抗igf－i受體抗體的制作方法

專利名稱：抗igf－i受體抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及與人胰島素樣生長因子-I受體(IGF-I受體)結合的抗體。更具體地說，本發明涉及可抑制IGF-I受體的細胞功能的抗IGF-I受體抗體。更具體地，本發明涉及可拮抗IGF-I、IGF-II和血清對腫瘤細胞生長和存活的作用的抗體，它們基本上缺乏激動劑活性。本發明也涉及所述抗體的片段，所述抗體的人源化(humanized)和表面重構(resurfaced)的形式，所述抗體的偶聯物(conjugates)，抗體衍生物(derivatives)，和它們在診斷、研究和治療應用中的用途。本發明進一步涉及改良的抗體或其片段，它們可從上述的抗體及其片段制成。在另一個方面，本發明涉及編碼所述抗體或其片段的多聚核苷酸，以及含有所述多聚核苷酸的載體。
背景技術：
胰島素樣生長因子-I受體(IGF-I受體)是一種跨膜異源四聚體蛋白，其具有兩個細胞外α鏈和兩個跨膜β鏈，通過二硫鍵連接成β-α-α-β構型。胰島素樣生長因子-I(IGF-I)和胰島素樣生長因子-II(IGF-II)作為配體通過IGF-I受體的細胞外結構域結合到其上，從而刺激其細胞內的酪氨酸激酶結構域，引起該受體的自體磷酸化(autophosphorylation)和底物磷酸化。IGF-I受體與胰島素受體同源，在β鏈的酪氨酸激酶結構域中有84％的高度序列相似性，在α鏈的細胞外富含半胱氨酸的結構域中有48％的較低序列相似性(Ulrich，A.等，1986，EMBO，5，2503-2512；Fujita-Yamaguchi，Y.等，1986，J.Biol.Chem.，261，16727-16731；LeRoith，D.等，1995，Endocrine Reviews，16，143-163)。IGF-I受體及其配體(IGF-I和IGF-II)在大量的生理學過程中扮演者重要角色，包括在胚胎發生過程中的生長和發育、代謝、成體的細胞增殖和細胞分化(LeRoith，D.，2000，Endocrinology，141，1287-1288；LeRoith，D.，1997，New England J.Med.，336，633-640)。
IGF-I和IGF-II均可在血液中作為內分泌激素而發揮作用，此時它們主要與IGF結合蛋白以復合物的形式存在，IGF-I和IGF-II還可作為局部產生的旁分泌和自分泌生長因子而發揮作用(Humbel，R.E.，1990，Eur.J.Biochem.，190，445-462；Cohick，W.S.和Clemmons，D.R.，1993，Annu.Rev.Physiol.55，131-153)。IGF-I受體被認為涉及促進腫瘤細胞的生長、轉化和存活(Baserga，R.等，1997，Biochem.Biophys.Acta，1332，F105-F126；Blakesley，V.A.等，1997，Journal of Endocrinology，152，339-344；Kaleko，M.，Rutter，W.J.和Miller，A.D.1990，Mol.Cell.Biol，10，464-473)。因此，已經知道數種類型的腫瘤表達的IGF-I受體水平較正常水平高，包括乳癌、結腸癌、卵巢癌、滑膜肉瘤和胰腺癌(Khandwala，H.M.等，2000，EndocrineReviews，21，215-244；Werner，H.和LeRoith，D.，1996，Adv.Cancer Res.，68，183-223；Happerfield，L.C.等，1997，J.Pathol，183，412-417；Frier，S.等，1999，Gut，44，704-708；van Dam，P.A.等，1994，J.Clin.Pathol.，47，914-919；Xie，Y.等，1999，Cancer Res.，59，3588-3591；Bergmann，U.等，1995，Cancer Res.，55，2007-2011)。在體外，IGF-I和IGF-II顯示可以作為數種人類腫瘤細胞系有效的有絲分裂原，如肺癌、乳癌、結腸癌、骨肉瘤和宮頸癌(Ankrapp，D.P.和Bevan，D.R.，1993，Cancer Res.，53，3399-3404；Cullen，K.J.，1990，Cancer Res.，50，48-53；Hermanto，U.等，2000，Cell Growth & Differentiation，11，655-664；Guo，Y.S.等，1995，J.Am.Coll.Surg.，181，145-154；Kappel，C.C.等，1994，Cancer Res.，54，2803-2807；Steller，M.A.等，1996，Cancer Res.，56，1761-1765)。這些腫瘤和腫瘤細胞系中的數種也可表達高水平的IGF-I或IGF-II，它們可以自分泌或旁分泌的方式刺激其生長(Quinn，K.A.等，1996，J.Biol.Chem.，271，11477-11483)。流行病學研究已經顯示，增高的IGF-I血漿水平(和IGF結合蛋白-3的較低水平)與前列腺癌、結腸癌、肺癌和乳癌的危險性增加有關(Chan，J.M.等，1998，Science，279，563-566；Wolk，A.等，1998，J.Natl.Cancer Inst.，90，911-915；Ma，J.等，1999，J.Natl.Cancer Inst.，91，620-625；Yu，H.等，1999，J.Natl.Cancer Inst.，91，151-156；Hankinson，S.E.等，1998，Lancet，351，1393-1396)。已經有建議，可以采用降低血漿中IGF-I水平或抑制IGF-I受體功能的策略來預防癌癥(Wu，Y.等，2002，Cancer Res.，62，1030-1035；Grimberg，A和Cohen P，2000，J.Cell.Physiol，183，1-9)。IGF-I受體可保護腫瘤細胞免受生長因子缺失(growth factordeprivation)，貼壁非依賴性(anchorage-independence)或細胞毒性藥物處理所引起的凋亡(Navarro，M.和Baserga，R.，2001，Endocrinology，142，1073-1081；Baserga，R.等，1997，Biochem.Biophys.Acta，1332，F105-F126)。對其促有絲分裂，轉化和抗凋亡活性至關重要的IGF-I受體結構域已經通過突變分析被鑒定出來。例如，IGF-I受體的酪氨酸1251殘基被鑒定對于抗凋亡和轉化活性非常重要，但與其促有絲分裂活性無關(O′Connor，R.等，1997，Mol.Cell.Biol，17，427-435；Miura，M.等，1995，J.Biol.Chem.，270，22639-22644)。通過配體活化的IGF-I受體的細胞內信號通路涉及胰島素受體底物(IRS-1和IRS-2)的酪氨酸殘基的磷酸化，它們可將磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3-激酶)招集(recruit)至膜上。PI-3激酶的膜結合磷脂產物可活化絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，其底物包括促凋亡蛋白BAD，它可被磷酸化成為非活化狀態(Datta，S.R.，Brunet，A.和Greenberg，M.E.，1999，Genes & Development，13，2905-2927；Kulik，G，Klippel，A.和Weber，M.J.，1997，Mol.Cell.Biol 17，1595-1606)。在MCF-7人乳癌細胞中IGF-I受體的促有絲分裂信號轉導需要PI-3-激酶，不依賴有絲分裂原活化的蛋白激酶，而在分化的大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞中的存活信號轉導需要PI-3-激酶和有絲分裂原活化的蛋白激酶通路(Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.，212，31163-31171；Parrizas，M.，Saltiel，A.R.和LeRoith，D.，1997，J.Biol.Chem.，272，154-161)。已經顯示，通過反義(anti-sense)策略下調IGF-I受體可降低幾種腫瘤細胞系在體內和體外的致腫瘤性，如黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤(Resnicoff，M.等，1994，Cancer Res.，54，4848-4850；Lee，C.-T.等，1996，Cancer Res.，56，3038-3041；Muller，M.等，1998，Int.J.Cancer，77，567-571；Trojan，J.等，1993，Science，259，94-97；Liu，X.等，1998，Cancer Res.，58，5432-5438；Shapiro，D.N.等，1994，J.Clin.Invest.，94，1235-1242)。而且，據報道，IGF-I受體的顯性負突變體(dominant negative mutant)可降低過度表達IGF-I受體的轉化Rat-1細胞在體內的致腫瘤性和體外的生長(Prager，D.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2181-2185)。表達IGF-I受體mRNA的反義分子的腫瘤細胞當被注射進入動物中時，在生物擴散腔(biodiffusion chambers)中會發生大量的凋亡。這種觀察使得IGF-I受體成為一種有吸引力的治療靶標，這是基于這樣的假設，即通過抑制IGF-I受體可使腫瘤細胞較正常細胞更易凋亡(Resnicoff，M.等，1995，Cancer Res.，55，2463-2469；Baserga，R.，1995，Cancer Res.，55，249-252)。在腫瘤細胞中抑制IGF-I受體的功能的另一個策略是應用抗IGF-I受體的抗體，所述抗體可與IGF-I受體的細胞外結構域結合，并抑制其活化。據報道，已經進行了幾種嘗試來開發抗IGF-I受體的鼠單克隆抗體，其中獲得了兩種抑制性抗體IR3和1H7，它們的應用已經在幾個IGF-I受體研究中被報道。應用部分純化的胎盤胰島素受體制備物來免疫小鼠，開發IR3抗體，這產生選擇性地結合胰島素受體的抗體IR1，以及兩種抗體IR2和IR3，這兩種抗體顯示出對IGF-I受體(生長調節素-C受體)的優先沉淀，但也能微弱地沉淀胰島素受體，由此開發出IR3抗體(Kull，F.C.等，1983，J.Biol.Chem.，258，6561-6566)。通過用純化的胎盤IGF-1受體制備物免疫小鼠開發出1H7抗體，在這個過程中除了產生三種刺激性抗體外，還產生抑制性抗體1H7(Li，S.-L.等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，196，92-98；Xiong，L.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，89，5356-5360)。在另一個報道中，通過用表達高水平的IGF-I受體的轉染3T3細胞免疫小鼠，獲得一系列特異針對人IGF-I受體的鼠單克隆抗體，通過結合競爭研究及其對IGF-I與轉染3T3細胞結合的抑制或刺激可將它們分為7類(Soos，M.A.等，1992，J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。因此，盡管IR3抗體是體外IGF-I受體研究中最常用的抑制性抗體，但它有一些缺點，即它對表達人IGF-I受體的轉染3T3和CHO細胞顯示有激動活性(agonistic activity)(Kato，H.等，1993，J.Biol.Chem.，268，2655-2661；Steele-Perkins，G.和Roth，R.A.，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171，1244-1251)。同樣，在由Soos等人開發的一系列抗體中，最具抑制性的抗體24-57和24-60也在轉染3T3細胞中顯示出激動活性(Soos，M.A.等，1992，J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。盡管，據報道IR3抗體可抑制IGF-I(但不是IGF-II)與完整細胞中和溶解后細胞中表達的受體的結合，它顯示出在體外抑制IGF-I和IGF-II刺激細胞中DNA合成的能力(Steele-Perkins，G.和Roth，R.A.，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171，1244-1251)。IR3抗體的結合表位已經從嵌合的胰島素-IGF-I受體構建物中推導出來，是IGF-I受體的223-274區域(Gustafson，T.A.和Rutter，W. J.，1990，J.Biol.Chem.，265，18663-18667；Soos，M.A.等，1992，J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。MCF-7人乳癌細胞系通常被用作模型細胞系來證明體外IGF-I和IGF-II的生長響應(Dufoumy，B.等，1997，J.Biol.Chem.，272，31163-31171)。在MCF-7細胞中，IR3抗體可不完全地阻斷在無血清的條件下外源性添加的IGF-I和IGF-II的刺激效應的大約80％。而且，IR3抗體在10％的血清中并不很明顯地抑制(小于25％)MCF-7細胞的生長(Cullen，K.J.等，1990，Cancer Res.，50，48-53)。在體外，IR3抗體對血清刺激的MCF-7細胞生長的這種微弱抑制作用與體內研究的結果一致，在體內，IR3抗體的處理并不能明顯抑制裸鼠中MCF-7異種移植物的生長(Arteaga，C.L.等，1989，J.Clin.Invest.，84，1418-1423)。由于IR3和其他已報道的抗體的微弱激動活性，以及它們不能明顯抑制腫瘤細胞如MCF-7細胞在血清刺激這樣更加生理化的條件下生長(這里所述的血清刺激不同于在無血清條件下外源添加的IGF-I或IGF-II的刺激作用)，因此需要能夠明顯抑制腫瘤細胞的血清刺激性生長，但其本身不顯示出明顯的激動劑活性的新的抗IGF-I受體抗體。
發明概述因此，本發明的目的是提供可特異結合胰島素樣生長因子-I受體并通過拮抗該受體而抑制該受體的細胞活性的抗體、抗體片段和抗體衍生物，它們實質上也不具有對該受體的激動劑活性。因此，在第一個實施方案中，提供了鼠抗體EM 164，在此對其進行了完整的表征，即其輕鏈和重鏈可變區的氨基酸序列，輕鏈和重鏈可變區的基因的cDNA序列，其CDRs(互補決定區)的鑒定，其表面氨基酸的鑒定，和將其以重組形式進行表達的手段。在第二個實施方案中，提供了重構表面或人源化的抗體EM 164，其中所述抗體或其片段的暴露于表面的殘基在輕鏈和重鏈中被替換以便更接近地類似于已知的人抗體表面。這種人源化抗體與鼠EM164相比，在作為治療或診斷試劑方面的實用性要更強。人源化的抗體EM164的特征在此也完全被揭示，包括其輕鏈和重鏈可變區各自的氨基酸序列，輕鏈和重鏈可變區的基因的DNA序列，CDRs的鑒定，其表面氨基酸的鑒定，和其以重組形式進行表達的方法的公開。在第三個實施方案中，提供了一種抗體，它能夠在生長刺激物存在的情況下抑制癌癥細胞的生長超過大約80％，所述刺激物例如血清、胰島素樣生長因子-I和胰島素-樣生長因子-II。在第四個實施方案中，提供了一種抗體或抗體片段，其具有重鏈和輕鏈，所述重鏈包含分別具有SEQ ID NOS1-3中所示的氨基酸序列的CDRsSYWMH(SEQ ID NO1)，EINPSNGRTNYNEKFKR(SEQ ID NO2)，GRPDYYGSSKWYFDV(SEQ ID NO3)；所述輕鏈包含具有SEQ ID NOS4-6中所示的氨基酸序列的CDRsRSSQSIVHSNVNTYLE(SEQ ID NO4)；KVSNRFS(SEQ ID NO5)；FQGSHVPPT(SEQ ID NO6)。在第五個實施方案中，提供了抗體，其重鏈具有的氨基酸序列與SEQ ID NO7中所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性(identity)，SEQ ID NO7為
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDY YGSSKWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ IDNO7)。類似地，提供了具有輕鏈的抗體，所述輕鏈具有與SEQ ID NO8描述的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，SEQ IDNO8為DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO8)。在第六個實施方案中，提供了具有人源化或重構表面的輕鏈可變區的抗體，所述輕鏈可變區具有對應于SEQ ID NOS-9-12中的其中一個的氨基酸序列DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO9)；DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ED NO10)；DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO11)；或DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO12)。類似地，提供了抗體，其具有人源化或重構表面的重鏈可變區，該區域具有與SEQ ID NO13對應的氨基酸序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ IDNO13)。在第七個實施方案中，提供了具有改良的特性的本發明抗體或抗體片斷。例如，對IGF-I受體具有更強的親和性的抗體或抗體片段可通過本發明的抗體或片段的親和力成熟(affinity maturation)來制備。本發明進一步提供了所述抗體的偶聯物，其中細胞毒性試劑直接地或者通過一個可切割的或不可切割的連接物(linker)，被共價連接于本發明的抗體或抗體的表位(epitope)結合片段。在優選的實施方案中，所述細胞毒性試劑是紫杉醇、美登木素類生物堿(maytansinoid)、CC-1065或CC-1065類似物。本發明進一步提供了進一步被標記的可在研究或診斷應用中被使用的抗體或其片段。在優選的實施方案中，所述標記是放射標記、熒光團(fluorophore)、生色團(chromophore)、顯影劑(imaging agent)或金屬離子。也提供了一種診斷方法，其中所述的被標記的抗體或片段被施于懷疑患有癌癥的對象，并測定或監測對象體內的標記物的分布。在第八個實施方案中，本發明提供了通過將本發明的抗體，抗體片段或抗體偶聯物單獨施用或者與其他細胞毒性試劑或治療試劑聯合施用來治療患有癌癥的對象的方法。所述癌癥可以是下列的一種或者多種，例如乳癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜肉瘤、前列腺癌或其他還待被確定其中IGF-I受體水平升高的癌癥。在第九個實施方案中，本發明提供了通過或者單獨或與其他細胞毒性劑或治療劑組合，給予本發明的抗體、抗體片段或抗體偶聯物，來治療患有癌癥的對象的方法。特別地，優選的細胞毒劑和治療劑包括多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉酚(paclitaxel)、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(trastuzumab)(Herceptin)、卡培他賓(capecitabine)、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦、戈舍瑞林(goserelin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康(topotecan)、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克(abarelix)、唑來瞵酸鹽(zoledronate)、鏈硝脲、妥昔(rituximab)(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷(fludarabine)、伊馬替尼(imatinib)、阿糖胞苷、伊莫單抗(ibritumomab)(Zevalin)、托西莫單抗(tositumomab)(Bexxar)、干擾素α-2b、美法侖(melphalam)、硼替佐米(bortezomib)(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(gefitinib)(Iressa)、埃洛尼替(erlonitib)(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)和埃坡霉素(epothilones)。更優選地，治療劑是鉑試劑(諸如卡鉑、奧沙利鉑、順鉑)、紫杉烷(諸如紫杉酚、多烯紫杉醇)、吉西他濱或喜樹堿。癌癥可以是下述舉例的癌癥中的一種或多種乳癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜肉瘤、胰腺癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤和橫紋肌肉瘤、或還待被確定的其中IGF-I受體水平被提高的其他癌癥。在第十個實施方案中，本發明提供了試劑盒，該試劑盒包括本文中描述的一種或多種要素，和使用這些要素的說明書(instruction)。在優選的實施方案中，本發明的試劑盒包括本發明的抗體、抗體片段或偶聯物，以及治療劑。該優選實施方案的說明書包括使用本發明的抗體、抗體片段或偶聯物，以及治療劑，來抑制癌癥細胞生長的說明書，和/或使用本發明的抗體、抗體片段或偶聯物，以及治療劑治療患有癌癥的患者的方法的說明書。
附圖簡述[35]

圖1顯示了純化的EM164抗體與過量表達人Y125 1F IGF-I受體或人胰島素受體的細胞的特異結合的熒光激活細胞分選(FACS)分析。圖2示出了EM164抗體結合生物素化的人IGF-I受體的結合滴定曲線。圖3示出了EM164抗體對生物素化的IGF-I受體結合人乳癌MCF-7細胞的抑制。圖4顯示了EM164抗體對MCF-7細胞中IGF-I刺激的IGF-I受體自磷酸化的抑制。圖5顯示了EM164抗體對MCF-7細胞中IGF-I刺激的IRS-1磷酸化的抑制。圖6顯示了EM164抗體對SaOS-2細胞中IGF-I刺激的信號轉導的抑制。圖7顯示了通過MTT分析檢測的EM164抗體對不同的生長條件下MCF-7細胞的生長和存活的影響。圖8顯示了在不同血清濃度下，EM164抗體對MCF-7細胞的生長和存活的影響。圖9示出了EM164抗體對NCI-H838細胞的IGF-I-和血清-刺激的生長和存活的抑制。圖10顯示了EM164抗體，紫杉醇或EM164抗體和紫杉醇的聯合處理對小鼠中Calu-6肺癌異種移植物生長的影響。圖11示出了人源化EM164抗體(v.1.0)和鼠EM164抗體的結合之間的競爭。圖12顯示了鼠抗IGF-I受體抗體EM164的輕鏈引導區和可變區的cDNA(SEQ ID NO49)和氨基酸序列(SEQ ID NO50)。箭頭標記了構架1的起始。根據Kabat的3個CDR序列用下劃線劃出。圖13顯示了鼠抗IGF-I受體抗體EM164重鏈引導區和可變區的cDNA(SEQ ID NO51)和氨基酸序列(SEQ ID NO52)。箭頭標記了構架1的起始點。3個CDR序列根據Kabat被下劃線標出。圖14顯示了抗體EM164的輕鏈和重鏈CDR氨基酸序列，根據Chothia典型分類定義(Chothis canonical class definitions)確定。也顯示了AbM建模軟件(AbM modeling software)對重鏈CDR的定義。
輕鏈CDR1是SEQ ID NO4，CDR2是SEQ ID NO5，CDR3是SEQ IDNO6。重鏈CDR1是SEQ ID NO1，CDR2是SEQ ID NO2，和CDR3是SEQ ID NO3。AbM重鏈CDR1是SEQ ID NO53，CDR2是SEQ EDNO54，CDR3是SEQ ED NO55。圖15顯示了Crl(SEQ ID NO56)和J558.c(SEQ ID NO57)基因的胚系序列與抗IGF-I受體抗體EM164的輕鏈和重鏈氨基酸序列的比對。短劃線(-)表示序列的同一性。圖16顯示了用于構建和表達重組的嵌合的和人源化的EM164抗體的質粒。A)輕鏈克隆質粒，B)重鏈克隆質粒，C)哺乳動物抗體表達質粒。圖17顯示了從結構文件組中的127個抗體中篩選出的輕鏈的10個最同源的氨基酸序列，被用來預測EM164的表面殘基，em164 LC(SEQ ID NO58)，2jel(SEQ ID NO59)，2pcp(SEQ ID NO60)，1nqb(SEQ ID NO61)，1kel(SEQ ID NO62)，1hyx(SEQ ID NO.63)，1igf(SEQ ID NO64)，1tet(SEQ ID NO65)，1clz(SEQ ID NO66)，1bln(SEQ ID NO67)，1cly(SEQ ID NO68)，保守序列(SEQ ID NO69)。圖18顯示了從結構文件組中的127個抗體中篩選出的重鏈的10個最同源的氨基酸序列，被用來預測EM164的表面殘基，em164 HC(SEQ ID NO70)，1nqb(SEQ ID NO71)，1ngp(SEQ ID NO72)，1fbi(SEQ ID NO73)，1afy(SEQ ID NO74)，1yuh(SEQ ID NO75)，1plg(SEQ ID NO76)，1d5b(SEQ ID NO77)，1ae6(SEQ ID NO78)，1axs(SEQ ID NO79)，3hfl(SEQ ID NO80)，保守序列(SEQ ED NO81)。圖19顯示了所述10個最同源結構的每個(A)輕鏈和(B)重鏈可變區殘基的平均可及性。數字代表在Kabat抗體序列中的位置編號。圖20顯示了鼠EM164(muEM164)和人源化EM164(huEM164)的輕鏈可變區氨基酸序列。muEM164(SEQ ID NO82)，huEM164 V1.0(SEQ ED NO83)，huEM164 V1.1(SEQ ED NO84)，huEM164 V1.2(SEQ ED NO85)，huEM164 V1.3(SEQ ED NO86)。圖21顯示了鼠EM164抗體(muEM164，SEQ ID NO87)和人源化EM164抗體(huEM164，SEQ ED NO88)的重鏈可變區氨基酸序列。圖22顯示了huEM164 v1.0輕鏈可變區DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO89，氨基酸SEQ ID NO90)和重鏈可變區DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO91，氨基酸SEQ ID NO92)。圖23顯示了人源化EM164 v1.1的輕鏈可變區DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO93；氨基酸SEQ ID NO94)，v1.2的輕鏈可變區DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO95；氨基酸SEQ ID NO96)和v1.3的輕鏈可變區DNA和氨基酸序列(DNA，SEQ ID NO97；氨基酸SEQ ID NO98)。圖24顯示了人源化EM164 v1.0抗體和鼠EM164抗體對IGF-I刺激的MCF-7細胞生長和存活的抑制。圖25顯示EM164可抑制IGF-I刺激的MCF-7細胞周期。圖26顯示EM164可抑制IGF-I和血清的抗凋亡效應。用EM164進行的處理可引起凋亡性細胞死亡，這通過被切割的CK18蛋白水平升高證實。圖27顯示了使用EM164抗體，吉西他濱(吉西他濱)或EM164和吉西他濱的聯合進行的處理對免疫缺陷小鼠中人BxPC-3胰腺癌異種移植物生長的影響。
發明祥述[62]本發明發現和改良了可與細胞表面上的人胰島素樣生長因子-I受體(IGF-IR)特異結合的新的抗體。所述抗體和片段具有獨特的抑制受體的細胞功能的能力，而沒有活化受體本身的能力。因此，以前已知的可特異結合和抑制IGF-IR的抗體即使在缺少IGF-IR配體的情況下也可活化受體，而本發明的抗體或片段可拮抗IGF-IR卻又實質上缺少激動劑活性。而且，本發明的抗體和抗體片段可抑制人腫瘤細胞如MCF-7細胞在有血清條件下的生長超過80％，其抑制程度高于使用以前已知的抗IGF-IR抗體所獲得的程度。本發明的實施源自一種鼠抗IGF-IR抗體，在此稱為EM164，對此進行了完全的表征，包括輕鏈和重鏈的氨基酸序列，CDRs的鑒定，表面氨基酸的鑒定，以及其以重組形式進行表達的方法。在圖15中顯示了胚系序列(germline sequence)，并將其與EM164的序列進行比對。這樣的比較鑒定出EM164中可能的體細胞突變(somatic mutation)，包括在輕鏈CDR1中的一個和重鏈CDR2中的一個。抗體EM164和其人源化形式的輕鏈和重鏈的一級氨基酸和DNA序列在此被公開。但本發明的范圍不限于包含這些序列的抗體和片段。相反，與胰島素樣生長因子-I受體特異結合，并拮抗該受體的生物學活性，而又實質上缺少激動劑活性的所有抗體和片段都包括在本發明的范圍之內。因此，抗體和抗體片段可能在其骨架(scaffold)，CDRs，輕鏈和重鏈的氨基酸序列上與抗體EM164或人源化衍生物有區別，并仍然包括在本發明的范圍之內。通過建模(modeling)鑒定抗體EM164的CDRs，并且其分子結構已經被預測。另外，盡管所述CDRs對于抗原結合部位(epitope)的識別很重要，但它們對于本發明的抗體和片段并不是必需的。因此，提供了具有改善的性質的抗體和片段，例如可通過本發明的抗體的親和力成熟來產生。多樣的抗體和抗體片段，以及抗體模擬物(mimics)可以很容易地通過在位于一套特定的CDRs的側面的可變區和恒定區序列中進行突變、刪除和/或插入而產生。因此，例如，對于一套既定的CDR，可以通過不同重鏈的取代而得到不同類型的Ab，由此產生例如IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE型抗體和同型(isotypes)抗體。同樣，在本發明范圍內的人造抗體可通過將一組既定的CDRs嵌入進整個合成的骨架中而產生。術語“可變的(variable)”在此用來描述可變結構域的某些部分，它們的序列在抗體之間是不同的，可用于每一特定抗體與其抗原的結合以及特異性。然而，可變性通常并不是在抗體的可變結構域中平均分布的。這種可變性典型地集中在輕鏈和重鏈可變結構域內的稱為互補性決定區(complementarity determining regions，CDRs)或高變區(hypervariable regions)的三個片段內。可變結構域的更加高度保守的部分稱為構架(framework，FR)。重鏈和輕鏈的可變結構域每個都包含4個構架區，大部分采取β-片層構型，通過三個CDRs連接，形成環狀連接，在一些情況下形成β-片層結構的一部分。各條鏈中的CDR通過FR區緊靠在一起，并和來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點(E.A.Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，1991，NIH)。恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但顯示有多種效應器功能(effector function)，如該抗體參與抗體依賴的細胞毒性。人源化抗體或不受其他哺乳動物排斥的抗體可以采用幾種技術來產生，如表面重構(resurfacing)和CDR移植(CDR grafting)。在表面重構技術中，將分子建模，統計分析和誘變技術結合起來調整可變區的非CDR表面以使其類似于靶宿主的已知抗體的表面。抗體表面重構的策略和方法和降低抗體在不同宿主中的免疫原性的其它方法在美國專利5,639,641中公開，在此引入以供參考。在CDR移植技術中，鼠重鏈和輕鏈CDRs被移植進人的整個構架序列中。本發明也包括在本說明書中描述的抗體的功能等價物(functionalequivalents)。功能等價物具有與所述抗體相當的結合特性，包括例如，嵌合的，人源化的和單鏈的抗體以及其片段。產生這樣的功能等價物的方法在PCT申請WO 93/21319，歐洲專利申請239,400；PCT申請WO89/09622；歐洲專利申請338,745；和歐洲專利申請EP 332,424中公開，分別在此整體引入以供參考。功能等價物包括有其氨基酸序列實質上與本發明的抗體的可變區或高變區的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“實質上相同”在用于描述氨基酸序列時是指與另一條氨基酸序列具有至少大約90％，更優選至少大約95％的序列同一性的序列，這種同一性可以根據Pearson和Lipman的FASTA搜索方法測定，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448(1988)。嵌合抗體優選具有實質上或全部地源自人抗體恒定區的恒定區以及實質上或全部地源自除人之外的哺乳動物的可變區序列的可變區。抗體的人源化形式的制備例如可通過將鼠抗體的互補性決定區替換進人構架結構域中來完成，例如，見PCT申請公開號W092/22653。人源化抗體優選具有除了實質上或全部地源自相應的人抗體區的互補性決定區(CDR)和實質上或全部地源自非人的哺乳動物的CDRs之外的恒定區和可變區。功能等價物也包括單鏈抗體片段，也稱為單鏈抗體(scFvs)。這些片段含有抗體可變重鏈氨基酸序列(VH)的至少一個片段，該片段與抗體可變輕鏈序列(VL)的至少一個片段相連，這些片斷間可以具有一個或多個將其互相連接的連接物，也可以沒有這樣的連接物。這樣的連接物可以是短的，柔性的肽，它們是經過選擇的，以確保一旦(VL)和(VH)結構域被連接起來便能形成適當的三維折疊，從而保留住作為該單鏈抗體片段的來源的完整抗體的靶分子結合特異性。通常，(VL)或(VH)序列的羧基末端可通過這樣的肽連接物共價相連至互補(VL)和(VH)序列的氨基酸末端。單鏈抗體片段可通過分子克隆，抗體噬菌體表面展示文庫或類似的技術產生。這些蛋白可在真核細胞或原核細胞，包括在細菌中產生。單鏈抗體片段包含具有本說明書中描述的完整抗體的可變區或互補性決定區(CDRs)中的至少一個的氨基酸序列，但缺少那些抗體的一些或所有的恒定結構域。這些恒定結構域不是抗原結合所必需的，但構成了完整抗體的結構的主要部分。單鏈抗體片段因此可以克服在應用含有部分或所有恒定結構域的抗體時相關的一些問題。例如，單鏈抗體片段往往沒有生物分子和重鏈恒定區之間的不期望的相互作用，或其它不想要的生物學活性。另外，單鏈抗體片段較完整抗體要顯著小，因此較完整抗體有更高的毛細血管通透性，可使單鏈抗體片段更有效地定位和結合于靶抗原結合位點上。而且，抗體片段可以相對大規模地在原核細胞中產生，因此方便了其生產。而且，單鏈抗體片段相對小的尺寸使它們在接受者中激發起免疫應答的可能性小于完整抗體。功能等價物進一步包括具有與完整抗體相同或相當的結合特性的抗體片段。這樣的片段含有一個或兩個Fab片段或F(ab′)2片段。優選地，所述抗體片段含有完整抗體的所有六個互補性決定區，盡管含有更少的這樣的區域，如含有三個，四個或五個CDRs的片段也是有功能的。進一步，功能等價物可以是下面的免疫球蛋白類型的任何一類中的成員或者組合IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE、及其亞類。在此所述的抗IGF-I受體抗體EM164及其人源化變體的氨基酸和核酸序列的知識，可用來開發同樣可結合人IGF-I受體，并抑制IGF-I受體的細胞功能的其他抗體。基于初級抗體(primary antibody)序列的知識，數個研究調查了在抗體序列中不同位置導入一個或多個氨基酸變化對其特性如結合和表達水平的影響(Yang，W.P.等，1995，J.MolBiol，254，392-403；Rader，C.等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，8910-8915；Vaughan，T.J.等，1998，Nature Biotechnology，16，535-539)。在這些研究中，初級抗體的變異體已經通過改變CDR1，CDR2，CDR3或構架區中重鏈和輕鏈基因的序列而產生，使用的方法如寡核苷酸介導的位點定向誘變，盒式誘變(cassette mutagenesis)，易錯PCR，DNA重排(shuffling)，或者利用大腸桿菌的增變株(mutator-strains)(Vaughan，T.J.等，1998，Nature Biotechnology，16，535-539；Adey，N.B.等，1996，第16章，277-291頁，在″Phage Display of Peptides andProteins″，Eds.Kay，B.K.等，Academic Press)。這些改變初級抗體的序列的方法導致二級抗體(secondary antibodies)的親和性增加(Gram.，H.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，3576-3580；Boder，E.T.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，10701-10705；Davies，J.和Riechmann，L，1996，Immunotechnolgy，2，169-179；Thompson，J.等，1996，J.Mol Biol，256，77-88；Short，M.K.等，2002，J.Biol.Chem.，277，16365-16370；Fui-ukawa，K.等，2001，J.Biol.Chem.，276，27622-27628)。通過改變抗體的一個或多個氨基酸殘基的類似定向策略，在本發明中描述的抗體序列可以被用來開發具有改善的功能的抗IGF-I受體抗體。本發明的偶聯物包括在此公開的與細胞毒性試劑相連接的抗體，片段和其類似物。優選的細胞毒性試劑是美登木素類生物堿，紫杉烷(taxanes)和CC-1065類似物。所述偶聯物可通過體外的方法來制備。為了將細胞毒性試劑與抗體連接，使用了連接基團。適合的連接基團在本領域是為人所熟知的，包括二硫基團，硫醚基團，酸性不穩定(acidlabile)基團，光不穩定基團，肽酶不穩定基團和酯酶不穩定基團。優選的連接基團是二硫基和硫醚基。例如，偶聯物可采用二硫化物交換反應(disulfide exchange reaction)或在抗體和細胞毒性試劑之間形成硫醚鍵而構建。美登木素類生物堿和美登木素類生物堿類似物屬于優選的細胞毒性試劑。合適的美登木素類生物堿的例子包括美登醇和美登醇類似物。合適的美登木素類生物堿在美國專利4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499和5,846,545中公開。紫杉烷也是優選的細胞毒劑。適合用于本發明的紫杉烷公開于美國專利6,372,738和6,340,701中。CC-1065和其類似物也是優選的用于本發明的細胞毒性藥物。CC-1065和其類似物在美國專利6,372,738；6,340,701；5,846,545和5,585,499中公開。制備這樣的細胞毒性偶聯物的一種吸引人的候選物是CC-1065，CC-1065是從鏈霉菌(Streptomyces zelensis)的培養肉湯中分離出的一種有效的抗腫瘤抗生素。CC-1065較普遍使用的抗癌藥物，如阿霉素，氨甲蝶呤和長春新堿的體外效力高大約1000倍(B.K.Bhuyan等，Cancer Res.，42，3532-3537(1982))。細胞毒性藥物例如氨甲蝶呤，柔毛霉素，阿霉素，長春新堿，長春堿，美法侖，絲裂霉素C，苯丁酸氮芥，卡奇霉素也適合制備本發明的偶聯物，所述藥物分子也可通過中間載體分子如血清白蛋白而連接到抗體分子上。為了診斷性應用，本發明的抗體通常會用可檢測的部分(moiety)來標記。所述的可檢測的部分可以是能夠直接或間接產生可檢測信號的任何一種物質。例如，可檢測部分可以是放射性同位素，如3H，14C，32P，35S，或131I；熒光或化學發光化合物，如異硫氰酸熒光素，若丹明，或蟲螢光素(luciferin)；或酶，如堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。可應用本領域中已知的將抗體與可檢測部分偶聯的任何方法，包括由Hunter等，Nature 144945(1962)；David等，Biochemistry 131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth 40219(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30407(1982)描述的那些方法。本發明的抗體可以在任何已知的分析方法中被應用，如競爭結合分析，直接和間接夾心分析，和免疫沉淀分析(Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，147-158頁(CRC Press，Inc.，1987))。本發明的抗體也用于進行體內成像，其中用可檢測部分如不透射線的試劑(radio-opaque agent)或放射性同位素標記的抗體被施予對象，優選施于血流中，然后測定宿主中標記抗體的存在和位置。這種成像技術可用于惡性腫瘤的分級(staging)和治療。抗體可用任何可在宿主中可檢測到的部分來標記，不管是通過核磁共振，放射學或本領域中已知的其他檢測方法。本發明的抗體也可用作親和純化試劑。在這個過程中，使用本領域中已知的方法將抗體固定在合適的支持物上，如Sephadex樹脂或濾紙上。基于它們對IGF-I受體在細胞中的功能的抑止，本發明的抗體可以用作生物學研究試劑。為了進行治療應用，本發明的抗體或偶聯物可以以藥學上可接受的劑型施于對象。它們可作為丸劑靜脈施與或在一段時間內連續輸注，通過肌肉內，皮下，關節內，滑膜內，鞘內，口服，局部或吸入途徑給藥。抗體也可通過腫瘤內，腫瘤旁，病灶內或病灶旁的途徑給藥，發揮局部以及全身的治療效應。合適的藥學上可接受的載體，稀釋劑和賦形劑是為人所熟知的，可由本領域中的技術人員根據臨床情形來確定。合適的載體，稀釋劑和/或賦形劑的實例包括(1)Dulbecco′s磷酸緩沖液，pH大約7.4，含有大約1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％鹽水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)葡萄糖。本發明的方法可在體外，體內或離體實施。在其他治療性處理中，本發明的抗體，抗體片段或偶聯物可與一種或多種其他的治療性試劑共同施用或相繼施用。合適的治療性藥劑包括但不限于細胞毒性試劑或細胞生長抑制試劑。紫杉醇是一種優選的治療性試劑，也是一種細胞毒劑。癌癥治療試劑是指那些可殺死癌癥細胞或限制癌癥細胞的生長而對宿主產生最小的損害的試劑。因此，這樣的試劑可以利用癌癥細胞特性(例如，代謝，血管化作用或細胞表面抗原呈遞)與健康宿主細胞的任何差異。腫瘤形態學的差異是進行干預(intervention)的潛在位點例如，第二種治療物可以是抗體如抗VEGF抗體，它可用于延遲實體腫瘤內部的血管化作用，由此可減慢其生長速率。其它的治療試劑包括但不限于輔助物如鹽酸格拉司瓊(granisetron HCL)，雄性激素抑制劑如亮丙瑞林乙酸鹽(leuprolide acetate)，抗生素如阿霉素，抗雌激素藥如它莫西芬，抗代謝藥如α干擾素-2a，細胞毒性藥物如紫杉醇，酶抑制劑如ras法尼基-轉移酶(ras farnesyl-transferase)抑制劑，免疫調節劑如阿地白介素(aldesleu kin)，和氮芥衍生物如鹽酸美法侖(melphalan HCl)，以及類似物。可與EM164組合以獲得改善的抗-腫瘤效率的治療劑包括用于腫瘤學實踐的多種多樣的試劑(參考Cancer，Principles & Practice ofOncology，DeVita，V.T.，Hellman，S.，Rosenberg，S.A.，第六版，Lippincott-Raven，Philadelphia，2001)，諸如多烯紫杉醇、紫杉酚、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(Herceptin)、卡培他賓、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來瞵酸鹽、鏈硝脲、妥昔(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷、伊馬替尼、阿糖胞苷、伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)、α干擾素-2b、美法侖、硼替佐米(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(Iressa)、埃洛尼替(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)、埃坡霉素，以及細胞毒性藥物和針對細胞-表面受體的抗體的偶聯物。優選的治療劑是鉑試劑(諸如卡鉑、奧沙利鉑、順鉑)、紫杉烷(諸如紫杉酚、多烯紫杉醇)、吉西他濱和喜樹堿。一種或多種額外的治療劑可以在本發明的抗體、抗體片段或偶聯物之前、同時或之后給予。本領域技術人員將理解，對于每一個治療劑來說，特定的給藥順序可能具有優點。類似地，本領域技術人員將理解，對于每一治療劑，本發明的試劑、抗體、抗體片段或偶聯物之間的給藥時間長度可以變化。盡管本領域技術人員將理解到，每一治療劑的劑量將取決于試劑的特性，優選的劑量可以在約10mg/平方米至約2000mg/平方米，更優選地在約50mg/平方米至約1000mg/平方米范圍內。對于優選的試劑諸如鉑試劑(卡鉑、奧沙利鉑、順鉑)，優選的劑量約10mg/平方米至約400mg/平方米，對于紫杉烷(紫杉酚、多烯紫杉醇)，優選的劑量約20mg/平方米至約150mg/平方米，對于吉西他濱，優選的劑量約100mg/平方米至約2000mg/平方米，對于喜樹堿，優選的劑量約50mg/平方米至約350mg/平方米。該治療劑以及其他治療劑的劑量可以取決于本發明的抗體、抗體片段或偶聯物是否與治療劑同時給藥或順序給藥。無論是同時給藥或順序給藥，本發明的抗體、抗體片段或偶聯物和一種或多種額外的治療劑的給藥，可以如上面為治療應用所描述的那樣進行。將會被本領域技術人員理解的是，用于同時給藥的合適的藥學上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑取決于正被同時給藥的特定治療劑的特性。當以含水劑型存在而不是被凍干時，所述抗體典型地以大約0.1mg/ml至100mg/ml的濃度進行配制，盡管在這些范圍之外的很大變化也是允許的。為了治療疾病，抗體或偶聯物的合適劑量將依賴于如上面所定義的要治療的疾病類型、疾病的嚴重性和病程，而不論所述抗體的施用是為了預防還是治療、以往治療的過程、患者的臨床病史和對抗體的反應、以及主治醫生的判斷。抗體可以在一次或在多次治療過程中被適當地給予患者。取決于疾病的類型和嚴重性，對于給藥于患者，初始的候選劑量優選約1mg/平方米至約2000mg/平方米的抗體，更優選地，約10mg/平方米至約1000mg/平方米的抗體，無論是例如通過一次或多次分開給藥還是連續輸注來進行。對于在若干天或更長時間期間反復給藥，取決于條件，反復進行治療，直到獲得對疾病癥狀的理想的抑制。然而，其他劑量方案也可以應用，并不排除在外。本發明也包括試劑盒，該試劑盒包括一種或多種本文中描述的要素，以及使用這些要素的說明書。在優選的實施方案中，本發明的試劑盒包括本發明的抗體、抗體片段或偶聯物，以及治療劑。該優選實施方案的說明書包括使用本發明的抗體、抗體片段或偶聯物和治療劑，來抑制癌癥細胞生長的說明書，和/或使用本發明的抗體、抗體片段或偶聯物和治療劑治療患有癌癥的患者的方法的說明書。優選地，用于本試劑盒的抗體具有與小鼠雜交瘤EM164(ATCC登記號PTA-4457)產生的鼠抗體EM164同樣的氨基酸序列，或該抗體是其表位-結合片段，其中抗體以及抗體片段特異性地結合到胰島素-樣生長因子-I受體。用于試劑盒中的抗體或抗體片段也可以是表面重構形式的EM164抗體、人源化形式的EM164抗體、或改變形式的EM164抗體，該抗體具有至少一個核苷酸突變、剔除或插入。這三種形式的抗體中的每一種抗體或抗體片段都保留與EM164抗體相同的結合特異性。優選地，用于本試劑盒的治療劑選自多烯紫杉醇、紫杉酚、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(Herceptin)、卡培他賓、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來瞵酸鹽、鏈硝脲、妥昔(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷、伊馬替尼、阿糖胞苷、伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)、α干擾素-2b、美法侖、硼替佐米(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(Iressa)、埃洛尼替(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)和埃坡霉素。更優選地，治療劑是鉑試劑(諸如卡鉑、奧沙利鉑、順鉑)、紫杉烷(諸如紫杉酚、多烯紫杉醇)、吉西他濱或喜樹堿。本發明試劑盒的要素是適合于試劑盒的形式，諸如溶液或凍干粉末。將會被本領域技術人員所理解的是，試劑盒的要素的濃度或數量取將根據試劑盒的每一種要素的特性和目的用途而變化。試劑盒的說明書中指出的癌癥和細胞包括乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜肉瘤、胰腺癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤和橫紋肌肉瘤。
實施例[104]現通過參考下面的實施例來描述本發明，其僅僅是說明性的，而并非限制本發明。
實施例1鼠EM164抗體[105]在該這第一個實施例中，公開了本發明的鼠源性抗體的完整的一級氨基酸結構和cDNA序列，以及它的結合特性和將其以重組形式表達的方式。因此，充分且完整地公開了本發明的抗體及其制備，這樣在免疫學領域中的普通技術人員將能夠制備所述的抗體，而不需要過多的實驗。
A.抗-IGF-I受體的單克隆抗體雜交瘤的產生[106]應用表達帶有Y1251F突變的人IGF-I受體的細胞系來進行免疫，因為它可表達大量的IGF-I受體(～107/細胞)。在IGF-I受體的胞漿結構域中的Y1251F突變導致轉化和抗凋亡信號傳導功能的喪失，但不影響IGF-I結合和IGF-I刺激的促有絲分裂信號轉導(O′Connor，R.等，1997，Mol Cell.Biol，17，427-435；Miura，M.等，1995，J.Biol Chem.，270，22639-22644)。另外，突變也不影響抗體的產生，因為本實施例的抗體結合于IGF-I受體的細胞外結構域，該結構域在Y1251F突變體和野生型受體中是相同的。用帶有Y1251F突變的人IGF-I受體基因以及嘌呤霉素抗性基因轉染IGF-I受體缺陷型小鼠的3T3樣細胞，產生表達帶有Y1251F突變的人IGF-I受體的細胞系，用嘌呤霉素(2.5微克/mL)并通過FACS分選對IGF-I受體的高表達進行選擇(Miura，M.等，1995，J.Biol.Chem.，270，22639-22644)。具有高水平IGF-I受體表達的細胞系進一步用高濃度的嘌呤霉素如25微克/mL進行選擇，這個濃度對大多數細胞是有毒性的。存活的集落被揀出，并選擇那些顯示出高水平IGF-I受體表達的集落。6月齡的CAF1/J雌性小鼠在第0天用過量表達Y1251F突變型人IGF-I受體的細胞進行腹膜內免疫(5×105個細胞，懸浮于0.2mL PBS中)。所述動物用0.2mL細胞懸液如下進行加強免疫(boosted)第2天，1×106細胞；第5天，2×106細胞；第7、9、12和23天，1×107細胞。在第26天，處死小鼠，移走其脾臟。脾臟在兩塊毛玻璃片之間被磨碎以獲得單細胞懸液，用含有青霉素和鏈霉素的無血清RPMI培養基(SFM)進行清洗。脾細胞沉淀重懸于10mL 0.83％(w/v)氯化銨水溶液中，置于冰上10分鐘以裂解血紅細胞，然后用無血清的培養基(SFM)清洗。脾細胞(1.2×108)與來自非分泌性鼠骨髓瘤細胞系P3×63Ag8.653(ATCC，Rockville，MD；Cat.#CRL1580)的骨髓瘤細胞(4×107)集中在一個試管中，并用無血清RPMI-1640培養基(SFM)清洗。去掉上清液，細胞沉淀重懸于殘余的培養基中。該試管置于37℃的一燒杯水中，以0.5mL/分鐘的滴入速率緩慢地加入1.5mL聚乙二醇溶液(50％PEG(w/v)，平均分子量1500，在75mM HEPES中，pH 8)，同時輕輕振蕩試管。等待1分鐘后，如下加入10mL SFM第1分鐘1mL，第2分鐘2mL，第3分鐘7mL。然后再將10mL在1分鐘內緩緩加入。細胞通過離心被沉淀，用SFM中清洗，重懸于添加了5％胎牛血清(FBS)、次黃嘌呤/氨蝶呤/胸苷(HAT)、青霉素、鏈霉素和10％雜交瘤克隆添加劑(HCS)的RPMI-1640生長培養基中。細胞接種在96孔平底組織培養板中，每孔有200μL培養物，其中有2×105個脾細胞。5-7天后，從每孔中移去100μL，用添加了次黃嘌呤/胸苷(HT)和5％FBS的生長培養基替換。用于免疫和產生雜交瘤的一般條件的描述可參見J.Langone和H.Vunakis(Eds.，Methods in Enzymology，Vol.121，″ImmunochemicalTechniques，Part I″；1986；Academic Press，Florida)以及E.Harlow和D.Lane(″AntibodiesA Laboratory Manual″；1988；Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork)。也可使用本領域中技術人員所熟知的其它免疫和雜交瘤產生技術。通過ELISA篩選雜交瘤克隆的培養物上清液與純化的人IGF-I受體的結合，通過ELISA和FACS篩選雜交瘤克隆的培養物上清液與過量表達人IGF-I受體的細胞的特異性結合和與過量表達人胰島素受體的細胞的無法結合，如下所述。對過量表達人IGF-I受體的細胞較過量表達人胰島素受體的細胞顯示出更高結合親和力的克隆被擴增和亞克隆。亞克隆的培養物上清通過上述的結合分析被進一步篩選。通過這個過程，選擇出了亞克隆3F1-C8-D7(EM164)，其重鏈和輕鏈基因被克隆，并被測序，如下所述。通過如下的方法分離人IGF-I受體，用于針對來自雜交瘤克隆的上清液與IGF-I受體的結合而進行篩選。用生物素化試劑如硫代-NHS-LC-生物素，硫代-NHS-SS-生物素，或NHS-PEO4-生物素修飾重組的IGF-I，制備出生物素化的IGF-I。生物素化的IGF-I在鏈親和素-瓊脂糖珠上被吸收，并與過量表達人野生型或Y1251F突變型IGFR的細胞的裂解物一起孵育。用含有2至4M尿素和去垢劑如triton X-100或辛基-β-糖苷的緩沖液清洗和洗脫這些珠子。洗脫出的IGF-I受體用PBS透析，并通過SDS-PAGE在還原條件下分析純度，結果顯示了IGF-I受體的α和β鏈的條帶，其分子量分別為大約135kDa和95kDa。為了檢查雜交瘤上清液與純化的IGF-I受體的結合，用在pH 9.5的50mM CHES緩沖液中稀釋的純化人IGF-I受體樣品(通過親和性純化樣品的尿素/辛基-β-糖苷洗脫物的透析而制備出來)包被Immulon-4HB ELISA板(Dynatech)(100μL；4℃，過夜)。這些孔用200μL的封閉緩沖液(10mg/mL BSA，溶于含有50mM Tris，150mMNaCl，pH 7.5和0.1％tween-20的TBS-T緩沖液中)來封閉，并與來自雜交瘤克隆的上清液(100μL；在封閉緩沖液中稀釋)孵育大約1h至12h，用TBS-T緩沖液清洗，與羊抗鼠-IgG-Fc-抗體-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物(100μL；在緩沖液中的濃度為0.8μg/mL；JacksonImmunoResearch Laboratories)共同孵育，然后洗滌并用ABTS/H2O2底物(0.5mg/mL ABTS，0.03％H2O2，在0.1M檸檬酸鹽緩沖液中，pH4.2)在405nm處進行檢測。典型地，來自3F1雜交瘤亞克隆的上清液在3分鐘的顯色過程中產生了大約1.2個吸光度單位的信號，與此相比，從其他一些雜交瘤克隆的上清液中獲得的值為0.0。這種ELISA的一般條件類似于如E.Harlow和D.Lane所述的抗體結合和檢測的標準ELISA條件(″Using AntibodiesA Laboratory Manual″；1999，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)，所述的標準條件也可被應用。用過量表達人Y1251F-IGF-I受體的細胞系和過量表達人胰島素受體的細胞系對雜交瘤上清液進行ELISA篩選，篩選出與人IGF-I受體而不與人胰島素受體特異結合的雜交瘤上清。兩種細胞系都是由IGF-I受體缺陷型小鼠的3T3樣細胞產生的。過量表達IGF-I受體的細胞和過量表達胰島素受體的細胞分別從組織培養瓶中通過快速的胰蛋白酶/EDTA處理來獲取，然后細胞懸浮在含有10％FBS的生長培養基中，通過離心而被沉淀，在用PBS清洗。將被清洗的細胞(100μL，大約1-3×106細胞/mL)加入到用植物血球凝集素(100μL，20μg/mLPHA)包被的Immulon-2HB板的孔中，離心10分鐘，使其粘附于PHA-包被的孔中。輕輕拍打有細胞的板以去掉PBS，然后在37℃干燥過夜。用含有5mg/mL BSA的PBS溶液在37℃封閉孔1h，然后輕輕地用PBS清洗。然后將雜交瘤克隆的等分上清液(100μL；在封閉緩沖液中稀釋)加入到含有過量表達IGF-I受體的細胞的孔中和含有過量表達胰島素受體的細胞的孔中，并在室溫下孵育1h。所述孔用PBS清洗，用羊抗鼠-IgG-Fc-抗體-辣根過氧化物酶偶聯物(100μL；0.8μg/mL，在封閉緩沖液中)孵育1h，然后清洗，使用ABTS/H2O2底物檢測結合。在與過量表達IGF-I受體的細胞孵育后，3F1雜交瘤亞克隆的典型上清液在12分鐘顯色過程中產生了0.88個吸光度單位的信號，與此相比，與過量表達人胰島素受體的細胞孵育后獲得的值為0.22個吸光度單位。為了提供純化的EM164抗體，依照生產廠商的說明書，使雜交瘤在Integra CL 350瓶中(Integra Biosciences，Maryland)生長。從Integra瓶的收獲上清液中獲得大約0.5-1mg/mL的抗體，這是使用抗體標準品通過ELISA和SDS-PAGE/考馬斯亮藍染色來定量的。在蛋白A-瓊脂糖珠的色譜柱上通過親和色譜來純化抗體，所述純化是在標準的純化條件下進行，即在含有3M NaCl的100mM Tris緩沖液，pH8.9中上樣和清洗，然后用含有150mM NaCl的100mM醋酸溶液洗脫。含有抗體的洗脫級分用冷的2M K2HPO4溶液中和，并用PBS在4℃進行透析。通過測量280nm的吸光度(消光系數＝1.4mg-1mL cm-1)來測定抗體濃度。純化的抗體樣品在還原條件下通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色進行分析，結果顯示只有抗體的重鏈和輕鏈條帶，分別在大約55kDa和25kDa處。所述純化抗體的同型體為具有κ輕鏈的IgG1。
B.EM164抗體的結合特征[115]純化的EM164抗體的特異性結合可使用過量表達人IGF-I受體的細胞和過量表達人胰島素受體的細胞進行熒光激活細胞分選(FACS)來證實(圖1)。使用過量表達IGF-I受體的細胞和過量表達胰島素受體的細胞(2×105個細胞/mL)，在圓底的96孔板中孵育在100μL冷FACS緩沖液(1mg/mL BSA，在Dulbecco′s MEM培養基中)中的EM 164抗體(50-100nM)1h。通過離心細胞將細胞沉淀，用冷的FACS緩沖液通過輕輕吹打進行清洗，然后與羊抗鼠-IgG-抗體-FITC偶聯物(100μL；10μg/mL，在FACS緩沖液中)在冰上孵育1h。細胞被沉淀，清洗，重懸在120μL的1％甲醛PBS溶液中。使用FACSCalibur讀數器(BD Biosciences)分析培養板。在過量表達IGF-I受體的細胞與EM164抗體孵育后，獲得了很強的熒光變化，相比而言，過量表達胰島素受體的細胞與EM164抗體的孵育所產生的變化是沒有顯著意義的(圖1)，這證明了EM164抗體在其與IGF-I受體的結合中是有選擇性的，并不與胰島素受體結合。對照抗體，抗-IGF-I受體抗體1 H7(Santa Cruz Biotechnology)和抗胰島素受體α抗體(BD Pharmingen Laboratories)，在與過量表達IGF-I受體和胰島素受體的細胞的孵育后分別產生了熒光的變化(圖1)。使用EM164抗體和表達IGF-I受體的人乳癌MCF-7細胞(Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.，272，31163-31171)，通過FACS分析也觀察到了很強的熒光變化，這說明EM164抗體結合于人腫瘤細胞表面上的人IGF-I受體。通過ELISA滴定抗體在數種濃度下與直接包被的IGF-I受體(應用生物素化的IGF-I親和純化得到，如上)或間接俘獲的生物素化IGF-I受體的結合，測定EM164抗體與人IGF-I受體結合的解離常數(Kd)。生物素化的IGF-I受體是應用PEO-馬來酰亞胺-生物素試劑(Pierce，Molecular Biosciences)對過量表達IGF-I受體的細胞的去垢劑溶解裂解物進行生物素化而制備的，它可應用固定在NHS-瓊脂糖珠上的抗IGF-I受體β鏈抗體進行親和純化，并用溶于含有NP-40去垢劑的緩沖液中的2-4M尿素洗脫，并用PBS透析。EM164抗體與生物素化的IGF-I受體結合的Kd測定是通過將Immulon-2HB板用100μL含有1μg/mL鏈親和素的碳酸鹽緩沖液(150mM碳酸鈉，350mM碳酸氫鈉)在4℃過夜包被而進行的。鏈親和素包被的孔用200μL封閉緩沖液(含有10mg/mL BSA的TBS-T緩沖液)進行封閉，用TBS-T緩沖液清洗，并與生物素化的IGF-I受體(10至100ng)在室溫下孵育4h。然后清洗含有間接俘獲的生物素化IGF-I受體的孔，與以不同濃度溶于封閉緩沖液中的EM164抗體(5.1×10-13M至200nM)在室溫下孵育2h，然后在4℃孵育過夜。接下來用TBS-T緩沖液清洗孔，與羊抗鼠-IgGH+L-抗體-辣根過氧化物酶偶聯物(100μL；0.5μg/mL，在封閉緩沖液中)共同孵育，然后洗滌，應用ABTS/H2O2底物在405nm處檢測。Kd的值通過單一位點結合(one-site binding)的非線性回歸(non-linear regression)來估計。類似的結合滴定還通過使用EM164抗體的Fab片段來進行，該片段是通過木瓜酶消化抗體而制備的，如E.Harlow和D.Lane(″UsingAntibodiesA Laboratory Manual″；1999，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)所描述。EM164抗體與生物素化人IGF-I受體結合的結合滴定曲線產生的Kd值為0.1nM(圖2)。EM164抗體的Fab片段也與人IGF-I受體非常緊密地結合，Kd值為0.3nM，表明EM164抗體與IGF-I受體的單體結合也非常強烈。EM164抗體與IGF-I受體結合的這種極低的解離常數值部分是由于非常低的Koff速率造成的，這是通過延遲洗滌與固定的IGF-I受體結合的抗體1-2天后所觀察到的強結合信號所證實的。EM164抗體可用來免疫沉淀IGF-I受體，如通過人乳癌MCF-7細胞的去垢劑溶解裂解物與固定在蛋白G-瓊脂糖珠(Pierce ChemicalCompany)上的EM164抗體的孵育所證實的。EM164抗體免疫沉淀物的Western印跡采用兔多克隆抗-IGF-I受體β鏈(C-末端)抗體(SantaCruz Biotechnology)和羊抗兔-IgG-抗體-辣根過氧化物酶偶聯物來檢測，然后沖洗，進行增強型化學發光(ECL)檢測。MCF-7細胞的EM164免疫沉淀物的Western印跡顯示了與IGF-I受體的β鏈對應的條帶，在大約95kDa處，以及與前-IGF-I(pro-IGF-I)受體對應的條帶，在大約220kDa處。類似的免疫沉淀也對其他細胞類型實施以檢查EM164抗體的結合的種屬特異性，結果顯示該抗體也與來自cos-7細胞(非洲綠猴)的IGF-I受體結合，但不與3T3細胞(小鼠)，CHO細胞(中國倉鼠)或羊成纖維細胞(山羊)的IGF-I受體結合。在MCF-7細胞的裂解物的Western印跡中，EM164抗體不能檢測SDS變性的人IGF-I受體，表明它是與天然的，未變性的人IGF-I受體的具有一定構象的表位結合。EM164抗體的結合結構域進一步應用截短的α鏈構建物來表征，該構建物含有其側面帶有L1和L2結構域的富含半胱氨酸的結構域(殘基1-468)，以及與之融合的16-mer-C末端片段(殘基704-719)，它的末端是C-末端抗原決定部位標記。這種較小的IGF-I受體缺少殘基469-703，已經有報道其可結合IGF-I，盡管所述結合不如天然的全長IGF-I受體緊密(Molina，L.等，2000，FEES Letters，467，226-230；Kristensen，C.等，1999，J.Biol.Chem.，274，37251-37356)。因此，制備了截短的IGF-I受體α鏈構建物，其含有殘基1-468以及與之融合的C-末端片斷，該片斷是殘基704-719，側翼是C-末端myc抗原決定部位標記。構建了表達這種構建物并且也可在人胚胎腎293T細胞中暫時表達該構建物的穩定細胞系。觀察到EM164抗體與這種截短的IGF-I受體α鏈構建物的強烈結合。在被檢測的兩種抗體中，IR3(Calbiochem)也可與這種截短的α鏈結合，但1H7抗體(Santa Cruz Biotechnology)不發生結合，表明EM164抗體的抗原決定部位與1H7抗體明顯不同。
C.EM164抗體抑制IGF-I對MCF-7細胞的結合[124]IGF-I與人乳癌MCF-7細胞的結合可被EM164抗體抑制(圖3)。MCF-7細胞與或者不與5μg/mL EM164抗體在無血清培養基中孵育2h，然后與50ng/mL生物素化IGF-I在37℃孵育20分鐘。然后用無血清培養基洗滌細胞兩次，去掉未結合的生物素-IGF-I，然后用含有1％NP-40和蛋白酶抑制劑的50mM HEPES，pH 7.4裂解。Immulon-2HBELISA板用鼠單克隆抗-IGF-I受體β鏈抗體包被，并將其用于從裂解產物中俘獲IGF-I受體和結合的生物素-IGF-I。所述包被抗體與IGF-I受體β鏈的胞漿C-末端結構域的結合不干擾生物素-IGF-I與IGF-I受體的細胞外結構域的結合。洗滌孔，并與鏈親和素-辣根過氧化物酶偶聯物孵育，再次洗滌，然后使用ABTS/H2O2底物來檢測。5μg/mL EM164抗體對IGF-I與MCF-7細胞結合的抑制實質上是可定量的，這幾乎等價于使用缺少生物素-IGF-I的對照時獲得的ELISA本底。除了上述的EM164抗體對IGF-I與MCF-7細胞的結合的抑制情況的分析，下面的分析證明了EM164抗體可高效地取代與MCF-7細胞結合的IGF-I，如生理條件下所需要的，即需要拮抗性的抗IGF-I受體抗體取代已結合的內源性生理配體(如IGF-I或IGF-II)。在這個IGF-I取代分析中，在12孔板中生長的MCF-7細胞遭受血清饑餓(serum-starved)，隨后與生物素化的IGF-I(20-50ng/mL)在無血清培養基中于37℃(或4℃)孵育1至2h。然后，用EM164抗體或對照抗體(10-100μg/mL)在37℃(或在4℃)處理帶有結合的生物素化IGF-I的細胞，處理30min至4h。然后用PBS洗滌細胞，在含有1％NP-40的裂解緩沖液中，在4℃裂解細胞。ELISA如上所述進行，用以從所述裂解產物中俘獲IGF-I受體，然后采用鏈親和素-辣根過氧化物酶偶聯物檢測與所述受體結合的生物素化IGF-I。該ELISA證明了EM164抗體在37℃能夠幾乎完全地取代細胞上預結合的生物素化IGF-I(在30min內為90％，在4h內～100％)，在4℃在2h中，取代大約50％。在另一個試驗中，NCI-H838肺癌細胞與生物素-IGF-I一起孵育，然后洗滌，與EM164抗體在4℃孵育2h，結果使結合的生物素-IGF-I減少80％。因此，EM164抗體可高效地取代癌細胞上預結合的IGF-I，這在治療上是非常重要的，因為可以通過取代已結合的內源性生理配體而拮抗IGF-I受體。MCF-7細胞與EM164抗體在4℃孵育2h(或在37℃孵育30min)，根據應用了抗IGF-I受體β鏈抗體(Santa Cruz Biotechnology；sc-713)的Western印跡分析，這種孵育并不導致IGF-I受體的明顯下調，盡管與EM164抗體在37℃長時間孵育2h可引起IGF-I受體25％的下調。因此，在這些短期試驗中，EM164抗體在4℃和37℃抑制IGF-I的結合和取代已結合的IGF-I均不能通過由于EM164抗體的結合引起受體下調來解釋。EM164抗體有效抑制IGF-I與IGF-I受體的結合和取代預結合的IGF-I的機制很可能是通過結合位點的共享或空間阻遏(stericocclusion)或變構效應所引起的結合競爭。
D.EM164抗體抑制IGF-I受體介導的信號傳導[127]用EM164抗體處理乳癌MCF-7細胞和骨肉瘤SaOS-2細胞幾乎完全抑制細胞內的IGF-I受體信號傳導，這表現為IGF-I受體自體磷酸化的抑制和其下游效應物如胰島素受體底物-1(IRS-1)，Akt和Erk1/2的磷酸化的抑制(圖4-6)。在圖4中，MCF-7細胞在12孔板的常規培養基中生長3天，然后用20μg/mL的EM164抗體(或抗-B4對照抗體)在無血清培養基中處理3h，然后用50ng/mL的IGF-I在37℃刺激20min。然后細胞在冰冷的含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的緩沖液(50mM HEPES緩沖液，pH7.4，1％NP-40，1mM原釩酸鈉，100mM氟化鈉，10mM焦磷酸鈉，2.5mM EDTA，10μM亮肽素，5μM胃蛋白酶抑制劑，1mM PMSF，5mM苯甲脒和5μg/mL抑肽酶)中被裂解。ELISA板用抗IGF-I受體β鏈C-末端的單克隆抗體TC123進行預包被，與裂解物樣本在室溫下孵育5h以俘獲IGF-I受體。然后洗滌含有被俘獲的IGF-I受體的孔，并與生物素化的抗磷酸酪氨酸抗體(PY20；0.25μg/mL；BD TransductionLaboratories)孵育30min，然后洗滌，與鏈親和素-辣根過氧化物酶偶聯物(0.8μg/mL)孵育30min。洗滌孔，用ABTS/H2O2底物檢測。抗B4對照抗體的應用沒有顯示出對IGF-I刺激的IGF-I受體自體磷酸化作用的抑制。與之相比，在用EM164抗體處理后可獲得對IGF-I刺激的IGF-I受體自體磷酸化作用的完全抑制(圖4)。為了證明對胰島素底物-1(IRS-1)的磷酸化作用的抑制，在應用的ELISA中，使用固定化的抗-IRS-1抗體從裂解物中俘獲IRS-1，然后測定可與磷酸化的IRS-1結合的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3-激酶)的相關p85亞基(Jackson，J.G.等，1998，J.Biol.Chem.，273，9994-10003)。在圖5中，MCF-7細胞用5μg/mL的抗體(EM164或IR3)在無血清培養基中處理2h，然后用50ng/mL的IGF-I在37℃刺激10min。抗IRS-1抗體(兔多克隆抗體Upstate Biotechnology)通過與ELISA板上包被的羊抗兔-IgG抗體孵育而被間接俘獲，然后通過4℃孵育過夜，用抗IRS-1抗體從細胞裂解物樣品中俘獲IRS-1。然后孔與鼠單克隆抗-p85-PI-3-激酶抗體(Upstate Biotechnology)孵育4h，然后用羊抗鼠-IgG-抗體-HRP偶聯物處理30min。然后洗滌孔，使用ABTS/H2O2底物檢測(圖5)。如在圖5中顯示，EM164抗體較IR3抗體更為有效地抑制IGF-I-刺激的IRS-1磷酸化作用，當在缺少IGF-I的情況下與細胞孵育時，EM164抗體對IRS-1磷酸化作用不顯示任何激動劑活性。在SaOS-2細胞(圖6)和MCF-7細胞中，其它下游效應物如Akt和Erk1/2的活化，也可以劑量依賴的方式被EM164抗體抑制，如采用裂解物和磷酸化特異性抗體(兔多克隆抗-磷酸化-Ser473Akt多克隆和抗-磷酸化-ERK1/2抗體；Cell Signaling Technology)的Western印跡所顯示。pan-ERK抗體證實了所有泳道中上樣的蛋白量相等(圖6)。用EM164抗體處理SaOS-2細胞并不抑制EGF-刺激的Erk1/2磷酸化，因此證實了EM164抗體對IGF-I受體信號傳導通路抑制作用的特異性。
E.EM164抗體抑制IGF-I-、IGF-II-和血清-刺激的人腫瘤細胞的生長和存活[131]在無血清條件下檢測了幾種人腫瘤細胞系，檢測其對IGF-I的生長和存活反應。這些細胞系在IGF-I，IGF-II或血清存在的情況下用EM164抗體處理，采在2-4天后用MTT分析檢測其生長和存活反應。大約1500個細胞被鋪板在96孔板上，在含有血清的常規培養基中，第二天用無血清的培養基(添加了鐵轉運蛋白和BSA的無血清RPMI培養基，或者無酚紅的培養基，如Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.，272，31163-31171所述)換液。在無血清培養基中生長1天后，細胞用大約75μL 10μg/mL的抗體孵育30min-3h，然后添加25μL的IGF-I(或IGF-II或血清)溶液，獲得終濃度為10ng/mL的IGF-I，或20ng/mL的IGF-II，或0.04-10％血清。在一些試驗中，在加入EM164抗體之前先用IGF-I刺激細胞15min，或一起加入IGF-I和EM164抗體。然后使細胞再生長2-3天。然后加入MTT溶液(3-(4，5)-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽；25μL 5mg/mL的PBS溶液)，細胞放回孵箱2-3h。然后去掉培養基，用100μL DMSO換液并混合，在545nm測量板的吸光度。幾種人腫瘤細胞系顯示在加入IGF-I或IGF-II或血清后的生長和存活反應明顯被EM164抗體抑制，不管抗體是在IGF-I之前被加入，或IGF-I在抗體之前被加入，還是IGF-I和抗體一起被加入(表1)。
表1.EM164抗體對IGF-I-刺激的腫瘤細胞生長和存活的抑制作用
a在含有5-10μg/mL EM164抗體的無血清培養基中，響應于10ng/mL IGF-I作用3至4天的細胞的生長/存活的MTT分析。
b基于與對照(有血清但無抗體)的比較，通過MTT分析或集落形成分析，在5-10μg/mL EM164抗體存在的情況下1.25-10％血清中細胞生長所受到的抑制；基于對照(無血清但有抗體，以及有血清但無抗體)，定量測定MCF-7，NCI-H838和SK-N-SH細胞所受到的抑制的程度，以解釋細胞的自分泌/旁分泌IGF刺激作用。
ND表示由于染色的難度而無數據或數據較小。EM164抗體強烈地抑制IGF-I或血清刺激的乳癌MCF-7細胞的生長和存活(圖7和8)。在一個獨立的實驗中，EM164抗體強烈地抑制IGF-II刺激的MCF-7細胞生長和存活。以前關于應用市售抗體如IR3抗體的報道顯示僅可微弱地抑制血清刺激的MCF-7細胞生長和存活，如在圖7中IR3和1H7抗體所證實的(Cullen，K.J.等，1990，Cancer Res.，50，48-53)。與之相比，EM164抗體是血清或IGF刺激的MCF-7細胞生長的有效抑制劑。如在圖8中顯示，EM164抗體在很寬的血清濃度范圍內(0.04-10％血清)都能同樣有效地抑制MCF-7細胞的生長和存活。通過細胞計數來測定EM164抗體對MCF-7細胞的生長抑制。因此，在12孔板中，大約7500個細胞被鋪板在含有10％FBS的RPMI培養基中，其中存在或者缺少10μg/mL的EM164抗體。生長5天后，未處理的對照樣品的細胞計數為20.5×104個細胞，與之相比，EM164抗體處理的樣品的細胞計數僅有1.7×104細胞。用EM164抗體進行的處理可在5天內抑制MCF-7細胞的生長大約12倍。EM164抗體的這種抑制作用明顯高于已報道的使用IR3抗體在6天的分析中對MCF-7細胞產生的2.5倍的抑制作用(Rohlik，Q.T.等，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，276-281)。與對照抗B4抗體相比，IGF-I和血清刺激的非小細胞肺癌系NCI-H838的生長和存活也可被EM164抗體強烈地抑制(圖9)。對于NCI-H838和MCF-7細胞，在無血清培養基中用EM164抗體處理所產生的信號較未處理的樣品小，推測其原因是EM164抗體也可抑制這些細胞的自分泌和旁分泌IGF-I和IGF-II刺激(圖7和9)。HT29結腸癌細胞的集落大小也在用EM164抗體處理后大大減少。因此，EM164抗體在所有已知的抗IGF-I受體抗體中是獨特的，它能有效地抑制腫瘤細胞如MCF-7細胞和NCI-H838細胞的血清刺激性生長超過80％。EM164抗體引起處于細胞周期的G0/G1期的細胞發生生長停滯，消除了IGF-I的促有絲分裂效應。為了進行細胞周期分析，在存在或不存在EM164(20μg/mL)的情況下用IGF-I(20ng/mL)處理MCF-7細胞1天，然后通過碘化丙啶染色和流式細胞儀進行分析。如在圖25中所示，在缺少EM164時對IGF-I刺激作出反應的細胞的周期進程(41％細胞處于S期，50％處于G0/G1期)在EM164處理的細胞(僅有9％處于S期，77％細胞處于G0/G1期)中被抑制。除了對細胞增殖的抑制作用以外，EM164抗體的處理可導致細胞的凋亡。為了測定細胞凋亡，在存在或缺少EM164的情況下，用IGF-I或血清孵育NCI-H838肺癌細胞1天，測定胱天蛋白酶(caspase)對細胞角蛋白CK18蛋白的切割(圖26)。在缺少EM164時，相對于無IGF-I的對照，添加IGF-I或血清產生了更低的胱天蛋白酶切割的CK18信號，這表明IGF-I和血清可防止胱天蛋白酶的活化。EM164的處理可抑制IGF-I和血清的抗凋亡效應，這可由在有EM164存在時所獲得的被切割的CK18水平較缺少EM164時要高來說明(圖26)。
F.EM164抗體與其他細胞毒性劑和細胞抑制劑協同抑制人腫瘤細胞的生長和存活[138]EM164抗體與紫杉醇的聯合施用較紫杉醇單獨施用對非小細胞肺癌Calu6細胞明顯更有抑制作用。同樣，EM164抗體與喜樹堿的聯合較喜樹堿單獨施用對結腸癌HT29細胞的生長和存活明顯更有抑制作用。因為并不期望單獨的EM164抗體像有機化學毒性藥物一樣對細胞有毒性，所以在臨床條件下，EM164抗體顯著的細胞生長抑制效應和化學毒性藥物的細胞毒性效應的協同在癌癥的聯合治療中是非常有效的。EM164抗體與抗EGF受體抗體(KS77)的聯合效應較單獨的EM164抗體或KS77抗體對數種腫瘤細胞系如HT-3細胞，RD細胞，MCF-7細胞和A431細胞的生長和存活具有更明顯的抑制作用。因此，將針對兩種生長因子受體如IGF-I受體和EGF受體的中和抗體聯合起來所產生的協同效應在臨床的癌癥治療中也是有用的。根據EM164抗體作為單一試劑在抑制不同人類癌癥細胞系中的效力，如表1所示，使用EM164抗體與其他抗-癌癥治療劑的聯合，進行了額外的效力研究。在這些對不同癌癥細胞系的研究中，比起或者單獨使用EM164或者單獨使用其他治療劑，EM164抗體和其他抗-腫瘤治療劑的聯合治療產生甚至更加大的抗-癌癥效力。因此，EM164抗體和其他抗-腫瘤治療劑的這些聯合應用在抑制癌癥細胞增殖和存活中高度有效。可以與EM164聯合用于改進抗癌癥效力的治療劑包括用于腫瘤學實踐的多種藥劑(參考Cancer，Principles & Practice of Oncology，DeVita，V.T.，Hellman，S.，Rosenberg，S.A.，第六版，Lippincott-Raven，Philadelphia，2001)，諸如多烯紫杉醇、紫杉酚、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(Herceptin)、卡培他賓、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來瞵酸鹽、鏈硝脲、妥昔(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷、伊馬替尼、阿糖胞苷、伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)、α干擾素-2b、美法侖、硼替佐米(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(Iressa)、埃洛尼替(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)、埃坡霉素，以及細胞毒性藥劑和針對細胞-表面受體的抗體形成的偶聯物。對于這些聯合治療，EMl64與一種或多種具有不同的作用機制的抗-癌癥藥劑聯合，諸如烷化劑、鉑試劑、激素治療、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、抗微管劑、分化劑(differentiation agent)、抗血管生成或抗血管化作用治療、放射治療、促黃體生成激素釋放激素(LHRH)或促性腺激素-釋放激素(GnRH)的激動劑和拮抗劑、抑制性抗體或針對細胞-表面受體的小分子抑制劑，和其他化學治療劑(參考Cancer，Principles & Practice of Oncology，DeVita，V.T.，Hellman，S.，Rosenberg，S.A.，第六版，Lippincott-Raven，Philadelphia，2001)。在一個實施例中，LHRH拮抗劑抗排卵肽(0.1至10微摩爾)和EM164抗體(0.1至10納摩爾)的聯合，比或者單獨使用EM164或者單獨使用抗排卵肽，更顯著地抑制MCF-7乳癌細胞的增殖。在與鉑試劑的聯合治療的實施例中，比起或者單獨使用EM164或者單獨使用順鉑的抑制，EM164抗體(10微克/ml)和順鉑(0.1-60微克/ml)的聯合治療，產生對MCF-7乳癌細胞的增殖和存活的更大的抑制。EM164抗體與其他治療劑的這些聯合應用能有效地抵抗若干癌癥，包括乳癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤。EM164抗體和治療劑或者可以同時給予或者可以按照順序給予，以進行癌癥治療。EM164抗體與細胞毒性藥物的偶聯物在將所述細胞毒藥物向過量表達IGF-I受體的腫瘤進行靶向輸送的過程中也是有價值的。EM164抗體與放射性標記或其它標記的偶聯物可用于過量表達IGF-I受體的腫瘤的治療和成像。
G.EM164作為單一試劑或與抗癌試劑聯合進行處理時對免疫缺陷小鼠中人癌癥異種移植物的影響[144]人非小細胞肺癌Calu-6異種移植物是通過在免疫缺陷小鼠中皮下注射1×107個Calu-6細胞而建立的。如在圖10中顯示，含有已建立的100m3 Calu-6異種移植物的這些小鼠單獨用EM164抗體處理(靜脈注射6次，每次0.8mg/小鼠，每周兩次)或單獨用紫杉醇處理(腹腔注射5次紫杉醇；每兩天1次；每次15mg/kg)，或聯合紫杉醇和EM164抗體進行處理，或單獨給予PBS(200μL/小鼠，6次注射，每周2次，靜脈注射)，每個處理組使用5只小鼠。與PBS對照相比，用EM164抗體處理可明顯延緩腫瘤的生長。基于小鼠體重的測量值，沒有觀察到EM164抗體的毒性。盡管單獨的紫杉醇的有效性持續到14天，但到那時腫瘤才開始消退。然而，與單獨用紫杉醇進行處理的組相比，在紫杉醇和EM164抗體聯合處理的組中，腫瘤的生長明顯被延緩。人胰腺癌異種移植物是通過向5周齡的雌性SCID/ICR小鼠(Taconic)皮下注射含有107個BxPC-3細胞的PBS而建立的(0天)。然后帶有80mm3的已建立腫瘤的小鼠用EM164單獨處理(13次注射，每次0.8mg/小鼠，尾側靜脈注射，在第12、16、19、23、26、29、36、43、50、54、58、61和64天進行注射)，用吉西他濱(吉西他濱)單獨處理(腹腔注射兩次，每次150mg/kg/小鼠，在第12和19天)，用吉西他濱和EM164按照上述方案進行聯合處理，單獨給予PBS，和單獨給予對照抗體(使用與EM164相同的方案)，這5個處理組中的每一個都使用5只小鼠。如在圖27中所示，EM164的單獨處理或與吉西他濱的聯合處理都在一開始便導致腫瘤異種移植物的總體消退，在EM164處理組的5只動物中有4只，在聯合處理組的所有5只動物中出現了這樣的消退。僅在EM164組中的第43天和聯合處理組中的第68天見到一只以上的動物發生可測量到的腫瘤再生，這導致了在第74天得到的平均腫瘤體積與對照處理組相比要明顯減小(P值分別為0.029和0.002；雙側T-檢驗；圖27)。在另一項研究中，EM164抗體的處理(單獨使用或與抗EGF受體抗體聯合使用；腹腔注射)可抑制小鼠中已建立的BxPC-3異種移植物的生長。鼠EM164和人源化的EM164抗體對于小鼠中建立的BxPC-3異種移植物顯示出等同的抑制作用，因此證明了人源化的EM164的效價在體內與鼠EM164的效價相同。在不同的EM164抗體給藥方式比較中，腹膜內和靜脈內注射EM164抗體對于小鼠中建立的BxPC-3異種移植物的生長顯示出等同的抑制作用。在另一異種移植物研究中，用EM164抗體治療顯示出能顯著延緩小鼠中建立的A-673人橫紋肌肉瘤/尤文肉瘤異種移植物的生長。
H.EM164抗體的輕鏈和重鏈的克隆和測序[147]從EM164雜交瘤細胞中純化出總RNA。使用4-5μg總RNA和寡聚dT或隨機六聚物引物進行逆轉錄酶反應。采用Co等人所述的RACE方法(J.Immunol.，148，1149-1154(1992))和Wang等人所述的簡并引物(J.Immunol.Methods，233，167-177(2000))進行PCR反應。RACE PCR方法需要一個中間步驟來將多聚G尾添加至第一條cDNA鏈的3’末端上。用Qianeasy(Qiagen)柱純化RT反應，用50μl的1XNEB緩沖液4洗脫。用0.25mM CoCl2，1mM dGTP和5units的末端轉移酶(NEB)在1X NEB緩沖液4中對所述洗脫液進行dG加尾反應。混合物在37℃孵育30分鐘，然后將1/5的反應物(10μl)直接加入到PCR反應中作為模板DNA。除了引物和模板的差異以外，RACE和簡并PCR反應是完全相同的。對于RACE PCR是直接使用末端轉移酶反應物作為模板，而簡并PCR反應是直接使用RT反應混合物。在RACE和簡并PCR反應中，使用相同的3′輕鏈引物HindKL-tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagttggtgc(SEQ ID NO14)和3′重鏈引物Bgl2IgG1-ggaagatctatagacagatgggggtgtcgttttggc(SEQ ID NO15)。在RACE PCR中，1個多聚C 5′引物同時用于重鏈和輕鏈EcoPolyC-TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC(SEQ ID NO16)，而簡并5′末端PCR引物為對于輕鏈，為Sac1MK-GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQID NO17)；對于重鏈，為下列引物的等量混合物EcoR1MH1-CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQID NO18)和EcoR1MH2-CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO19)。在上述的引物序列中，混合堿基如下定義H＝A+T+C，S＝g+C，Y＝C+T，K＝G+T，M＝A+C，R＝A+g，W＝A+T，V＝A+C+G。使用下述程序進行PCR反應1)94℃，3分鐘，2)94℃，15秒，3)45℃，1分鐘，4)72℃，2分鐘，5)返回步驟#2循環29次，6)在72℃最后延伸10分鐘，PCR反應完成。采用限制性酶，將通過PCR引物產生的PCR產物克隆進pBluescript II SK+(Stratagene)。通過常規的方法，對若干獨立的輕鏈和重鏈克隆測序以鑒定和避免聚合酶產生的可能的序列錯誤(圖12和13)。使用Chothia典型分類定義(Chothia canonical classification definitions)，鑒定出三個輕鏈和重鏈CDRs(圖12-14)。搜索NCBI IgBlast數據庫，表明抗-IGF-I受體抗體的輕鏈可變區可能衍生自小鼠IgVk Crl胚系基因，而重鏈可變區可能衍生自IgVhJ558.c胚系基因(圖15)。對鼠EM164抗體蛋白進行測序，以證實圖12和13中顯示的序列。純化的EM164抗體的重鏈和輕鏈條帶從凝膠(SDS-PAGE，還原條件)轉移至PVDF膜上，從該PVDF膜上切下，通過蛋白測序進行分析。所述輕鏈的N-末端序列通過Edman測序測定為DVLMTQTPLS(SEQ ID NO20)，這與從EM164雜交瘤獲得的克隆輕鏈基因的N-端序列相匹配。發現重鏈的N-末端對于Edman蛋白測序來說是封閉的。質量為1129.5(M+H+，單同位素)的重鏈胰蛋白酶消化肽片段通過源后衰減(post-source decay)(PSD)分成片段，其序列測定為GRPDYYGSSK(SEQ ID NO21)。質量為2664.2(M+H+，單同位素)的另一個重鏈胰蛋白酶消化肽片段也通過源后衰減(PSD)分成片段，其序列鑒定為SSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFAR(SEQ ID NO22)。這兩個序列都與從EM164雜交瘤獲得的克隆重鏈基因的CDR3和框架3(FR3)的序列完全匹配。
I.EM164抗體的重組表達[159]輕鏈和重鏈成對序列被克隆進單一的哺乳動物表達載體中(圖16)。人可變序列的PCR引物產生了一些限制性位點，它們可使人信號序列在pBluescriptII克隆載體中被連接，所述可變序列被克隆進哺乳動物表達質粒中，輕鏈或重鏈的克隆分別使用了EcoRI和BsiWI或HindIII和ApaI位點(圖16)。輕鏈可變序列符合讀框地(in-frame)被克隆到人IgK恒定區上，重鏈可變序列被克隆到人Igγ恒定區序列中。在最終的表達質粒中，人CMV啟動子可驅動輕鏈和重鏈cDNA序列的表達。根據本領域中熟知的方法進行重組鼠EM164抗體的表達和純化。
實施例2人源化版本的EM164抗體[160]大體上根據美國專利5,639,641和如下公開的原理和方法進行EM164抗體的表面重構，以提供適合作為治療或診斷試劑的人源化抗體形式。
A.表面預測[161]為了預測鼠抗IGF-I受體抗體(EM164)可變區的表面殘基，應用了一組具有溶解結構的抗體的可變區殘基的溶劑可及性(solventaccessibility)。用MC軟件包來計算一組127個獨特抗體結構文件(表2)的氨基酸的溶劑可溶性(Pedersen等人，1994，J.Mol.Biol.，235，959-973)。通過序列比對，從這127個結構中確定出10條最相似的輕鏈和重鏈氨基酸序列。計算每個可變區殘基的平均溶劑可及性(averagesolvent accesibility)，具有超過30％的平均可及性的位點被認為是表面殘基。通過僅對具有兩個相同的側翼殘基的那些結構計算各個殘基的可及性，進一步檢驗平均可及性在25％和35％之間的位點。
表2 來自Brookhaven數據庫的用來預測抗IGF-I受體抗體(EM164)的表面的127個抗體結構
B.分子建模[162]鼠EM164的分子模型采用Oxford分子軟件包AbM來產生。抗體構架(framework)的建立是來自具有最相似的氨基酸序列的抗體的結構文件，對于輕鏈，文件是2jel，對于重鏈則是1nqb。通過搜索含有非冗余溶解結構(non-redundant solved structures)的C-α結構數據庫可建立非正式的CDR(non-canonical CDRs)。CDR的5范圍內的殘基被確定。
C.人Ab選擇將鼠EM164的表面位置與Kabat數據庫(Johnson，G.和Wu，T.T.(2001)Nucleic Acids Research，29205-206)中人抗體序列的相應位置進行比較。應用抗體數據庫管理軟件SR(Searle 1998)從天然的重鏈和輕鏈人抗體對中提取和比對抗體表面殘基。特別考慮到進入CDR的5范圍內的位點，選擇了具有最相同的表面殘基的人抗體表面，以替換鼠抗IGF-I受體抗體的表面殘基。
D.PCR誘變[164]在鼠EM164 cDNA克隆(見上)上進行PCR誘變以構建表面重構的人EM164(在此標為huEM164)。引物組被設計，以產生huEM164的所有受測形式所需的8個氨基酸變化，額外的引物被設計，以選擇性地產生兩種5殘基的變化(表3)。PCR反應按下面的程序來執行1)94℃1分鐘，2)94℃15秒，3)55℃1分鐘，4)72℃1分鐘，5)返回#2步驟，循環29次，6)最后在72℃進行最后的延伸步驟4分鐘，完成反應。PCR產物用其相應的限制性酶消化，如上所述地克隆進pBluescript克隆載體。克隆被測序以證實所需的氨基酸變化。
表3 用來構建4種人源化EM164抗體的PCR引物
E.可變區表面殘基[165]由Pedersen等人(J.Mol.Biol.，235，959-973，1994)和Roguska等人(Protein Eng.，9，895-904，1996)描述的抗體表面重構技術是從預測鼠抗體可變序列的表面殘基開始的。表面殘基被定義為其總表面積的至少30％可與水分子接觸(accessible to a water molecule)的氨基酸。在這127個抗體結構文件組中10個最同源的抗體被鑒定出(圖17和18)。將這些被比對的序列中的每個Kabat位置的溶劑可及性進行平均化，各個殘基的相對可及性的分布顯示在圖19中。輕鏈和重鏈均有26個殘基的平均相對可及性(relative accessibilities)至少為30％(圖19)因此這些殘基是EM164的預測的表面殘基。有數個殘基的平均可及性在25％和35％之間，這些殘基被進一步檢驗，這通過僅對所述殘基兩側帶有兩個完全相同的殘基的抗體進行平均化來實施(表4和5)。在進行這樣的附加分析后，上面最初鑒定出的表面殘基組仍然沒有改變。
表4 EM164抗體輕鏈和重鏈可變序列的表面殘基和平均可及性(ave.acc.)
表5
平均可及性在25％和35％之間的殘基被進一步分析，通過對在所述疑問殘基兩側有兩個完全相同的殘基的抗體子集進行平均來實施。這些臨界表面位置及其新的平均可及性值被給出。NA是指在這10個最相似的抗體中沒有相同側翼殘基的殘基。
F.用分子建模來測定哪個殘基落入CDR的5內[167]對上述用AbM軟件包產生的分子模型進行分析，以確定在CDR的5范圍內的EM164表面殘基。為了重構鼠EM164抗體，在CDR之外的所有表面殘基都應該變為在人類中的對應物(counterparts)，但在CDR的5范圍之內的殘基要被特別謹慎地對待，因為它們對抗原特異性也可能有貢獻。因此，后者的這些殘基必須被鑒定出，并在整個人源化過程中都要對它們進行謹慎考慮。在表面重構中被使用的CDR定義結合了重鏈CDR2的AbM定義和剩余的5個CDRs的Kabat定義(圖14)。表6顯示了在EM164模型的輕鏈或重鏈序列內，處于任何CDR的殘基的5范圍內的殘基。
表6在CDR的5內的EM164抗體框架表面殘基CDR的5內的EM164表面殘基
G.最同源的人表面的鑒定[168]用于重構EM164的候選人抗體表面在Kabat抗體序列數據庫中用SR軟件鑒定出來，該軟件僅基于抗體數據庫來搜索特定的殘基位點。為了保留天然的配對，輕鏈和重鏈的表面殘基一起進行比較。來自Kabat數據庫的最同源的人表面按照序列同一性的等級次序進行排列。最頂端的5個表面在表7中給出。然后比較這些表面以鑒定出它們中的哪一個在CDR的5之內需要的變化最小。白血病B細胞抗體，CLL 1.69，要求的表面殘基變化數目最小(總共10個)，而在這些殘基中僅有2個位于CDR的5內。EM164的全長可變區序列也可與Kabat人抗體數據庫進行比對，CLL 1.69再次被鑒定為最相似的人可變區序列。共同地，這些序列比較將人白血病B細胞抗體CLL 1.69鑒定為EM164的人表面的優選選擇。
表7從Kabat數據庫中提取出的最同源的5個人類序列
通過SR產生比對(Pedersen 1993)。位于CDR 5內的EM164表面殘基被下劃線標記。
H.構建人源化EM164基因[170]使用如上所述的PCR誘變技術對EM164的10個表面殘基(表7)進行變化。因為CLL 1.69的表面殘基中的8個不在CDR的5之內，因此這些殘基在所有形式的人源化EM164中均從鼠源性轉變為人源性(表8和9)。在CDR的5內的兩個輕鏈表面殘基(Kabat位點3和45)被改變為人源性或保留為鼠源性。這些選擇共同產生出4種構建的EM164人源化形式(圖22和23)。在這4種人源化形式中，1.0型(1.0 version)具有所有的10個人源性表面殘基。就CDR附近的改變而言，最保守的形式是1.1型，它保留了在CDR的5之內的所有鼠源性表面殘基。所有4種人源化EM164抗體基因都被克隆進抗體表達質粒中(圖16)以便用于暫時的和穩定的轉染。
表8制備人源化EM164抗體1.0-1.3型時的殘基變化
I.比較人源化EM164抗體與鼠源性EM164抗體對全長IGF-I受體和截短的IGF-I受體α鏈結合的親和性[172]人源化EM164抗體1.0-1.3的親和性與鼠源性EM164抗體的親和性是通過結合競爭分析(binding competition assays)來比較的，其中使用了生物素化全長人IGF-I受體或myc-表位標記的截短的IGF-I受體α鏈，如上所述。通過在人胚胎腎293T細胞中暫時轉染合適的表達載體來獲得人源化EM164抗體樣本，抗體濃度通過ELISA利用純化的人源化抗體標準品進行測定。為了進行ELISA結合競爭測定，將人源化抗體樣本和多種濃度的鼠EM164抗體的混合物與間接俘獲的生物素化全長IGF-I受體或myc-表位標記的截短的IGF-I受體α鏈一起孵育。平衡后，使用羊抗人Fab’2-抗體-辣根過氧化物酶偶聯物檢測結合的人源化抗體。就([結合的鼠Ab]/[結合的人源化Ab])對([鼠Ab]/[人源化Ab])進行作圖，它理論上產生一條直線，斜率＝(Kd人源化Ab/Kd鼠 Ab)，由此可以確定人源化抗體和鼠抗體的相對親和性。競爭分析的一個實例在圖11中顯示。Immulon-2HB ELISA板按每孔100μL 5μg/mL的鏈親和素在室溫用碳酸鹽緩沖液包被7h。鏈親和素包被的孔用200μL封閉緩沖液(10mg/mL BSA，在TBS-T緩沖液中)封閉1h，用TBS-T緩沖液清洗，與生物素化IGF-I受體(每孔5ng)4℃孵育過夜。然后含有間接俘獲的生物素化IGF-I受體的孔被洗滌，與人源化EM164抗體(15.5ng)和鼠抗體(0ng，或16.35ng，或32.7ng，或65.4ng，或163.5ng)的混合物在100μL的封閉緩沖液中室溫孵育2h，然后在4℃孵育過夜。然后用TBS-T緩沖液清洗各孔，并與羊抗人-Fab’2-抗體-辣根過氧化物酶偶聯物(100μL；1μg/mL，在封閉緩沖液中)孵育1h，然后多次洗滌，使用ABTS/H2O2底物在405nm處檢測。([結合的鼠Ab]/[結合的人源化Ab])對([鼠Ab]/[人源化Ab])的曲線產生一條直線(r2＝0.996)，斜率(＝Kd人源化Ab/Kd鼠Ab)為0.52。因此人源化抗體1.0型較鼠EM164抗體與IGF-I受體的結合更緊密。對于人源化EM164抗體1.0，1.1，1.2和1.3型與鼠EM164抗體對全長IGF-I受體或截短的IGF-I受體α鏈的結合競爭，可獲得類似的梯度值，范圍為大約0.5至0.8，這表明所有的EM164抗體人源化形式都具有相似的親和性，它們都高于作為母本的鼠EM164抗體的親和性。在重鏈中帶有92F→C突變的EM164抗體的嵌合形式在與鼠EM164抗體的一個類似的結合競爭中顯示出大約為3的斜率，表明EM164的92F→C突變體結合IGF-I受體的親和性較鼠EM164抗體低3倍。人源化EM1641.0型抗體顯示出對IGF-I刺激的MCF-7細胞生長和存活的抑制作用，這與鼠EM164抗體相似(圖24)。人源化EM164 1.0型抗體對血清刺激的MCF-7細胞生長和存活的抑制作用與鼠EM164抗體的抑制作用相似。
表9
將Kabat編號系統用于不同形式的EM164 Ab的輕鏈和重鏈可變區多肽。根據在多肽鏈中的位置，將氨基酸殘基分組為構架(FR)和互補性決定區(CDR)。取自Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，1991，NTH Publication No.91-3242J.以在此所述的鼠源性和人源化抗體序列作為開始來提供改良的抗IGF-I受體抗體的過程[175]抗IGF-I受體抗體EM164及其人源化變體的氨基酸和核酸序列被用來開發其他的具有改良特性的抗體，它們也在本發明的范圍內。所述改良的特性包括與IGF-I受體的親和性增加。基于初級抗體(primary antibody)序列的知識，幾個研究調查了在抗體序列的不同位點導入一個或多個氨基酸變化對其特性如結合作用和表達水平的影響(Yang，W.P.等，1995，J.Mol Biol，254，392-403；Rader，C.等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，8910-8915；Vaughan，T.J.等，1998，NatureBiotechnology，16，535-539)。在這些研究中，初級抗體的變體已經通過在CDR1，CDR2，CDR3或構架區中改變重鏈和輕鏈基因的序列而產生，采用的方法如寡核苷酸介導的位點定向誘變，盒式誘變，易錯PCR，DNA重排，或利用大腸桿菌的增變株(Vaughan，T. J.等，1998，Nature Biotechnology，16，535-539；Adey，N.B.等，1996，16章，277-291頁，在″Phage Display ofPeptides and Proteins″，Kay，B.K.等人主編，Academic Press)。通過應用標準的篩選技術，改變初級抗體的序列的這些方法已經獲得了親和性增加的次級抗體(secondary antibodies)(Gram，H.等，1992，Proc.Nad.Acad.Sci.USA，89，3576-3580；Boder，E.T.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，10701-10705；Davies，J.和Riechmann，L.，1996，Immunotechnolgy，2，169-179；Thompson，J.等，1996，J.Mol.BioL，256，77-88；Short，M.K.等，2002，J.BioL Chem.，277，16365-16370；Furukawa，K.等，2001，J.Biol.Chem.，276，27622-27628)。通過改變抗體的一個或多個氨基酸殘基的一種相似的定向策略，在本發明中所述的抗體序列可以被用來開發具有改良功能的抗IGF-I受體抗體，如具有合適基團的抗體，所述基團例如在方便進行共價修飾的連接點處的游離氨基基團或硫醇基團，這可以在例如治療試劑的連接中被應用。
K.鼠的，嵌合的和其它的抗IGF-I受體抗體的可供選擇的表達系統[178]也可利用那些與用來表達人源化抗體的表達質粒(上述)相類似的哺乳動物表達質粒來表達鼠抗IGF-I受體抗體。具有鼠恒定區，包括輕鏈κ和重鏈γ-1序列的表達質粒是已知的(McLean等，2000，MolImmunol.，37，837-845)。這些質粒被設計用來接受任何抗體的可變區，如鼠抗-IGF-I受體抗體，這通過簡單的限制性消化和克隆來實施。為了建立與表達質粒相容的限制性，通常需要對抗IGF-I受體抗體進行額外的PCR方法。表達完整鼠抗IGF-I受體抗體的一種可選擇的方法是取代嵌合的抗IGF-I受體抗體表達質粒中的人恒定區。利用可變區的序列盒以及輕鏈和重鏈恒定區的序列盒來構建嵌合表達質粒(圖16)。正如抗體可變區序列可通過限制性消化被克隆進這種表達質粒中一樣，單獨的限制性消化被用于任何恒定區序列的克隆。κ輕鏈和γ-1重鏈cDNA被克隆，所述克隆例如源自鼠雜交瘤RNA，如所述的用于克隆抗IGF-I抗體可變區的RNA。同樣，合適的引物可以利用Kabat數據庫中獲得的序列進行設計(見表10)。例如，應用RT-PCR來克隆恒定區序列，并創造出將這些片段克隆進嵌合抗IGF-I受體抗體表達質粒中所需的限制性位點。然后這種質粒被用于在標準的哺乳動物表達系統如CHO細胞系中表達完整的鼠抗-IGF-I受體抗體。
表10被設計用來分別克隆鼠γ-1恒定區和鼠κ恒定區的引物
引物根據Kabat數據庫中獲得的序列進行設計(Johnson，G和Wu，T.T.(2001)Nucleic Acids Research，29205-206)保藏聲明[180]根據布達佩斯條約的條款，能產生鼠EM164抗體的雜交瘤于2002年6月14日保藏于美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection)，PO Box 1549，Manassas，VA 20108，保藏登記號(Accession Number)為PTA-4457。在本公開中引用到了某些專利和已印制的出版物，其教導的內容在此分別以其整體引入作為參考。盡管本發明已經參照其具體的實施方案作了詳細描述，但對于本領域的專業技術人員，明顯的是，對其所作的各種變化和修飾不背離其精神和范圍。
序列表<110>伊繆諾金公司(Immunogen，Inc.)<120>抗IGF-I受體抗體<130>F190322<140>10/729,441<141>2003-12-08<150>10/170,390<151>2002-06-14<160>96<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體重鏈互補決定區<400>1Ser Tyr Trp Met His1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體重鏈互補決定區<400>2Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Arg<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體重鏈互補決定區<400>3Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體輕鏈互補決定區<400>4Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu1 5 10 15
<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體輕鏈互補決定區<400>5Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體輕鏈互補決定區<400>6Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr1 5<210>7<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗體重鏈<400>7Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe85 90 95Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>8<211>113<212>PRT<213>人工序列
<223>抗體輕鏈<400>8Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>9<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈可變區<400>9Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110
Arg<210>10<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈可變區<400>10Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>11<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈可變區<400>11Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>12<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化輕鏈可變區<400>12Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105110Arg<210>13<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化重鏈可變區<400>13Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala15 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe85 90 95Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>14<21L>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并3’輕鏈PCR引物-HindKL<400>14tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc46<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并3’重鏈PCR引物-Bgl2IgG1<400>15ggaagatcta tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多聚C 5’PCR引物-EcoPolyC<400>16tatatctaga attccccccc cccccccccc 30<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并5’輕鏈PCR引物-Sac1MK<400>17gggagctcga yattgtgmts acmcarwctm ca 32<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并5’重鏈PCR引物-EcoR1MH1
<220>
<221>misc feature<222>(18)..(18)<223>″n″可以是任何核酸<400>18cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc 32<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>簡并5’重鏈PCR引物-EcoR1MH2<220>
<221>misc feature<222>(18)..(18)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>19cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35<210>20<211>10<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>20Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser1 5 10<210>21<211>10<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>21Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys1 5 10<210>22<211>24<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>22Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp1 5 10 15Ser Ala Val Tyr Tyr Phe Ala Arg20<210>23<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>23caggtgtaca ctcccaggtc caactggtgc agtctggggc tgaagtggtg aagcctg57
<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>24caatcagaag ttccagggga aggccacac 29<210>25<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>25ccttcccctg gaacttctga ttgtagttag tacg34<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>26caggtgtaca ctccgatgtt gtgatgaccc aaactcc 37<210>27<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>27caggtgtaca ctccgatgtt ttgatgaccc aaactcc 37<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>28gactagatct gcaagagatg gaggctggat ctccaagac 39<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>29ttgcagatct agtcagagca tagtacatag taatg 35<210>30<211>48<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>30gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccaaggctcc tgatctac 48<210>31<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>31gtggcagtgg agcagggaca gatttcac28<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>32gaaatctgtc cctgctccac tgccactg28<210>33<211>19<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>33Asp Leu Thr Leu Leu Gln Pro Gly Gln Lys Gly Asp Ser Arg Glu Lys1 5 10 15Lys Arg Ala<210>34<211>18<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>34Asp Val Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Arg Gly Asp Ala Arg Glu Lys1 5 10 15Lys Arg<210>35<211>19<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>35Asp Gln Ser Leu Ile Pro Pro Gly Gln Lys Gly Asp Ser Arg Asp Lys1 5 10 15Lys Arg Ala
<210>36<211>18<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>36Asp Met Ser Ser Val Arg Pro Gly Gln Lys Gly Ser Ser Ser Asp Lys15 10 15Lys Arg<210>37<211>18<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>37Glu Val Ser Gly Pro Arg Pro Gly Gln Arg Gly Asp Ser Arg Glu Lys1 5 10 15Lys Arg<210>38<211>18<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>38Glu Val Ser Gly Pro Arg Pro Gly Gln Arg Gly Asp Ser Arg Glu Lys1 5 10 15Lys Arg<210>39<211>25<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>39Gln Gln Gln Ala Leu Lys Pro Gly Lys Lys Thr Pro Gly Gln Glu Lys1 5 10 15Lys Arg Lys Ser Ser Ser Glu Ala Ser20 25<210>40<211>25<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>40Gln Gln Val Ala Val Lys Pro Gly Lys Lys Thr Pro Gly Gln Gln Lys1 5 10 15Gln Gly Lys Ser Ser Ser Glu Gln Ser20 25
<210>41<211>25<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>41Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Gly Lys Lys Thr Pro Gly Lys Asp Asp1 5 10 15Lys Gly Thr Ser Asn Asn Glu Gln Ser20 25<210>42<211>25<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>42Gln Gln Val Ala Val Lys Pro Gly Lys Lys Thr Pro Gly Gln Gln Lys1 5 10 15Lys Gly Lys Ser Ser Ser Glu Gln Ser20 25<210>43<211>24<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>43Gln Val Ala Val Lys Pro Gly Lys Lys Thr Pro Gly Gln Gln Lys Gln1 5 10 15Gly Lys Ser Ser Ser Glu Gln Ser20<210>44<211>24<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>44Gln Val Ala Val Lys Pro Gly Lys Lys Thr Pro Gly Gln Gln Lys Gln1 5 10 15Gly Glu Ser Ser Ser Glu Gln Ser20<210>45<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>45ttttgagctc ttatttacca ggagagtggg agaggctctt 40<210>46<211>37<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>46ttttaagctt gccaaaacga cacccccatc tgtctat 37<210>47<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>47ttttggatcc taacactcat tcctgttgaa gc 32<210>48<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>48ttttgaattc gggctgatgc tgcaccaact g 31<210>49<211>396<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(396)<400>49atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Alal 5 10 15tcc agt agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc96Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile35 40 45gta cat agt aat gta aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca192Val His Ser Ash Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc agg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga att tat tac tgc336Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys100 105 110ttt caa ggt tca cat gtt cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg384Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125
gaa atc aaa cgg 396Glu Ile Lys Arg130<210>50<211>132<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>50Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile35 40 45Val His Ser Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg130<210>51<211>429<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(429)<400>51atg gga tgg agc tat atc atc ctc ttt ttg gta gca aca gct aca gaa48Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Glu1 5 10 15gtc cac tcc cag gtc caa ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg gtg aag96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgt aag gct tct ggc tac acc ttc144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45acc agc tac tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt192Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga gag att aat cct agc aac ggt cgt act aac tac aat240
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag agg aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc288Glu Lys Phe Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95aca gcc tac atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac ttt gca aga gga aga cca gat tac tac ggt agt agc aag tgg384Tyr Tyr Phe Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp115 120 125tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca429Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140<210>52<211>143<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>52Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Glu1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Phe Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp115 120 125Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140<210>53<211>10<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>53Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His1 5 10<210>54<211>10
<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>54Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn1 5 10<210>55<211>15<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>55Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10 15<210>56<211>100<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>56Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro100<210>57<211>98<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>57Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ash Glu Lys Phe50 55 60
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<223>合成抗體結構<400>62Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Phe Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>63<211>113<212>PRT<213>人工序列
<220>
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Arg<210>65<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成抗體結構<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(101)..(101)<223>″X″可以是任何氨基酸<400>69Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Xaa Ile Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Xaa Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>70<211>124<212>PRT
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<220>
<223>合成抗體結構<400>79Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Gly Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80MetGln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly His Ser Tyr Tyr Phe Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120<210>80<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成抗體結構<400>80Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser1 5 10 15Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Trp20 25 30Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly35 40 45Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr His Glu Arg Phe Lys50 55 60Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Leu85 90 95His Gly Asn Tyr Asp Phe Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr100 105 110Val Ser Ser
115<210>81<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成抗體結構<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(43)..(43)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(50)..(50)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(52)..(52)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(54)..(54)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(57)..(57)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(59)..(59)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(99)..(99)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(100)..(100)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(103)..(108)<223>″X″可以是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(116)..(116)<223>″X″可以是任何氨基酸<400>81Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Xaa His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Xaa Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Ser Gly Xaa Thr Xaa Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Val Tyr Cys85 90 95Ala Arg Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser115 120<210>82<211>113<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>82Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>83<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化的EM164抗體
<400>83Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>84<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化的EM164抗體<400>84Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg
<210>85<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化的EM164抗體<400>85Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>86<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化的EM164抗體<400>86Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ash Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>87<211>123<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>87Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe85 90 95Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120<210>88<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化的EM164抗體<400>88Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe85 90 95Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120<210>89<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化EM164抗體的可變區-輕鏈<220>
<221>CDS<222>(1)..(339)<400>89gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga48Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15gat cca gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ata gta cat agt96Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30aat gta aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct144Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca agg ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca192Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt gga gca ggg aca gat ttc aca ctc agg atc240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga att tat tac tgc ttt caa ggt288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95tca cat gtt cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aaa ctg gaa atc aaa336Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110cgt339Arg<210>90<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建物<400>90Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>91<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化EM164抗體的可變區-重鏈<220>
<221>CDS<222>(1)..(369)<400>91cag gtc caa ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg gtg aag cct ggg gct48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15tca gtg aag ctg tcc tgt aag get tct ggc tac acc ttc acc agc tac96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45gga gag att aat cct agc aac ggt cgt act aac tac aat cag aag ttc192Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60cag ggg aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac240Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac ttt288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe85 90 95gca aga gga aga cca gat tac tac ggt agt agc aag tgg tac ttc gat336Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp100 105 110gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc369Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120<210>92<211>123
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建物<400>92Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Phe85 90 95Ala Arg Gly Arg Pro Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Lys Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120<210>93<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化EM164 v1.1抗體的輕鏈可變區<220>
<221>CDS<222>(1)..(339)<400>93gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga48Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15gat cca gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ata gta cat agt96Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30aat gta aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca ggc cag tct144Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca192Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60gac agg ttc agt ggc agt gga gca ggg aca gat ttc aca ctc agg atc240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga att tat tac tgc ttt caa ggt288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95tca cat gtt cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aaa ctg gaa atc aaa336Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110cgt339Arg<210>94<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的構建物<400>94Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Val Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>95<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化EM164 v1.2抗體的輕鏈可變區<400>95gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tccagcctcc 60atctcttgca gatctagtca gagcatagta catagtaatg taaacaccta tttagaatgg 120tacctgcaga aaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggagcaggga cagatttcac actcaggatc 240agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300ccgacgttcg gtggaggcac caaactggaa atcaaacgt 339<210>96
<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人源化EM164 v1.3抗體的輕鏈可變區<400>96gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tccagcctcc60atctcttgca gatctagtca gagcatagta catagtaatg taaacaccta tttagaatgg120tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggagcaggga cagatttcac actcaggatc240agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct300ccgacgttcg gtggaggcac caaactggaa atcaaacgt 339
權利要求
1.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是抗體或其表位-結合片段，以及其中所述抗體或所述片段特異性地結合到胰島素-樣生長因子-I受體，所述第一治療劑選自(i)抗體，或其表位-結合片段，具有與鼠抗體EM164相同的氨基酸序列，所述鼠抗體EM164由小鼠雜交瘤EM164(ATCC登記號PTA-4457)產生，(ii)表面重構抗體，或其表位-結合片段，具有與鼠抗體EM164相同的結合特異性，(iii)人抗體或人源化的抗體，或其表位-結合片段，具有與鼠抗體EM164相同的結合特異性，(iv)抗體的功能等價物，或其表位-結合片段，具有與鼠抗體EM164相同的結合特異性，(v)鼠抗體EM164的變體，或其表位-結合片段，相比起鼠抗體EM164，具有至少一個核苷酸突變、刪除或插入，并有與鼠抗體EM164相同的結合特異性，和(vi)由鼠雜交瘤EM164(ATCC登記號PTA-4457)產生的鼠抗體EM164，或其表位-結合片段，和(b)第二治療劑。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述第二治療劑選自多烯紫杉醇、紫杉酚、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(Herceptin)、卡培他賓、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來瞵酸鹽、鏈硝脲、妥昔單抗(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷、伊馬替尼、阿糖胞苷、伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)、α干擾素-2b、美法侖、硼替佐米(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(Iressa)、埃洛尼替(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)和埃坡霉素。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述第二治療劑選自卡鉑、奧沙利鉑、順鉑、紫杉酚、多烯紫杉醇、吉西他濱和喜樹堿。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述第一治療劑以約1mg/平方米至約2000mg/平方米的劑量給予患者，其中所述第二治療劑以約10mg/平方米至約2000mg/平方米的劑量給予所述患者。
5.根據權利要求1所述的組合物，其中所述第一治療劑以約10mg/平方米至約1000mg/平方米的劑量給予患者，其中所述第二治療劑以約50mg/平方米至約1000mg/平方米的劑量給予所述患者。
6.一種藥物組合物，包括根據權利要求1所述的組合物，和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
7.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是包含至少一個互補性決定區的抗體或抗體片段，所述互補性決定區具有選自如下的氨基酸序列SYWMH(SEQ ID NO1)，EINPSNGRTNYNEKFKR(SEQ ID NO2)，GRPDYYGSSKWYFDV (SEQ ID NO3)，RSSQSIVHSNVNTYLE (SEQ ID NO4)，KVSNRFS (SEQ ID NO5)，和FQGSHVPPT(SEQ ID NO6)，和(b)第二治療劑。
8.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是包含至少一個重鏈可變區和至少一個輕鏈可變區的抗體或抗體片段，其中所述重鏈可變區包括三個連續的互補-決定區，所述互補-決定區分別具有SEQ ID NOS1-3描述的氨基酸序列SYWMH(SEQ ID NO1)，EINPSNGRTNYNEKFKR(SEQ ID NO2)，GRPDYYGSSKWYFDV (SEQ ID NO3)；以及其中所述輕鏈可變區包括三個連續的互補-決定區，所述互補-決定區分別具有SEQ ID NOS4-6描述的氨基酸序列RSSQSIVHSNVNTYLE(SEQ ID NO4)，KVSNRFS (SEQ ID NO5)，FQGSHVPPT (SEQ ID NO6)，和b)第二治療劑。
9.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是抗體或其片段，其中所述的抗體包含與SEQ ID NO7描述的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的重鏈可變區QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKRKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ IDNO7)和(b)第二治療劑。
10.權利要求9的組合物，其中所述重鏈可變區與SEQ ID NO7描述的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
11.權利要求9的組合物，其中所述重鏈可變區具有SEQ ID NO7描述的氨基酸序列。
12.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是抗體或其片段，其中所述抗體包括輕鏈可變區，該輕鏈可變區與SEQ ID NO8描述的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO8)，和(b)第二治療劑。
13.權利要求12的組合物，其中所述輕鏈可變區與SEQ ID NO8表示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
14.權利要求12的組合物，其中所述輕鏈可變區具有SEQ ID NO8表示的氨基酸序列。
15.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是抗體或其片段，其含有具有選自下列序列的輕鏈可變區DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO9)；DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO10)；DVLMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO11)；DVVMTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSIVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO12)和(b)第二治療劑。
16.一種組合物，包括(a)第一治療劑，其中所述第一治療劑是抗體或其片段，其含有具有SEQ ID NO13所示的序列的重鏈可變區QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYFARGRPDYYGSSKWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO13)，和(b)第二治療劑。
17.權利要求7-16中的任一項所述的組合物，其中所述第二治療劑選自多烯紫杉醇、紫杉酚、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(Herceptin)、卡培他賓、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來瞵酸鹽、鏈硝脲、妥昔(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷、伊馬替尼、阿糖胞苷、伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)、α干擾素-2b、美法侖、硼替佐米(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(Iressa)、埃洛尼替(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)和埃坡霉素。
18.權利要求7-16中的任一項所述的組合物，其中所述第二治療劑選自卡鉑、奧沙利鉑、順鉑、紫杉酚、多烯紫杉醇、吉西他濱和喜樹堿。
19.一種抑制癌細胞生長的方法，包括將所述細胞與權利要求1的組合物接觸。
20.一種治療患有癌癥的患者的方法，包括給予所述患者有效劑量的權利要求1的組合物。
21.一種治療患有癌癥的患者的方法，包括給予所述患者有效劑量的權利要求6的藥物組合物。
22.權利要求19-21中的任一項的治療方法，其中所述癌癥是選自乳癌、結腸癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、肺癌、滑膜肉瘤、胰腺癌、黑素瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤和橫紋肌肉瘤的癌癥。
23.一種試劑盒，包括(a)第一治療劑，所述第一治療劑是具有與由鼠雜交瘤EM164(ATCC登記號PTA-4457)產生的鼠抗體EM164相同的氨基酸序列的抗體，或其表位-結合片段，其中所述抗體或所述片段特異性地結合到胰島素-樣生長因子-I受體，(b)第二治療劑，和(c)使用說明書。
24.一種抑制癌癥細胞生長的方法，包括用下列制劑接觸所述細胞(a)第一治療劑，所述第一治療劑是具有與由鼠雜交瘤EM164(ATCC登記號PTA-4457)產生的鼠抗體EM164相同的氨基酸序列的抗體，或其表位-結合片段，其中所述抗體或所述片段特異性地結合到胰島素-樣生長因子-I受體，和(b)第二治療劑。
25.一種治療患有癌癥的患者的方法，包括給予所述患者有效劑量的(a)第一治療劑，所述第一治療劑是具有與由鼠雜交瘤EM164(ATCC登記號PTA-4457)產生的鼠抗體EM164相同的氨基酸序列的抗體，或其表位-結合片段，其中所述抗體或所述片段特異性地結合到胰島-樣生長因子-I受體，和(b)第二治療劑。
26.權利要求24的方法，其中所述細胞同時與所述第一治療劑和所述第二治療劑接觸。
27.權利要求24的方法，其中所述細胞依次與所述第一治療劑和所述第二治療劑接觸，并且用兩種次序中的任意一種次序。
28.權利要求25的方法，其中所述第一治療劑和所述第二治療劑同時給藥。
29.權利要求25的方法，其中所述第一治療劑和所述第二治療劑依次給藥，并且用兩種次序中的任意一種次序。
30.權利要求24或25所述的方法，其中所述第二治療劑選自多烯紫杉醇、紫杉酚、阿霉素、表阿霉素、環磷酰胺、曲妥珠(Herceptin)、卡培他賓、它莫西芬、托瑞米芬、來曲唑、阿納曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、地塞米松、抗排卵肽、貝伐單抗(Avastin)、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、依立替康、依托泊甙、拓樸替康、吉西他濱、長春瑞濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來瞵酸鹽、鏈硝脲、妥昔單抗(Rituxan)、柔紅霉素、白消安、苯丁酸氮芥、氟阿糖腺苷、伊馬替尼、阿糖胞苷、伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)、α干擾素-2b、美法侖、硼替佐米(Velcade)、六甲蜜胺、門冬酰胺酶、吉非替尼(Iressa)、埃洛尼替(Tarceva)、抗-EGF受體抗體(Cetuximab、Abx-EGF)和埃坡霉素。
31.權利要求24或25的方法，其中所述第二治療劑選自卡鉑、奧沙利鉑、順鉑、紫杉酚、多烯紫杉醇、吉西他濱和喜樹堿。
全文摘要
可特異結合并抑制胰島素樣生長因子－I受體的抗體、人源化抗體、表面重構抗體、抗體片段、衍生抗體和上述抗體與細胞毒性試劑形成的偶聯物，它們可拮抗IGF－I、IGF－II和血清對腫瘤細胞生長和存活的效應，并且它們實質上不存在激動劑活性。任選地與其他治療劑聯合，所述的抗體及其片段可以用于治療IGF－I受體表達水平升高的腫瘤，如乳癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、滑膜肉瘤、前列腺癌和胰腺癌，所述的衍生抗體可用于IGF－I受體表達水平升高的腫瘤的診斷和成像。
文檔編號C07H21/04GK1886424SQ200480034889
公開日2006年12月27日 申請日期2004年12月7日 優先權日2003年12月8日
發明者R·辛格, D·J·塔瓦雷斯, N·E·達地吉恩 申請人:伊繆諾金公司