子家族的新配體，刺激腫瘤細胞生長)。J.Exp.Med.188:U85-1190(1998)。合適的共刺激部分的特定實例包括4-lBBL、CD80、OX40L和CD86,以下將更詳細地描述。然而，應當理解，上述任何共刺激部分可以根椐本發明來使用。或者，可以使用這些共刺激部分任一種受體的抗體。這樣的抗體是本領域已知的，并可以商業獲得并通過本領域已知的方法獲得。在本發明的一個實施方案中，使用抗-CD28抗體。用于免疫治療方法中的抗-CD28抗體是本領域已知的。參見，例如，Earle等，上文。示例的合適抗-CD28抗體包括人或鼠抗體，人源化抗體，重組產生的抗體，單鏈抗體和CD28結合抗體片段。可以通過本領域已知的方法獲得這樣的抗-CD28抗體。4-lBBL(也稱為4畫BB-L,4-BB配體，TNFSF9、1LA配體)是TNF受體家族的成員，并在激活后2-3天，在激活的抗原遞呈細胞(APC),包括激活的B細胞、巨噬細胞和DC上表達。4-1BB(也稱為CD137)，其是4-lBBL的受體，在激活的CD4+和CD8+T細胞表面上，在自然殺傷細胞、單核細胞和靜息DC上得到表達。最近還已經證明了Treg細胞組成型表達4-lBB受體。參見，例如，Choi等，2004，Z^oc.75:785-91;McHugh等，2002，/www"/(y16:311-23。4-lBBL含有254個氨基酸(26624Da)。參見，Alde畫等，EurJImmunol.1994年9月；24(9):2219-27。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.P41273找到人4-1BBL的全部氨基酸序列。4-1BBL是II型糖蛋白，由殘基1-28形成潛在的細胞質結構域，殘基29-49形成單個預測的跨膜結構域，殘基50-254形成潛在的胞外結構域，而殘基35-41表示聚-Leu鏈。可以在GenBank登錄號no.NM_003811中找到編碼人4-lBBL的核苷酸序列。可以結合其同源受體4-1BB的4-1BBL的殘基50-254或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根椐本發明來使用。例如，圖3A和3B列出了CSA-鼠4-1BBL的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:5和6)。圖4顯示了包括人4-1BBL胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。或者，可以將4-1BBL生物素化來形成包括作為共刺激部分的4-1BBL和作為結合對成員的生物素的綴合物。CD80(也稱為B7.1,CD28LG或LAB7)和CD86(也稱為B7.2，CD28LG2，LAB72)是示例共刺激多肽，兩者都結合由T細胞表達的CD28/CTLA4共受體。CD80含有288個氨基酸(33048Da)。參見Freeman等，J.Immunol.143(8)，2714-2722(1989)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.P33681找到人CD80的全部氨基酸序列。B7.1是I型糖蛋白，由殘基1-34形成分泌信號，殘基35-242形成潛在的胞外結構域，殘基243-263形成潛在的跨膜結構域，而殘基264-288形成潛在的細胞質結構域。因此，沒有分泌信號序列的成熟B7.1分子表示氨基酸35-288。可以在GenBank登錄號no.NM—005191中找到編碼人B7.1的核苷酸序列。可以結合其同源受體CD28的B7.1的殘基35-242或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根椐本發明來使用。例如，圖2A和2B列出了包括人B7.1(CD80)胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:3)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。或者，可以將CD80生物素化來形成包括作為共刺激部分的CD80和作為結合對成員的生物素的綴合物。B7.2含有329個氨基酸(37696Da)。參見Freeman等，Science262(5135)，909-911(1993)。可以在Swiss-Prot數據庫中依椐登錄號no.P42081找到人B7.2的全部氨基酸序列。B7.2是I型糖蛋白，由殘基1-23形成分泌信號，殘基24-247形成潛在的胞外結構域，殘基248-268形成潛在的跨膜結構域，而殘基269-329形成潛在的細胞質結構域。因此，沒有分泌信號序列的成熟B7.2分子表示氨基酸24-329。可以在GenBank登錄號no.NM—175862中找到編碼人CD86的核苷酸序列。可以結合其同源受體CD28的B7.2的殘基24-247或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根據本發明來使用。例如，圖5A和5B列出了包括人B7.2(CD86)胞外結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:8)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。或者，可以將CD86生物素化來形成包括作為共刺激部分的CD86和作為結合對成員的生物素的綴合物。B7.2通常不在靜息B細胞上表達，而是在外周血單核細胞(PBC)和DC上以低水平表達；然而，在激活后，B細胞和其它APC如巨噬細胞和DC上的表達得到上調。相反，CD86在PBC和DC上得到組成型表達，并且在B細胞上得到更快速的上調。T細胞受體(TCR)與APC上的MHC/肽復合物的相互作用使T細胞上的CD80/86與CD28同時增強，這導致脂質激酶磷脂酰肌醇3-激酶的酪氨酸磷酸化，其隨后抑制一系列導致IL-2基因表達的誘導、細胞增殖和分化成效應物功能的復雜胞內事件。信號2可以通過調節抗凋亡基因如Bal-xL來防止細胞死亡而進一步增大產生性免疫應答。OX40L是由樹突細胞和其他APC表達的，并結合存在于激活的T細胞上的OC40。OX40L含有183個氨基酸(21950Da)。參見Miura等，Mol.Cell.Biol.il:1313-1325(1991)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.P23510找到OX40L的全部氨基酸序列。OX40L是II型糖蛋白，殘基1-23為細胞質結構域，殘基24-50為跨膜結構域，而殘基51-183為胞外結構域。OX40L的核苷酸序列為3510bp,編碼序列為157-708(參見GenBank登錄號no.NM—003326.2)。可以結合其同源受體OX40的OX40L的殘基5卜183或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的C-端融合體，根據本發明來使用。LIGHT多肽(也稱為TNFS14、HVEM-L、LTg、TR2)是與淋巴毒素同源的TNF超家族成員。參見Mauri等，Immunity8(1)，21-30(1998)。可以在Swiss-Prot數據庫中依據登錄號no.043557找到人LIGHT的全部氨基酸序列。LIGHT含有240個氨基酸(26351Da)并且是II型糖蛋白，由殘基1-37形成潛在的細胞質結構域，殘基38-58形成單個預測的跨膜結構域，而殘基59-240形成潛在的胞外結構域。分裂位點涉及殘基82-83。可以在GenBank登錄號no.NMJ720M中找到編碼人LIGHT的核苷酸序列。可以結合其同源受體HVEM、LT卩R或TR6的LIGHT的殘基59-240或其片段可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合體，根據本發明來使用。例如，圖1A和IB列出了包括核心鏈霉抗生素和鼠LIGHT胞外結構域的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。或者，可以將LIGHT生物素化來形成包括作為共刺激部分的LIGHT和作為結合對成員的生物素的綴合物。LIGHT主要在激活的T細胞、NK細胞和未成熟的樹突細胞上表達，并用來調節免疫應答的各個方面。作為膜結合蛋白來合成LIGHT,但是其細胞表面表達受到幾個翻譯后機制的調節。在表達的幾分鐘內通過基質金屬蛋白酶從細胞表面分離LIGHT并作為可溶性分子累積(異形體l;大概表示殘基83-240;Swiss-Prot043557-1)。細胞表面細胞質片段表示異形體2(Swiss-Prot043557-2)。此外，各種細胞類型在泡嚢中存儲LIGHT并在激活時通過各種生物刺激分泌出來。盡管LIGHT的可溶性形式的作用沒有得到充分的表征，可以作為負反饋環，通過與HVEM和LT(3R竟爭來抑制膜結合形式的功能。LIGHT與三個不同的受體相互作用(1)T細胞上的皰滲病毒進入介質(HVEM),(2)LTpR，其主要在上皮細胞和基質細胞上表達，和(3)各種細胞上的可溶性誘騙受體3。這些相互作用賦予LIGHT不同的功能。與基質細胞上的LTJ3R的相互作用與各種細胞因子/趨化因子的產生、淋巴結(LN)器官發生和二級淋巴結構的恢復相關。另一方面，LIGHT與淋巴細胞上的HVEM受體的相互作用導致細胞因子的激活和產生，主要為IFN-y和GM-CSF。關于這點，LIGHT/HVEM軸似乎傳送與Th型應答激活相關的共剌激信號，這在腫瘤消除中起著關鍵作用。信號3用于刺激信號3的示例共刺激部分包括刺激信號3的細胞因子和生長因子，如IL-2、IL-4和TGF-p(包括TGF-卩1、TGF-p2和TGF-卩3)。用于治療方法中的IL-2和IL-4部分是本領域已知的。參見，例如，Eare等，2005,上文；Thorton等，2004,/w/wwwo/,172:6519-23;Thorton等，2004，￡w,/mww"o/.34:366-76。根據一個實施方案，使用細胞因子的成熟部分。例如，IL-2或IL-4,或其活性片段，可以鏈接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根據本發明來使用。例如，共同未決u.S.專利申請10/312,245公開了包括IL-2或IL-4的成熟部分和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白，根椐本發明是有用的。還可以參見圖6A和6B,其列出了IL-2-CSA嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:10)和氨基酸(SEQIDNO:ll)序列。或者，可以通過本領域已知的方法，將IL-1或IL-4生物素化來提供包括作為共剌激部分的IL-2或IL-4和作為結合對成員的生物素的綴合物。參見，例如，Jordan等，2003，C/i",DZag.Z^f6.//wwwwo/.10:339-44;DeJong等，1995,/wwwwo/.A/"/oc^184:101-12。TGF-卩1(也稱為TGF-卩，TGF1，CED，DPD1,HGNC:2997，進展性骨干性發育異常1，轉化生長因子pi)是多功能肽，控制許多細胞類型中的增殖、分化和其他功能。許多細胞合成(并分泌)TGF-卩l,并且基本上全部具有該肽的特定受體。TGF-|31調節許多其他肽生長因子的作用，并測定這些作用的正向或負向。它在骨重塑中起著重要作用，并且是潛在的成骨性骨形成剌激劑，引起涉及的成骨細胞的趨化性、增殖和分化。TGF-J31分子包括390個氨基酸(44,341道爾頓)。這是分裂成成熟TGF-pi和潛伏相關肽(LAP)的前體物質。沒有活性的形式由非共價結合LAP同型二聚物的TGF-pl同型二聚物構成。沒有活性的復合物可以含有潛在的TGF-p結合蛋白。活性形式是具有單體形式的12個氨基酸的成熟卩的同型二聚物，這是二疏化物連接的。SwissProt數椐庫中依據登錄號P01137找到的氨基酸序列包括殘基1-29處的29個氨基酸的信號肽，殘基30-278處的249個氨基酸的潛在相關肽，殘基279-390處的112個氨基酸的活性的TGF-pl基因的核酸序列，其中編碼序列在堿基842-2017。核酸序列最初TGF陽卩l,殘基244-246處的3個氨基酸的細胞連接位點。存在許多變體序列，本發明包括這些。在GenBank依據登錄號no.NM-000660找到表示核苷酸1-2745公開于Dernyk等，1987,Nucl.Acids.Res。TGF-pl作為可溶性的膜結合生長因子存在，并主要涉及器官生成和胚胎的早期模式。TGF-卩在免疫系統中起著重要作用。例如，缺乏TGF-pi的小鼠壽命短并且由于關鍵器官中的炎性淋巴細胞和巨噬細胞的大規模滲透而死亡，涉及外周耐受性中的TGF-卩1。一系列最近的研究已經表明TGF-卩能夠介導各種自體免疫和移植情況中對自體和同種抗體的耐受性。例如，在大鼠中，使用供體特異性輸血的同種異體移植與移植物內的高水平TGF-(3相關，通過滲透淋巴細胞和阻斷抗TGF-卩廢除的耐受性。Josien等，1998，C//"./"窗,.102:1920-26。此外，心臟移植物中的TGF-卩異常表達使得它們在同種異體接受者中的長期存活。同前。此外，在NOD中，發現使用抗-CD3抗體建立的自我耐受性依賴性TGF-p。Belghith等，2003,M^/.9:12-02-08。還已經表明胰島細胞中TGF-卩的瞬時表達通過Treg細胞能有效預防NOD中的自體免疫糖尿病。Peng等，2004，爿c"dSc/.WW4572-77。相似地，使用TGF-卩1的全身基因治療導致明顯糖尿病NOD中的耐受性，卩的細胞耐受性，和糖尿病的治療。Luo等，2005，7Va"s//a"f""ow79:1091-96。TGF-卩還已經顯示出在Treg細胞的產生、體內平衡和擴增中起著重要作用。例如，由于通過TGF-卩的FoxP3的調節，缺陷TGF-pl的小鼠在外周中具有降低數量的Treg細胞。Peng等，上文。Treg細胞從TGF-J3缺陷小鼠獲得性轉移至野生型動物導致它們持久的存在和功能，可能是由于TGF-j31的副分泌作用。還已經顯示出TGF-卩在NOD中的體內平衡和Treg細胞的功能中起著重要作用。參見，例如，Pop等，丄201:1333-46。與抗病林相比較，NOD小鼠具有顯著降低的絕對數量的Treg細胞。這種降低是由TGF-p細胞表面表達降低引起的，這隨后導致降低的FoxP3表達和改變的Treg細胞的功能，這與疾病的發作相一致。參見，例如，Gregg等，2004,7./畫歸/.173:7308-16;You等，2005，D,'a6e,w54:1415-22;Pop等，上文。TGF-卩還在通過誘導FoxP3表達將天然CD4+CD25T細胞轉化成Treg細胞中起著重要作用。TGF-卩轉化的Treg細胞可以抑制T細胞增殖并防止抗原激發后的T細胞的克隆擴增。盡管非常少的研究聚焦于TGF-卩誘導FoxP3表達的機制，這種作用似乎通過抑制Smad7的下調來介導，這種下調由FoxP3引起，因此使TGF-(3信號通過正調節劑Smad3和4。TGF-j3,或其活性片段，可以連接結合對成員或表達為含有結合對成員的融合蛋白，根據本發明來使用。例如，共同未決的U.S.專利申請10/312,245公開了包括人TGF-卩的活性結構域和核心鏈霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白，根據本發明來使用。請參閱圖7A和7B，其各自列出了該嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:12)和氨基酸(SEQIDNO:13)序列。或者，可以通過本領域公知的方法將TGF-卩或其活性片段生物素化，以提供包括作為共刺激部分的TGF-p和作為結合對成員的生物素的綴合物。還可以商業獲得生物素化的IL-2(R&DSystems)。結合對成員示例結合對是生物素和鏈霉抗生物素蛋白(SA)或抗生物素蛋白。還可以使用保持對生物素的基本結合活性的SA或抗生物素蛋白片段，如各自至少50%或更多天然SA或抗生物素蛋白的結合活性。這樣的片段包括"核心鏈霉抗生物素蛋白"("CSA"),全長鏈霉抗生物素蛋白多肽的截斷形式，其包括鏈霉抗生物素蛋白殘基13-138、14-138、13-139或14-139。參見，例如，Pahler等，丄仏o/.C/^.1987.262:13933-37。還可以使用保持強烈結合生物素的其它鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的截斷形式。參見，例如，Sano等，J5/o/C/^w.1995年II月24日，270(47):28204-09(描迷了核心鏈霉抗生物素蛋白變體16-133和14-138)(U.S.專利no.6.022,951)。還可以使用保持基本生物素結合活性或提高的生物素結合活性的鏈霉抗生物素蛋白突變體和鏈霉抗生物素蛋白核心形式。參見，Chilcoti等，尸wc層Jca""1995Feb28;92(5):1754-8;Reznik等，iVw^/Wec/mo/.1996年8月；14(8):1007-11。例如，可以使用具有降低免疫原性的突變體，如通過定點誘變除去潛在的T細胞抗原決定部位或淋巴細胞抗原決定部位突變的突變體。參見Meyer等，/Vo&,'"Sc/.200110:491-503。同樣，也可以使用保持基本生物素結合活性或提高的生物素結合活性的抗生物素蛋白的突變體和抗生物素蛋白的核心形式。參見，Hiller等，A'oc/iew.(1991)278:573-85;Livnah等，/Voc/4cadS"t/&490:5076-80(1993)。為了方便，在此刻的描迷中，如在此所用的術語"抗生物素蛋白，，和"鏈霉抗生物素蛋白"包括這些結合對成員的生物素結合片段、突變體和核心形式。抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白可從商業供應商獲得。此外，可以找到編碼鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的核酸序列以及鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白氨基酸序列，例如，在GenBank登錄號No.X65082;X03591;NM—205320;X05343;Z21611和Z21554。如在此所用的"生物素"包括能夠結合表面如細胞表面(包括胂瘤細胞表面)的含生物素部分，如NHS-生物素和EZ-LinkTM磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)。這樣的生物素的蛋白反應性形式是可購得的。在本發明的范圍中，生物素及其結合伴侶抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白之間的相互作用賦予了幾個優勢。例如，生物素對于鏈霉抗生物素蛋白(1013M")和抗生物素蛋白(10"M")具有非常高的親和性。此外，鏈霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白是各自結合四個生物素分子的四聚合多肽。因此，包括鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的免疫共刺激部分具有形成四聚物和高級結構的趨勢。因此，它們可以交聯其對應的免疫細胞受體，用于更有效的信號轉導，如通過受體的累積。本領域技術人員將認識到可以使用其它機理(例如，其它綴合方法，例如使用其它連接部分或化學或基因交聯)來提供免疫共刺激分子的高階結構，如包括免疫共刺激分子的二聚物、三聚物、四聚物和高階多聚物的綴合物，其同樣呈現出有利的特性。這樣的綴合物包括在本發明的范圍內。綴合物如上所述，本發明的一個方面涉及包括至少一個共刺激部分和結合對成員的綴合。可以通過本領域公知的方法制得這樣的綴合物。例如，共刺激部分和結合對成員可以直接或通過連接物相互共價結合或相互綴合。根據本發明的一個實施方案，綴合物是包括共刺激多肽和結合對成員如CSA的融合蛋白。可以通過本領域已知的多種不同方法中的任一種來制得融合蛋白。例如，可以化學合成或可以使用公知的重組核酸技術來產生一個或多個融合蛋白的成分多肽。(如在此所用的，"核酸，，指的是RNA或DNA)。可以使用例如聚合酶鏈式反應(PCR)來獲得本發明中有用的核酸序列。各種PCR方法描述于，例如，尸C尺尸n7ner,'爿La60mf07Ma簡a/,Dieffenbach7Dveksler編輯,ColdSpringHarborLaboratoeyPress,1995。根椐一個實施方案，共刺激多肽通過其C-端與結合對成員的N-端結合。例如，本發明包括CD80-CSA融合蛋白，TGF-P-CSA融合蛋白，IL-2-CSA融合蛋白和IL-4-CSA融合蛋白，其中CD80、TGF-卩、IL-2或1L-4部分通過其.C-端與CSA的N-端結合。根據另一個實施方案，共刺激多肽通過其N-端與結合對成員的C-端結合。例如，本發明包括CSA-4-1BBL融合蛋白，其中CSA部分通過其C-端與共刺激部分的N-端結合。共刺激多肽可以與結合對成員直接結合或可以通過一個或多個連接部分如一個或多個連接多肽來結合。包括共剌激多肽片段和/或結合對成員片段的核酸和多肽可用于本發明中，只要片段保持參照全長多肽的活性。因此，共刺激部分應當保持其共刺激活性(例如，保持其結合其受體或配體的能力)，并且結合對片段應當保持其結合其結合成員的能力。通過本領域的常規方法對于保留的活性來篩選片段，包括在以下實施例中舉例說明的那些。以下列出了示例性的共刺激多肽片段。綴合物可以在結合對成員和共刺激部分之間包括連接物如肽連接物。可以選擇連接物長度和組成來提高部分任一功能端的活性。連接物通常為約3至約15個氨基酸長，更優選約5至約10個氨基酸長，然而，可以使用更短或更長的連接物，或可以全部分配連接物。在這點上，可以使用已經用來連接單鏈抗體的重鏈和輕鏈的彈性連接物(例如，(Gly4Ser)3)。參見，Huston等(1988)尸賦淑.力caof.S"園，85:5879-5883;U.S.專利No.5,091,513，5,132,405，4,956,778;5,258,498和5,482,858。其它連接物是FENDAQAPKS或LQNDAQAPKS。免疫球蛋白Fc片段的一個或多個結構域(例如，CH1、CH2和/或CH3)也可以用作連接物。還可以使用化學連接物。修飾的、改變的或突變的核酸和多肽在本發明中也是有用的，只要它們保持參照核酸或多肽的活性。例如，適用于本發明的核酸和多肽序列與參照核酸或多肽，即，與編碼已知免疫共刺激多肽或結合對成員的核酸序列，具有至少約80%的序列同一性(包括至少80%的序列同一性)。在一些實施方案中，核酸序列或多肽與參照核酸或多肽具有至少約85°/。、至少約90%、至少約95%或至少約99%的序列同一性。本發明包括堿基改變"沉默"的核酸，因為它們編碼相同的氨基酸(即。簡并核酸序列)。本發明還包括編碼具有保守氨基酸置換的多肽的核酸，以及這樣的多肽。保守氨基酸置換(例如，用不同的疏水性殘基替代一個疏水性殘基)是本領域公知的并可以例如通過點突變等來實現。可以使用本領域已知的受體結合和/或生物篩選方法來證實給定的修飾序列、變體或突變體的適用性，如以上關于片段所迷的那些方法。如在此所用的，通過測定比對的核酸或多肽序列中配對位置的數量，將配對位置的數量除以比對核苷酸或氨基酸各自的總數并乘以100來計算"％序列同一性"。配對的位置指的是在比對序列的相同位置出現相同核苷酸或氨基酸的位置。比對核苷酸或氨基酸的總數指的是比對第二個序列需要的核苷酸或氨基酸的最小數量，并不包括非同源序列的比對(例如，強迫的比對)，如可以在目標序列的N-端或C-端融合的那些序列(即，編碼免疫共刺激多肽或結合對成員的序列)。比對核苷酸或氨基酸的總數可以對應于完整的編碼序列，或可以對應于全長序列的片段，如在此所限定的。可以使用Altschul等(1997,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402)描述的算法來比對序列，因為引入了BLAST(基本局部比對搜索工具)程序中，在環球網的ncbi.nlm.hih.gov可獲得。可以進行BLAST搜索或比對來測定核酸分子("詢問序列")和任何其它序列或其片段之間的百分比序列同一性，使用Altschul算法。可以使用BLASTN來比對和比較核酸序列之間的同一性，而使用BLASTP來比對和比較氨基酸序列之間的同一性。使用BLAST程序計算編碼治療性多肽的核酸序列與另一個序列之間的百分比同一性時，可以使用各自程序的缺省參數，包括缺口懲罰的缺省。可以通過如DNA或RNA印跡分析(即，雜交)、PCR或原'位雜交分析這樣的方法來檢測本發明的核酸。通常通過轉染細胞系中的免疫細胞化學或通過十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳接著考馬斯藍染色或蛋白質印跡分析來檢測多肽，使用具有特定多肽的特異性結合親和性的抗體(單克隆或多克隆)。這些方法中的許多更詳細地描迷于Sambrook等(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。編碼免疫共刺激多肽和結合對成員的核酸序列可以在構建體中可操作地相互連接，使用常規的分子生物學技術。參見，例如，A/o/ecw/arC/om"g.'Z^6om"o/Ma"w"/(分子克隆實驗室手冊)(Sambrook等,2001，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress)或S/zoW/VofocoAs/"Mo/ecw/"r(分子生物學的簡潔實驗方案)(Ausubel等，2002,第5版，CurrentProtocols)。適用于這些方法中的構建體是可購得的并是本領域日常使用的。構建體可以包括表達需要的序列，如啟動子序列，調控序列，如增強子序列，和應答序列和/或可誘導的序列，調節核酸序列的表達。如在此所用的，"可操作地連接"指的是(i)以指導或調節核酸表達的方式相對于核酸序列來放置啟動子和/或其它調控序列；和/或(ii)放置編碼免疫共刺激多肽的核酸和編碼結合對成員的核酸，使得編碼序列"在框內"，即，使得構建體編碼包括免疫共刺激多肽和結合對成員的融合蛋白。可以通過本領域已知的方法將構建體繁殖或表達，以在宿主細胞內產生多肽。如在此所用的，術語"宿主"或"宿主細胞"意思是不僅包括原核生物，如大腸桿菌，而且包括真核生物，如酵母、昆蟲、植物和動物細胞。動物細胞包括，例如，COS細胞和HeU細胞。可以用DNA分子(例如，構建體)轉化或轉染宿主細胞，使用本領域技術人員公知的任一種技術，如磷酸仍或醋酸鋰沉淀、電穿孔、脂轉染和微粒轟擊。含有本發明栽體的宿主細胞可以用于如繁殖載體、生產核酸(例如，DNA或RNA)、表達免疫共刺激多肽或其片段或表達融合蛋白的目的，如上所述。圖1A&1B、2A&2B、3A&3B、4A&4B、5A&5B和7A&7B顯示了代表性的核酸序列(SEQIDNO.1、3、5、8、10&12),這些序列編碼包括核心鏈霉抗生物素蛋白和共刺激多肽的綴合物，以及相應編碼的氨基酸序列(SEQIDNO.2、4、6、7、9、11&13)。本發明還提供了包括共刺激部分和作為結合對成員的生物素的綴合物。可以通過本領域已知的方法將共刺激部分生物素化，并且在以下的實施例中舉例說明。例如，來自Avidity,Inc.(Denver,CO)的生物素AviTag技術可以用來產生生物素化的蛋白。生物素Av汀ag由唯一的15個氨基酸肽構成，該肽由生物素連接酶BirA識別，生物素酶連接生物素與肽序列中的賴氨酸殘基。Schatz，1993，Biotechnology,11:1138-43。生物素AviTag可以在遺傳上融合至任何目標蛋白，使得可以用生物素分子標卡己蛋白質。生物素AviTag技術的一個潛在缺陷是低生物素化程度的可能性，因為系統在標記物片段中的單個唯一的賴氨酸殘基生物素化蛋白。為了克服任何這樣的問題，可以使用純化的生物素連接酶在體外修飾純化的得到標記的蛋白。因為通過酶進行生物素化，反應條件是溫和的，標記是高度特異性的，并且反應比使用生物素衍生物的蛋白化學修飾更有效。或者，Jordan等上文中所述的方法可以用來產生工程化且生物化的蛋白質。綴合物組合根據一個實施方案，本發明提供了用于擴增Treg細胞方法中的綴合物組合。在一個特定的實施方案中，組合包括(a)至少一個包括(i)刺激信號1、信號2或信號3中至少一個的部分和(ii)結合對的第一個成員的綴合物和(b)至少一個包括(i)刺激信號1、信號2或信號3中至少一個的部分和(ii)第二個結合對成員的綴合物。在一個實施方案中，組合包括刺激信號l、信號2或信號3中至少一個的部分。在一個特定的實施方案中，該部分刺激信號3。例如，該部分可以包括IL-2或IL-4。在另一個實施方案中，組合物包括刺激信號l、2和3中至少兩個的部分。在一個特定的實施方案中，該部分刺激信號2和3。在另一個特定的實施方案中，該部分刺激信號1和3。在另一個實施方案中，組合物包括刺激信號l、2和3全部的部分。在一個實施方案中，組合包括(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員和(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員，和(B)—個或多個選自以下的綴合物(a，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所迷結合對成員的第二個成員的第二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和Ui)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員。如上所述，任一種或多種綴合物可以包括融合多肽，該融合多肽包括第一綴合物(例如，共刺激部分)和第二綴合物成員(例如，結合對成員)。在一個實施方案中，結合對的第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(包括核心鏈霉抗生物素蛋白)，并且結合對的第二個成員包括生物素。可以在分開的組合物，或在單個組合物中來提供綴合物。每個組合物可以進一步包括藥物學上可接受的栽體、賦形劑或稀釋劑，如本領域已知的。藥物學上可接受的栽體是可以用作組合物介質的物質，因為在給藥范圍中，該物質是惰性的或另外在醫學上是可接受的，以及與活性劑是兼容的。藥物學上可接受栽體可以含有本領域公知的常4見藥物添加劑。在單個組合物中提供組合時，第一、第二或第三綴合物中的至少一個可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合與第四、第五、第六或第七綴合物中的至少一個結合。示例性組合包括以下的一個或多個包括4-1BBL和核心鏈霉抗生物素蛋白的綴合物或融合蛋白；包括CD80和核心鏈霉抗生物素蛋白的綴合物或融合蛋白；包括TGF-卩和核心鏈霉抗生物素蛋白的綴合物或融合蛋白；包括抗原(或抗原/MHC復合物)和生物素的綴合物；包括IL-2和生物素的綴合物；包括IL-4和生物素的綴合物；包括抗-CD3抗體和生物素的綴合物，和包括抗-CD28抗體和生物素的綴合物。方法
技術領域：
：本發明還提供了擴增Treg細胞的方法。在一個實施方案中，該方法涉及將Treg細胞接觸(a)至少一個包括(i)刺激信號1、信號2或信號3中至少一個的部分和(ii)結合對的第一個成員的綴合物和(b)至少一個包括(i)刺激信號1、信號2或信號3中至少一個的部分和(ii)第二個結合對成員的綴合物。在一個實施方案中，該方法包括將Treg細胞接觸刺激信號1、信號2或信號3中至少一個的部分。在一個特定的實施方案中，該部分刺激信號3。例如，該部分可以包括IL-2或IL-4。在另一個實施方案中，該方法包括將Treg細胞接觸刺激信號1、2和3中至少兩個的部分。在一個特定的實施方案中，該部分刺激信號2和3。在另一個特定的實施方案中，該方法刺激信號1和3。在另一個實施方案中，該方法包括將Treg細胞接觸刺激信號1、2和3中全部信號的部分。根據一個特定的實施方案，該方法包括將Treg細胞群體接觸(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員和(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所迷結合對的第一個成員的第二綴合物成員，和(B)—個或多個選自以下的綴合物(a，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對成員的第二個成員的第二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括所迷結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括第二個結合對成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員。如上所迷，已經發現Treg細胞表達4-lBBL、CD80和TGF-卩的受體。因此，根椐一個實施方案，Treg細胞包括第一、第二或第三綴合物中至少一個的受體，由此第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過第一綴合物成員和受體之間的結合與Treg細胞綴合。根據該實施方案，綴合物將結合其受體并與受體交聯，用于Treg激活和擴增。在該實施方案進一步的方面中，第四、第五、第六和第七綴合物中的至少一個通過第一個或第二綴合物中的至少一個與Treg細胞綴合，通過笫一個和第二個結合對成員之間的結合。Treg細胞群體可以包括CD4+細胞、CD25+細胞和FoxP3+細胞。在一個特定的實施方案中，Treg細胞群體包括CD4+CD25+FoxP3+細胞。根據一個實施方案，可以離體來實現該方法，通過離體將Treg細胞接觸綴合物。在該實施方案的一個方面中，基本上同時將至少兩個綴合物接觸Treg細胞。例如，在接觸Treg細胞群體的單個組合物中提供至少兩個綴合物。在一個特定的實施方案中，第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過第一個和第二個結合對成員之間的結合與笫四、第五、第六和第七綴合物中的至少一個結合。根據本發明方法的另一個離體實施方案，按次序將至少兩個綴合物與Treg細胞接觸。例如，可以在按次序接觸Treg細胞群體的分開的組合物中提供至少兩個綴合物。根椐該后一個實施方案，通過4-lBBL和/或CD80和/或TGF-卩及其在Treg細胞上的受體之間的結合，第一、第二和/或第三綴合物首先接觸并使其結合Treg細胞。然后，第四、第五、第六和/或第七綴合物可以接觸并使其結合Treg細胞，通過第一個和第二個結合對成員之間的結合。例如，可以通過使用標準技術從患者獲得Treg細胞并純化來實現Treg細胞的離體擴增，如使用抗CD25和CD4的抗體。然后在包括共刺激部分(如CSA-4-1BBL)的綴合物、包括抗-CD3抗體(如生物素化的抗-CD3抗體)和IL-2(包括生物素化的IL-2)的綴合物的存在下培養純化的Treg細胞。刺激3天后，給培養物補充IL-2(含有或不含有另外的4-lBBL)，持續7天。在一個實施方案中，從開始還使用了包括TGF-卩的綴合物(如CSA-TGF-卩或生物素化的TGF-卩)，持續幾周，或貫穿整個培養過程。再次重復該循環，只要將細胞保持于培養物中。根據另一個實施方案，通過將綴合物給藥于患者在體內實現擴增Treg細胞的方法。根據該實施方案，可以按次序或基本上同時來給藥綴合物。例如，可以按次序或基本上同時作為分開的組合物來給藥組合物，或可以作為單個組合物來給藥組合物。根據按次序給藥組合物的實施方案中，通過4-1BBL和/或CD80和/或TGF-卩及其在Treg細胞上的受體之間的結合，第一、第二和/或第三綴合物首先給藥并使其定位于Treg細胞。然后，可以給藥第四、第五、第六和/或第七綴合物，并通過第一個和第二個結合對成員之間的結合使其定位于Treg細胞。在單個組合物中同時給藥組合物的實施方案中，第一、第二和/或第三綴合物可以通過第一個和第二個結合對成員之間的結合與第四個、第五個、第六個和/或綴合物結合。根據該實施方案，通過4-lBBL和/或CD80和/或TGF-卩及其在Treg細胞上的受體之間的結合，綴合物可以定位于Treg細胞。可以全身或局部給藥綴合物，如通過靜脈內、腹膜或皮下注射。在一個實施方案中，可以通過不同的途徑給藥一個或多個綴合物。例如，可以局部給藥一種或多種綴合物，并且可以全身給藥一個或多個綴合物。本發明還包括在綴合中與綴合物一起使用游離共刺激部分，即該部分不是上迷綴合物成分的實施方案。因此，例如，Treg細胞可以接觸一個或多個綴合物，如上所述，并且還接觸一個或多個游離共刺激部分，如外源IL-2、IL-4或抗-CD3抗體。可以與接觸一個或多個綴合物同時、之前或之后，將Treg細胞接觸一個或多個游離共刺激部分。如上所述，可以離體或在體內實現這種接觸。根椐該實施方案，所用的外源IL-2的量比現有技術方法需要的高量低得多。例如，在現有技術方法使用2000IU/mL的情況中，我們顯示出更低的量，包括25IU/mLIL-2，是有效的。因此，本發明包括低于約25IU/mL至至少約1000IU/mL或更高量的IL-2的方法。例如，本發明包括使用低于約25IU/mL、約25IU/mL、約50IU/mL、約75IU/mL、約100IU/mL、約150IU/mL、約200IU/mL、約250IU/mL、約300IU/mL、約350IU/mL、約400IU/mL、約450IU/mL、約500IU/mL、約600IU/mL、約700IU/mL、約800IU/mL、約900IU/mL、約1000RJ/mL或更高量的IL-2的方法。以下實施例中討論的數椐表明信號3的刺激對Treg擴增是重要的。在本發明的范圍中，可以使用包括刺激信號3的部分的綴合物來刺激信號3，這樣的部分包括IL-2、IL-4或另一個細胞因子。或者，可以使用刺激信號3的游離共刺激部分如外源IL-2或IL-4來刺激信號3。在另一個可替換的實施方案中，可以通過任何其他方式，如本領域已知的其他方式來刺激信號3。本發明還提供了將Treg細胞給藥于患者的方法，其中根據上迷的方法離體擴增Treg細胞。根椐該實施方案，通過上述在的任何途徑如靜脈內來給藥Treg細胞。合適的患者包括需要Treg細胞擴增的人或其他動物。例如，根據本發明，患有自體免疫疾病如I型糖尿病或處于自體免疫疾病風險中的患者，或接受外源移植植入物的患者(即，同種異體移植患者和異種移植)，是Treg擴增的目標患者，接受骨髓移植的腫瘤患者(來預防GVHD)和接受外源造血或其他干細胞(如進行治療來產生很能夠混合嵌合體來治療造血遺傳缺陷或自體免疫疾病)的患者亦是如此。本發明還可以用于治療患有由致病丁eff細胞的擴增引起或與致病Teff細胞的擴增相關的任何疾病或處于這樣疾病風險中的患者。在一個實施方案中，該方法進一步包括將雷帕霉素給藥于患者。雷帕霉素具有有效的免疫抑制活性，并且已經廣泛用來防止實驗和臨床情況中的移植排斥。雷帕霉素沒有干擾T細胞的激活，但用來防止IL-2介導的信號，并且細胞周期停止于Gl-S邊界，因此導致T細胞無反應性和/或凋亡，并誘導手術耐受性。雷帕霉素通過抑制mTOR來起作用，mTOR是涉及蛋白合成啟動和存活信號傳輸的絲氨酸/蘇氨酸激在本發明范圍中重要的是就產生、維持和功能而言，雷帕霉素對Treg細胞和Teff細胞的不同作用。和calcineurin抑制劑如環孢霉素和他克莫司不同，雷帕霉素不干擾Treg細胞中FoxP3的激活和高表達水平。參見，例如，Baan等，2005，r謂—"麵ow80:110-17。在體內使用雷帕霉素已經顯示出能誘導CD4+CD8+胸腺細胞的凋亡并導致外周調節CD4+CD25+T細胞的擴增。Tian等，2004，7Va"^/aW""o"77:183-89。在離體培養中，顯示出雷帕霉素沒有千擾人Treg細胞的功能，而是抑制了Teff細胞的增殖和細胞因子分泌，并且與Teff細胞相反，Treg細胞能抵抗雷帕霉素誘導的凋亡。Game等，2005，/iw.rm"^/a"^5:454-64。與這些研究相一致，還已經顯示出，在雷帕霉素的存在下，Teff細胞在通過抗原的體外激活后經歷激活誘導的細胞死亡(AICD),而Treg細胞優先得到擴增并且在獲得性轉移至抑制接受者中時能夠阻斷異源胰島的排斥。Battaglia等，2005，別ood105:4743-48。雷帕霉素還顯示出能改變DC的免疫刺激功能朝向更加致耐受的表型，這隨后可以作為正反饋回路，用于Treg細胞的產生和擴增。Chiang等，2004，,/.//mww"o/.172:1355-63。這些受體與流行的觀念相一致，該觀念為與calcineurin抑制劑不同，雷帕霉素不干擾耐受性誘導。因此，雷帕霉素適用于本發明的方法中，其中Treg擴增是所需的。在另一個實施方案中，該方法進一步包括給予含有展示TGF-P的外源細胞(例如，同種異體或異種)的組合物。例如，可以修飾外源細胞如脾細胞、用抗原脈沖的樹突細胞、骨髄細胞、造血千細胞、實體器官和胰島細胞來展示TGF-P。在該實施方案的一個特定方面中，還將雷帕霉素給藥于患者。在一個實施方案中，通過以下的方法獲得修飾的外源細胞，該方法包括(a)將外源細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的外源細胞和(b)將修飾的外源細胞接觸包括TGF-卩和第二個結合對成員的綴合物，來形成展示TGF-p的外源細胞。TGF-卩可以是全長TGF-p或其任何活性片段，如上所述。設計雙功能分子，使得雙功能分子通過雙功能分子的細胞表面結合部分結合細胞表面后，結合對的第一個成員基本上保持其對于第二個結合對成員的親和性。當雙功能分子包括生物素時，可以通過以下舉例說明的方法或通過其他方法(如WO02/02751中所述的那些)將其定位于細胞表面。在一個特定的實施方案中，雙功能分子是可以在體內綴合細胞表面上的蛋白質的生物素形式，如NHS-生物素，包括磺基-NHS-LC-生物素。在雙功能分子包括生物素的實施方案中，結合對的第二個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(或其上述的任意變體，包括核心鏈霉抗生物素蛋白)。本發明還提供了擴增Treg細胞的方法，使用已經evvivo修飾來展示TGF-p的抗原脈沖過的DC。根據本發明的這個方面，用一個或多個抗原如一個或多個自體抗原來脈沖DC,然后離體修飾來展示TGF-卩，如上所述。在一個實施方案中，用一個或多個致糖尿病自體抗原如GAD、胰島細胞自體抗原(ICA)或自體抗原NRP-A7來脈沖DC。在一個特定的實施方案中，用GAD65、ICA512和NRP-A7中的每一個來脈沖DC。或者，用胰島裂解物脈沖未成熟的DC。在另一個實施方案中，用膠原來脈沖DC(例如，用于治療關節炎)。在另一個實施方案中，用髓磷脂堿性蛋白來脈沖DC(例如，用于治療多發性硬化)。獲得展示TGF-卩的脈沖DC的方法的一個實施方案包括(a)用抗原脈沖未成熟的樹突細胞，來獲得脈沖過的樹突細胞；(b)將脈沖的樹突細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的脈沖樹突細胞；和(c)將修飾的脈沖樹突細胞接觸包括TGF-卩和第二個結合對成員的綴合物來形成展示TGF-P的脈沖樹突細胞。TGF-P可以是全長TGF-卩或其任意的活性片段，如上所述。在一個特定的實施方案中，雙功能分子包括磺基-NHS-LC-生物素。在雙功能分子包括生物素的實施方案中，第二個結合對成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(或其上迷的任意變體，包括核心鏈霉抗生物素蛋白)。在一個實施方案中，通過本領域已知的方法驅使脈沖過的DC成熟。例如，可以通過用4-1BBL賻育來驅使脈沖過的DC成熟。根據本發明的這個方面，可以將脈沖過的、展示TGF-卩的DC給予需要Treg擴增的患者，如上述的那些目標患者。可以通過上述的任何途徑來給予DC，如通過靜脈內給藥。可以通過實驗來測定DC的最佳劑量，如下文中所述的。之前在NOD小鼠中使用脈沖DC的研究表明5x05細胞/動物和2x105細胞/動物在誘導Treg擴增中是有效的。本發明還包括將脈沖過的、展示TGF-卩的DC結合一種或多種上迷共刺激綴合物和/或結合雷帕霉素來給藥的方法。因此，例如，可以將脈沖過的、展示TGF-P的DC結合包括4-lBBL、CD80和/或IL-2或上述任何其他共刺激部分給藥于患者。另外地或可替換地，可以將雷帕霉素給藥于患者。根據這些實施方案，可以與DC基本上同時，或在DC之前或之后，給藥一種或多種綴合物和/或雷帕霉素。在本發明的一個實施方案中，使用包括4-lBBL和/或CD80、IL-2的綴合物和任選的TGF-(3來獲得非特異性的Treg擴增。在另一個實施方案中，使用包括4-1BBL和/或CD80和IL-2的綴合物，結合用相關抗原脈沖并用TGF-卩修飾的外源胰島或器官或樹突細胞，在暫時使用雷帕霉素的掩飾下，獲得抗原特異性的Treg擴增。本發明還提供了擴增Treg細胞的方法，以上述對于脈沖DC的相同方式，使用TGF-卩修飾的造血干細胞或骨髓細胞(BMC)，包括外源(例如，同種異體或異種)BMC。該方法可用于建立混合的嵌合體，例如，用于誘導對自體抗原、同種抗原和異種抗原的耐受性，和治療自體免疫力和造血遺傳缺陷。可以單獨使用該方法，或結合上述的共刺激綴合物和/或結合雷帕霉素，如上所述。使用造血干細胞或BMC不僅擴增Treg細胞，而且將盡力混合的嵌合體，該嵌合體將控制自體免疫力并允許胰腺|3細胞再生，使得預防和/或治療糖尿病。結合綴合物使用TGF-卩修飾的造血干細胞或外源BMC將擴增Treg細胞，其隨后將使得預防千細胞或BMC的排斥和建立控制自體反應性和同種反應性的混合嵌合體。根據本發明的這個實施方案，將造血干細胞或BMC生物素化并用TGF-P-CSA修飾，如上所述，并在雷帕霉素掩飾下靜脈內注射。可以結合給藥如上制得的一種或多種共刺激綴合物(包括CD80/IL-2和/或4-lBBL/IL-2綴合物)來實現這種處理，以便擴增致耐受性作用。用未修飾的或TGF-P-修飾的造血干細胞或BMC和雷帕霉素的處理將擴增Treg細胞，使得預防糖尿病。如上所述，TGF-P和雷帕霉素可以協同作用來阻斷自體抗原特異性Teff細胞的激活和擴增，同時促進Treg細胞的激活和擴增或其從CD4+CD25T細胞的轉化。一種或多種共刺激綴合物的任選使用可以進一步擴增該作用。以下實施例更詳細地說明了本發明，并且不在任何方面來限制本發明的范圍。實施例一般方法動錄非糖尿病小鼠(NOB)購自JacksonLaboraories(BarHarbor,Maine)并依據NIH和Guidelines來飼養。BALB/c和C57BL/6小鼠購自JacksonLaboratory(BarHarbor,ME),在路易斯維爾大學在SPF條件下詞養并根據學會和NIH指導來護理。/《^7^^^3《婉4^3和趟^仏-2和4-/^9L、CD卵和TGF-々炎合資^:可以使用果蠅DES表達系統(lnvitrogen;Carlsbad,CA)來建立表達這些分子的穩定轉染子，如Singh等，2003，Ca"cw63:4067-73中所迷的。在設定為25'C和105rpm的培養振蕩器中，在補充ImM疏酸銅的果蠅無血清培養基(Gibco;Carlsbad,CA)將轉染子孵育72小時，用于重組蛋白表達。通過離心收集培養物上清液并接受大規模純化，使用鈷(II)-羧曱基天冬氨酸鹽交聯的瓊脂糖固定的金屬親和性樹脂(BD-Talon，BDBiosciences)或Ni-NTA金屬親和性樹脂(Qiagen),利用工程化至蛋白質中的6x-His-標記物。簡而言之，通過逐滴加入95°/。乙醇產生10%乙醇的終濃度，以沉淀含有重組蛋白的培養基。在4。C孵育過夜后，將沉淀的蛋白重新溶解于1/10起始體積的結合緩沖液中(50mM磷酸鈉pH7.0;500mM氯化鈉；0.5%吐溫-20;1%甘油；5mM2-巰基乙醇)。使用5x凝膠床體積的結合緩沖液來平衡金屬親和性樹脂，加入重新溶解的蛋白溶液中，并在室溫用顛倒旋轉孵育45分鐘。用50-100ml洗涂緩沖液(50mM磷酸鈉pH7.0;500mM氯化鈉)將結合蛋白質的金屬親和性樹脂洗滌2x。使用2x凝膠床體積的洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉pH7.0;500mM氯化鈉；150mM咪唑)從金屬親和性樹脂洗脫結合的蛋白質。合并純化的蛋白洗脫液并裝栽于AmiconUltraTM(Millipore;Bedford,Mass)離心過濾裝置中，使用30kD分子量截留膜。將離心過濾裝置在3000rpm(2000xg)4'C離心15分鐘。將無菌PBS加入截留物中并將濾器在3000rpm(2000xg)再次離心。從離心過濾裝置中吸出含有濃縮/脫鹽蛋白的截留物，置于無菌的低溫瓶中，并儲存在液氮中。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分離蛋白的濃度。根據制造商的說明(Pierce)使用BCA蛋白測試來測定蛋白質濃度。時43和趁^:收集NOD的胰島并立即在4M硫氰酸胍中均質。按照之前所述的分離總RNA,參見，例如，Shiwan等，1993，《/.//wmmo/.150:2295-304。將純化的RNA溶解于二乙基焦碳酸鹽處理的水中，分配成小的等份，并在使用前存儲在-70。C。將該RNA的一部分用作RT-PCR的模板，使用鼠GAD編碼序列特異性的引物。參見，例如，Lee等,1993,5ioc/i//n.5/0/7/ip.1216:157-60。將PCR產物克隆至TA克隆栽體中(Invitrogen)。鑒定功能性克隆并用于亞克隆至用于表達的載體中pAC(Avidity)。細菌轉化并在氨芐青霉素培養基上選擇后，將幾個克隆接受最小質粒制備并用合適的限制酶消化來鑒定陽性克隆。將帶有插入片段的克隆用于大的質粒制備。將質粒用于轉化AVB100大腸桿菌，該菌林具有穩定整合至染色體中的6/M連接酶基因。用L-阿拉伯糖誘導蛋白表達，用于帶有生物素標記物的GAD的高水平表達。使用蛋白質印跡和用作探針的堿性磷酸酶綴合物的鏈霉抗生物素蛋白測定純化GAD的濃度、內毒素水平和生物素化。如果需要，使用來自Pierce的Detoxi-凝膠內毒素去除試劑盒來除去內毒素。將生物素化GAD等分并冷凍于-70'C直至使用。^^源f:通過在PBS中以1:1的摩爾比混合將包括共刺激部分和核心生物鏈霉素的綴合物結合生物素化的IL-2和/或生物素化的GAD蛋白。以以下所示的劑量靜脈內注射PBS中的所有綴合物和DC。;f^濕合時沐S勿應^^。在5天測試中作為應答劑培養來自天然BALB/c小鼠(lxl0V孔)的脾臟和淋巴結細胞，使用照射過的(2000cGy)來自天然C57BL/6小鼠的脾細胞("105/孔)作為刺激劑。以不同的應答劑與Treg的比例將擴增的Treg細胞加入培養物中。在培養的最后16小時中用H、胸腺嘧啶脫氧核苷來脈沖細胞。腐4移控。通過單次靜脈內注射200mg/kg鏈脲霉素(Biomol,PlymouthMeeting,PA)使雄性BALB/c小鼠(22-26g，6-8周大)患有糖尿病，并通過兩次〉300mg/dl連續血糖讀數來證實糖尿病。在力夷島移植前一天，通過靜脈內注射將5-8><106個離體擴增的Treg細胞轉移至每只動物。使用0.2mg/ml的釋放酶溶液(Roche)通過胰腺的原位灌輸從完全錯配的C57BL/6小鼠收集供體胰島。在37'C消化17分鐘后，使用Ficoll梯度純化胰島并在完全培養基中37'C維持過夜(補充10%FBS,2mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素/鏈霉素和50mM2-巰基乙醇的RPMI)。第二天收集胰島，用PBS洗滌并將400-600個胰島移植至每個BALB/c移植接受者的左側腎嚢下。對照動物移植同種異體胰島，但沒有接受Treg細胞。每周監控接受移植的動物三次，并通過兩次〉300mg/dl的連續血糖讀數來證實排斥。腐4^逸沐S勿應通過首先用0.2mg/ml釋放酶(Roche)消化胰腺從NOD動物的胰島收集滲透淋巴細胞，例如，如Yolcu等，2002，/wwwm(>M7:795-808中所述的。一旦獲得單個胰島，按照之前所述的將它們消化，例如，Green等,2002,/畫wm'(y16:183-91中所述的，來獲得胰島滲透淋巴細胞。將后者染色用于流式細胞術分析。^;《勿/^i:首先通過滴定目標一抗和二抗，然后在流式細胞術中使用最佳濃度來進行流式細胞術分析，使用標準程序。參見，例如，Mhoyan等，1997,7>"^//朋^〃0"64:1665-70。同型-配對抗體作為陰性對照。將樣品在FACSCalibur或Vantage(BectonDickinson;MountainView,CA)上運行并4吏用FlowJo(TreeSoft)或CellQuest(BDBiosciences)軟件進行分沖斤。炎y^^e^t勿應^W應^勿應^f為、浙在流式細胞術分析中使用這些細胞因子特異性的單克隆抗體(PharMingen)進行胞內IL-2、IL-4、1L-10和IFN-y的分析。參見，例如，Elson等，1995，</.^wnw"o/.154:4294-301。在37°C用4%多聚甲醛將細胞固定5分鐘，并用PBS/1%BSA洗滌兩次。在補充0.1。/。BSA和10。/。FCS的PBS-S緩沖液中(PBS，0.01MHEPES，0.1%皂草苷)在水上孵育過夜來阻斷非特異性結合后，用PBS-S緩沖液將細胞洗滌兩次并在水上用細胞因子特異性抗體賻育30分鐘。用PBS-S緩沖液洗涂兩次后，將它們在水上用FITC-綴合的抗小鼠IgG大鼠抗體孵育30分鐘，并通過流式細胞術來分析。同型配對的不相關抗體作為陰性對照。根據制造商的實驗方案(eBioscience)來進行胞內FoxP3分析。遞i^^4'細/敏^W71勿應為、i^弄浙;C或費。從天然BALB/c小鼠收集脾臟和淋巴結細胞，加工成單細胞懸浮液，并使用ACK溶液來裂解紅血球。為了細胞分選，用抗CD4-FITC、抗CD25-PE和抗CD8-APC將細胞染色。使用FACSVantage細胞分選儀(BDBioscience,SanJose,CA)來分選CD4+CD25'單陽性(SP)和CD4+CD25+雙陽性(DP)T細胞。分選的細胞為>95%純。在流式細胞術中使用CD4-APC、CD4-FITC、CD8-PE、CD8-PerCP、4-lBBL-PE、CD25-PE、CD95-F1TC、生物素-CD137、生物素-CD28、生物素-GITR、生物素-TGF-卩和FITC標記的抗生物素蛋白的Abs來測定原初和擴增的Treg細胞的表型。將具有相配熒光染料的同型Abs用作對照。根據制造商的實驗方案"Biosciences,SanDiego，CA)進行胞內FoxP3染色。對于受體表達測試，將分選的CD4+CD25+或CD4+CD25-T細胞在96-孔平板中單獨，或在IL-2(25U/ml)、照射過的脾細胞(lx105/孔)或兩者的存在下培養2天。在培養2天后，收集一部分細胞，用PBS洗涂兩次，并分成兩個分開的培養物。同時給一個培養物補充IL-2，而另一個保持沒有IL-2。培養2天后，用抗4-lBB或CD28的抗體將細胞染色，并使用流式細胞術來分析。在用IL-2和脾細胞培養2天后，收集一組細胞，洗滌兩次，并未處理再培養2天。在另一組細胞中，在第2天加入IL-2并再培養2天。用抗4-lBB或CD28的抗體將細胞染色，并使用流式細胞術來分析。Fo;c尸3W/r-尸C尺。使用TRI試劑從原初BALB/c小鼠的脾臟和淋巴結新鮮分選的CD4+CD25-和CD4+CD25+T細胞或擴增的Treg細胞分離總RNA。使用兩pgRNA來產生第一鏈cDNA,并進行PCR擴增，使用FoxP3和HPRT特異性引物，各自進行33和27個循環。引物序列為FoxP3正向5，-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3'FoxP3負向5，-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3'HPRT正向5，-GAAGTGTTGGATACAGCCCAGAC-3'HPRT負向5，-GAGGGTAGGCTGGCATCTAGGCT-3，逸歡病理夢評價胰島的自體免疫的組織學信號及其分泌胰島素的能力。在處理后的不同時間點從處理過的和對照NOD動物取出胰島。用10%緩沖的福爾馬林固定每個胰島片，包埋于石蠟中，并以4pM切片，并用蘇木精和曙紅(H&E)染色來測定一般的生理改變。按照之前所述的進行細胞因子、T細胞和胰島素的免疫組織化學。參見，例如，Green等，2002，/w/wwm(y16:183-91。DCW^務并^7放潛尿病戎/^脈/，使用GM-CSF和IL-4在來自NOD的骨髓(BM)細胞的培養物中產生未成熟的細胞4-5天。用GAD65、ICA512和NRP-A7肽的混合物(30pg/肽/ml)將細胞脈沖并用100ng/ml小鼠CSA-4-1BBL綴合物或CD40L驅使分化過夜。從GenScriptCorporation購得肽。將細胞徹底洗滌并用TGF-卩修飾(或核心鏈霉抗生物素蛋白作為對照蛋白)，按照上述和下文中詳述的方法。在一些實施方案中，將NODAPC與各種濃度的徹底滲析的NP40裂解物共培養，從用作自體抗原來源的NOD胰島制備該裂解物。用PBS洗涂后，在流式細胞術中分析一部分細胞，用于在免疫調節之前，在細胞表面上展示TGF-j3，II類上調和CD80/CD86共刺激分子。4細應^面丄W/^^:用水冷PBS洗滌DC并以2.5x106細胞/ml在含有5pMEZ-LinkTM磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)的pH8.0的PBS中室溫孵育20分鐘。將細胞徹底洗滌并以lxl(^細胞/ml在4。C孵育15分鐘，使用50-100ng純化的TGF-p-核心鏈霉抗生物素蛋白綴合物(或核心鏈霉抗生物素蛋白作為對照)。用PBS徹底洗滌后，將細胞處理用于流式細胞術分析并用于進一步的研究，如下所述。婉^，使用Kaplan-Meier曲線估算治療對1型糖尿病預防的作用。使用對數級檢驗(概括的Savage/MantelCox)測定不同組之間的存活差異。涉及比較來自單個動物組數據的程序首先具有使用F檢驗(兩組)或Levent，s檢驗(多組)檢測到的相等差異。當差異不相等時，進行log轉化。當比較正常分布的樣品平均值時，使用Student's檢驗(兩組)或Newman-Keuls檢驗(多組)。當數椐沒有正常分布時，使用Mann-WhitneyU檢驗(兩組)或Kruskal-Wallis檢驗(多組)。統計學顯著性定義為p<0，05。實施例l:CSA-4-lBBL綴合物的克隆和表達使用TRI試劑(MolecularResearchCenter,Cincinnati,OH)，從用LPS(5pg/ml)剌激2天的小鼠脾細胞中分離總RNA。將兩微克該RNA用于產生第一鏈cDNA，將其用作PCR的模板來擴增4-1BBL的胞外結構域(aa104-309),使用正義(5，-ATCGAATTCCGCACCGAGCC丁CGGCCAGCG-3，)和反義(5，-GGACTCGAGCATAGCAGCTTGAGGACTTAGC-3，)引物。將引物工程化來包括￡coRI和A7wl位點來促進定向和框內克隆至DES表達栽體中(Invitrogen，SanDiego,CA)。將PCR產物克隆至PCR2.1TOPO栽體中并將幾個陽性克隆接受DNA測序。用EcoRI和A7zo1消化含有正確4-1BBL序列的單個克隆并亞克隆至含有6xHis標記物和核心鏈霉抗生物素蛋白(CSA)的pMT/BiP/V5-His表達載體中，使得小鼠4-1BBL的胞外結構域在C-端克隆至CSA的生物素-結合和四聚體形成結構域。圖8A,在金屬可誘導表達栽體中，使用果蠅的分泌信號將嵌合基因框內亞克隆，并使用果蠅DES表達系統在S2昆蟲細胞中表達CSA-4-1BBL綴合物，使用瓊脂糖柱純化，并使用鱟阿米巴樣細胞裂解物試劑盒(CharlesRiver)測試內毒素。CSA-4-BBL綴合物作為四聚體和更高階結構存在，如在天然條件下通過PAGE測定的。只在變性條件下將四聚/寡聚結構解離成37kDa單體，并通過SDS-PAGE分級。圖8B顯示了變性(泳道2)和天然(泳道3)條件下純化CSA-4-1BBL的蛋白質印跡分析。在變性條件下，CSA-4-1BBL作為37kDa的單體出現，而在天然條件下，蛋白質作為四聚體和H50kDa的高階結構出現。如下測定了CSA-4-1BBL與4-1BB受體的結合。在總的混合的淋巴細胞反應(MLR)培養基(補充5%FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素/鏈霉素、10mMHEPES和100mMMEM-丙酮酸鈉的DMEM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)和50mM2-巰基乙醇(SIGMA,St.Louis.MO)中用5pg/mlConA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)刺激來自BALB/c或C57BL/6小鼠的脾細胞48小時。然后用CSA-4國BBL綴合物(200ng/lxl()6細胞)或等摩爾量的CSA對照蛋白(76ng/lxl06細胞)在旋轉振蕩器上將激活的和/或靜息細胞4'C孵育30分鐘。孵育后，用PBS將細胞洗滌幾次，用抗CD4(APC)、CD8(PerCP)、4-lBBL(PE)和SA(FITC)的抗體染色，并通過流式細胞術分析。將靜息和CSA-孵育的細胞用作陰性對照。對于阻斷測試，還用過量(50ng/lx06細胞)的抗4-1BB抗體(3H3，由Emery大學的R,Mittler友情提供，CA)將一百萬個激活的細胞孵育30分鐘。然后用PBS將細胞洗涂幾次，然后用200ng嵌合4-lBBL(CSA-4-1BBL)再孵育30分鐘。然后用PBS洗涂細胞并用抗CD4-APC、CD8-PerCP、4-1BBL-PE和CSA-FITC的抗體染色，并通過流式細胞術分析。將靜息和CSA-孵育的細胞用作陰性對照。用4-1BBL(200ng/lxl()6細胞)或對照CSA蛋白(76一><106細胞)將來自BALS/c小鼠的靜息或ConA激活的脾細胞在4'C孵育30分鐘。使用抗小鼠4-lBBL的抗體檢測CD4+和CD8+T細胞上的4-1BBL結合(黑線)。用CSA蛋白孵育的細胞用作對照(灰色填充的)。如圖8C中所示的，CSA-4-BBL結合表達4-lBB受體的激活CD8+和CD4+T細胞。這種結合對于4-lBB是特異性的，因為天然T細胞缺乏受體分選陰性，此外，首先用抗4-lBB抗體阻斷受體導致失去了結合(圖8C，右圖)。為了測試4-lBBL是否是功能性的，在各種濃度(圖8D中以ng/ml來顯示)的可溶性CSA-4-lBBL綴合物或對照CSA蛋白的存在下，用次佳濃度的抗-CD3抗體將從天然BALB/c的脾臟和淋巴結純化的總CD4+T細胞刺激4天。圖8D。用。3八-4-881^綴合物的共刺激在004+T細胞中產生了強有力的增殖應答，這是濃度依賴性的并且在統計學上是顯著的(p<0.05)。增殖應答是4-1BBL依賴性的，因為在等摩爾水平使用的CSA蛋白沒有在測量上增加由次佳劑量的抗-CD3抗體獲得的應答。總而言之，這些結果了CSA-4-1BBL綴合物具有核心鏈霉抗生物素蛋白的結構特征，因為其形成了四聚體和寡聚體，結合激活的T細胞上的4-1BB,并在次佳抗-CD3抗體刺激下作為T細胞的有效激活劑。實施例2:使用CSA-4-BBL綴合物的Treg擴增使用焚光激活的細胞分選(FACS)從BALB/c小鼠的脾臟中分選出CD4+CD25+Treg細胞(圖9A),并在同源APC存在下，用抗-CD3抗體(0.5ng/ml)、CSA-4-BBL(l^ig/ml)和IL-2(25IU/ml)激活。然后將細胞以lxi(^細胞/ml來維持，每3天使用補充IL-2的培養基，持續10-12天。然后將培養物接受另一輪的激活，接著用IL-2維持。如圖9中所示的，該方案使得Treg細胞在18-24天內Treg細胞擴增55至110倍，在25天內擴增110倍(圖9B)。在相同條件下但沒有CSA-4-1BBL綴合物維持的Treg細胞只得到了最小擴增。擴增的Treg細胞形成了由CD4+CD25*細胞構成的同種群(圖9A，右下圖)，該細胞表達高水平的FoxP3蛋白(通過RT-PCR或抗FoxP3抗體測定的)以及Fas、CD62L、GITR、CD25、CD28和細胞表面TGF-卩(數據未顯示)，并抑制異源應答以及使用抗CD3刺激的T細胞的多克隆激活(數據未顯示)。相反，沒有用4-1BBL的培養物只顯示出DP細胞數量的2.5倍擴增，并顯示出由CD4+CD25"*細胞和CD4+CD25*細胞構成的異種群(圖9A，右上圖)。與擴增的CD4""SP細胞不同，Treg細胞表達高水平的4-lBB。圖10(黑色填充的群未同型對照)。實施例3:擴增的Treg細胞延長胰烏同種異體移植的存活為了測試多克隆擴增到的Treg細胞的治療效果，將化學誘導的(用鏈脲霉素)糖尿病BALS/c小鼠獲得性轉移5-1(^106個如上所迷的在培養物中擴增的Treg細胞，持續20-25天，然后在24小時后，給予完全錯配的C57BL/6同種異體胰島的移植。監控動物的血糖水平，每周三次。所有Treg處理的動物(o)具有延長的存活(MST=68.7±10天)，在觀察階段的85天內，超過1/3(66%)沒有排斥移植物。圖11。明顯相反，所有沒有用Treg細胞治療的對照動物()強烈排斥移植物(MST=16.6±2.7天)。實施例4:擴增的CD4+CD25+Treg細胞是抑制性的在傳統的抑制測試中使用CD3刺激來表征擴增的Treg細胞的功能。與天然Treg細胞相似，在應答CD3刺激中保持無變應性的擴增的Treg細胞能夠抑制CD4+Teff細胞的多克隆增殖，并且這種抑制功能應當受到4-1BBL的抑制(圖12A)。使用混合淋巴細胞反應提供了如上所述的根據本發明擴增的Treg細胞的抑制功能的更多證椐。將天然BALS/c小鼠的脾臟和外周淋巴結細胞用作應答劑，而將來自天然C57BL/6小鼠的照射過的脾細胞用作刺激劑。存在顯著的(p<0,05)由擴增的Treg細胞引起的異體抗原驅使的Teff增殖的有效抑制，即使在10:1應答劑比Treg的比例(圖12B)。這表明了擴增的Treg細胞賦予了屬于天然產生的Treg細胞的傳統抑制總而言之，這些數據證明了用CSA-4-1BBL綴合物擴增的Treg功能實施例5A.4-lBBL和IL-2對于Treg細胞的協同作用在0.5ng/ml抗-CD3抗體的存在下，將分選的天然DP細胞與照射過的同源脾細胞共培養3天。給培養物補充25U/mlIL-2、lpg/mlCSA-4-1BBL或兩者的混合物。給Treg培養物加入IL-2或4-lBBL足以誘導Treg細胞(DP)增殖；然而，與補充Ipg/ml4-lBBL的那些相比較，在補充25U/mlIL-2的培養物中，存在4倍的增殖提高。圖13A。結合使用4-lBBL和IL-2產生了最大的增殖應答(超過單獨的IL-2兩倍；圖13A),表明這兩個蛋白協同作用來促進Treg細胞的增殖。還檢測了沒有APC的培養物系統中信號1、2和3各自對Treg增殖的單獨貢獻。在該測試中，通過可溶性抗-CD3抗體來提供信號1，通過4-lBBL提供信號2,通過IL-2提供信號3。單獨使用分選的天然DP細胞，沒有使用照射過的脾細胞，并給培養物補充抗-CD3抗體、CSA-4-1BBL和/或IL-2。如圖13B中所示的和表1中所概括的，剌激單獨的信號1或2在誘導Treg細胞增殖中是無效的，而刺激信號3導致適度的擴增。刺激信號l和2兩者也具有最小的Treg擴增效果。然而，剌激信號1或2結合通過IL-2的信號3刺激具有顯著的增殖效果，當所有三個信號得到刺激時，觀察到對Treg增殖的最劇烈的效果(2-3周內達到110-倍擴增)。擴增的Treg細胞全部是CD25亮并表達高水平的CD28、4-lBB、GITR、Fas、CD62L、膜結合TGF-p和FoxP3，與沒有用4-lBBL擴增的DP細胞相比4交。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>這些結果表明在刺激信號1、2和3對Treg細胞增殖的效果中存在等級制度。單獨刺激信號1或2實際上不具有效果，而單獨刺激信號3(通過IL-2)或除了信號1和/或2以外刺激信號3具有顯著的效果。刺激所有三個信號具有最顯著的效果，接著是信號2和3的刺激，然后是1和3。B.IL-2上調CD4+CD25+Treg細胞上的4-1BB受體的表達在IL-2和/或照射過的APC的存在或不存在下，將分選的CD4+CD25+(DP)Treg和CD4+CD25'(SP)Treg細胞培養2天。然后收集細胞，并在流式細胞術中分析4-1BB的表達。只有22。/。新鮮分選的Treg細胞表達了4-1BB,而沒有一個分選的Teff細胞對該受體是陽性的。當細胞單獨培養2天時，4-1BB的表達下調至背景水平(2%)。在照射過的APC的存在下培養Treg細胞對維持Treg細胞上的4-1BB的組成型表達具有最小的作用(8%)。明顯相反的是，將IL-2加入Treg細胞的培養物中不僅導致4-1BB受體的維持，而且介導上調(新鮮細胞的29%vs22%)。照射過的APC的加入進一步提高了IL-2對4-lBB表達上調的作用(53%)。為了進一步探測IL-2在維持/上調Treg細胞上的4-1BB中的作用，將APC加IL-2存在下培養的細胞徹底洗滌，并在IL-2不存在下重新培養2天(圖13C，上圖中的最后一個柱狀)。所有Treg細胞將4-lBB表達下調至背景水平。4-1BB表達通過IL-2的調節是Treg細胞特異性的，因為相似的處理在Teff細胞上的4-1BB表達模式的改變中是無效的(圖UC，下圖)。這些結果對我們的只是而言是第一次證明了IL-2維持/上調Treg細胞上的4-1BB表達，并提供了觀察IL-2和4-1BBL之間對Treg細胞離體增殖的協同作用的機理基礎。實施例6:功能性TGF-p-CSA級合物的構建按照上述的一般方法產生了包括CSA和TGF-卩活性形式的綴合物。當用于MLR測試中(圖14)或用抗CD3多克隆激活(數據未顯示)時，TGF-P-CSA綴合物對T細胞的增殖顯示出有效的抑制活性。這些數據證明了TGF-P-CSA是有活性的，并且可以用來阻斷抗原特異性增殖，并因此在體外和體內的Treg細胞擴增中是有用的。實施例7:用4-lBBL、CD80&IL-2的非選摔性Treg擴増如上所迷，理解NOD小鼠中糖尿病的產生涉及控制致病的Teff細胞的Treg細胞的功能的破壞。與糖尿病抗性抹相比，NOD小鼠在外周具有較少數量的Treg細胞，并隨著年齡顯示出Treg細胞數量和功能的下降，這與糖尿病的發作相關。盡管引起這種情況的確切機理還是未知的，APC調節Treg細胞的產生和維持的能力的缺乏可能起著作用。與這種論點相一致的是以下的觀察結果(i)NOD中的DC顯示出降低的共刺激分子如CD80的表達，這些共刺激分子對于Treg細胞的產生和功能是重要的，和(ii)各種對NOD小鼠中糖尿病的發病率具有保護作用的生物物質如蠕蟲和病毒可能通過DC的調節誘導Treg細胞。該實施例說明了使用包括CD80和/或4-1BBL和IL-2的綴合物在NOD小鼠中選擇性地擴增Treg細胞，并顯示了該方法對于保護NOD中的1型糖尿病的功效。綴合物將優先結合Treg細胞并以治療方式來擴增它們。可以將NOD中的糖尿病階段粗略地分為胰島炎前(1-3周)、胰島炎(4-8周)、前驅糖尿病(8-24周)和糖尿病(>28周)。這些階段根據圏養動物的結構而不同。選擇前驅糖尿病的雌性NOD小鼠，因為這些動物將具有充分發展的自體免疫力以及預期的Treg細胞和APC不足，預防這些動物中的糖尿病將具有臨床結果。為了在體內擴增Treg細胞，以各種組合、頻率和劑量，給動物靜脈內注射包括CD80和IL-2或4-1BBL和IL-2的綴合物。核心鏈霉抗生物素蛋白(CSA)/IL-2綴合物將用作對照。通過在使用前將CSA-CD80或CSA-4-1BBL綴合物與生物素化的IL-2以1:1的摩爾比混合來制備綴合物。使用CD28的超興奮(s叩eragonistic)抗體，發現在注射后3天產生峰值Treg擴增應答。因此，每3天給動物注射綴合物并就在下一次綴合物注射之前放血，來測定Treg擴增的水平。在流式細胞術中使用抗CD4和FoxP3的抗體進行定型。一旦從該血液分析測定了峰值Treg細胞擴增的時間，將動物犧牲，用于收集外周淋巴結，包括胰腺淋巴結、脾臟和胰腺。將脾臟和淋巴結以及從每只動物的胰島收集的GIL處理成單細胞懸浮液，并使用各種細胞表面CD4、CD8、4-1BB、CD62L、TGF-卩、CD25和胞內FoxP3、IL-10和IFN-y標記通過流式細胞術來定型，以具有T細胞狀態的綜合觀察。如在此所述的前驅糖尿病的NOD小鼠的處理將快速擴增Treg細胞而超過Teff細胞。預期通過CD80、4-lBBL和IL-2共刺激和存活信號的提供導致Treg細胞的快速擴增。通過DC的激活可以進一步加強這種效果，這可以歸功于Treg細胞功能的擴增和/或恢復。所得到的擴增可以是全身的，或Treg細胞可以優選回到胰腺淋巴結和胰腺，用于保護性應答。擴增的Treg細胞將表達所有典型的Treg細胞標記，如細胞表面TGF-卩、CD25、4-1BB和胞內IL-IO。實施例8:通過非選擇性Treg擴增預防1型糖尿病如下證明了前驅糖尿病的NOD動物中Treg擴增來預防或延遲1型糖尿病發作的能力。用包括CD80和IL-2或4-1BBL和IL-2的綴合物處理前驅糖尿病的NOD(12周大)動物，如上所述，并在允許Treg細胞強烈擴增的條件下處理，如以上的研究所測定的。監控動物的糖尿病發展，持續25周(到該時間為止，我們群體中超過85%的未操縱的雌性產生了糖尿病)。認為兩次連續每日測量血糖水平超過250mg/dl是糖尿病的證實。將28周時處理失敗的動物以及沒有產生糖尿病的那些犧牲，并收集各種組織，用于Treg表型測定以及免疫組織化學，以測定疾病的狀態(無vs.胰島炎前vs.胰島炎)。留下未處理或用CSA-IL-2綴合物處理的動物將作為糖尿病發病率的對照。根椐本發明，前驅糖尿病動物中的Treg細胞擴增將防止糖尿病的產生。持續的預防效果可能需要使用綴合物的周期性治療，以維持高比例的Treg比自體免疫Teff細胞。長期非糖尿病動物可以完全沒有疾病或可能帶有沒有臨床呈現的前胰島炎。預期患病的動物具有降低數量的Treg細胞，表達較低量的膜TGF-卩和分泌的IL-10。這些動物可能還含有大量分泌IFN-y的CD4+和CD8+Teff細胞。實施例9:使用4-lBBL&自體抗原的選擇性Treg擴增盡管Treg細胞能夠以抗原非特異性方式來抑制免疫應答，但抗原驅使的Treg細胞的激活和擴增就特異性和提高的功效而言可以給予很多優勢。該實施例說明了自體抗原特異性Treg細胞的選擇性擴增，使用包括4-lBBL和自體抗原GAD的綴合物，結合包括CD80和IL-2以及TGF-(3和IL-2的綴合物，用于將自體抗原有效地傳送至DC。還使用了雷帕霉素來提高功效。如上所述，DC組成型地表達4-1BB，并且通過4-lBBL/GAD綴合物結合的通過該受體的信號將導致DC的激活，共刺激分子的上調以及有效T細胞應答需要的各種細胞因子的合成和分泌。此外，CD80和IL-2將優先擴增Treg細胞，其組成型地表達CD28和CD25。同時，使用TGF-卩和IL-2將阻斷Teff細胞的功能和擴增，并提高Treg細胞的功能和擴增。雷帕霉素將通過阻斷Teff細胞的增殖并促進其凋亡來增大TGF-卩的作用，而對Treg細胞的擴增沒有主要的影響。因此，在TGF-卩和雷帕霉素的存在下，自體抗原的識別將選擇性地阻斷Teff細胞的激活和功能，同時促進抗原特異性Treg細胞的產生和擴增，而4-1BBL將激活DC,用于持續的Treg應答。以各種組合、頻率和劑量，給十二周齡的前驅糖尿病動物給藥(通過靜脈內注射)包括4-1BBL和GAD、CD80和IL-2,以及TGF-卩和IL-2的綴合物。通過將CSA-4-lBBL綴合物與生物素化的GAD混合(如上述所制備的)或如上所述通過將CSA-CD80或TGF-P-CSA綴合物與生物素化的IL-2混合來制備綴合物。在用綴合物治療的整個持續期間，每天通過腹膜內給予1.5mg/kg劑量的雷帕霉素。在流式細胞術中使用CD4和FoxP3的抗體監控動物血液中Treg細胞的峰值擴增。一旦測定到峰值Treg應答的時間，使動物安樂死，用于收集外周淋巴結，包括胰腺淋巴結，脾臟和胰腺，并按照以上實施例7中所述的，對各種細胞表面和胞內標記進行多參數定型。留下未處理或用各種綴合物組合處理的NOD接受者將用作對照。之前，測定了對于Treg細胞擴增最有效的條件，將它們用于處理另一組動物，用于預防糖尿病。預期用全部四個綴合物(4-1BBL/GAD;4-1BBL/IL-2;CD80/IL-2;丁GF-卩/IL-2)和雷帕霉素的聯合治療是用于抗原特異性的Treg細胞擴增和預防前驅糖尿病動物的糖尿病的有效方案。4-1BBL/GAD綴合物將GAD自體抗原傳送至DC，導致蛋白質加工，DC的激活并將GAD遞呈至Treg細胞以及致病的Teff細胞。TGF-卩和雷帕霉素將協同作用來阻斷自體抗原特異性Teff細胞的激活和擴增，同時促進通過CD80/IL-2以及4-1BBL/IL-2和/或4-1BBL/GAD綴合物的Treg細胞的激活和擴增。TGF-卩和雷帕霉素還將通過誘導FoxP3表達而促進CD4+CD25-原初T細胞轉化成Treg細胞。在用TGF-卩或雷帕霉素中至少之一處理的組中將獲得自體抗原特異性Treg細胞的特異性擴增，因為這兩種物質優先阻斷Teff細胞增殖，而對Treg細胞的擴增沒有明顯的影響。Treg細胞的擴增與糖尿病的預防相關。使用綴合物的周期性重復治療對于維持Treg集合是有用的。使用另外的自體抗原(例如，包括4-1BBL和其他不同的自體抗原的綴合物)可以通過擴增更寬類別的Treg細胞來提高效果。實施例10:使用修飾的、脈沖的DC選擇性擴增Treg細胞該實施例說明了使用DC來擴增Treg細胞，該DC已經用三種致糖尿病自體抗原(GAD、ICA152和NRP-A7)的混合脈沖過，并用TGF-卩修飾過。可以單獨使用該方法，或結合上述的共剌激綴合物和/或結合上述的雷帕霉素來使用。使用用三種自體抗原脈沖的DC將引發不同類型的Treg細胞，并且DC上TGF-卩的直接展示不僅限制了任何可能與全身使用可溶性蛋白相關的毒性，而且還將有效地擴增和/或恢復Treg細胞的功能，使得防止NOD中的糖尿病。使用GM-CSF和IL-4從NOD的骨髓產生未成熟的DC，如上所迷。用致糖尿病抗原GAD65、胰島細胞自體抗原(ICA512)肽和NRP-A7肽的混合物將細胞脈沖。通過用4-1BBL過夜孵育驅使未成熟DC成熟，并通過流式細胞術來表征，使用抗CDllc的抗體和各種成熟標記，如高水平的II類MHC、CD80和CD86分子。將DC生物素化(5pMEZ-LinkSulfo-NHS-LC-Btioin，Pierce)并用TGF-p-CSA(100ng/l(^細胞)修飾，如上所述，并在雷帕霉素的掩飾下，靜脈內注射至前驅糖尿病動物中。以不同的劑量靜脈內注射DC，開始為5><105細胞/動物。(該劑量的用兩個GAD肽和一個hsp60肽脈沖的DC已經顯示出能有效降低前驅糖尿病NOD小鼠中的糖尿病發病率)。在相關的實驗中，還給予了如上制得的CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2綴合物(結合脈沖的、修飾的DC),來增大致耐受性效果。將未修飾的細胞和用CSA修飾的細胞用作對照。如上所述，分析動物的Treg細胞擴增和糖尿病的預防。用未修飾的或TGF-卩修飾的脈沖的DC和雷帕霉素的處理將擴增Treg細胞，使得預防糖尿病。如上所述，TGF-P和雷帕霉素可以協同工作來阻斷自體抗原特異性Teff細胞的激活和擴增，同時促進Treg細胞的激活和擴增，或其從CD4+CD25T細胞的轉化。任選使用CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2綴合物可以進一步擴增這種效果。實施例ll:使用修飾的BMC選擇性擴增Treg細胞該實施例說明了使用用TGF-(3修飾的外源(同種異體或異種)骨髓細胞(BMC)來擴增Treg細胞。可以單獨使用該方法，或結合上迷的共刺激綴合物和/或結合雷帕霉素，如上所述。使用BMC不僅擴增Treg細胞，而且還建立了混合的嵌合體，這將控制自體免疫力并允許胰島卩細胞再生，使得預防和/或治療糖尿病。使用用TGF-卩修飾的外源BMC結合綴合物將擴增Treg細胞，其隨后將使得預防BMC排斥并建立混合嵌合體，這將控制自體和異種兩種反應性。如上所述將BMC生物素化(5pMEZ-LinkSulfo-NHS-LC-Btioin,Pierce)并用TGF-卩-CSA(100ng/106細胞)修飾，并在雷帕霉素的掩飾下，靜脈內注射至前驅糖尿病的動物中。以不同的劑量靜脈內注射BMC,開始為5xl05細胞/動物。在相關的實驗中，還給予了如上制得的CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2綴合物(結合修飾的BMC)，來增大致耐受性效果。將未修飾的細胞和用CSA修飾的細胞用作對照。如上所述，分析動物的Treg細胞擴增和糖尿病的預防。用未修飾的或TGF-p修飾的BMC和雷帕霉素的處理將擴增Treg細胞，使得預防糖尿病。如上所述，TGF-卩和雷帕霉素可以協同工作來阻斷自體抗原特異性Teff細胞的激活和擴增，同時促進Treg細胞的激活和擴增，或其從CD4+CD25'T細胞的轉化。任選使用CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2綴合物可以進一步擴增這種效果。實施例12:嵌合4-lBBL(CSA-4-BBL)抑制Treg細胞的抑制性功能，同時驅使Treg細胞和Teff細胞增殖我們使用嵌合4-1BBL蛋白(CSA-4-BBL)研究了4-1BB信號在Treg功能中的作用。在基于卩H]胸苷引入的共培養實驗中，從天然BALB/c小鼠分選的CD4+CD25+雙陽性(DP)T細胞顯著抑制了由CD3刺激誘導的單陽性(SP)CD4+CD25Teff細胞的增殖性應答(圖15A)。通過給培養物補充lpg/ml嵌合4-lBBL(CSA-4-1BBL)有效(p<0.05)且特異性地抑制了這種抑制性作用，但沒有使用等摩爾濃度的CSA對照蛋白。為了測試所觀察到的由嵌合4-1BBL引起的抑制作用的抑制是否是由于CD4+Teff細胞增殖應答的恢復或誘導的Treg細胞的增殖所引起的，用CFSE(羧基熒光素琥珀酰亞胺酯)將SP細胞標記，并用于共培養實驗中(圖2B，上圖)。與對照相比較(56%),用嵌合4-lBBL共刺激導致提高的CD4+Teff細胞增殖(75%)。將Treg細胞加入培養物中顯著降低了CD4+Teff細胞的增殖(30%),這通過4-lBBL得到了部分恢復(62%)。共培養實驗中缺乏應答4-lBBL共刺激的CD4+Teff細胞增殖的全部恢復可能是由于Treg細胞與Teff細胞竟爭嵌合蛋白和/或其他因子，如IL-2。在平行的實驗中，將CFSE標記的DP細胞用于共培養實驗中，來測試Treg細胞是否還顯示出對4-1BBL刺激的增殖應答(圖15B,下圖)。當單獨培養(44%,與對照的17%相比)或結合SPTeff細胞(58%vs.對照的28。/。)培養時，存在Treg細胞應答4-lBBL的顯著增殖。總而言之，這些結果證明了4-lBBL驅使Treg細胞增殖，而抑制其抑制性功能。實施例13:擴增的CD4+CD25+Treg細胞的表型使用流式細胞術將實施例2中擴增的細胞對傳統的Treg細胞標記進一步表征。擴增的Treg細胞表達CD25、4-lBB、CD28、GITR、Fas、CD62L和細胞表面TGF-P。重要地，與沒用4-1BBL擴增的那些相比較，所有這些標記在4-1BBL擴增的Treg細胞上得到顯著上調(圖9A和16A)。擴增的Treg細胞還表達了信號轉錄因子FoxP3，如通過RT-PCR所測定的(圖16B),以及胞內信號(圖16C)。重要地，與沒用4-1BB刺激的Treg細胞相比較，在4-lBBL存在下擴增的Treg細胞具有提高水平的FoxP3蛋白。總而言之，這些數據證明了4-lBBL刺激上調了涉及天然產生Treg細胞的產生/功能的所有細胞表面標記以及FoxP3。*承承承盡管足夠詳細地描述和舉例說明了本發明，用于本領域技術人員來制備和使用，各種替換、改變和改進應當是清楚的，而沒有脫離本發明的精神和范圍。在此提供的實施例是優選實施方案的表示，并不是打算來限制本發明的范圍。本領域技術人員將產生其中的改變和其他用途。這些改變包括在本發明精神內，并由權利要求的范圍來限定。對在此公開的本發明形成各種替代和改變而沒有脫離本發明的范圍和精神是本領域技術人員顯而易見的。人員水平的表示。在此引入所有專利和出版物作為參考，至如同每篇單獨的出版物特意并單獨表示引入作為參考的相同程度。可以在缺少在此未特意公開的任意要素、限制的情況下合適地實施在此說明性描述的本發明。因此，例如，在此的每個情況中，術語"包括"、"基本上包括"和"包含"中的任一個可以由其他兩個術語中的任一個來替代。已經使用的術語和表述用作描述而非限制的術語，分的意圖，但是認為各種改變:所要求的本發明^圍內是可^的。因此，應當理解盡管已經通過優選的實施方案和任選特征特異性地公開了本發明，在此公開的概念的改變和變化依靠本領域的技術人員，并其他實施方案列于以下的示例性實施方案和隨后的權利要求內示例性實施方案1.一種組合，包括(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-p多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(B)—個或多個選自以下的綴合物(a，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員。在實施方案1中，細胞因子的選擇不受限制。2.實施方案1的組合，其中所迷結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所述第二個成員包括生物素。3.實施方案1的組合，其中所迷結合對的所述第一個成員包括核心生物素。4.實施方案1的組合，其中所迷第一、第二或第三綴合物中的至少一個包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一綴合物成員和所迷第二綴合物成員。5.實施方案1的組合，其中所述細胞因子選自IL-2、IL-4或IL-7。6.實施方案1的組合，其中所迷抗原是自體抗原。7.實施方案1的組合，其中所述抗原選自胰島素、膠原、髓磷脂堿性蛋白和MHC/抗原復合物。8.實施方案1的組合，其中所述抗原選自谷氨酸脫氫酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原帖NRP-A7。9.實施方案1的組合，其中在分開的組合物中提供所述綴合物。10.實施方案6的組合，其中所述分開組合物中的至少一種進一步包括藥物學上可接受的栽體、賦形劑或稀釋劑。11.實施方案1的組合，其中在單個組合物中提供所述綴合物。12.實施方案8的組合，其中所述單個組合物進一步包括藥物學上可接受的栽體、賦形劑或稀釋劑。13.實施方案8的組合，其中所述第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過所述結合對的所述第一個和第二個成員之間的結合與所述第四、第五、第六或第七綴合物中的至少一個結合。14.擴增Treg細胞的方法，所迷方法包括將Treg細胞群體接觸(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(B)—個或多個選自以下的綴合物(a，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的笫二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員。15.實施方案14的方法，其中所述Treg細胞包括所述第一、第二或第三綴合物中至少一個的受體，并且其中所迷第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過所述第一綴合物成員和所述受體之間的結合與所述Treg細胞綴合，并且所述第四、第五、第六和第七綴合物中的至少一個通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述Treg細胞綴合。16.實施方案14的方法，其中離體實現所述接觸。17.實施方案16的方法，其中所述綴合物中的至少兩個基本上同時接觸所述Treg細胞。18.實施方案16的方法，其中在單個組合物中提供所述綴合物中的至少兩個。19.實施方案18的方法，其中所述第一、第二或第三綴合物中的至少一個通過所述第一個和第二個結合對成員之間的結合與所述第四、第五、第六和第七綴合物中的至少一個綴合。20.實施方案16的方法，其中所述綴合物中的至少兩個按次序接觸所迷Treg細胞。21.權利要求16的方法，進一步包括將所述擴增的Treg細胞給藥于患者。22.權利要求14的方法，其中通過將所述綴合物給藥于患者在體內實現所述接觸。23.實施方案14的方法，其中所述Treg細胞群體包括選自CD4+細胞、CD25+細胞和FoxP3+細胞的Treg細胞。24.實施方案23的方法，其中所述Treg細胞群體包括CD4+CD25+FoxP3十細胞。25.實施方案21或22的方法，其中所迷患者患有自體免疫疾病或處于自體免疫疾病的風險中。26.實施方案25的方法，其中所述患者患有I型糖尿病或處于I型糖尿病的風險中。27.實施方案21或22的方法，其中所述患者是外源移植患者。28.實施方案21或22的方法，進一步包括將雷帕霉素給藥于所述患者。29.實施方案21或22的方法，進一步包括將包括展示TGF-p的外源細胞的組合物給藥于所述患者。30.實施方案29的方法，進一步包括將雷帕霉素給藥于所迷患者。31.實施方案29的方法，其中所述外源細胞選自脾細胞、胰島組織和骨髓細胞。32.實施方案29的方法，其中通過以下方法獲得所迷外源細胞(a)將外源細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的外源細胞；和(b)將所述修飾的外源細胞接觸包括TGF-卩和所述結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-p的外源細胞。33.實施方案14的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，并且所述結合對的所迷第二個成員包括生物素。34.實施方案14的方法，其中所述結合對的所述第一個成員包括核心鏈霉抗生物素蛋白。35.實施方案14的方法，其中所述第一、第二或第三綴合物中的至少一個包括融合多肽，該融合多肽包括所迷第一綴合物成員和所迷第二綴合物成員。36.實施方案4的方法，其中所述細胞因子選自IL-2和IL-4。37.實施方案14的方法，其中所述抗原是自體抗原。38.實施方案14的方法，其中所述抗原選自胰島素、膠原、髓磷脂堿性蛋白和MHC/抗原復合物。39.實施方案14的方法，其中所述抗原選自谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原NRP-A7。40.實施方案14的方法，進一步包括將所述Treg細胞接觸游離的IL-2。41.實施方案14的方法，進一步包括將所述Treg細胞接觸游離的抗-CD3抗體或游離的抗-CD28抗體。42.獲得展示TGF-卩的脈沖樹突細胞的方法，包括(a)用抗原脈沖未成熟樹突細胞，以獲得脈沖的樹突細胞；(b)將所述脈沖的樹突細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的脈沖樹突細胞；和(c)將所述修飾的脈沖樹突細胞接觸包括TGF-p和所迷結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-P的脈沖樹突細胞。43.實施方案42的方法，其中所述抗原是致糖尿病自體抗原。44.實施方案43的方法，其中所述致糖尿病自體抗原選自谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原NRP-A7。45.實施方案44的方法，其中所迷致糖尿病自體抗原選自GAD65和ICA512。46.實施方案45的方法，包括用GAD65、ICA512和NRP-A7中的每一個脈沖所迷未成熟樹突細胞。47.實施方案42的方法，其中所述抗原是膠原。48.實施方案42的方法，其中所述抗原是髓磷脂堿性蛋白。49.實施方案42的方法，進一步包括驅使所述脈沖的樹突細胞成熟。50.實施方案49的方法，其中所述驅使包括用4-1BBL孵育所述脈沖的樹突細胞。51.展示TGF-卩的抗原脈沖的樹突細胞群體。52.通過實施方案42的方法制得的展示TGF-卩的抗原脈沖的樹突細胞群體。53.在患者中擴增Treg細胞的方法，包括將含有展示TGF-卩的抗原脈沖的樹突細胞的組合物給藥于所述患者。54.在患者中擴增Treg細胞的方法，包括將含有通過實施方案42的方法制得的展示TGF-p的脈沖樹突細胞的組合物給藥于所述患者。55.實施方案54的方法，進一步包括將雷帕霉素給藥于所述患者。56.獲得展示TGF-卩的造血干細胞或骨髄細胞的方法，包括(a)將造血干細胞或骨髓細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞；和(b)將所述修飾的細胞接觸包括TGF-(3和所述結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-卩的細胞。57.實施方案56的方法，其中所述結合對的所述笫一個成員包括生物素和所迷結合對的所迷第二個成員包括核心鏈霉素。58.在患者中擴增Treg細胞的方法，包括將含有展示TGF-p的造血干細胞或展示TGF-卩的骨髓細胞的組合物給藥于所迷患者。59.實施方案58的方法，其中通過以下方法制備展示TGF-卩的細胞，該方法包括(a)將造血千細胞或骨髄細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞；和(b)將所迷修飾的細胞接觸包括TGF-卩和所迷結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-卩的細胞。60.實施方案58的方法，進一步包括將雷帕霉素給藥于所迷患者。61.實施方案58的方法，其中所述患者是需要對自體抗原、同種抗原或異種抗原的耐受性誘導；卩細胞再生；外源移植排斥的預防；或遺傳上固有造血性疾病治療的患者。62.展示TGF-p的骨髓細胞群體。63.通過以下方法制得的展示TGF-卩的骨髓細胞群體，該方法包括(a)將骨髓細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞；和(b)將所述修飾的細胞接觸包括TGF-卩和所述結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-p的細胞。64.展示TGF-J3的造血干細胞群體。65.通過以下方法制得的展示TGF-|3的造血千細胞群體，該方法包括(a)將造血干細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞；和(b)將所述修飾的細胞接觸包括TGF-卩和所迷結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-卩的細胞。權利要求1.一種組合，其包括(A)一個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-1BBL多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-β多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(B)一個或多個選自以下的綴合物(a’)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(b’)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(c’)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；和(d’)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員。2.權利要求1的組合，其中所迷第一、第二或第三綴合物中的至少一個包括融合多肽，該融合多肽包括所述第一綴合物成員和所述第二綴合物成員。3.權利要求1的組合，其中所迷細胞因子選自IL-2、IL-4或IL-7。4.權利要求l的組合，其中所迷抗原是自體抗原。5.權利要求1的組合，其中所迷抗原選自胰島素、膠原、髄磷脂堿性蛋白、MHC/抗原復合物、谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原NRP-A7。6.權利要求1的組合，其中在分開的組合物中提供所述綴合物。7.權利要求l的組合，其中在單個組合物中提供所述綴合物。8.擴增Treg細胞的方法，所述方法包括將Treg細胞群體接觸(A)—個或多個選自以下的綴合物(a)第一綴合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的笫一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(b)第二綴合物，其包括(i)包括CD80多肽的笫一綴合物成員和(ii)包括結合對的第一個成員的第二綴合物成員；(c)第三綴合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第一個成員的第二綴合物成員；和(B)—個或多個選自以下的綴合物(a，)第四綴合物，其包括(i)包括抗-CD3抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(b，)第五綴合物，其包括(i)包括細胞因子的第一綴合物成員和(ii)包括所迷結合對的第二個成員的第二綴合物成員；(c，)第六綴合物，其包括(i)包括抗原的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員；和(d，)第七綴合物，其包括(i)包括抗-CD28抗體的第一綴合物成員和(ii)包括所述結合對的第二個成員的第二綴合物成員。9.權利要求8的方法，其中(a)離體和/或(b)在體內實現所述接觸。10.權利要求8的方法，其中所述的Treg細胞群體包括選自CD4+纟田胞、CD25+多田胞和FoxP3+纟田胞的Treg纟田胞。11.權利要求8的方法，進一步包括將含有展示TGF-|3的外源細胞的組合物給予所述患者，其中所述外源細胞選自脾細胞、胰島組織和骨髓細胞。12.權利要求8的方法，其中所述抗原選自胰島素、膠原、髄磷脂堿性蛋白、MHC/抗原復合物、谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原NRP-A7。13.獲得展示TGF-卩的脈沖樹突細胞的方法，所述方法包括(a)用抗原脈沖未成熟樹突細胞，來獲得脈沖的樹突細胞；(b)將所述的脈沖樹突細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的脈沖樹突細胞；和(c)將所述修飾的脈沖樹突細胞接觸包括TGF-卩和所述結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-p的脈沖樹突細胞。14.權利要求13的方法，其中所述抗原選自膠原；髓磷脂堿性蛋白；和糖尿病自體抗原，其中所述糖尿病自體抗原進一步選自谷氨酸脫羧酶(GAD)、胰島細胞自體抗原(ICA)和自體抗原NRP-A7。15.展示TGF-卩的抗原脈沖的樹突細胞群體。16.在患者中擴增Treg細胞的方法，所迷方法包括將含有展示TGF-卩的抗原脈沖的樹突細胞的組合物給藥于所迷患者。17.獲得展示TGF-卩的造血干細胞或骨髄細胞的方法，所迷方法包括(a)將造血干細胞或骨髓細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所迷細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞；和(b)將所迷修飾的細胞接觸包括TGF-卩和所迷結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-(3的細胞。18.在患者中擴增Treg細胞的方法，所迷方法包括將含有展示TGF-卩的造血干細胞或展示TGF-卩的骨髄細胞的組合物給藥于所述患者。19.展示TGF-卩的細胞群體，其中所述細胞選自骨髄細胞和造血干細胞。20.權利要求19的展示TGF-P的細胞群體，所述細胞群體是通過以下方法制得的，該方法包括(a)將細胞接觸包括結合對的第一個成員和結合所述細胞表面的分子的雙功能分子來形成修飾的細胞，其中所述細胞選自骨髓細胞和造血干細胞；和(b)將所述修飾的細胞接觸包括TGF-卩和所述結合對的第二個成員的綴合物來形成展示TGF-卩的細胞。全文摘要本發明提供了用于離體或在體內擴增Treg細胞的方法和組合物，其使用一個或多個包括共刺激部分的綴合物，該共刺激部分刺激涉及Treg細胞發展的三個信號中的至少一個，和/或使用用抗原脈沖的并修飾來展示TGF-β的樹突細胞，或修飾來展示TGF-β的造血干細胞或骨髓細胞。該方法和組合物可以用于，例如，治療和預防自體免疫疾病，包括1型糖尿病，和預防外源移植排斥，以及建立混合的嵌合體，誘導對自體抗原、同種抗原和異種抗原的耐受性，β細胞再生，預防外源移植排斥和治療遺傳上固有的造血性疾病。文檔編號C07K14/495GK101378783SQ200680052490公開日2009年3月4日申請日期2006年12月7日優先權日2005年12月8日發明者H·什爾萬申請人:路易斯維爾大學研究基金會有限公司