專利名稱：：喹羥酮的化學合成工藝的制作方法
技術領域：
：本發明涉及獸藥領域，尤其是獸藥飼料添加劑。
背景技術：
：在藥物改造研制上，自1965年黎巴嫩貝魯特(Beirut)的Haddalin和Issidorides發表Beirut反應第一篇文章以來，已有上百種應用該反應合成的專利問世和合成不下一千種新的N，N-二氮雜奈-1，4二氧化物(喹噁啉)類化合物。事實上，根據Beirut反應合成的多種喹噁啉化合物的取代衍生物如痢立清(Catbadox)、喹乙醇(Quinocetone)、乙酰甲喹等作為抗菌及促生長劑應用于畜牧獸醫及養殖業中，已取得了巨大的經濟與社會效益。但此類化合物存在較大的毒副作用，單純地改變其側鏈已不能滿足需要，因為結果往往是毒性降低，其效果也大大下降。我國對喹噁啉類化合物的研究是一項熱門課題，多年來先后仿制出許多獸藥及飼料添加劑藥物如喹乙醇、乙酰甲喹等，下一步任務是創新。本工作借助HIRFL提供的重離子束對喹噁啉進行結構改造，只要離子注入能量大于其每個化學鍵的最低結合能(約10eV/鍵)，那么結構改造就可能發生。盡管目前尋找新藥有許多途徑，但前期都需用較長時間做大量實驗，一般開發一類新藥至少要10年左右，如能有新的簡單、快捷方法，將會加速開發新藥的步伐，縮短研制周期，大大降低研究費用，重離子在這方面或許會有所作為，雖然剛剛起步，但它對藥物結構改造和拓寬篩選途徑，已顯示出了巨大潛力，對醫藥事業的發展將會起到積極的推動作用。在先導藥物分子接受了離子能量后，便會造成分子鏈的斷裂和鍵的破壞，當它們修復時，就會發生重組，也可能與停留在周圍的離子發生作用，通過置換或加成(例如，加氧、抽氫、環的擴大或縮小等)反應，構成與原來分子結構與組成不相同的新分子或多個單體。這種新分子或單體可能具有更好的藥效(例如，抗菌活性增強，毒性降低等)。這樣，就可以用分離出的藥效明顯的單體作為標樣來進行化學合成，通過藥理學、毒理學和臨床試驗滿意后，再經過中試和一定的審批手續，就能正式生產這種新藥，從而找到一種快捷有效的研制新藥的新途徑。在國內，利用離子束來進行藥物品質改良方面，主要是對微生物的輻照誘變育種，因為國內用來做這方面工作的離子束能量都很低，不可能輻照很厚的樣品。而我們擬釆用的是蘭州重離子研究裝置(HIRFL)提供的中能重離子束，它可以輻照較厚的固體藥物樣品，類似的工作在國內外還未見報道。但在國外已有常規輻射(如x-、Y-射線)對有機化合物進行分子結構改造的研究，然而常規輻射的LET(即單位路程上轉移的能量)要比重離子小得多，而且這種輻射粒子不可能參與置換或加成反應，它使分子結構改變的效率較低。所以利用重離子束進行這項研究具有獨特優勢。本工作應用重離子'2(:6+,'608+對喹烯酮結構進行改造，獲得至少四種輻照產物，并對輻照后的喹烯酮進行紫外、薄層層析(TLC)的分析及抗菌活性的研究，將分離后的單體進行紅夕卜、核磁、質譜并初步確定了結構。結果表明，重離子輻照后的喹烯酮抗菌作用明顯提高，輻照產物單體化學結構將為人工化學合成提供基礎，有可能成為尋找新藥的一種方法，有關此方面的工作未見報道。
發明內容本發明的目的為利用重離子對喹烯酮輻照產生的新物質作為標樣，進行化學合成制備出抗菌活性強、毒性低的喹羥酮，本發明所公開的就是喹羥酮的化學合成工藝。喹烯酮在重離子加速器中經'2(:6+或'6(T的輻照產生了喹羥酮，其抑菌活性比喹烯酮更強，呈黃色粉末狀，無臭，在吡啶，二甲基亞砜中溶解，微溶于二氧六環、丙酮，不溶于水、乙酸乙酯中。化學名為E-2-甲基-3-2，-羥基苯乙烯甲酰基喹喔啉-1，4-二氧化物(喹羥酮)，分子式為C18H14NA，分子量322，溶點為183-185'C。本發明設計了如下3條合成喹羥酮的路線及化學合成工藝。合成路線l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>根據合成路線1制定的喹羥酮的化學合成工藝，步驟如下(1)將18.3g鄰硝基苯胺和0.42g四丁基溴化銨溶于70g甲醇中，加入25.3g的50%氫氧化鈉水溶液，在0-l(TC下繼續攪拌，慢慢滴入127g次氯酸鈉水溶液，然后在0-10'C下繼續攪拌l小時，分去水相，得苯并呋咱一l一氧化物得甲苯溶液，在真空下蒸去甲醇，加水洗滌、過濾，得苯并呋咱一l一氧化物。(2)將16.2g的苯并呋咱一l一氧化物和13.5g的乙酰丙酮溶于30ml的三乙胺中，讓該溶液在室溫下靜置，收集沉淀，干燥后可得2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物，經用甲醇重結晶可得純品。(3)將5g的2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物溶于20ml1，6-二氧六環中溶解，加入3g水楊醛,25-9(TC,緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，倒入水中，終止反應,沉淀析出，抽濾，得到粗產品，丙酮洗滌得到喹羥酮純品。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>合成路線2:根據合成路線2制定的喹羥酮的化學合成工藝，步驟如下將5g水楊醛加入到10ml2，4一戊二酮，反應溫度25-6CTC，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中，終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，乙醇重結晶得到中間體純品。稱取中間體5g加入20ml乙醇溶解，加入3.5克苯并呋咱，反應溫度25-60'C，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中，終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，丙酮重結晶得到喹羥酮純品。合成路線3:O根據合成路線3制定的喹羥酮的化學合成工藝，步驟如下將5g苯并呋咱加入到10ml2,4-戊二酮，反應溫度25-80°C，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中，終止反應,沉淀析出，抽濾，得到粗產品，乙醇重結晶得到乙酰甲喹純品。將5g的乙酰甲喹溶于20ml1,6-二氧六環中溶解，加入3g水楊醛,25-90。C，緩慢倒入4n!l二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中，終止反應,沉淀析出，抽濾，得到粗產品，丙酮重結晶得到喹羥酮純品。經上述三種工藝合成的產品進行紅外光譜、質譜和核磁共振的譜學鑒定，解析分子結構，測試結果如下1、紅外光譜(IR):儀器采用NicoletNEXUS670FT-IR儀器，IR(KBr)cnf1:3500-2850,3084,1661,1566,1447，1329,1260，1091;2、質譜(MS):儀器型號HP-5998,EI-MS顯示有[M]+322;3、核磁共振(NMR):儀器采用IN0VA-400MHz超導核磁共振儀，'HNMR(DMS0_d6)Sppm:10.88(OH),8.5(1H,d,J=8.4Hz,H_5),8.42(1H,d,J=8.4Hz,H-8),7.97(2H,m,H_6,H_7),7.84(1H,d，J=16.4Hz,H-13)'7.56(1H,d,J=7.6Hz,H-19),7.33(1H,d，J=16.4Hz，H-12)，7.28(1H,t,J=7.2Hz,H-17),6.92(1H'd,J=8.0Hz,H_16),6.83(1H,t,J=7.2,Hz,H-18),2.36(3H,s,3-CH3);13CNMR(DMS0-D6)Sppm:187.3,160.0,144.6,139.0,138.9,137.6,136.6,133.1,132.5,131.5，130.9,125.3,120.6,119.7,119.5,116.5,14.0;根據EI-MS數據，結合核磁共振(NMR)譜數據可確定該化合物分子式為C,晶美04分子量為322;IR中1661峰以及13CNMR中S181.3表明分子中存在羰基官能團，5H7.84(1H,d,J=16.4Hz,H-13),SH7.33(1H，d，J=16.4Hz,H-12)的化學位移以及偶合常數表明分子中C-12，13的雙鍵為反式構型；根據HMQC歸屬碳上的質子信號，根據HMBC歸屬碳氫遠程相關，COSY顯示5、8上的質子與6、7位的質子有遠程偶合關系，12位和13位上的質子有遠程偶俁關系，17位和16，18位上的質子有遠程偶合關系；18位和17、19位上的質子有遠程偶合關系；以上數據及分析結果可確定該化合物為喹羥酮。DMSO:化合的'HNMR(400MHz)和"C麵(100MHz)數據及gHMBC相互關系(5，ppm,TMS,DMSO"cU<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由此得出喹羥酮的化學結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>E-2-diethyl-3-2'-Hydro-PhenylethylecetoneQuinoxaline-l,4-dioxdeE-2-甲基-3-2'-羥基苯乙烯甲酰基-喹噁啉-l，4-二氧化物測試結果說明通過上述三種不同的化學合成工藝，都能得到所要求與重離子輻照物標樣相同的喹羥酮。以下對化學合成產物喹羥酮進行肉雞的促生長作用和抑菌作用進行研究。喹羥酮的促生長作用1、材料及方法1.1材料喹烯酮與喹羥酮，由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制，純度99%;喹乙醇，由山西芮城獸藥廠生產，純度大于98%;安卡紅羽肉雞，購于甘肅省種雞場；試劑盒均由南京建成生化公司提供。紫外分光光度儀,HP2040A。1.2添加不同的喹噁啉類添加劑對肉雞生產性能、蛋白代謝的影響。試驗設計采用隨機分組設計，各組基礎日糧相同，選用1日齡健康安卡紅羽肉雞320只，平均體重為40.07土L94g。隨機分為4組，每組4個重復，每重復20只，公母各半，各組初始體重差異不顯著，4組分別為，I:空白對照II:喹乙醇，III:喹羥酮，IV:喹烯酮。1.3試驗飼糧實驗期為42天，分為0-3周齡和4-6周齡2期。試驗飼糧根據《安卡紅羽肉雞飼養管理手冊》推薦配制各階段基礎詞糧配方。除豆粕、玉米，魚干粉、麩皮的粗蛋白、鈣和磷含量為實測值外，其它飼料組分的成分及能量價值均查自中國飼料成分及營養價值表。試驗結果1不同水平的喹羥酮對肉雞生產性能的影響在本試驗中，添加喹羥酮的試雞的平均日增重、采食量和飼料轉化率都高于對照組，且50mg/kg和75mg/kg劑量組與對照組差異顯著(P〈0.05)。由本試驗可以看到，喹羥酮50mg/kg和75mg/kg的可提高日增重、采食量和飼料轉化率，與其他喹噁啉添加劑相比，毒性小，無致畸、致癌、致突變性和光毒性。但隨著添加劑量增大，各項指標有所下降。2不同水平的喹羥酮對氮的影響添加喹羥酮后，50mg/kg和75mg/kg組粗蛋白日食入量和表觀利用率都顯著高于對照組和100mg/kg組(P〈0.05);添加組的日排泄蛋白質顯著低于對照組(P<0.05)。因為喹羥酮可以改變腸道微生物種類，抑制有害菌產生的毒物刺激腸道，減少腸壁細胞更新，使腸壁變薄，有利于對營養物質(特別是蛋白質)吸收利用。3不同濃度梯度喹羥酮對肉雞血漿白蛋白和總蛋白的影響在本試驗中添加不同濃度喹羥酮后，添加組和未添加組差異不顯著(P〉0.05),喹羥酮50mg/kg組血漿總蛋白和白蛋白含量相對最高，為提高機體蛋白合成提供有利的內環境，從而增強蛋白利用率。本試驗也充分說明，喹羥酮毒性小，對肝臟分泌蛋白功能沒有負面影響。4不同濃度梯度喹羥酮對肉雞小腸的影響添加不同水平喹羥酮后，50mg/kg和75mg/kg組的小腸重量和小腸重/體重的值比對照組顯著低(P<0.05)，而小腸的長度各組之間差異不顯著，本試驗添加抗生素喹羥酮后，降低小腸重量，主要是因為喹羥酮抑制腸道有害微生物產生的有毒物質對腸壁的刺激，減少腸壁細胞更新，且腸壁纖毛排列更有規律且更加纖細，腸壁固有層更薄，有助于減少維持需要的營養物質和能量，使更多的營養物質用于試雞的生長發育。5不同濃度梯度喹羥酮對肉雞肌肉中RNA和DNA的影響添加不同濃度喹羥酮后，肉雞肌肉中RNA的濃度都明顯高于對照組(P〈0.05):而DNA濃度各組之間差異不顯著(P〉0.05);添加喹羥酮的試雞肌肉中RNA/DNA的值顯著高于對照組(P>0.05)，而添加喹羥酮的各組之間差異不顯著(P〈0.05)。因此認為，喹羥酮可以影響代謝，增加肌肉中的RNA濃度和RNA/DNA值，從而導致蛋白質、細胞的形成和組成增多，促進肌肉蛋白合成增強，進而達到增加動物體重，促進生產。不同濃度喹羥酮實驗證明，添加50mg/kg和75mg/kg喹輕酮主要有以下幾個作用1、飼養試驗表明，提高曰增重、增加釆食量，提高飼料轉化率2、消化代謝試驗表明，喹羥酮可提高飼料氮的利用率，增加氮沉積；3、通過分析肌肉中RNA和DNA的濃度表明，喹羥酮促進肌細胞的肥大性增生，增強肌肉的生物蛋白合成能力。4、對小腸分析試驗表明，喹羥酮可改善小腸組織結構，使腸壁變薄，增強對營養物質的吸收利用。在試驗過程中，50mg/kg的添加效果最為明顯，而高劑量喹羥酮對試雞的生產性能影響并不顯著，因此在實踐中適宜的添加量可保證畜禽最大限度發揮生產性能，同時也可降低生產成本，得到最高的經濟效益，是理想的促生長飼料添加劑。體外抑菌試驗試驗為對喹羥酮(M)和喹烯酮(0)的抑菌性進行對比。喹稀酮、喹羥酮的抑菌試驗對比試管法(單位u/ml)<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注0為喹烯酮，M為喹羥酮；"一"抑菌，"+"長菌杯碟法(單位mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上體外抑菌試驗結果看出喹羥酮的抑菌性比喹烯酮的抑菌性高。體內抗菌實驗每組用20只肉雞進行試驗，健康對照組不感染，不給藥，與實驗組在同一條件下飼養，觀察結果全部健活。感染組用大腸桿菌進行腹腔感染但不給藥，一般于24h內即明顯發病，腹瀉沉郁，三天內全部死亡。感染給藥組全部存活，精神正常。感染藥物對照組與以上相同劑量喹烯酮，存活15只，精神JE常。體外抑菌與體內抑菌結果一致。本發明的有益效果本發明是以重離子輻照產物作為標物，通過設計出的工藝路線，制定的化學合成工藝進行合成的有效范例，這大大縮短了研制周期，節約了大量的費用，為今后的新藥研制工作開辟了新的道路。喹羥酮是一種新的化合物，與已有的喹烯酮相比具有促生長作用高、抗菌活性強，毒性低等優點，是一種極有生命力的獸藥飼料添加劑。圖1-1為喹噁啉類化合物通過重離子輻照后獲得喹羥酮新化合物的路線框圖1-2為圖1-1的續圖。具體實施例方式現將喹羥酮的三種化學合成工藝的實施過程敘述如下第一種工藝路線的合成工藝(1)將18.3g(0.133mol)鄰硝基苯胺溶于70g甲醇中，加入25.3g(0.266mol)的50%氫氧化鈉水溶液，在O-l(TC下繼續攪拌，慢慢滴入127g(0.185mol)次氯酸鈉水溶液(有效氯含量為5.2%)，約一小時滴加完畢，然后在0-l(TC下繼續攪拌1小時，分去水相。得苯并呋咱一1—氧化物的甲醇溶液，加水洗滌，過濾，镥17.4g的苯并呋咱一1—氧化物。(2)將16.2g的苯并呋咱一1—氧化物和13.5g的乙酰丙酮溶于;30ml的三乙胺中，讓該溶液在室溫下靜置18小時，收集沉淀，干燥后可得16g的2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物，用甲醇重結晶可得純品。(3)將5g的2—乙酰基一2甲基喹噁啉一l，4二氧化物溶于20ml1，6—二氧六環中溶解，加入3g水楊醛，25—9(TC，緩慢倒入4ml二乙胺，例入時呈線狀，顏色逐漸變為褐色，反應20-60min(反應時間視顏色變化情況而定)，倒入水中，終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，用丙酮洗滌得到5.0-6.8g喹羥酮純品。第二種工藝路線的合成工藝(1)將5g水楊醛加入到10ml2，4—戊二酮，反應溫度25-60'C,緩慢倒入4ml二乙胺，倒入時呈線狀，顏色逐漸變為褐色，反應20-60tnin(反應時間視顏色變化而定)，倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，用乙醇重晶得到4-5.5g中間體純品。(2)稱取中間體5g加入20ml乙醇溶解，加入3.5g苯并呋咱，反應溫度25-60。C，緩慢倒入4ml二乙胺，倒入時呈線狀，顏色逐漸變為褐色，反應20-60min(反應時間視顏色變化而定)，倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，用丙酮重結晶得到4.8-5.2g喹羥酮純品。第三種工藝路線的合成工藝(1)將5g苯并呋咱加入到10ml2,4—戊二酮，反應溫度25-80°C,緩慢倒入4ml二乙胺，倒入時呈線狀，顏色逐漸變為褐色，反應20-60min(反應時間視顏色變化而定)，倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，用乙醇重結晶得到4.5g乙酰甲喹純品。(2)將5g的乙酰甲喹溶于20ml1,6—二氧六環中溶解，加入3g水楊酸，25-9CTC，緩慢倒入4ml二乙胺，倒入時呈線狀，顏色逐漸變為褐色，反應20-60min(反應時間視顏色變化而定)，倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，用丙酮重結品得到5.0-6.8g喹羥酮純品。上述各例的反應時間與反應溫度有關，如反應溫度低，反應時間就要長一些，如反應溫度高，反應時間可短一些。權利要求1.喹羥酮的化學合成工藝，其特征為工藝步驟如下(1)將18.3g鄰硝基苯胺溶于70g甲醇中，加入25.3g的50％氫氧化鈉水溶液，在0-10℃下繼續攪拌，慢慢滴入127g次氯酸鈉水溶液，滴加完畢后在0-10℃下繼續攪拌1小時，分去水相。得苯并呋咱-1-氧化物的甲醇溶液，加水洗滌，過濾，得苯并呋咱-1-氧化物。(2)將16.2g的苯并呋咱-1-氧化物和13.5g的乙酰丙酮溶于30ml的三乙胺中，讓該溶液在室溫下靜置，收集沉淀，干燥后可得2-乙酰基-2甲基喹噁啉-1，4二氧化物，用甲醇重結晶可得純品。(3)將5g的2-乙酰基-2甲基喹噁啉-1，4二氧化物溶于20ml1，6-二氧六環中溶解，加入3g水楊醛，25-90℃，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中，終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，丙酮洗滌得到喹羥酮純品。2、喹羥酮的化學合成工藝，其特征為工藝步驟如下(1)將5g水楊醛加入到10ml2，4一戊二酮，反應溫度25-60°C，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，乙醇重晶得到中間體純品。(2)稱取中間體5g加入20ml乙醇溶解，加入3.5g苯并呋咱，反應溫度25-60°C，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，丙酮重結品得到喹羥酮純品。3、喹羥酮的化學合成工藝，其特征為工藝步驟如下(1)將5g苯并呋咱加入到10ml2,4—戊二酮，反應溫度25-8(TC，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，乙醇重結晶得到乙酰甲喹純品。(2)將5g的乙酰甲喹溶于20ml1,6—二氧六環中溶解，加入3g水楊醛，25-90'C，緩慢倒入4ml二乙胺，顏色逐漸變為褐色，再倒入水中終止反應，沉淀析出，抽濾，得到粗產品，丙酮重結晶得到喹輕酮純品。全文摘要本發明為喹羥酮的化學合成工藝，涉及獸藥飼料添加劑領域，現有的合成技術是從多種喹噁啉化合物的取代衍生物中選取，但此類化合物存在較大的毒副作用，單純改變側鏈已不能滿足需要，本發明利用重離子束對喹噁啉進行結構改造，產生出新的化合物分子，通過藥效學研究，分離出標樣進行化學合成，本發明設計了三條合成路線，并對應了三種化學合成工藝，對新的化合物進行了譜學鑒定，確定為都是喹羥酮，經過進一步的促生長和毒性試驗，顯示出比先導化合物喹烯酮有明顯的改進和提高，本發明具有研制周期大大縮短，研制費用大量節約的有益效果，并表明喹羥酮是一種極有生命力的獸藥飼料添加劑。文檔編號C07D241/00GK101182313SQ200710122910公開日2008年5月21日申請日期2007年7月3日優先權日2007年7月3日發明者何榮智,衛增泉,梁劍平,王曙陽申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所