新型磷脂酶c的制作方法

專利名稱：：新型磷脂酶c的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種磷脂酶C、可制造該磷脂酶C的絲狀菌、自絲狀菌培養物中分離出該磷脂酶C的方法、編碼該磷脂酶C的DNA，以及該磷脂酶C的制造方法等。具體而言，本發明涉及一種特別適用于食品工業及醫藥品工業的磷脂酶C，特別是由絲狀菌中的米曲霉(爿s/erg〃/Mso/^zae)或溜曲霉(y^/ergz7/wsa附a"/)所制造的磷月旨酶C、生產該磷脂酶C的絲狀菌、自絲狀菌培養物中分離精制出該磷脂酶C的方法、編碼該磷脂酶C的DNA，以及該磷脂酶C的制造方法等。
背景技術：
：[l]磷脂酶C先前已知有動物及微生物可制造磷脂酶C。源自動物的酶主要是具有磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)選擇性的磷脂酶C，而源自微生物中的細菌、放線菌、酵母菌及霉菌的磷脂酶C也是已知的。細菌、放線菌及酵母菌所制造的磷脂酶C，幾乎都對磷脂酰肌醇或磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine)具有選擇性。已知源自細菌的磷脂酶C例如由下列細菌所制造尸w^mom^"/zwy/M/z'e"wi(例如見于專利文獻1:日本特開昭50-1017183號)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Bw/A:/zo/wew^ma〃a'，例如見于非專利文獻1:KorbsrisateS等.,Toww"/o/C7/w'c"/M/cn76/o/og7,1999，Vol.37,3742-3745)、蠟樣芽胞桿菌(Bac///^cwew，例如見于非專利文獻2:TanC.等,/Vofe/wExpresw'ow_Pw^yi.ca"'o"，1997，Vol.10，365-372)、金黃色葡萄球菌(6Va//^/ococcw^m^ew，例如見于非專禾'J文獻3:DaughertyS.等,/"/ec"owaw<i/mwwm'(y,1993,Vol.61，5078-5089)，以及產氣莢膜梭狀芽胞桿菌(C7a^Wwmp^/H"ge"s，例如見于非專利文獻4:TitballR.等，/"/e"/o"twd/mwMm'(y,1989，Vol.57,367-376)等等。己知源自放線菌的磷脂酶C例如是八丈島鏈霉菌(5V^ptomyc^/wc/^>e"w;y)(例如見于專利文獻2:日本特開昭49-55893號)所制造的磷脂酶C。源自酵母菌的磷脂酶C已知例如是下列酵母菌所制造的白色念珠菌(a/6/ca"s，例如見于非專利文獻5:AndaluzE.等，2001,Vol.18,711-721)、釀酒酵母菌(Sacc/zaromjcescereWw》e，例如見于非專利文獻6:PayneW.等，Mo/簡/wdCe脂or1993，Vol.13,4351-4364)。己知源自霉菌的磷脂酶C有兩例。其一來自黑曲霉菌"^e^///^m'gw，例如見于專利文獻3:日本特開第2000-166543號)，另一來自佐氏曲霉菌(^pwg/〃Msa"o/)(例如見于非專利文獻7:MatsuokaS.等,_8/o/ec/zwo/og_yflwd萬/oc/zewz、/7-7，1987，Vol.9，401-409)。卵磷脂卵磷脂是廣泛分布于動物、植物、菌類中的代表性甘油磷脂。所謂的甘油磷脂是指磷酰堿以共價鍵與1，2-二酰基甘油的3-位結合的化合物，其中堿的部分包括膽堿、乙醇胺、絲氨酸、肌醇以及甘油等，其組成比例依來源而有所不同。卵磷脂在使用上是歸屬于甘油磷脂類。卵磷脂具有表面活性功能、抗氧化功能及生理活性功能等，可應用于食品、詞料、醫藥品等中。在食品工業中，以蛋黃卵磷脂及大豆卵磷脂等為代表的天然卵磷脂可作為食品添加物使用，其主要是作為乳化劑等以改變食品性質，所以供給量甚多。卵磷脂的酶處理現也正在進行使用酶將卵磷脂部分水解，以賦予其新性質的研究。現今所用的酶為磷脂酶類的酶，已知有磷脂酶A、B、C、D等，其中磷脂酶A可選擇性水解甘油磷脂的1-或2-位的脂肪酸，磷脂酶B可進行非選擇性水解，磷脂酶C可水解出二酰基甘油及磷酰堿，磷脂酶D可分解出磷脂酸及堿。于食品工業領域中，現在最常使用的是磷脂酶A。雖然卵磷脂難溶于水，但若使用磷脂酶A處理卵磷脂，則其酰基可部分水解而生成水溶性的溶血卵磷脂(lysoledthin)。將溶血卵磷脂用作食品添加物時，所得食品的物性與習知使用卵磷脂所得食品的物性可能不同。[4]神經鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)神經鞘氨醇磷脂是由甘油磷脂與磷脂所構成的，代表為神經鞘磷脂(sphingomyelin)，其是膽堿磷酸與神經酰胺(ceramide)的伯醇經磷酸二酯結合的化合物，廣泛存在于動物臟器中。母乳中也含有，因此有時也將其添加入嬰兒用奶粉中。若使用磷脂酶C處理神經鞘磷脂，則可使膽堿磷酸脫落而生成神經酰胺。神經酰胺現正廣泛應用于化妝品中作為保濕成分，又有報導稱異位性皮膚炎是由于神經酰胺不足所造成的。磷脂酶C在食品中的應用于水存在下使用磷脂酶C，即可自卵磷脂制造二酰基甘油，如下圖所示■0...—"CQ~~^~'■'0""'"國''-"^0""""""^""^Ftihc—o*-~co—82+&。.....h!;-0-co-r2+r3~hp。4。3卵磷脂二酰基甘油上式中R,及R2各自表示烷基，R3表示膽堿、乙醇胺、甘油、肌醇等基團。于食品原料中引起如上反應，即可提供一種附加有與磷脂酶A本質上不同的特性的商品。此處所使用的磷脂酶C必須能夠水解各種甘油磷脂。例如，大豆卵磷脂中是以磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺為主，其中也含有磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇等。另外，源自蛋黃的卵磷脂中主要含有磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺。因此，所使用的磷脂酶C較佳可以無區別地水解上述物質。但，食品中除磷脂以外尚含有大量磷酸酯，如其被水解而使磷酸游離，則會進一步改變該食品的性質，故此作法仍不夠好。因此，較佳的選擇是不會水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C，例如是對甘油磷酰膽堿等類似于磷脂但不含脂質部分的磷酸酯不具酶活性的磷脂酶c。就此觀點而言，所使用的磷脂酶c較佳是不具有磷酸酶活性的蛋白質，也即對作為磷酸酶基質的對硝基苯基磷酸不具分解活性的磷脂酶c。另外，于食品工業中為防止食品變質，較佳作法是于中性至弱酸性pH區域進行各種處理，因此，含有磷脂酶等的酶劑以于該pH區域內具有較高活性者為佳。磷脂酶C在食品工業中的應用磷脂酶C的用途例如有改善于面包的冷凍保存生面團烤制時在面包表面產生的老化、緩和梨皮狀表皮及改進食用油的純化步驟等。于由大豆/菜籽等制造食用油時，由于卵磷脂是造成色澤或口味變差的原因，故必須除去卵磷脂。為達該目的，人們一直在研究如何使用習知的磷脂酶A將卵磷脂部分水解成溶血卵磷脂，而使其變為水溶性后加以除去的方法。然而，此處也可使用磷脂酶C使卵磷脂成為二酰基甘油，而與三酰基甘油共同成為油的一個成分。將此方法應用于食用油的制造步驟中，即可有效提高產率。此處所使用的磷脂酶C必須能夠水解各種磷脂，例如上述大豆油中所含的各種磷脂，或是棉籽油或菜籽油中所含的各種磷脂。所使用的磷脂酶C較佳可以無區別地水解這些磷脂。另外，由于制油工業中是于酸性加溫條件下除去油以外的雜質，故較佳使用于酸性區域活性較高且具有一定的熱穩定性的酶劑。為了使被處理的粗制油成為酸性，有時會使用檸檬酸，故所使用的磷脂酶C較佳是于檸檬酸存在下具有活性及一定的熱穩定性。[7]已知的磷脂酶C的問題動物、細菌、放線菌或酵母菌所制造的磷脂酶C主要是對磷脂酰肌醇或磷脂酰膽堿具選擇性，故不適用于需要分解各種基質的食品工業。另外，有些國家及地區因宗教原因而不能接受動物來源的酶劑，故其于通用性上也有問題。再者，會制造磷脂酶C的細菌幾乎都具病原性，故安全上也有問題。習知源自絲狀菌的磷脂酶C能夠水解各種磷脂，而先前用于制造磷脂酶C的任何絲狀菌于食用酶制造上已有實用效果。源自黑曲霉菌(A戸gz'腸m.,)與佐氏曲霉菌"，rg〃/w"a"o。兩菌的酶的溫度或pH值相關特性極相似，且分子量也相同。兩者于酸性側中均具有較強活性，但于中性附近卻完全沒有活性。因此，這些酶可以使用于可能在酸性側使用酶的制油工業中。但是，關于磷脂酶C在檸檬酸中的性質卻未有記載，其實際上是否可用于制油工業尚不明確(請見專利文獻3及非專利文獻7)。另外，磷脂酶C于pH6時活性幾乎為0，故一般認為大多在中性附近進行酶反應的食品工業中難以使用上述酶(請見專利文獻3)。再者，有報導指出黑曲霉菌所制造的磷脂酶C對作為磷酸酶的基質的磷脂酸的分解活性很高(專利文獻3)。因此，該酶具有水解磷酸單酯的能力，故可推斷其為同時具有磷酸酶活性的蛋白質。此外，也有報導指出佐氏曲霉菌所制造的磷脂酶C對2-十六酰基氨基-4-硝基苯酚磷酰基膽堿的分解活性很高(非專利文獻7)。因此，可推斷該酶是一種同時能夠水解除磷脂外的磷酸二酯的蛋白質。因此，使用以上各種酶進行加工的食品，可能會遭受不必要的改性。如此可列舉出以下磷脂酶C的問題習知的磷脂酶C其作為酶的功效不足，或于安全方面有問題等等，因此可于市場流通的含磷脂酶C的酶劑至今尚不存在。至于所期望的酶劑的性質可列舉如下其是源自于食品用酶劑制造中已有實用效果的微生物，于酸性側或中性附近能夠有效水解各種磷脂，于檸檬酸緩沖液中也具有活性并具有一定程度的熱穩定性，以便用于制油工業。再者，也希望能舉出一種磷脂酶C，其不會水解以甘油磷酰膽堿為代表的除磷脂外的磷酸酯。
發明內容如上所述，所期望的磷脂酶C的性質列舉如下可于酸性側或中性附近有效水解各種磷脂、于檸檬酸緩沖液中也具有活性及一定程度的熱穩定性，以便用于制油工業。再者，也希望能舉出一種磷脂酶C，其不會水解以甘油磷酰基膽堿為代表的除磷脂外的磷酸酯，且較佳是源自在食品用酶劑制造上已具實用效果的微生物。因此，如何提供這樣的磷脂酶C，在該
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中是非常令人關注的。本發明人為發現一種安全性良好、可于酸性側或中性附近有效水解各種磷脂、于檸檬酸緩沖液中也具有活性及一定程度的熱穩定性，同時又不會水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C而進行了不懈研究，從而純化出源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC41卯株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13卯7株的磷脂酶C，并篩選源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株的磷脂酶C的基因，以完成本發明。也即，本發明關于(1)一種磷脂酶C，其于酸性至中性pH下顯示活性，且實質上不水解除磷脂外的磷酸酯。(2)如(1)所述的磷脂酶C，其不具有對磷脂酰肌醇的特異性。(3)如(1)或(2)所述的磷脂酶C，其最適pH值是在pH3至pH6的范圍內。(4)如(1)至(3)中任一項所述的磷脂酶C，其于pH7時的相對活性為20%以上。(5)如(1)至(4)中任一項所述的磷脂酶C，其由絲狀菌產生。(6)如(5)所述的磷脂酶C，其中絲狀菌為曲霉屬。(7)如(6)所述的磷脂酶C，其由米曲霉(Aspergillusoryzae)或溜曲霉(Aspergillustamarii)產生。(8)如(7)所述的磷脂酶C，其由米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株，或是溜曲霉(Aspergillust薩rii)的IAM13907株產生。(9)如(1)至(8)中任一項所述的磷脂酶C，其表現出以下性質1)以SDS-PAGE電泳法測得的分子量約為87000;2)水解磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酰甘油；3)實質上不水解甘油磷酰膽堿及對硝基苯基磷酸；4)在pH3至pH9范圍內，水解源自蛋黃的卵磷脂；5)于0。C至8(TC范圍內具有如4)所述的水解活性；6)在溫度穩定性方面，當pH4.5時，于小于等于45'C的溫度下是穩定的；7)在pH穩定性方面，于pH3至pH10范圍內是穩定的。(10)—種磷脂酶C,其是以下a)d)中任一項所述的蛋白質a)具有序列號5的氨基酸序列的蛋白質；b)具有由序列號4的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的蛋白質；c)具有a)或b)所述的氮基酸序列中減少、取代或附加一或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有磷脂酶C活性的蛋白質；d)包含a)或b)所述的氨基酸序列而得的蛋白質。(11)一種被分離出的絲狀菌，其具有制造如(1)(4)、(9)、(10)中任一項所述的磷脂酶C的能力，且屬于米曲霉或溜曲霉，但溜曲霉的IAM13卯7株除外。(12)如(11)所述的絲狀菌，其是米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC41卯株。(13)—種DNA，是以下a)d)中任一所述的DNA:a)具有序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列的DNA;b)包含與a)所述的DNA具有70%以上的核苷酸序列相同性的核苷酸序列，且編碼具有磷脂酶C活性的蛋白質的DNA;c)編碼具有序列號5的氨基酸序列的蛋白質的DNA;d)包含序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列的DNA。(14)一種磷脂酶C，其是由(11)所述的DNA所編碼的蛋白質。(15)—種磷脂酶C的制造方法，包括1)培養(9)所述的米曲霉或溜曲霉的工序；以及2)自1)的培養產物中將磷脂酶C分離/純化的工序。(16)如(15)所述的方法，其中米曲霉是FERMABP-10200株或NBRC4190株，溜曲霉是IAM13907株。圖l顯示源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的純化磷脂酶C的活性與pH值的關系。圖2顯示源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的純化磷脂酶C的活性與溫度的關系。圖3顯示源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的純化磷脂酶C的熱穩定性。圖4顯示源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的純化磷脂酶C的pH穩定性。圖5顯示源自溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的純化磷脂酶C的活性與pH值的關系。圖6顯示源自溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的純化磷脂酶C的活性與溫度的關系。圖7顯示源自溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的純化磷脂酶C的熱穩定性。圖8顯示源自溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的純化磷脂酶C的pH穩定性。圖9顯示源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC41卯株的純化磷脂酶C的活性與pH值的關系。具體實施例方式以下詳細說明本發明，其中只要沒有特別指定，則以下所述各特性的測定方法皆是基于后述實施例或試驗例中所記載的測定方法。本發明涉及一種于酸性至中性pH區域具有活性，且實質上不會水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C;或可說是一種于酸性至中性pH區域具有活性，但不具有磷酸酶活性的磷脂酶c。所謂"于酸性至中性pH區域具有活性"，是指于pH值約3~7的范圍內的相對活性大于等于20%。(酶活性的測定法是"試驗例1-1:pH活性"中所記載的方法)另外，所謂"實質上不會水解除磷脂以外的磷酸酯"，是指以對磷脂酰膽堿(源自蛋黃)的水解活性為100%時，對磷脂酸的水解活性小于等于30%，較佳小于等于25%，以及/或是對甘油磷酰膽堿的水解活性小于等于15%，較佳小于等于10%，以及/或是對對硝基苯基磷酸的水解活性小于等于10%，較佳小于等于5%。"實質上不水解甘油磷酰膽堿及對硝基苯基磷酸"也表示類似意思。此處磷脂酸被認為是中性脂肪及甘油磷脂的合成中間體，因此于本案的中是不包含于甘油磷脂(磷脂)中的。所謂"不具有磷酸酶活性"，是指對磷脂酸或硝基苯酚磷酸的分解活性小于等于對磷脂酰膽堿的分解活性的50%;對磷脂酸的分解活性較佳小于等于對磷脂酰膽堿的40%，更佳是小于等于30%，再佳是小于等于25%。另外，對硝基苯基磷酸的分解活性較佳小于等于對磷脂酰膽堿的30%，更佳是小于等于20%，再佳是小于等于10%。本發明的磷脂酶C也具有對神經鞘磷脂的分解活性，較佳的是此分解活性等于或高于對磷脂酰膽堿的分解活性。具體而言，以對磷脂酰膽堿(源自蛋黃)的分解活性為100%時，對神經鞘磷脂的分解活性較佳是大于等于90%，更佳是大于等于105%，再佳是大于等于115%。另外，本發明的磷脂酶C也具有對磷脂酰乙醇胺的分解活性，其較佳與對磷脂酰膽堿的分解活性相近。具體而言，以對磷脂酰膽堿(源自蛋黃)的分解活性為100%時，對磷脂酰乙醇胺的分解活性較佳大于等于80%，更佳是大于等于85%，再佳是大于等于90%且小于等于150%。磷脂酶C的所謂"不具有磷脂酰肌醇專一性"，是指與對磷脂酰肌醇的分解活性(相對活性)相比，對除磷脂酰肌醇以外的基質的分解活性較高。此處除磷脂酰肌醇以外的基質較佳是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油。本發明的磷脂酶C作用時的pH值較佳在酸性至中性范圍內，尤其是在pH3至pH6的范圍內，更佳是在pH3至pH5的范圍內，再佳則是在pH4至pH5的范圍內。另外，所謂"于pH7時的相對活性"，是以活性最高的pH值時的水解活性為100%時，以百分率(％)表示pH7時的酶水解活性的相對值。本發明的磷脂酶C于pH7時的相對活性較佳大于等于20%,更佳是大于等于40%，再佳則是大于等于50%。關于溫度活性，本發明的磷脂酶C的作用溫度較佳在457(TC范圍內，更佳是在557(TC范圍內，再佳是在607(TC范圍內。另外，本發明的磷脂酶C較佳是在557(TC范圍內有大于等于50%的相對活性，更佳是在4570'C范圍內有大于等于50%的相對活性；再佳是在357(TC范圍內有50%的相對活性。另外，更佳的是其在5565°C范圍內的相對活性大于等于80%。另外，關于溫度穩定性的所謂的"穩定"，是指具有大于等于40%的殘存水解活性；本發明的磷脂酶C于45'C或以上處理溫度下的殘存活性較佳大于等于50%，更佳是大于等于70%，再佳是大于等于80%。另外，本發明的磷脂酶C較佳是在45"C、更佳5(TC、再佳60"C的處理溫度下，具有大于等于40%的殘存水解活性。另外，關于pH穩定性，其所謂"穩定"是指經過保存處理后仍具有大于等于5%的殘存水解活性；本發明的磷脂酶C的處理pH值在59的范圍內時，其殘存水解活性較佳是大于等于40%，更佳是大于等于50%，再佳是大于等于60%。另外，處理pH值在68的范圍內時，其殘存水解活性較佳是大于等于60%，更佳是大于等于70%，再佳是大于等于80%。另外，本發明的磷脂酶C的其它示例可例舉如含有序列號l、2及3的氨基酸序列中的任一個，較佳是含有任意兩個，再佳是含有全部三個，并且具有磷脂酶C活性的蛋白質。當該蛋白質含有這三個氨基酸序列中的二個以上時，各氨基酸序列的排列順序也可為任意順序。另外，本發明也包括具有于序列號5的氨基酸序列中減去、取代或附加一或多個氨基酸而得的氨基酸序列，且具有磷脂酶C活性的蛋白質。已知氨基酸序列經置換的蛋白質仍具有與天然蛋白質相同的活性的示例己知有將相當于白介素2(IL-2)基因中對應半胱氨酸的核苷酸序列置換為對應絲氨酸的核苷酸序列而獲得的蛋白質，其仍保持原來IL-2的活性(Wang，A.等，(1984)6Wewce，224，1431-1433)。另外，本發明的磷脂酶C的他例可例舉如具有序列號5的氨基酸序列的蛋白質。再者，對包含序列號5的氨基酸序列的蛋白質而言，只要其具有磷脂酶C活性，則仍包含于本發明的范圍中。本發明的磷脂酶C的其它示例又包括具序列號5的氨基酸序列且經糖鏈修飾的蛋白質。另外，對包含該種氨基酸序列的蛋白質而言，其只其要具有磷脂酶C的活性，則也包含于本發明中。本發明的磷脂酶C其較佳的示例包括源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的磷脂酶C、具有序列號5的氨基酸序列的蛋白質，以及具有序列號5的氨基酸序列且經糖鏈修飾的蛋白質；更佳者是源自溜曲霉(Aspergillustamarii)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的磷脂酶C，以及具有序列號5的氨基酸序列且經糖鏈修飾的蛋白質。本文中所謂"本發明的DNA"，是指編碼本發明的磷脂酶C的DNA，包括cDNA、基因組DNA、經人工修飾的DNA、化學合成的DNA等等，只要是現在已知的DNA，則任意形態均可。本發明的DNA的示例之一，是具有序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列，且編碼具有磷脂酶C活性的蛋白質的DNA。本發明的DNA的其它示例包括與序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列間的核苷酸序列相同性大于等于70%的DNA。此種DNA包括自然界發現的變異型DNA、人工造成的變異型DNA及源自異種生物的相同DNA等。另外，本發明的DNA的其它示例也包括編碼具有序列號4的氨基酸序列的蛋白質的DNA。再者，對應于所需氨基酸的密碼子也可任意選擇，其例如可考慮所利用宿主的密碼子的使用頻率，而根據常用方法來決定(Grantham,R.等(1981)A^c/"c爿c/AAe&,9,143-174)。再者，這些核苷酸序列的密碼子的部分改變可依常用方法，利用包含編碼所期望的改變的合成寡核苷酸序列的引物，而以"部位特異性變異導入法"(SiteSpecificMutagenesis/Mark,D.F.等(1984)7VW/.爿cadSc/.USA81,5662-5666)等方法進行。本發明的DNA的其它實也包括具有序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列的DNA。另外，也包括序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列的DNA，只要其編碼具有磷脂酶C活性的蛋白質，則也包含于本發明中。另外，本發明的磷脂酶C的例子包括具有由本發明的DNA所編碼的氨基酸序列的蛋白質。另外，為了自本發明的磷脂酶C制做有任意一個、二個或更多個氨基酸缺失的改變體，可使用以核酸外切酶Bal31等自末端切斷DNA的方法(岸本利光等所著的"續生物化學實驗講座1*基因研究法II"，335-354)及盒式(cassette)突變法(岸本利光所著的"新生物化學實驗講座2'核酸m重組DNA技術"，242-251)等。如此般，即便是由利用習知基因工程方法所得的基于本發明DNA的蛋白質，只要其具有磷脂酶C的活性，則也包含于本發明中。如此的磷脂酶C不必含有序列號5的完整氨基酸序列；舉例來說，即便是含有其部分序列的蛋白質，只要該蛋白質表現出磷脂酶C的活性，則也包含于本發明的磷脂酶C中。另外，編碼該種磷脂酶C的DNA也包含于本發明中。本發明所使用的磷脂酶C也可為自磷脂酶C制造菌中純化而得的、經粗純化而得的、除菌體的破碎液以外直接使用菌體的培養上清液而得的。于培養磷脂酶C制造菌時，較佳是除碳源、氮源以外還在培養基中添加表面活性劑。或者，較佳是在添加有魚粉、芝麻醬(日文；7Urf7)、棉籽粕等天然材料的培養基中進行培養。表面活性劑的例子包括TritonTM、吐溫、蔗糖脂肪酸酯、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、以及皂素等。磷脂酶C制造菌的培養可使用通常的培養裝置、培養基來進行，并可適當選擇液體培養、固體培養等方式。液體培養可使用燒瓶或發酵槽，且可使用培養開始后不追加培養基的分批培養法，或是在培養過程中添加適量培養基的流加料培養法。培養基中添加有碳源、氮源，并可依需要添加維他命、微量金屬等。碳源例如是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等單糖類，麥芽糖、纖維二糖、異麥芽糖、乳糖、蔗糖等二糖類，淀粉等多醣類，以及麥芽提取物等。氮源可使用胺、硫酸銨、硝酸銨等無機氮源，酵母提取物、麥芽提取物、有機性液肥、蛋白胨(peptone)等有機氮源。這些培養基中的組合物量可適當選擇，且培養溫度、pH值、通氣攪拌量等可因應磷脂酶C的制造方式作適當選擇。于磷脂酶C制造菌的培養結束后，進行離心分離，而可直接使用除去菌體的培養上清液作為粗酶液。另外，也可使用以離子交換層析法等進行粗純化所得的純化酶液。本發明中所謂米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株也包含其所有變異菌株，只要其可產生本發明的磷脂酶C即可。另外，這些變異株中也含有以遺傳學方法，如重組、轉導(transduction)、轉化(transformation)等而獲得的。即，可制造本發明的磷脂酶C的米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株、其變異株以及與其無明確區別的菌株皆全部包含于米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的范圍中。另外，本發明的磷脂酶C可以是在載體中插入本發明DNA的重組質體來轉化宿主細胞，并自該轉化細胞的培養產物中獲得而得的。此種于適當載體中插入本發明DNA的重組質體的操作也包含于本發明中。用于上述目的的載體可以是一般已知的各種載體，其較佳者例如是原核細胞用載體、真核細胞用載體、源自哺乳動物的細胞用載體等，但并非限定于此。通過如此的重組質體，即可轉化其它原核生物或真核生物的宿主細胞。進而，使用具有適當啟動子序列及/或與特性表達相關的序列的載體，或是將該種序列導入而制成表達載體，即可使基因于各宿主中表現出來。如此的表達載體為本發明的重組質體的較佳型態。可通過將本發明的重組質體導入各種細胞中，而獲得宿主細胞。如此的細胞可為原核細胞，也可為真核細胞，只要其為可導入質體的細胞即可。原核細胞的宿主例如是大腸桿菌(&c/zehc/^co//)及枯草桿菌(^"7/ww^7&)等。為了于這些宿主細胞內使目的基因轉化，可以利用含有源自適于宿主的菌種的復制子(R印licon，即復制起點)及調節序列的質體載體來轉化宿主細胞。另外，此載體較佳具有可使轉化細胞具備基因表達選擇性的序列。例如，大腸菌中經常使用K12株等；載體通常可使用pBR322及pUC系屬的質體，但并非僅限于此，而可使用周知的各種菌株及載體。用于大腸菌的啟動子例如是色氨酸(tip)啟動子、乳糖(lac)啟動子、色氨酸/乳糖(tac)啟動子、脂蛋白(lpp)啟動子、多肽鏈伸展因子Tu(tuffi)啟動子等，其中任一啟動子均可用于制造本發明的磷脂酶C。枯草菌中較佳者例如是207-25株，可配合其使用pTUB228(Ohmura，K.等(1984)丄BZ0c/7e附.，95，87-93)等載體，但并非僅限于此。另外，如將啟動子與編碼枯草桿菌ot-淀粉酶的信號肽序列的DNA序列加以連結，即可于菌體外產生分泌表達。真核細胞的宿主細胞包括脊椎動物、昆蟲、酵母等的細胞，其中脊椎動物細胞可以是源自哺乳動物的細胞，例如作為猿猴細胞的COS細胞(Gluzman，Y.(1981)CW/23,175-182，ATCCCRL-1650)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCCCCL-61)的二氫葉酸還原酶缺損株(Urlaub,G.andChasin,LA.(1980)P亂胸/.v4cW.5W.USA77,4126-4220)等。脊椎動物細胞的表達啟動子可使用位于所要常態表達的基因前段的啟動子、RNA的剪接部位、聚合腺苷酸化部位，以及具有轉錄終結序列等的啟動子，而依需要也更可具有復制起點。此種表達載體例如是具有SV40的初期啟動子的pSV2dhfr(Subramani，S.等(1981)Mo/.Ce〃.1,854-864)等，但并非僅限于此。以使用COS細胞作為宿主細胞的情形為例，其可使用具有SV40復制起點且可于COS細胞中自主增殖，且還具有轉錄啟動子、轉錄終結信號及RNA剪接部位的表達載體。該表達載體可通過二乙氨基乙基(DEAE)匿右方定糖酐(dextran)法(Luthman,H.andMagnusson，G.(1983)7Vwc/dcv4"Ai^，11,1295-1308)、磷酸鈣-DNA共沉淀法(Graham,F.L.andvanderEb，A,J.(1973)J^>o/ogy，52，456-457)以及電脈沖穿孔法(Neumann,E.等(1982)￡MSO丄，1,841-845)等方法送入COS細胞中，以獲得所要求的轉化細胞。另外，使用CHO細胞作為宿主細胞時，可使表達載體與令具有抗生物質G418耐性標記物功能的neo基因表達而得的載體(例如pRSVneo(Sambrook,J.等(1989):"Mo/ecw/arC7om'wg爿丄a6on3toryMa肌a/",ColdSpringHarborLaboratory,NY)及pSV2-neo(Southern,P.J.andBerg,P.(1982)乂Mo/.^;/.Ge"ef.，1,327-341)等)進行協同轉染，并選擇G418耐性的菌落，而獲得可穩定制造本發明的磷脂酶C的轉化細胞。使用昆蟲細胞作為宿主細胞時，通常使用源自鱗翅類夜蛾科的5^^0^era/n^^^/a種的卵巢細胞的株化細胞(Sf-9或Sf-21)或源自粉斑夜蛾(7Wc/zop/w/amO的卵細胞的HighFive細胞(Wickham,T.J.等(1992)5Zofec/mo/./Vog./:391-396)作為宿主細胞，其通常使用利用苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)的多角體蛋白質啟動子的pVL1392/1393載體(Kidd，I.M.andV.C.Emery(1993)"77ze膨o/6acM/ov/rwsesasex/^esw.owveCo^s",4p//〖e<i5z'oc/ze附/s^yawe/i/o&c/wo/ogy，42,137-159)作為桿狀病毒轉移載體。此外，也可使用利用桿狀病毒的P10或同堿性蛋白質啟動子的載體。再者，也可將AcNPV的包膜表面蛋白質GP67的分泌信號序列連結于目標蛋白質的N末端側，而表達出作為分泌蛋白質的重組蛋白質(Zhe-meiWang,等(1998)Biol.Chem.,379，167-174)。在以真核微生物作為宿主細胞的特性表達系列中，周知的是酵母菌，其中較好的是Sacc/zaromycw屬酵母菌，例如釀酒酵母(5Vjfcc/2arom少ce51cereWw'ae)或畢赤酵母(尸/c/z/apaeon's)。lt匕酵母菌等真核微生物的表達載體例如可優選利用醇脫氫酶基因的啟動子(Bennetzen,J.L.andHall,B.D.(1982)/B"/.C7;em.,257,3018-3025)及酸性磷酸酶基因的啟動子(Miyanohara，A.等(1983)iVoc.^cfld<Sc/.USA80,1-5)。另外，以分泌型蛋白質狀態加以表達時，也可將分泌信號序列與宿主細胞所持有的內在性蛋白酶或已知蛋白酶的切斷部位置于N末端側，而得重組體以進行表達。例如，可以在畢赤酵母菌所表達的胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶系列的人類肥大細胞類胰蛋白酶的系統中，將酵母菌的《因子分泌信號序列與畢赤酵母菌所持有的KEX2蛋白酶的切斷部位連結，使之表達，藉此于培養基中分泌活性型類胰蛋白酶(Andrew,L.Niles，等(1998)Bz'o&c/mo/.yl/p/.B/oc/zem.,28，125-131)。以上述方式所獲得的轉化體可依一般方法加以培養，以于細胞內或細胞外制造本發明的磷脂酶C。在所用的培養基方面，可依照所采用的宿主細胞種類而適當選擇慣用的各種培養基。例如，若使用上述COS細胞，則可使用RPMI1640培養基或Dulbeco改造的Eagle培養基(以下稱為"DMEM")等培養基，并依需要添加胎牛血清等血清成分。在培養條件方面，只要(302濃度在0~50%的范圍內即可，較佳是110%，更佳是5%。培養溫度為099。C即可，較佳是2050。C，更好的是35~40°C。通過上述培養在轉化體細胞內或細胞外，以重組蛋白質的型態而產生的本發明的磷脂酶C，其自培養產物中的分離純化可藉助于利用蛋白質的物理化學性質、化學性質、生物化學性質(酶活性等)等性質的各種分離操作(參照"生化學數據書II"，1175-1259項，第1版第1次印刷，1980年6月23日東京化學同人股份有限公司發行；腸c/z師勿，Vol.25,No.25,8274-8277(1986);腸.>/.腸c/z復，163,313-321(1987)等等)。具體而言，該方法例如是一般的重結晶處理、使用蛋白質沉淀劑的處理(鹽析法)、離心分離、滲透壓沖擊法、冷凍溶解法、超聲波破碎、超濾、凝膠過濾、吸附層析法、離子交換層析法、親和層析法、高效液相色譜(HPLC)等各種液體層析法、透析法，以及這些方法的組合等。通過上述方法即可以高產率在工業規模下制造所要的重組蛋白質。另外，通過將包括6個殘基的組氨酸分子連結于所要表達的重組蛋白質上，可使用鎳親和層析管柱時進行有效的純化。上述方法也可組合使用，以更容易地以高收率及高純度大量制造本發明的磷脂酶c。另外，以上述方法制造的磷脂酶c也可作為本發明的較佳示例。所謂磷脂酶C制造菌是指實質上能夠制造磷脂酶C的微生物，其中包含在菌體內蓄積磷脂酶C的微生物及將磷脂酶C分泌至菌體外的微生物等。如欲使用磷脂酶C制造菌的培養上清液或自培養上清液中所純化的磷脂酶C時，可使用于分泌磷脂酶C至菌體外的微生物。本發明所使用的磷脂酶C可為源自米曲霉(Aspergillusoryzae)或溜曲霉(Aspergillustamarii)的磷脂酶C，較佳是源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株。磷脂酶C可為上述多種磷脂酶C制造菌本身所制造的，也可為其變異體或修飾體所制造的，且也可為將上述多種磷脂酶C制造菌的磷脂酶C基因導入宿主而得的轉化體所制造的重組蛋白質。磷脂酶C制造菌的得到米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株可自獨立行政法人制品評價技術基礎機構的生物技術本部的生物遺傳資源部門(NBRC:NITEBiologicalResourceCenter;〒292-0818日本國千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8，主頁網址〈http:〃www.nite.go.jp/>)購得。溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907(二IAM13907)株可自東京大學分子細胞生物學研究所(IAM:InstituteofMolecularandCellularBiosciences,TheUniversityofTokyo;亍113-0032東京都文京區彌生1-1-1，主頁網址〈http:〃www.iam.u-tokyo.ac.jp/indexe.html〉)購得。米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的菌學特征如下所示。首先根據Klich的文獻(Klich，M.A.(2002)"/<^""http://ca"o"o/TheNetherlands)，于四種培養基(CYA培養基、CY20S培養基、CZ培養基、MEA培養基)中接種米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株，觀察其菌學特征。色調顯示方面，是依據"Methuenhandbookofcolour"—書(Kornerup，A.andWanscher,J.H.(1978)Methuenhandbookofcolour(3rd.edition).EryeMethuen,London)。四種培養基(CYA培養基、CY20S培養基、CZ培養基、MEA培養基)的組成如下CYA培養基[Czapek酵母瓊脂(CzapekYeastExtractAgar)培養基](1.0gK2HPO4、10mlfCzapek濃縮液、5g酵母提取物、30g蔗糖、15g瓊脂、1000ml蒸餾水)承Czapek濃縮液(30gNaNO3、5gKCl、5gMgS04'7H20、O.lgFeS04'7H20、0.1gZnSO4'7H20、0.05gCuSO4'5H20、100ml蒸餾水)CY20S培養基[20%蔗糖Czapek酵母瓊脂(CzapekYeastExtractAgarwith20%Sucrose)土咅養基](1.0gK2HPO4、10ml承Czapek濃縮液、5g酵母提取物、200g蔗糖、15g瓊脂、1000ml蒸餾水)CZ培養基[Czapek氏瓊脂(CzapekDoxAgar)培養基](1.0gK2HPO4、10mlWzapek濃縮液、30g蔗糖、17.5g瓊脂、1000ml蒸餾水)MEA培養基[麥芽提取物瓊脂(MaltExtractAgar)培養基](20g麥芽提取物、lg蛋白胨、20g葡萄糖、20g瓊脂、1000ml蒸餾水)1)菌學特征米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的菌學特征CYA培養基中的菌落，于25i:下培養一周后其直徑為36-40mm。菌落稍厚，呈羊毛狀，中心部分成為棉毛狀，且自中心部分形成放射狀的溝紋。菌絲為白色，且分生孢子松散地形成于中心部分，而呈灰黃色(4B4)至黃白色(4A2)。未觀察到浸出液、菌核。背面為淡黃色(2A4)至白色(2A1)，且自中心部分形成放射狀的溝紋。未觀察到可溶性色素。CYA培養基中的菌落，于37"下培養一周后直徑為54-58mm。菌落較厚，呈羊毛狀。菌絲為白色，且分生孢子形成于中心部分，而呈灰黃色(4B4)至黃白色(4A2)。未觀察到浸出液、菌核。背面為淡橙色(4A4)至白色(4A2)，且自中心部分形成放射狀的溝紋。未觀察到可溶性色素。CY20S培養基中的菌落于25r下培養一周后直徑為35-41mm。其菌落特征與CYA培養基相同，但中心部分的棉毛狀菌絲略多。CZ培養基中的菌落于25'C下培養一周后直徑為17-21mm。其菌落特征與CYA培養基相同，但菌落較小，且分生孢子的形成松散。MEA培養基中的菌落于25"C下培養一周后直徑為37-41mm。菌落較薄，且呈棉毛狀。菌絲為白色，且分生子松散地形成于中心部分，而呈暗綠色(26D4)至灰綠色(26D6)。未觀察到浸出液、菌核。背面呈灰黃色(4B3)至黃白色(4A2)，但未觀察到可溶性色素。此菌類于14X:至42。C下繁殖，于18。C至38'C下可觀察到分生孢子形成。分生孢子頭部為放射狀至平緩的圓柱狀。分生孢子柄寬度為6.7~13.6〃m，長度為302.2~1398.0^m，且無色、粗面。頂囊呈偏球形至燒瓶形，寬度為14.6-29.3〃m。曲霉("^erg〃/a)主要呈單列狀(uniseriate)，很少呈兩列狀(biseriate)，且自頂囊的上半部形成分生孢子的梗基(metulae)或瓶梗(phialide)。梗基尺寸為11.328.3x5.29.9^m。瓶梗為燒瓶形，尺寸為8.421.3x3.87.7〃m。分生孢子具光滑面，呈偏球形至蛋形，且直徑為4.2~6.3/mi。根據以上菌學特征檢索符合本菌的菌種時，發現其與Klich文中所記載的米曲霉(Aspergillusoryzae)^/z/^rg)特征基本上一致。因此，將FERMABP-10200株鑒定為米曲霉(Aspergillusoryzae)f^/2/Zn^g;C^M，且寄存于日本獨立行政法人產業技術綜合研究所的專利生物寄存中心。自磷脂酶C制造菌所得的磷脂酶C的具體性質如下所示，但本發明的磷脂酶C所具有的性質非僅限于此。由米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株所制造并經純化的磷脂酶C具有以下性質1)以SDS-PAGE法測得其分子量約87000。2)于pH3至pH9的范圍內可水解源自蛋黃的卵磷脂(NACALAITESQUE股份有限公司生產)。3)于08(TC范圍內具有4)所述的水解活性。4)當pH4.5時，于小于等于45。C的溫度下是穩定的。5)于pH3至pH10的范圍內是穩定的。6)如2)所述的水解活性最佳時的pH值為4.5。7)于pH4.5時，如3)所述的水解活性最佳時的溫度為65°C。8)會水解磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酰甘油，但實質上不會水解甘油磷酰膽堿及對硝基苯基磷酸。例如，酶對各種基質的相對活性示于表1中，其中對源自蛋黃的磷脂酰膽堿的活性設為100%。表1中主要記載源自蛋黃的基質及源自大豆的基質，其中源自蛋黃的卵磷脂是自NACALAITESQUE股份有限公司購得，源自大豆的卵磷脂則是自辻制油股份有限公司購得，除此以外的基質是自SIGMA-ALDRICHJapan股份有限公司購得。表1_相<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>9)具有如下所示的部分氨基酸序列(自N末端開始)Thr畫Ala隱Asp隱Ser畫Ala畫Thr-Ala-IIe畫Gly-Tyr-Val-Thr-Pro-Ser-Met(序列號1)。Glu畫Ala匿Tyr醫Gly-Ser-Leu-Leu-Thr-Pro漏Pro(序列號2)。Val-Pro-Pro-Ser-His-Asn-Pro-Gln-Trp-Ala(序列號3)。10)蛋白質杯被糖鏈修飾。根據以上內容，即可列舉出本發明的磷脂酶C所具有的性質如下，但并非僅限于此。1)以SDS-PAGE法測得的分子量約87000。2)于pH3至pH9的范圍內可水解源自蛋黃的卵磷脂(NACALAITESQUE股份有限公司制造)。3)于08(TC范圍內具有如4)所述的水解活性。4)當pH4.5時，于小于等于45。C的溫度下是穩定的。5)于pH3至pH10范圍內為穩定的。另外，制造本發明的磷脂酶C的方法也包含于本發明的范圍中。于培養基的中培養以米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC41卯株或溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株為代表的磷脂酶C制造微生物，即可制造磷脂酶C。例如，可使用在0.1~5.0%多蛋白胨(和光純藥工業股份有限公司制)及0.1~1.0°/。酵母提取物(日本BectonDickinson股份有限公司制)中添力口0.051.0%脫氧膽酸鈉而得的培養基，或是于0.1~4.0%PharmaMedia(TRANDERSPROTEIN股份公司制)中添加0.051.0%的TritonX-100(SIGMA-ALDRICHJapan股份有限公司制)或0.05~0.3%的蛋黃卵磷脂所得的培養基，或者是含1~10%魚粉(池口喜一郎商店)的培養基，于16。C至45'C下以100~250rpm的轉速振蕩培養1至15天。實施例以下舉出一些實施例以及試驗例，但本發明的范圍并非僅限于此。實施例1:自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株中純化出磷脂酶C1)調制粗酶液于加入100ml的經滅菌且具有表2所示組成的培養基的500ml三角燒瓶(種燒瓶)中，接種lml經過濾滅菌的5%脫氧膽酸鈉溶液，以及米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株的菌體，并于26'C下以170rpm轉速振蕩培養7天。表2培養基_聚蛋白胨40g酵母提取物5g磷酸氫二鉀0.2g硫酸鎂0.5g加入純水后成為1000ml培養結束后，于4'C下以10000G進行十分鐘離心分離，并將所得的上清液作為粗酶液。2)酶活性測定方法磷脂酶C的水解活性是以下述方式進行測定。<1>卵磷脂的水解反應將1.5g蛋黃卵磷脂(NACALAITESQUE股份有限公司制)溶于50ml的4%(wt/v)TritonX-100中得到的基質溶液，再向該基質溶液中添加60/4的200mM醋酸緩沖液(pH5.5)，并保持于37°C下。接著于該混合液中添加酶液后攪拌均勻，并保持于37'C下而進行3小時的酶反應。<2〉游離磷酰堿的水解反應此步驟是以堿性磷酸酶水解于酶反應中所產生的磷酰堿。首先于的<1〉中所調制的酶反應液中加入的200mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH8.0)及1/a堿性磷酸酶(SIGMA-ALDRICHJapan股份有限公司制)，再于37"C下反應40分鐘。再者，此時也同時制做未添加堿性磷酸酶的樣品作為空白對照組。<3>無機磷酸的定量此步驟是以PhosphaCTestWako(和光純藥工業股份有限公司制)對<2>所得的無機磷酸進行定量。首先于100//1的于<2>所得的反應液中添加PhosphaCTestWako的A液及B液各lml，再于37"C下反應20分鐘。接著測定該混合液于750nm波長的吸光度，其與空白對照組的差即為磷脂酶C的活性。以下將每1分鐘酶反應生成l^mol磷酰堿的酶活性設為1單位。3)調制純化酶液首先使用8000ml的10mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)，對1200ml的于1)所得的粗酶液每12小時透析8次。接著將其加入預先以lOmM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡化的DEAEToyo-Pead管柱(直徑2.2cmx長度20cm，Tosoh股份有限公司制)，使之吸附。以10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分清洗該管柱后，于600ml的lOmM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)中產生0至0.2M的氯化鈉線性濃度梯度，以使吸附于該管柱的成分溶出。對來自蛋黃的卵磷脂具分解活性的溶出部分為氯化鈉濃度0.050.08M時的溶出部分(90ml)，故將其作為粗純化酶溶出部分。接著使用4000ml的20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)對90ml所獲得的活性溶出部份每12小時透析3次后，添加至預先以20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡化的MonoQ管柱(直徑10mmx長度10cm，Amersham生物科技股份有限公司制)，使之吸附于管柱中。接著以2.0mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分清洗該管柱后，于250ml的20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)中產生00.2M的氯化鈉線性濃度梯度，以溶出吸附于該管柱中的成分。具有對來自蛋黃的卵磷脂的分解活性的溶出部分為氯化鈉濃度0.10.12M時的溶出部分(25ml)。接著將25ml所得活性溶出部分加以濃縮，再加至預先以含0.15M氯化鈉的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡化的HiLoadSephadex200pg管柱(直徑16mmx60cm，Amersham生物科技股份有限公司制)中，然后以含0.15M氯化鈉的lOmM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)將其溶出。具有對來自蛋黃的卵磷脂的分解活性的溶出部分為溶出量介于60ml至70ml之間者。因此，該溶出部分即作為純化酶溶液。4)純化酶的分子量測定純化酶的分子量是以使用12.5%聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE法(請見Laemmli,U.K.，A^/wre，227，680(1970))求得，并使用下述的標準蛋白質a.分子量94000的磷酸化酶(phosphorylase)、b.分子量67000的白蛋白(albumin)、c.分子量43000的卵白蛋白(ovalbumin)、d.分子量30000的碳酸酐酶(carbonicanhydrase)、e.分子量20100的胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor)、f.分子量14400的a-乳白蛋白(a-lactalbumin)。該純化酶顯示出分子量約87000的單一帶(band)。實施例2:自溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株中純化出磷脂酶C1)調制粗酶液于加入有100ml的表2所示組成的培養基的500ml容量三角燒瓶(種燒瓶)中，接種lml經過濾器滅菌的5%脫氧膽酸鈉溶液及溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的菌體，并于26°C下以170rpm轉速振蕩培養5天。培養結束后，于4"C下以10000G進行IO分鐘離心分離，并將所得的上清液作為粗酶液。2)調制純化酶液此例是以實施例1中3)所述的相同方式進行純化，而得純化酶溶液。3)純化酶的分子量測定此例是以實施例1中4)所述的相同方法進行測定。此純化酶顯示出分子量約87000的單一帶。實施例3:自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株中純化出磷脂酶C1)調制粗酶液于加入100ml經滅菌的具有表3所示組成的培養基的500ml三角燒瓶(種燒瓶)中，接種米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株的菌體，并于26。C下以170rpm轉速振蕩培養7天。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>待培養結束后，于fC下以IOOOOG進行IO分鐘離心分離，并將所得的上清液作為粗酶液。2)調制純化酶液首先使用8000ml的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)，對600ml的l)中所得的粗酶液每12小時透析5次。接著將其添加至預先以lOmM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡化的DEAEToyo-Pearl管柱(直徑2.2cmx長度20cm，Tosoh股份有限公司制)，使的吸附于管柱中。接著以lOmM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分清洗該管柱后，于600ml的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)中產生00.6M的氯化鈉線性濃度梯度，以溶出該管柱吸附的成分。具有分解來自蛋黃的卵磷脂的活性的溶出部分為氯化鈉濃度0.300.35M時的溶出部分(50ml)，故以其為粗純化酶液。接著使用4000ml的20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)，對50ml所得的活性溶出部分每12小時透析3次后，再加入預先以20mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡化的MonoQ管柱(直徑10mmx長度10cm，Amersham生物科技股份有限公司制)，使之吸附于管柱中。接著以20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.5)充分清洗該管柱，再于250ml的20mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)中產生00.6M的氯化鈉線性濃度梯度，以溶出該管柱所吸附成分。具有對來自蛋黃的卵磷脂的分解活性的溶出部分是氯化鈉濃度為0.12-0.20M時的溶出部分(35ml)。接著將35ml所得的活性溶出部分濃縮，再添加至預先以含有0.15M氯化鈉的lOmM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡化的HiLoadSephadex200pg管柱(直徑16mmx60cm，Amersham生物科技股份有限公司制)，再以含有0.15M氯化鈉的lOmM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液(pH7.5)將其溶出。具有對來自蛋黃的卵磷脂的分解活性的溶出部分是溶出量為60~70ml間的溶出部分。因此，該溶出部分是為純化酶溶液。3)純化酶的分子量測定此測定是以實施例1的4)所述的相同方法來進行，結果發現純化酶顯示出分子量約87000的單一帶。實施例4:源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株的磷脂酶C的部分氨基酸序列的決定首先使用超濾膜(Sartorius股份有限公司制的VIVASPIN2，其截斷分子量為1萬)將純化的酶溶液濃縮至1mg/ml左右，再于150閃的濃縮酶液中添加改性緩沖液(Denaturebuffer,含6M的鹽酸胍(guanidine)、10mMEDTA及0.1M碳酸氫銨，pH7.8)以及6,1的50mM二硫代蘇糖醇溶液，再于95"C下反應IO分鐘。待冷卻至室溫后，于反應液中添加30^1溶有50mM碘乙酰胺的改性緩沖液，再于暗室中于室溫下反應1小時。接著將該溶液添加于預先以20mM碳酸氫銨(pH8.0)平衡化的HitrapDesalting管柱(安瑪西亞Amersham生物科技(股份)公司)中，再以20mM碳酸氫銨溶液(pH8.0)溶出的。接著對溶出量L52.5ml間的溶出部分進行冷凍干燥，再溶于的20mM碳酸氫銨(pH8.0)中。接著于所得的溶液中添加60單位胰蛋白酶(經修飾的，Promega股份有限公司制)，再于37匸下進行18小時的酶反應。接著將反應液注入高效液相色譜儀(日立制作所股份有限公司制)中，而將分解出的氨基酸的峰加以分離，其條件如下.-管柱Tosoh股份有限公司制的TSKgelODS-120T管柱(4.6mmx150mm)A緩沖液0.1%三氟乙酸(TFA)/水B緩沖液:0.1。/。TFA/乙腈梯度10—70%B2%/ml流速lml/分鐘接著挑出經分離的分解氨基酸的3個峰(B緩沖液濃度為30%至38%左右)，再以氨基酸序列解析裝置(ProcisecLC，AppliedBiosystemsJAPAN股份有限公司制)進行解析。所得的部分氨基酸序列自氨基端開始表記。Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-Thr-Ala-Ile-Gly-Tyr-Val-Thr-Pro-Ser-Met(序列號1)。Glu-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu-Leu-Thr-Pro-Pro(序列號2)。Val-Pro-Pro-Ser-His-Asn-Pro-Gln-Trp-Ala(序歹[J號3)。實施例5:鑒定源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株的編碼磷脂酶C的DNA1)全RNA的純化首先于20ml的液體培養基(2%聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.02°/。磷酸氫二鉀、0.05%硫酸鎂)中，于26。C下對米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株進行1天的前培養。其后，對另一液體培養基(5%魚粉)進行1%植菌，并于26。C下培養4天。接著將經過培養的菌體吸引進行集菌，再轉移至-8(TC下的經高壓蒸氣滅菌后再冷凍的研缽中。接著一面添加液體氮，一面使用研棒將菌體磨碎成粉末狀。接著使用植物全RNA提取套件(RNeasyPlantMiniKit，Qiagen股份有限公司審U)對完全成為粉末狀的菌體進行全RNA的純化，而得的905ngl濃度的溶液。2)磷脂酶C基因的解讀此處是以5，RACE法及3，RACE法解讀基因序列。具體而言，是使用5'RACE系統及3'RACE系統(均由Invitrogen股份有限公司制造)及聚合酶ExTaq(TAKARABIO股份有限公司制)進行聚合酶鎖反應(PCR)。此時PCR引子在擴增5'側的基因序列用時為5，-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'及5，-GACAGTGTAGTCGAGCACAGCGAA-3，，在擴增3'側的基因序列用時為5'畫GACTCTGCCACCGCAATCGGCTA-3'及5，-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3，。PCR循環放大的設定依序是94。C/5分鐘、(94。C/30秒、55。C/30秒、72。C/2分30秒)x30次、72t710分鐘、4'C，從而擴增5'側的基因序列約1200個堿基對(b.p.)及3'側的約800個b.p.。對各PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳處理后，以QIAquickGelExtractionKit(Qiagen股份有限公司制)進行純化，再使用TOPOTMTA篩選套件(Invitrogen(股份)公司)連結純化物與載體以進行轉化。接著于37。C下于瓊脂培養基(LB/Agar，和光純藥工業股份有限公司制)上，將經轉化的大腸菌培養一晚后，于37。C下于液體培養基(LB肉湯，和光純藥工業股份有限公司制)中，將已繁殖的菌落培養一晚。接著使用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen股份有限公司制)自已增殖的大腸菌中純化出質體，并進行DNA序列的解析。DNA序列解析的結果示于序列號4中，而依據DNA序列所推測的氨基酸序列示于序列號5中。實施例6:對源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC41卯株的磷脂酶C進行糖肽酶處理1)酶反應首先使用超濾膜(Sartorius股份有限公司制造的VIVASPIN2，其截斷分子量為1萬)濃縮經純化的酶溶液，再于的濃縮酶液中添加蒸餾水、的0.25mM磷酸緩沖液(pH7.5)及的1M2-巰基乙醇/2。/。十二垸基硫酸鈉溶液，并于95。C下反應5分鐘。在快速冷卻后，添加2.5一的15%TritonX-100(SIGMA-ALDRICHJapan股份有限公司制)，并添加10單位的糖肽酶F(SIGMA-ALDRICHJapan股份有限公司制)，再于37。C下反應20小時。2)反應后的分子量測定此測定所用方法與實施例1的4)相同。酶反應后顯示出分子量約63000的單一帶。試驗例1:源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP匿10200株的磷脂酶C的純化酶液的各項性質接著對實施例1的3)所得的純化酶液進行活性測定。1)pH活性此測定是依照實施例1的2)所示的方法，其中酶反應條件設為37。C下10分鐘。另外，緩沖液使用情形如下于pH2.3至pH3.7時使用甘氨酸-鹽酸緩沖液，于pH3.3至pH6.2時使用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，于pH6.1至pH8.0時使用MOPS緩沖液，而于pH8.2至pH9.2時使用Atkins-Pantin緩沖液。接著將活性最高的pH條件下的水解活性作為100%,而將各pH值下酶的相對水解活性繪于圖1中。在使用檸檬酸緩沖液的情形下活性最高的pH值4.5左右。2)溫度活性接著測定于pH4.5的檸檬酸緩沖液中的溫度活性，是依照實施例1的2)所示的方法來進行，其中酶反應條件設為37"C下20分鐘。接著將活性最高的溫度下的水解活性設為100%，而將各溫度下的相對酶水解活性繪于圖2中。由圖2可知，活性最高的溫度為65'C附近。3)熱穩定性首先將純化酶溶液分別于各種溫度下處理30分鐘，再測定其殘存水解活性。詳細過程是先向預先保持于處理溫度下的9(^1的25mM檸檬酸緩沖液(pH4，5)中溫30分鐘。接著于60/d實施例l所制備的蛋黃卵磷脂溶液中添加的200mM檸檬酸緩沖液(pH4.5)，并保持于37'C而添加60,1經加溫處理的酶液，然后于37"C下進行30分鐘酶反應。接著依據實施例1的2)的方法定量游離的磷酰堿分子。接著將最高殘存水解活性當作100%，而將各溫度的相對水解活性繪于圖3中。由圖3可知，當pH4.5時，酶至少在小于等于6(TC的溫度時是穩定的。4)pH穩定性首先于多個純化酶液樣品中分別添加的下述各pH值的200mM緩沖液，再于37'C下保溫30分鐘。緩沖液使用情形如下于pH2.7至pH3.2時使用甘氨酸-鹽酸緩沖液，于pH3.5至pH6.1時使用醋酸-醋酸鈉緩沖液，于pH6.3至pH7.9時使用MOPS緩沖液，而于pH8.3至pH10.8時使用Atkins-Pantin緩沖液。接著于60/4的200mM檸檬酸緩沖液(pH4.5)與60/a實施例1的2)所述的卵黃卵磷脂溶液的混合液中，加入6(^1的下述溶液后攪拌均勻，再于37°C下進行IO分鐘酶反應，所述溶液為于60^1經加溫的酶混合液中添加60W水而得的溶液。游離的磷酰堿分子的定量是依照實施例1的2)所述者進行。接著以最高殘存水解活性為100%，而將各pH值下的相對水解活性繪于圖4中。由圖4可知，該酶于pH3至pH10的范圍內是穩定的。5)純化酶的基質選擇性接著測定基質選擇性，其是使用實施例1的3)所制備的純化酶液，而測定方法如實施例1的2)所述。其中，基質溶于pH4.5的200mM檸檬酸緩沖液中且保溫在37。C下，進行10分鐘的酶反應。以對源自蛋黃的磷脂酰膽堿水解活性為100%時，對其他基質的相對活性示于表4中。表4_<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>試驗例2:源自溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13907株的磷脂酶C的純化酶液的各項性質接著對實施例2的2)所得純化酶液進行活性測定。1)pH活性此測試是依試驗例l所示方法。在此也將活性最高的pH條件下的活性當作100%，而將各pH值下的相對酶活性繪于圖5中，由其可知活性最高的pH值在4.5附近。2)溫度活性此測試同樣依試驗例1所示方法。在此也將活性最高的溫度下的活性當作100%，而將各溫度下的相對酶活性繪于圖6中，由其可知活性最高的溫度在65'C附近。3)熱穩定性此測試同樣依試驗例1所示方法。在此也將最高殘存水解活性當作100%，而將各溫度下的相對水解活性繪于圖7中。由圖7可知，當pH4.5時，該酶于小于等于45'C的溫度下是穩定的。4)pH穩定性此測試同樣依試驗例1所示方法。在此也將最高殘存活性設為100%，而將各pH值下的相對水解活性繪于圖8中。由圖8可知，該酶于pH3至pH10的范圍內是穩定的。2)純化酶的基質選擇性此測試同樣依試驗例1所示方法。在此也以對源自蛋黃的磷脂酰膽堿的水解活性為100%，而將該酶對各基質的相對活性示于表5中。表^_<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>試驗例3:源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC4190株的磷脂酶C的純化酶液的各項性質此例是對實施例3的2)所得純化酶液進行活性測定。OpH活性此測試同樣依試驗例1的方法。在此也將活性最高的pH條件下的活性當作100%，而將各pH值下的相對水解活性繪于圖9中，由其可知活性最大的pH值為4.5左右。2)純化酶的基質選擇性此測試同樣依試驗例1所示方法。在此也將對源自蛋黃的磷脂酰膽堿的水解活性當作100%，而將該酶對各基質的相對活性示于表6表_^_<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>發明的效果如上述，本發明的磷脂酶C是源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERMABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM13卯7株的酶，其安全性佳，具有于酸性pH區域或中性pH區域附近有效水解各種甘油磷脂的能力，于檸檬酸緩沖液中也具有活性，且具有一定程度的熱穩定性，又不會水解除磷脂以外的磷酸酯。因此，于食品工業以及制油工業領域也可發揮優良的效果。權利要求1.一種磷脂酶C，其于酸性至中性pH下顯示活性，且實質上不水解除磷脂以外的磷酸酯。2.根據權利要求1所述的磷脂酶C，其不具有對磷脂酰肌醇的特異性。3.根據權利要求1或2所述的磷脂酶C，其最適pH值在pH3至pH6的范圍內。4.根據權利要求13中任一項所述的磷脂酶C，其于pH7時的相對活性為20%以上。5.根據權利要求14中任一項所述的磷脂酶C，其由絲狀菌產生。6.根據權利要求5所述的磷脂酶C，所述絲狀菌為曲霉屬。7.根據權利要求6所述的磷脂酶C，其由米曲霉(Aspergillusoryzae)或溜曲霉(Aspergillustamarii)產生。8.根據權利要求7所述的磷脂酶C，其由米曲霉的FERMABP-10200株或NBRC4190株，或者溜曲霉的IAM13907株產生。9.根據權利要求18中任一項所述的磷脂酶C，其具有以下性質1)以SDS-PAGE電泳法測得的分子量約為87000;2)水解磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酰甘油；3)實質上不水解甘油磷酰膽堿及對硝基苯基磷酸；4)于pH3至pH9范圍內，水解源自蛋黃的卵磷脂；5)于0。C至8(TC的范圍內，具有4)所述的水解活性；6)在溫度穩定性方面，當pH4.5時，在45'C以下的溫度下是穩定的；以及7)在pH穩定性方面，于pH3至pH10范圍內是穩定的。10.—種磷脂酶C，其是以下a)d)中任一項所述的蛋白質a)包含序列號5所記載的氨基酸序列的蛋白質；b)包含由序列號4的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的蛋白質；c)包含a)或b)所述的氨基酸序列中減少、取代或附加一或多個氨基酸后的氨基酸序列，且具有磷脂酶C活性的蛋白質；以及d)包含a)或b)所述的氨基酸序列而得的蛋白質。11.一種被分離的絲狀菌，其具有制造權利要求14、9和10中任一項所述的磷脂酶C的能力，且屬于米曲霉或溜曲霉，但溜曲霉的IAM13907株除外。12.根據權利要求11所述的絲狀菌，其為米曲霉的FERMABP-10200株或NBRC4190株。13.—種DNA，其是以下a)d)中任一項所述的DNA:a)包含序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列的DNA;b)包含與a)所述DNA具有70。/。以上的核苷酸序列相同性的核苷酸序列，且編碼具有磷脂酶C活性的蛋白質的DNA;c)編碼包含序列號5所記載的氨基酸序列的蛋白質的DNA;以及d)包含序列號4的編碼區域(CDS)的核苷酸序列的DNA。14.一種磷脂酶C，其是由權利要求13所述的DNA所編碼的蛋白質。15.—種磷脂酶C的制造方法，包括1)培養權利要求9所述的米曲霉或溜曲霉的工序；以及2)從l)的培養產物中將磷脂酶C分離/純化的工序。16.根據權利要求15所述的磷脂酶C的制造方法，其中米曲霉為FERMABP-10200株或NBRC4190株的米曲霉，溜曲霉為IAM13907株的溜曲霉。全文摘要本發明提供一種磷脂酶C，該磷脂酶C具有于酸性pH區域或中性pH區域附近有效水解各種磷脂的能力，在檸檬酸緩沖液中也具有活性，并且具有一定程度的熱穩定性，還具有不會水解不含脂質部分的磷酸酯的性質。此磷脂酶C于酸性至中性的pH區域中表現出活性，且實質上不水解除磷脂以外的磷酸酯。文檔編號C07K1/00GK101410513SQ20068005378公開日2009年4月15日申請日期2006年3月10日優先權日2006年3月10日發明者小野泰典,深澤徹也,長崎詠子申請人:三菱化學食品株式會社