專利名稱：用離子液體結晶蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種蛋白質結晶的新方法，特別是涉及一種將離子液體用于蛋白質結晶的新方法。
背景技術：
近年來，由于生物活性物質在醫學、藥學、化學、農業和工業方面的廣泛應用，因此通過X射線晶體學揭示生物大分子結構與功能之間關系而顯得尤為重要。以晶體形式存在的生物大分子是比較穩定的，而X射線衍射是確定晶體分子三維空間結構最可靠的方法。具體了解生物大分子結構對于新藥設計、蛋白質工程以及改變分子結構或構象等方面都具有十分重要的意義。但是從總體方面來說，生物大分子的晶體培養仍然是摸索性和經驗性的，在某種程度上還要靠機遇。晶體培養已成為當前阻礙提高晶體結構分析速度的關鍵性問題。
專利申請號為97192855.X的專利申請文件中公開了一種從蛋白質溶液結晶蛋白質的方法，該方法包括(a)用包含硫原子的鹽處理蛋白質溶液，所說的硫原子具有低于6的氧化態；(b)以結晶形式回收蛋白質。本發明的特點在于將離子液體用于蛋白質的結晶。近年來，離子液體已經被廣泛應用于生物領域。例如由于其電化學穩定性高，具有較高的電導率和較寬的電化學窗口，人們已成功的利用離子液體來分離純化蛋白質。并且有研究表明，某些蛋白質在離子液體中的活性和穩定性大大提高。一些蛋白質在水中的溶解度較小，很難得到符合X射線的晶體，而離子液體對很多無機和有機物質都表現出良好的溶解能力，這就為這類蛋白質的結晶提供了可能。此外，離子液體的結構具有更大的可設計性，即可通過修飾或調變陰陽離子的結構或種類來調控離子液體的物理化學性質，以滿足特定的應用需求。由于離子液體的低揮發性，使蛋白質分子緩慢的從溶液中析出而結晶，避免了多晶的生成。而且所培養的蛋白質晶體與不加離子液體比較衍射強度高，重復性好。
發明內容本發明的目的在于提供一種將離子液體用于蛋白質結晶并使其處于一種可控狀態的用離子液體結晶蛋白質的方法。
本發明的目的是這樣實現的用離子液體-水混合溶液從蛋白質溶液中結晶蛋白質，所述的離子液體-水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。
所述的離子液體為咪唑類離子液體、硝基乙胺類離子液體、胍類離子液體、季銨類離子液體、季鏻類離子液體或吡啶類離子液體中的一種，其重量比含量優選5～50％。
所述的沉淀劑是氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、醋酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸鉀、磷酸鉀、酒石酸鉀、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、碘化鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、氯化鋰或硫酸鋰中的一種，其重量比濃度優選3～6％。
所述緩沖溶液pH值優選4.4～10.5。
采用本發明的蛋白質結晶新方法，將濃度為10～300mg/mL的蛋白質溶液添加至離子液體-水混合溶液中，進行蛋白質結晶。
采用本發明的蛋白質結晶新方法進行蛋白質結晶，可以在0℃～50℃條件下獲得蛋白質晶體。
采用本發明的蛋白質結晶新方法進行蛋白質結晶，可以使工藝條件變得寬泛，而且在不同條件下可獲得不同形貌的蛋白質單晶，所培養的蛋白質晶體衍射強度高，重復性好，提高了結晶過程的可操作性。
采用本發明的蛋白質結晶新方法，可以獲得動物蛋白質晶體，如蛋清溶菌酶；也可以獲得植物蛋白質晶體，如索馬甜蛋白。
采用本發明的蛋白質結晶新方法，既可以從配制的蛋白質溶液中獲得蛋白質單晶，也可以直接從蛋白質粗原料中結晶蛋白質。
圖1為比較例中不加離子液體時，以氯化鈉為沉淀劑，濃度4％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖2為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.4，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為1∶6時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖3為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為1∶6時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖4為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖5為本發明中以硫酸鈉為沉淀劑，濃度4％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖6為本發明中以氯化鎂為沉淀劑，濃度6％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖7、8為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)，采用批量結晶法，氫氧化鈉緩沖體系下，pH值9.0～10.5，加入1～50μl四氟硼酸丁基甲基咪唑時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖9、10為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)，采用批量結晶法，氫氧化鈉緩沖體系下，pH值9.0～10.5，加入5～100mg氯丁基甲基咪唑時所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖11為本發明中以雞蛋清為原料，以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)，采用批量結晶法，氫氧化鈉緩沖體系下，pH值9.0～10.5，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑所得蛋清溶菌酶晶體圖。
圖12為本發明中以酒石酸鉀鈉為沉淀劑，濃度8％(重量)，采用懸滴結晶法，N-(2-乙酰氨基)-亞氨二乙基緩沖體系下，pH值6.5～7.0，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑所得索馬甜蛋白質晶體圖。
具體實施方式
下面舉例對本發明做更詳細地描述比較例1為了更清楚地反映本發明的效果，先進行一個比較例1，在不加離子液體的情況下，酸性體系中，通常得到多晶或孿晶；在堿性條件下，我們很難獲得可以用于X射線衍射的單晶體。按常規方法，在pH值4.5，氯化鈉濃度4％(重量)，室溫的條件下，培養出溶菌酶球晶如圖1所示。
實施例1配制濃度為10～50mg/mL的溶菌酶溶液，調節醋酸-醋酸鈉緩沖體系pH值至4.4。以氯化鈉為沉淀劑，濃度為3％(重量)。采用懸滴結晶法，懸滴中包括5μl溶菌酶溶液，2μl四氟硼酸丁基甲基咪唑和12μl緩沖溶液。池液中四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液比例與懸滴一致，氯化鈉濃度為15％(重量)，于室溫下培育，得塊狀晶體如圖2所示。
實施例2除了將實施例1中醋酸-醋酸鈉緩沖體系pH值變更為4.6外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，所得晶體與圖1相比為長塊狀晶體如圖3所示。
實施例3除了將實施例2中懸滴所包含四氟硼酸丁基甲基咪唑和緩沖溶液體積分別變更為5μl和9μl外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，實驗所得棒狀晶體如圖4所示。
實施例4除了將實施例3中沉淀劑變更為硫酸鈉，濃度變為4％(重量)，pH值調至4.5外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，得塊狀晶體如圖5所示。
實施例5除將了實施例4中沉淀劑變更為氯化鎂，濃度變為6％(重量)外，其它均按相同步驟配制懸滴與池液，在相同條件下培育，得小塊晶體如圖6所示。
實施例6配制濃度為10～50mg/mL的溶菌酶溶液，調節氫氧化鈉緩沖體系pH值至9.0～10.5。以氯化鈉為沉淀劑，濃度為5％(重量)。采用批量結晶法，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑1～50μl，于4℃下培育12h，在溶菌酶溶液中析出溶菌酶結晶。而且3天后結晶生成通過肉眼和實體顯微鏡都可確認并可進行X射線衍射分析。得十二面晶體，晶體尺寸為100～500μm，如圖7、8所示。
實施例7除了將實施例6中加入小瓶中的四氟硼酸丁基甲基咪唑替換為5～100mg氯丁基甲基咪唑以外，其它都按照同樣的步驟制備溶菌酶結晶溶液。將其密封并于4℃下培育24h，在溶菌酶溶液中析出溶菌酶結晶。而且5天后結晶生成通過肉眼和實體顯微鏡都可確認并可進行X射線衍射分析。得雙錐體和塊狀晶體，晶體尺寸為30～200μm其晶體形貌如圖9、10所示。
實施例8取一定量蛋清，用2體積水將其溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液調節體系pH值至9.0～10.5。以氯化鈉為沉淀劑，濃度5％(重量)。采用批量結晶法，加入四氟硼酸丁基甲基咪唑1～30μl，于4℃下溫育24h，在蛋清溶液中析出溶菌酶結晶。得大量微晶，晶體尺寸為5～100μm，如圖11所示。
實施例9配制濃度為20～30mg/mL的索馬甜蛋白溶液，調節N-(2-乙酰氨基)-亞氨二乙基體系下緩沖體系pH值至6.5～7.0。以酒石酸鉀鈉為沉淀劑，濃度為8％(重量)。采用懸滴結晶法，懸滴中包括5μl索馬甜蛋白溶液，1～6μl四氟硼酸丁基甲基咪唑和適量緩沖溶液。池液中四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液比例與懸滴一致，酒石酸鉀鈉濃度為20％(重量)，于室溫下培育，得八面雙錐晶體如圖12所示。
權利要求
1.一種用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是用離子液體一水混合溶液從蛋白質溶液中結晶蛋白質，所述的離子液體一水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。
2.根據權利要求1所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是所述的離子液體為咪唑類離子液體、硝基乙胺類離子液體、胍類離子液體、季銨類離子液體、季鏻類離子液體或吡啶類離子液體中的一種。
3.根據權利要求2用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是所述的離子液體的重量比含量優選5～50％。
4.根據權利要求1所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是所述的沉淀劑是氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、醋酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸鉀、磷酸鉀、酒石酸鉀、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、碘化鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、氯化鋰或硫酸鋰中的一種。
5.根據權利要求4所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是所述的沉淀劑的重量比濃度優選3～6％。
6.根據權利要求1所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是pH值優選4.4～10.5。
7.根據權利要求1所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是所述的蛋白質溶液是配制的蛋白質溶液或者是蛋白質的粗原料。
8.根據權利要求7所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是所用蛋白質是植物蛋白或者是動物蛋白。
9.根據權利要求1-8任何一項所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是將濃度為10～300mg/mL的蛋白質溶液添加至離子液體一水混合溶液中。
10.根據權利要求1-8任何一項所述的用離子液體結晶蛋白質的方法，其特征是結晶溫度為0℃～50℃。
全文摘要
本發明提供的一種用離子液體結晶蛋白質的方法。用離子液體－水混合溶液從蛋白質溶液中結晶蛋白質，所述的離子液體－水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。采用本發明的蛋白質結晶方法進行蛋白質結晶，可以使工藝條件變得寬泛，而且在不同條件下可獲得不同形貌的蛋白質單晶，所培養的蛋白質晶體衍射強度高，重復性好，提高了結晶過程的可操作性。
文檔編號C07K1/14GK101092445SQ20071007235
公開日2007年12月26日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者張密林, 徐曉冬, 李欣欣, 丹媛媛, 景曉燕 申請人:哈爾濱工程大學