專利名稱：一種延長白細胞介素-18結合蛋白體內半衰期的方法
技術領域：
本發明涉及一種具有延長G細胞介素-18結合蛋白體內半衰期的方法 背景技術蛋白質藥物在血液、肝臟或腎臟內容易發生變性或酶解。因為蛋白質藥物的低穩定性， 為了保持活性物質的有效血漿濃度，所以要求以持續的頻率施用對患者施用多肽藥物。此外， 因為蛋白質藥物通常足通過注射被施用，所以蛋白質藥物的頻繁注射給患者造成了相當的不 便。因此，己有許多研究在開發具有被提高的血液循環半衰期并同時保持其高藥理功效的蛋 白質藥物。這些想得到的蛋白質藥物也應當滿足了對提高的血清穩定性、高活性、對各種蛋 白的可應用性以及當注射到患者體內時誘發非所需的免疫應答的低可能性的要求。用于提高蛋0質穩定性的最常用的方法之一足用高度可溶的大分子，例如聚乙二醇 ("PEG")，對多肽進行化學修飾，該大分子阻止了多肽與蛋白酶的接觸。也熟知的是當 PEG被特異地或非特異地連接到多肽藥物時，PEG增加了多肽藥物的可溶性并防止其被水解， 從而增加了多肽藥物的血清穩定性，并且因為它的低抗原性而不引起任何免疫應答。但是， 這些PEG化(pegylated )多肽所具有的缺點是當PEG的分子量增加時降低了活性物質的活 性和產量。在US5， 738， 846和W092/6221中分別公丌了與兩個被激活的PEG綴合的千擾素和 被連接到兩個具有不同活性的多肽上的PEG間隔物；但是在延長生理學活性多肽的體內活性 方面，它們沒有顯示出任何突出的效果。也報道了通過經異質雙功能(hetero-bifunctional) PEG將重組人粒細胞集落刺激因子 ("G-CSF")共價連接到蛋白上可延長G-CSF的循環半衰期。但是，經修飾的G-CSF-PEG-蛋白的穩定性只比真G-CSF( autheniic G-CSF)高4倍，因此它還不能被投入到實踐應用中。作為另一種增強生理學活性多肽的體內穩定性的方法，通過利用重組技術在轉化體中生 成了與穩定的蛋白質融合的活性多肽。例如，己知A蛋白是用于增強與其融合的多肽的穩定 性的最有效的蛋白質中的一種，己經報道的這樣的融合蛋白有很多(W093/15199和 W093/1520Q,和EP413，622)。但是，與白蛋白結合的融合蛋白仍有活性被降低的問題。US5， 045， 312公丌了 一種為了增強生K激素的活性，使用交聯劑，例如碳化二亞胺、戊二 醛、酞基氯等將生長激素綴合到牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白上的方法。但是，這一方法是 單獨地針對于增強靶生長激素的活性。另外，使用化學化合物例如碳化二亞胺、戊二醛、酞 基氯等作為交聯劑是不利的，這是由于它們強烈的毒性和反應的非特異性。己經報道了免疫球蛋白能用作抗體以呈現出依賴抗體的細胞毒性(ADCC)和依賴補體的 細胞毒性(CDC)的抗休，糖鏈在ADCC及CDC中發揮了重要作用。盡管缺失糖鏈，無糖基化 免疫球蛋白具有與糖基化免疫球蛋白相似的血液半衰期，但是由于去糖基化，它對補體或受 體的親和力下降了 10到1000倍。盡管在將生理學活性多肽與各種大分子進行組合方面己經進行了很多的嘗試，但是所有 的嘗試都不能達到同時增加穩定性和活性。作為一種用于增強活性蛋白的穩定性并同時保持 其體內活性的改進方法，本發明提供了 一種蛋0質彼此共價連接的一種生理學活性蛋白。發明內容因此，本發明的第一個目的是提供-一種具有體內半衰期被延長的生理學活性蛋白的、且 不誘導患者體內的免疫應答、同時將蛋白活性提高的蛋白質藥物。本發明的另一個目的是提供--4中用于制備包括共價連接的一種生理學活性蛋白的方法。本發明的另一個目的是提供一種包括具有延長的體內卡衰期的所述的生理學活性蛋白質 藥物組合物。本發明的另一個目的是提供一種增強生理學活性蛋白的體內穩定性并延長其循環半衰期 且增強其活性的方法。以下實施的方式進一歩闡述本發明。但是，并不能認為本發明限制于以下的優選實施。 具體實施方案1. 白細胞介素-18結合蛋白的基因定點突變挑取白細胞介素-18結合蛋白表達菌株單菌落至LB培養基中培養過夜，第二夭上午轉接 至SPI培養基中，培養至對數生長末期；取培養液至SP工I培養基中培養，取適量加入EP管中， 離心收集菌體，棄靜培養基加入預冷的MgC1.2 ，輕輕搖動懸浮菌體，冰上靜置，離心收集菌 體，棄靜MgCL溶液，每管加入預冷的CaCl2 ，輕輕搖動懸浮菌體，冰上靜置，離心收集菌 體，棄靜CaCL溶液，每管加入適量的CaCh，加入DNA,輕輕混勻，靜止。用SPII培養基稀釋， 涂平板培養基。通過定點突變引入半胱氨酸。2. 白細胞介素-18結合蛋白的純化及其相互組合高速離心機收集菌并加氫氧化鈉裂解菌，加入緩沖液洗滌并超聲破碎，掛鎳柱除去雜蛋 G，洗脫蛋白并離子交換獲得純蛋白加入少量硫酸，待反應完全收集備用。3. 白細胞介素-18結合蛋白組合物半衰期檢測根據使用動物模型的體內試驗，本發明的白細胞介素-18結合蛋白組合物在體內的半衰 期延長了 10倍，很好的解決/ 0細胞介素-18結合蛋O在體內半衰期過短并需頻繁給藥的問 題。另外，根據使用動物模型的體內試驗，白細胞介素-18結合蛋白組合物表現出極好的體 內活性。
權利要求
1.一種延長白細胞介素-18結合蛋白體內半衰期的方法，其特征在于，在白細胞介素-18結合蛋白易受降解部位引入半胱氨酸，使白細胞介素-18結合蛋白通過引入的半胱氨酸的共價鍵兩兩結合，形成白細胞介素-18結合蛋白組合物。
2 .如權利要求l所述方法，其特征在于，所述半胱氨酸，包括所有的氨基酸。
3 .如權利要求1所述方法，其特征在于， 結合蛋白相互組合。
4 .如權利要求1所述方法，其特征在于， 肽鍵等連接。
5.如權利要求l所述方法，其特征在于， 干擾素及其受體。所述兩兩結合包括兩個及以上的白細胞介素-18 所述共價鍵連接包括通過巰酯鍵、酯鍵、醚鍵、 所述白細胞介素-18結合蛋白包括各種細胞因子、
6.如權利要求3的白細胞介素-18結合蛋白相互組合，可以是非同種蛋白之間組合。
全文摘要
本發明涉及一種具有延長白細胞介素-18結合蛋白體內半衰期的方法，在白細胞介素-18結合蛋白易受蛋白酶降解部位引入半胱氨酸，使白細胞介素-18結合蛋白通過半胱氨酸的巰酯鍵兩兩共價結合，阻止了白細胞介素-18結合蛋白與蛋白酶的結合，提高了白細胞介素-18結合的活性和延長了其在體內的半衰期。本發明也提供包括所述蛋白質藥物學上可接受的組合物，制備該組合物的方法，和在治療各種疾病、狀況或病癥中使用該組合的方法，以提高藥物在體內的半衰期和生物活性。
文檔編號C07K1/107GK101274954SQ200810023490
公開日2008年10月1日 申請日期2008年4月16日 優先權日2008年4月16日
發明者海 龐, 鵬 王, 陳曉翔 申請人:江蘇大元生物科技有限責任公司