用于沉淀肽的裝置和方法

專利名稱：用于沉淀肽的裝置和方法
用于沉淀肽的裝置和方法 本發明涉及用于沉淀肽和蛋白質的裝置及方法領域。
在分離肽和蛋白質的過程中(例如，從身體組織或從細菌細胞培養 物)，本領域已知多種肽或蛋白質沉淀方法。
尤其是在用于臨床應用的血漿蛋白領域中，存在工業分級分離方法
(所謂的Cohn方法，E丄Cohn等，J. Chem. Am. Soc. 68, 1946， 459以 及US 2,390,074，在此通過引用并入本文)，其包括許多的分批處理步驟， 包括如沉淀以及離心分離或過濾沉淀的蛋白的操作。通過更大且更均勻 的沉淀顆粒大小改善分離和產率。在本文中，還考慮到Chan等，Biotech. Bioeng. XXVIII (1986), 387-393, Chang， Bioeng. 31(1988), 841-846, Raphael等，Can. J. Chem. Eng. 73 (1005), 471-483以及US 4 067 863, 所有文獻均通過引用并入本文。
然而，由于這些性質一般會受到沉淀劑(乙醇EtOH或/和緩沖劑)過 飽和的損害，這是由于不充分的混合及過量的粒子壓力造成的，許多應 用已顯示常規的分批反應器不是最優的，在該反應器中，沉淀劑的混合、 沉淀、粒子的生長和熟化全都在一個攪拌罐中完成。不充分混合的另一 結果可能是額外的產率損失，這是由于過熱(溶解熱)以及有害的pH值引 起的。
因此，本發明的一個目的是提供用于沉淀肽和/或蛋白質的方法，其 允許具有較高產率的更受到控制的沉淀的許多應用。
此類方法公開于本發明的權利要求1中。因此，公開了用于沉淀肽 的方法，其包括以下步驟
a) 肽水溶液與沉淀助劑的第一混合步驟；以及
b) 用于沉淀該肽的沉淀步驟。
其中彼此空間分離地進行步驟a)和b)。術語"空間分離的"尤其是 指和/或包括步驟a)和b)在兩個不同的容器(其通過導管等彼此連接)中 進行；然而，術語"空間分離的"還特別地意味著和/或包括步驟a)和b) 在可以在一個容器(例如，流體反應器)的兩個分離部分進行。
術語"沉淀助劑，，尤其包括和/或是指能夠輔助或引起肽從水溶液中 沉淀出的任何化學物質或化學物質的任何混合物。才艮據本發明的優選的實施方案，該沉淀助劑選自有機溶劑(其包括乙醇)、鹽溶液、酸、pH 緩沖劑、酚、非離子聚合物、離子聚電解質或其混合物。
術語"肽"尤其還包括取代或未取代的肽和/或蛋白質，所述取代可以 是(但不限于)糖苷、核酸、烷基、芳基或其混合物，其中可以取代肽 骨架和/或側鏈基團。
通過應用這一方法，在4艮寬的應用范圍內，可以達到至少一個或更 多個以下優點
-減少濃度波動以及粒子中的壓力；
-系統地調節相對飽和的可能性并且避免過量過飽和；
-由于以上原因，在許多應用中，可以達到在一種溶液中可能包含 的不同肽的更好的分離；
-減少肽損壞
-減少處理時間
-更高的產率以及沉淀的肽的質量 -減少"按比例擴大"的問題
根據本發明的實施方案，步驟a)中宏觀混合時間2 1 ms且￡1000 ms,根據本發明的實施方案，步驟a)中宏觀混合時間^ 10 ms且SlOO ms。
根據本發明的實施方案，步驟a)中平均混合速度(在混合管內部的 平均速度)2 0.05m/s且S5m/s。這可能在許多應用中有助于保持步驟 a)中的時間盡可能小。根據本發明的實施方案，步驟a)中平均混合速度2 0.2 m/s且Sl.5m/s,根據本發明的實施方案，步驟a)中平均混合速度2 0.3 m/s且￡1 m/s。
根據本發明的實施方案，步驟a)中噴射混合器內部的壓降Ap 2 0.05 巴且S20巴。這已顯示在本發明的許多應用中更進一步改善步驟a)。根 據本發明的實施方案，步驟a)中Ap20.1巴且^2.5巴。根據本發明的實 施方案，步驟a)中Ap^0.2巴且S1巴。
根據本發明的實施方案，在具有至少兩個進口的噴射混合器中進行 步驟a),所述至少兩個進口分別用于肽溶液和沉淀助劑。
在這一點上，尤其優選dl(肽溶液進口的直徑)與D(混合室的寬度) 的比例^0.1:1且S0.4:1;更優選^0.2:1且^).3:1。
在這一點上，尤其優選d2(沉淀助劑進口的直徑)與D(混合室的寬度) 的比例^0.05:1且^0.3:1;更優選^0.08:1且^0.13:1。
5根據本發明的實施方案，在用至少一個產生臨界粒子壓力的轉子持
續攪拌的同時，進行步驟b)。根據本發明的實施方案，在用至少一個葉 片式攪拌器持續攪拌的同時，進行步驟b)。已顯示在本發明內的許多應 用中，這可能有助于改善步驟b)的沉淀。
術語"葉片式攪拌器"尤其是指或包括若干個與共同軸上可能提供 的垂直向沒有夾角的徑向葉片；如果使用此類葉片式攪拌器，尤其優選 葉片的數量2 3且^9,優選^4且S6。
根據本發明的實施方案，在連續和/或間斷攪拌或用^ 0.01W/m3且 ^50 W/mS的逐步改變的攪拌功率攪拌時，進行步驟b)。所述量度已顯示 在許多應用實踐中導致肽的良好沉淀表現，尤其導致更穩定的沉淀的更 大的平均大小。根據本發明的實施方案，在用2 0.1 W/m3且^20 W/mM覺 拌時進行步驟b),根據本發明的實施方案，在用2 1.5 W/m3且S5 W/m3 攪拌時進行步驟b)。
根據本發明的實施方案，在用沒有斜式葉片并因此主要產生徑向流 的攪拌器攪拌的同時進行步驟b)。
根據本發明的實施方案，該攪拌器設置為具有^0且￡0.15的偏心率 (extrentricity)。在本發明的上下文中，術語偏心率(excentricity)是 指和/或包括術語e/D,其中e是從該攪拌器的邊緣至進行步驟b)的容器 和/或區室壁的距離，且D是進行步驟b)的容器和/或區室的直徑。
所述量度已顯示在許多應用的實踐中也改善了沉淀，因為這樣可以 極大地提高該攪拌器的混合性能。
根據本發明的實施方案，該攪拌器設置為具有^0.1且^).05的偏心 率，根據本發明的實施方案，該攪拌器設置為具有^0.03且^).015的偏 心率。
根據本發明的實施方案，葉片直徑d與進行步驟b)的容器和/或區室 的直徑D的比值是d:D 20.4:1且^0.7:1。通過這樣估支，可以為本發明內 的許多應用保證具有降低的攪拌器顆粒壓力的持續改善的攪拌性能。
根據本發明的實施方案，葉片直徑d與進行步驟b)的容器和/或區室 的直徑D的比值是d:D 20.45:1且^).65:1，根據本發明的實施方案，d:D 20.5:1且^0.6:1。
根據本發明的實施方案，所述至少 一個葉片式攪拌器的葉片高與直 徑比值是h:d 20.15:1且Sl.3:1,其中h是高且d是直徑。在該葉片式攪拌器包含若干個葉片的情況下，尤其優選所有的葉片符合這一比值。根
據本發明的實施方案，葉片式攪拌器葉片的高寬比值h:d 20.25:1且
根據本發明的實施方案，進行步驟a)的容器和/或區室對進行步驟 b)的容器和/或區室的比值是^).01:l且S0.1:1。出人意料地顯示對于許多 應用，具有相對于沉淀容器相對小的混合室(即，進行步驟a)的容器)是 有利的，因為這樣在步驟a)期間沉淀助劑可以以更大過量存在。
根據本發明的實施方案，進行步驟a)的容器和/或區室對進行步驟 b)的容器和/或區室的比值是20.02:1且^0.08:1 。
根據本發明的實施方案，該方法在步驟a)和b)之間包括步驟al): al)進行笫一凝聚物形成和/或熱交換以除去步驟a)的混合熱。 這已顯示對于本發明內的許多應用是有利的，因為這樣可以避免蛋 白質變質或變性。
根據本發明的實施方案，該方法在步驟a)和b)之后包括步驟c): c)恒定地和/或間斷地從步驟b)中輸送出沉淀懸浮液的部分溶液， 以在步驟a)中共混合。
通過這樣做，在許多應用中，該沉淀步驟可以持續或類分批運行， 這可以有助于改善肽的沉淀。
根據本發明的實施方案，該方法在步驟al)和b)之間包括步驟a2) 和a3》
a2)混合其它的沉淀助劑和
a3)隨意任選地重復步驟al)和a2)。
本發明還涉及用于完成本發明的方法的裝置。
前述部件、以及所請求的部件和在所描述的實施方案中根據本發明 應用的部件在大小、形狀、材料選擇和技術理念方面沒有任何特殊的例 外，因此可以沒有限制地應用在相關領域已知的選擇標準。
在下面的權利要求和以下以示范例的形式顯示進行本發明的方法 的裝置的若干優選實施方案的各個附圖的描述中公開了本發明目的的 其它的詳細描述、特征和優點。


圖1顯示了用于實施根據本發明的第一個實施方案的本發明方法的 裝置的示意圖。
7圖2顯示了顯示對于再循環模式("B")和分批沉淀模式("A")而言的蛋白質濃度對沉淀助劑量的示意圖解。
圖3顯示了用于實施根據本發明的第三個實施方案的本發明步驟a)的混合室的示意橫斷面視圖；以及
圖4顯示了用于實施根據本發明的第四個實施方案的本發明方法的裝置的示意圖。
圖5顯示了用于實施根據本發明的第五個實施方案的本發明方法的裝置的示意圖。
圖6顯示了用于實施根據本發明的第六個實施方案的本發明方法的裝置的示意圖。
圖7顯示了用于實施根據本發明的第七個實施方案的本發明方法的裝置的示意圖。
圖8顯示了用于實施根據本發明的第八個實施方案的本發明方法的裝置的示意圖。
圖1顯示了用于實施根據本發明的第一個實施方案的本發明方法的裝置l的示意圖。該裝置包含第一容器IO,在這里提供沉淀助劑，該容器通過第一泵15與噴射混合器30連接，在這里進行該方法的步驟a)。
第二容器20,在這里提供待沉淀的肽(例如，與其它體液諸如糖，核酸等一起在水溶液中)，其也通過第二泵25與噴射混合器30連接。
在噴射混合器30中，進行根據本發明方法的步驟a)，優選如之前描述的那樣進行混合步驟。混合步驟之后，通過熱交換器40除去至少一些熱量，并且然后將該混合物輸送至沉淀容器50。
應當注意，在本文中的圖l是示意圖，并且在實際應用中情況非常可能有些不同。
根據本發明的實施方案，尤其優選輸送該混合物至容器的導管以具有^2。且S8。的"喇叭樣，，截面結束。
在沉淀容器中，并且提供優選如上所述的葉片式攪拌器60。
圖2顯示了顯示對于再循環模式("B")和分批沉淀模式("A")而言的蛋白質濃度對沉淀助劑量的示意圖解。在這一圖解中，實線表示蛋白質在溶液中的溶解度。
盡管不限于此，但本發明實際上目前擁有兩個主要^t式，分批沉淀模式("A")和再循環模式("B")。
在分批沉淀才莫式中，將大大過量的沉淀助劑立即加入到蛋白質溶液 中，其將導致該示意圖中的點"A"。過飽和的量(Ac)將導致蛋白質的幾乎 馬上的沉淀。由于相對于第二步驟b),混合步驟a)是快的，因此這能夠 在許多應用中應用以加速沉淀過程。
在再循環模式("B，，)中，僅加入少量過量的沉淀助劑。因此，更小的 Ac將導致蛋白質的僅部分沉淀(如在示意圖中所示)。再次加入一些沉淀 助劑，且等待沉淀作用。最后，添加-沉淀-添加-沉淀等的繼續理想地將 在飽和曲線c、直線)和點線之間發生。
對于一些應用而言，這一再循環模式具有這樣的優點，即沉淀的肽 有時將更潔凈，因為避免了共沉淀。減少的過飽和度Ac/c^可能導致顆 粒生長與成核速度的比值的升高并且可能因此改善沉淀結果。
在這一特定的實施方案中，沉淀容器50通過線70(參見圖4)與容器 20(其含有肽)和噴射混合器30之間的連接相連接。這允許持續地從容器 50內取得部分混合物，以與沉淀助劑IO再次混合。
圖3顯示了用于實施根據本發明的第三個實施方案的本發明步驟a) 的噴射混合器的橫斷面示意圖。系統100包含兩個進口 110、 120,分別 用于肽溶液(通過ql標記)和沉淀助劑(q2)。該進口分別具有直徑dl、 d2。
尤其優選dl(肽溶液進口)與D(其為混合室的寬度)的比值20.1:l且 S0.4:l，更優選20.2:1且^0.3:1。
尤其優選d2(沉淀助劑進口)與D(其為混合室的寬度)的比值^0.05:l 且^0.3:1，更優選20.08:1且<0.13:1。
如能從圖3看到的那樣，通過安裝隔板在噴射混合器中形成了混合 區130，所述隔板占據混合管150寬度的約3/4。如能從圖3看到的那樣， 在130部分中將存在具有高湍流的宏觀對流(由于對抗的液體噴射所 致)，而在遠離該隔板的管140中，產生更少的湍流。然后將肽溶液和沉 淀助劑的混合物輸送至如通過"q，，標記的熱交換器或沉淀容器中。
圖4顯示了用于實施根據本發明的第四個實施方案的本發明方法的 裝置l，的示意圖。這一裝置l，與圖1的裝置非常類似，除了提供了兩條 用于實施再循環纟莫式的線70之外。在這一特別的實施方案中，提出了 兩類再循環
模式l:在沉淀劑和蛋白質的第一混合后，僅有熟化容器50用于第二和進 一步的再循環(僅用圖4中的再循環線"l")。因此，不會立即達到每一再 循環的終沉淀劑濃度，并且對于本發明內的許多應用而言，比模式2發 生更大的沉淀劑濃度變化。
模式2
在這一模式中，將熟化容器50和容器20(其最初含有蛋白質溶液) 備選地用于混合。在沉淀劑和蛋白質溶液的第一混合后，將第二再循環 的混合物輸送至完全空的蛋白質容器20中。在第三再循環運行期間， 再次應用熟化容器50，并如此繼續(應用圖4中的再循環線"1"和"2")。 在這一模式中，迅速獲得且很好地界定沉淀劑濃度并且不會發生濃度波 動。
與再循環^t式l相比，對于本發明內的許多應用而言，可以實現與 飽和曲線的更小的距離。
圖5顯示了用于實施根據本發明的第五個實施方案的本發明方法的 裝置l，，的示意圖。這一裝置包含其中提供沉淀助劑的第一容器IO，和含 有肽溶液的容器20，。兩個容器與泵15，和25，連接，進行所述方法步驟 a)的噴射混合器15，通過在非常均勻的流體條件下產生第一蛋白質凝聚 物的螺旋管反應器40a、 40b、 40c等與熟化容器50，連接。該螺旋管反 應器還可被用作熱交換器以在所需時進行熱量去除。用兩個葉片式攪拌 器60，裝備這一實施方案中的容器50，，盡管這對于這一特別的實施方案 而言不是特別重要的。布置這一裝置用于"逐步"沉淀(如在圖2中通過 "B"標記的那樣)。
圖6顯示了用于實施根據本發明的第六個實施方案的本發明方法的
裝置r"的示意圖。這一裝置r，，與圖i的裝置非常類似，除了其被裝
備用于實施連續過程之外。這意味著，以長容器的形式提供熟化容器50， 并且葉片式攪拌器60包含若干個用于實施多步驟攪拌過程的葉片，所
分布并且因此導致非常類似的停留時間。這^i置^循模式A(如在圖2 中用"A"標記)。
根據其它實施方案(圖中未顯示)，可以提供線ql和/或q2,其分別 導向容器10和20。通過這樣做，也可以如上所述那樣發生一些再循環。 圖7顯示了用于實施根據本發明的第七個實施方案的本發明方法的裝置r，"的示意圖。在這一實施方案中，省略了額外的熟化容器，而在
螺旋管反應器內部發生沉淀，該螺旋管反應器還可被用作熱交換器40。
該螺旋反應器也具有流體成分在沉淀反應器內部非常窄的停留時間分 布并且因此導致非常類似的停留時間。正如本領域技術人員很容易看到
的那樣，這一裝置也設計用于連續才莫式(如通過"q，，標記的那樣)。這一裝 置遵循^t式A(如在圖2中用"A，，標記)。
根據其它實施方案(圖中未顯示)，可以提供線ql和/或q2,其分別 導向容器10和20。通過這樣做，也可以如上所述那樣發生一些再循環。
圖8顯示了用于實施根據本發明的第八個實施方案的本發明方法的 裝置r""的示意圖。在這一實施方案中，也省略了額外的熟化容器， 并且如本領域技術人員很容易看到的那樣，這一裝置也設計用于連續模 式(如通過"q"標記的那樣)。
然而，布置這一裝置用于"逐步"沉淀，如圖2中通過"B"標記的那 樣。為這一原因，提供了若干個螺旋反應器40a-40d,在它們的每一個 之前，通過線A-D添加規定量的沉淀助劑。該螺旋反應器也還可以用作 熱交換器。
根據其它實施方案(圖中未顯示)，可以提供線ql和/或q2,其分別 導向容器10和20。通過這樣做，也可以如上所迷那樣發生一些再循環。
實施例I
通過應用以下實施例將能更好地理解本發明，所述實施例(僅以例證 的方式)顯示了應用本發明的裝置和方法從溶液中沉淀出蛋白質。
應用100升熟化容器50,在根據本發明的圖l的裝置中進行沉淀。 為了輸送蛋白質溶液，應用低切力(low-shear)泵。
根據圖3組裝噴射混合器，應用兩個具有d產2.5 mm和d2=6mm的 入口，結束于具有D-24mm直徑寬度的混合室中。以這樣的方式應用噴 射混合器，即達到具有Re=1500的雷諾數(Reynolds-Number)的湍流 混合物。通過湍流條件應用這一噴射混合器，65 ms的混合時間是可行 的。
噴射混合器之后，應用具有A-0.35m2熱交換面積的熱交換器。 沉淀助劑(醋酸鹽緩沖劑和乙醇)的通過量是q尸68 1/h，蛋白質溶液 (根據Cohn的血漿溶液，參見上述參考文獻)q2=756 l/h。熟化容器內的pH值是7.12〈pH〈7.28,溫度為-3。C左右。
使用的熟化容器具有DR=406mm的直徑，裝備有具有h/dR=0.5的葉 片高直徑比值的葉片式攪拌器。該葉片式攪拌器具有6個葉片，具有 dR/D= 0.55的攪拌器容器直徑比值。從該葉片至容器的相對距離是 e/DR= 0.025。
通過接近容器底部的、具有約5。錐形角(如上所述)的噴槍將沉淀助 劑和蛋白質溶液的混合物導入容器，因此，該流的進入功率小于 0.3 W/m3。
該沉淀導致以下結果
能夠以比標準方法高得多的量(測試結果得到約50%)從其它蛋白質 中分離纖維蛋白原。只能在蛋白質溶液中發現其它蛋白質，諸如IgG、al-抗胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原和白蛋白，即基本上沒有發生共沉淀。
在上述詳細的實施例中，元件和特征的特定組合僅僅是示范性的； 還明確地預期了這些教導和本申請以及通過引用并入的專利/申請中的 其它教導的互換和替代。正如本領域技術人員能夠認識到的那樣，本文 所描述內容的變形、修改和其它實施在不背離如所請求的本發明精神和 范圍的情形下是本領域普通技術人員可想到的。因此，前面的描述僅僅 是以實施例的方式，并且不意圖作為限制。本發明的范圍在如下權利要 求及其等同形式中限定。此外，在說明書和權利要求書中使用的參考標 記不會限制所請求的本發明的范圍。
權利要求
1.用于沉淀肽的方法，其包括以下步驟a)肽水溶液與沉淀助劑的第一混合步驟；以及b)用于沉淀該肽的沉淀步驟，其中彼此空間分離地進行步驟a)和b)。
2. 權利要求1的方法，其中步驟a)中平均混合速度^0.05m/s且S5m/s。
3. 權利要求1到2任一項的方法，其中步驟a)中Ap^:0.05巴且^20巴。
4. 權利要求l-3任一項的方法，其中步驟a)中宏觀混合時間^ 1 ms 且￡1000 ms。
5. 權利要求l-4任一項的方法，其中步驟a)中宏觀混合時間2 8ms 且^120 ms。
6. 權利要求l-5任一項的方法，其中在用葉片式攪拌器連續攪拌時 進行步驟b)。
7. 權利要求l-6任一項的方法，其中在用^0.1W且^50W攪拌時進 行步驟b)。
8. 權利要求1-7任一項的方法，其中該攪拌器設置為具有$0且 的偏心率。
9. 權利要求1-8任一項的方法，其中葉片直徑d與進行步驟b)的 容器和/或區室的直徑的比值是d:D三0.4:1且^0.7:1 。
10. 權利要求l-9任一項的方法，其中進行步驟a)的容器和/或區室 對進行步驟b)的容器和/或區室的比值是20.02:1且S0.08:1 。
11. 權利要求1-10任一項的方法，其中在步驟a)和b)之間包括步 驟al):al)進行第一沉淀和/或熱交換以改善沉淀并除去步驟a)的混合熱。
12. 權利要求1-11任一項的方法，其中在步驟a)和b)之后包括步 驟c):c) 恒定地和/或間斷地從步驟b)中輸送出沉淀懸浮液的部分溶液， 以在步驟a)中共混合。
13. 權利要求l-12任一項的方法，在步驟al)和b)之間包括步驟a2) 和a3):a2)混合其它的沉淀助劑和a3)隨意任選地重復步驟al)和a2)。
14.實施根據權利要求1-13任一項的方法的裝置。
全文摘要
本發明涉及沉淀肽的方法，其中肽與沉淀助劑的混合步驟和沉淀本身空間上分離。
文檔編號C07K1/30GK101679482SQ200780047106
公開日2010年3月24日 申請日期2007年11月27日 優先權日2006年12月22日
發明者喬格·考寧, 克勞斯·凱澤, 德克·哈夫科斯特, 斯蒂芬·基爾赫納, 理查德·帕斯昆內利, 羅爾夫·特雷克曼 申請人:塔利克里斯生物治療公司;拜爾技術服務有限責任公司