專利名稱：：一種抗病毒蛋白質及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及蛋白質，具體地說，涉及一種用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV，humanimmunodeficiencyvirus)禾口/或乙型肝炎病毒(HBV，hepatitisBvirus)感染的抗病毒蛋白質，以及這種抗病毒蛋白質的應用。
背景技術：
：APOBEC家方矣(apolipoproteinBmRNAeditingenzyme-catalyticpolypeptidefamily,載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽家族)是近年來新發現的一種具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質分子，可以使胞嘧啶脫氨轉變為尿嘧啶(C—U)，其家族成員包括hAPOBECl(即人APOBECl)、hAPOBEC2(即人APOBEC2)、hAPOBEC3A(即人APOBEC3A)、hAPOBEC3B(即人APOBEC3B)、hAPOBEC3C(即人APOBEC3C)、hAPOBEC3D(即人APOBEC3D)、hAPOBEC3E(即人APOBEC3E)、hAPOBEC3F(即人APOBEC3F)、hAPOBEC3G(即人APOBEC3G)、hAPOBEC3H(即人APOBEC3H)、hAPOBEC4(即人APOBEC4)、rAPOBECl(即大鼠APOBECl)、活化誘導的脫氨酶(activation-induceddeaminase,AID)等十余禾中(APOBEC國mediatedviralrestriction:notsimplyeditingTrendsBiochemSci(生化禾斗學進展)2007;32(3):118-128;禾口APOBECfamilyproteins:novelantiviralinnateimmunity.IntJHematol(國際血液學雜志)2006;83(3):213-216)。APOBEC家族最重要的結構特征是它們都具有保守的、依賴鋅離子的胞嘧啶脫氨酶活性結構域(CloningandmutagenesisoftherabbitApoBmRNAeditingprotein.Azincmotifisessentialforcatalyticactivity,andnoncatalyticauxiliaryfactor(s)oftheeditingcomplexarewidelydistributed.JBiolChem(生物化學雜志)1994;269(34):21725-21734)。多數APOBEC家族成員只有一個胞嘧啶脫氨酶結構域，而hAPOBEC3B、hAPOBEC3F、hAPOBEC3G分子各包含兩個胞嘧啶脫氨酶結構域。目前發現APOBEC成員具有很強的抗病毒活性，能夠抑制逆轉錄病毒如人類免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV，simianimmunodeficiencyvirus)、馬傳染性貧血病毒(EIAV，equineinfectiousanemiavirus)、鼠白血病病毒(MLV，murineleukaemiavirus)和乙型肝炎病毒(HBV)的復制。對HIV等逆轉錄病毒而言，APOBEC的胞嘧啶脫氨酶結構域可以使胞嘧啶脫氨轉變為尿嘧啶(C—U)，C—U的轉變進一步引發三種不同的后續反應(1)含有U的單鏈cDNA被尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)識別并移去U，產生無嘌呤嘧啶的位點，再被DNA堿基切除修復酶(核酸內切酶)作用，導致DNA降解(DNAdeaminationmediatesinnateimmunitytoretroviralinfection.Cell(細胞)2003;113(6):803-809);(2)過多的U堿基可以干擾正鏈合成的起始(IncorporationofuracilintominusstrandDNAaffectsthespecificityofplusstrandsynthesisinitiationduringlentiviralreversetranscription.JBiolChem(生物化學雜志)2003;278(10):7902-7909);(3)負鏈中12%的C可以被脫氨轉變為U，大量的C—U突變會導致正鏈中出現G—A高頻突變，以至于不能編碼功能性的病毒蛋白，或者因為提前形成終止密碼子而產生截短的無功能產物。上述三種后續反應最終導致逆轉錄病毒不能完成整個復制周期。對HBV而言，APOBEC主要通過抑制病毒前基因組RNA的包裝和核衣殼化來實現其抗病毒功能(InhibitionofhepatitisBvirusreplicationbyAPOBEC3G.Science(科學)2004;303(5665):1829)。但是，APOBEC家族無法在細胞外發揮抗病毒功能，這大大限制了它在醫療上的應用。為了使APOBEC家族發揮抗病毒功能，需要將其導入細胞內。在細胞生物學和臨床藥學研究領域，將多肽、蛋白質或寡核苷酸等導入細胞內，目前普遍采用的手段有物理方法，如顯微注射、電穿孔等；化學方法，如脂質體包裹法、洋地黃皂苷處理法等；生物方法，如病毒載體法等。但上述方法分子導入率低，易造成細胞損傷甚至死亡，使得許多無生物膜通透性且易降解的親水性多肽、蛋白質及寡核苷酸在藥學領域的應用大大受限。近年來研究發現,生物體中有一類蛋白及多肽能夠以一種無受體介導、不耗能、非經典內吞的方式進入細胞漿或細胞核(Proteintransports:thenonclassicalinsandouts.CurrBiol(當代生物學)1997;7(5):R318-320)。這些具有細胞膜穿透能力的蛋白或多肽被稱為穿膜肽(membranepenetratingpeptides，MPPs，又稱為細胞膜穿透肽)，包括單純皰疹病毒衣殼蛋白VP22，人類免疫缺陷病毒Tat蛋白、果蠅同源異型轉錄調節蛋白(antennapedia，Antp)和一些人工合成的多肽(ThethirdhelixoftheAntennapediahomeodomaintranslocatesthroughbiologicalmembranes.JBiolChem(生物化學雜志)1994;269(14):10444-10450;禾口Intercellulartraffickingandproteindeliverybyaherpesvirusstructuralprotein.Cell(細胞)1997;88(2):223-233;和Cellularuptakeofthetatproteinfromhumanimmunodeficiencyvirus.Cell(細胞)1988;55(6):1189-1193)，盡管它們在氨基酸序列、細胞內定位及穿膜潛能等方面存在不同，但均能有效地將多肽、蛋白質或DNA片段導入多種哺乳動物細胞。穿膜肽介導的物質轉運過程具有很多優勢，例如它與細胞膜親和性高、穿膜速度快，最重要的是對細胞膜沒有破壞性；此外，穿膜肽的穿膜過程還可以逆向進行，也就是說，它還可以從細胞內穿過細胞膜進入基質，或者從一個細胞轉移到另外一個細胞；穿膜肽分子量往往比較小，不易被肝和脾吞噬細胞消除，甚至有的穿膜肽在血漿存在的情況下也具有轉染細胞的能力；由于穿膜肽不經受體介導的內吞途徑進入細胞，避免了內吞后進入溶酶體降解，因此在細胞內的作用時間相對延長。另外，APOBEC分子量較大，免疫原性較強，直接應用于人體可能會誘導較高的抗體水平而降低其抗病毒效果。
發明內容本發明所要解決的技術問題是將穿膜肽技術和APOBEC的抗病毒活性有機結合，提供一種抗病毒蛋白質及其應用，這種抗病毒蛋白質具有細胞膜穿透活性，能夠在細胞之間進行自由穿梭，并以一種非受體、非能量依賴的方式進入細胞內，并且能夠有效抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)和/或乙肝病毒(HBV)的復制。采用的技術方案如下一種抗病毒蛋白質，其特征在于它是融合蛋白質，包含穿膜肽結構域和至少二個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體。優選上述抗病毒蛋白質包含至少三個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域；抗病毒蛋白質中胞嘧啶脫氨酶結構域的數量增多，有助于提高其抗病毒效果。更優選上述抗病毒蛋白質中的胞嘧啶脫氨酶結構域來自三種不同的APOBEC家族成員，例如一種抗病毒蛋白質包含三個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域，其中第一個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3G，第二個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3B，第三個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3F。由于不同APOBEC家族來源的胞嘧啶脫氨酶結構域在氨基酸組成方面存在一定差異，這會導致其在抗病毒過程中發揮不同的功能，因此來自三種不同APOBEC家族成員的胞嘧啶脫氨酶結構域的聯合使用，能夠增強抗病毒蛋白質抑制病毒增殖的效果。進一步，優選上述抗病毒蛋白質包含至少四個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域；抗病毒蛋白質中胞嘧啶脫氨酶結構域的數量增多，有助于提高其抗病毒效果。更優選上述抗病毒蛋白質中的胞嘧啶脫氨酶結構域來自至少三種不同的APOBEC家族成員，例如一種抗病毒蛋白質包含四個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域，其中第一二個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3F，第三個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3G，第四個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3B;另一種抗病毒蛋白質包含四個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域，其中第一個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3G，第二個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3B，第三個胞嘧啶脫氨酶結構域來自hAPOBEC3F，最后一個胞嘧啶脫氨酶結構域來自rAPOBECl。由于不同APOBEC家族來源的胞嘧啶脫氨酶結構域在氨基酸組成方面存在一定差異，這會導致其在抗病毒過程中發揮不同的功能，因此來自至少三種不同APOBEC家族成員的胞嘧啶脫氨酶結構域的聯合使用，能夠增強抗病毒蛋白質抑制病毒增殖的效果。構成上述穿膜肽結構域的序列可以是下述具有穿膜肽活性的序列中的一種來源于HIVTat蛋白(transactivator,人類免疫缺陷病毒Tat蛋白)的GRKKRRQRRRPPQ序列；來源于HIVTat蛋白的RKKRRQRRR序列；來源于單純皰疹病毒衣殼蛋白VP22的DAATARGRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD序列；來源于果蠅同源異型轉錄調節蛋白Antp(antennapedia)的RQIKIWFQNRRMKWKK序列；轉運子(transportan)序列GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;兩親性模式肽KLALKLAALKAALKLA;連續的精氨酸RRRRRRRRR;基于信號序列的多肽GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV;基于信號序列的多肽AAVALLPAVLLALLAP。構成上述穿膜肽結構域的序列可以發生合理的、不影響其生物學活性的改變，例如，非核心作用氨基酸的缺失、非核心作用氨基酸的插入、非核心作用氨基酸的替換、多種具有穿膜肽活性的序列的組合等，但這些改變的核心目的應該是引導抗病毒蛋白質有效地穿透細胞膜或核膜。上述穿膜肽結構域在抗病毒蛋白質中的位置應能夠保證它有效發揮穿膜活性，可以位于抗病毒蛋白質的N端(即氨基端)、C端(即羧基端)或中間區域，優選N端。優選上述來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域所具有的核心基序是H-X-E-(X)23-28-P-C-(X)2-4-C，其中H為組氨酸，E為谷氨酸，C為半胱氨酸，P為脯氨酸，X代表任意氨基酸。優選上述抗病毒蛋白質中的胞嘧啶脫氨酶結構域是來源于APOBEC家族中的hAPOBEC3G、hAPOBEC3F、hAPOBEC3B和rAPOBECl這四種蛋白質分子的胞嘧啶脫氨酶結構域，也就是說，在選擇抗病毒蛋白質中胞嘧啶脫氨酶結構域的來源時，優先考慮選擇這四種蛋白質分子的胞嘧啶脫氨酶結構域，這四種蛋白質分子所含的胞嘧啶脫氨酶結構域共有下述七種來自hAPOBEC3G的N端的胞嘧啶脫氨酶結構域，來自hAPOBEC3G的C端的胞嘧啶脫氨酶結構域，來自hAPOBEC3F的N端的胞嘧啶脫氨酶結構域，來自hAPOBEC3F的C端的胞嘧啶脫氨酶結構域，來自hAPOBEC3B的N端的胞嘧啶脫氨酶結構域，來自hAPOBEC3B的C端的胞嘧啶脫氨酶結構域，來自rAPOBECl的胞嘧啶脫氨酶結構域。對于hAPOBEC3G、hAPOBEC3F、hAPOBEC3B這三種蛋白質而言，每個蛋白質分子中都具有兩個胞嘧啶脫氨酶結構域，分別位于N端和C端。胞嘧啶脫氨酶結構域的位置和氨基酸組成方面的微小差異可能決定了它們在抗病毒過程中發揮不同的功能，因此，更優選抗病毒蛋白質既包含來自hAPOBEC3G、hAPOBEC3F或hAPOBEC3B的N端的胞嘧啶脫氨酶結構域，又包含來自hAPOBEC3G、hAPOBEC3F或hAPOBEC3B的C端的胞嘧啶脫氨酶結構域。上述胞嘧啶脫氨酶結構域可以處于抗病毒蛋白質的N端(即氨基端)、C端(即羧基端)或中間區域。為了使抗病毒蛋白質中串聯的每一個胞嘧啶脫氨酶結構域在空間結構上都能相對獨立并有效發揮其功能，保持良好的生物學活性，優選抗病毒蛋白質中各結構域之間用柔性連接肽連接，具體地說，穿膜肽結構域和胞嘧啶脫氨酶結構域之間、相鄰兩個胞嘧啶脫氨酶結構域之間用柔性連接肽連接。柔性連接肽必須有足夠的柔韌性與靈活度，因此構成柔性連接肽的氨基酸多為非極性且側鏈較短的氨基酸，如甘氨酸(G)和絲氨酸(S)，也就是說，柔性連接肽富含甘氨酸(G)和絲氨酸(S)。優選柔性連接肽是GGGG、GSSSG、GSGGSG、GGGGS、(GGGGS)2和(GGGGS)3中的一種或者任意多種的組合。過短的連接肽可在分子內部造成空間位阻，影響蛋白的正確折疊；過長的連接肽則可能增加蛋白的免疫原性，因此更優選柔性連接肽是(GGGGS)2、GGGGGSSSG、GSSSGGSGGSG、GSGGSGGGGGS、GGGGGSGGSG、GSSSGGGGGS或GGGGGGGGS。為了利于制備抗病毒蛋白質時對抗病毒蛋白質進行純化，同時有利于檢測抗病毒蛋白質應用后的分布和表達情況，優選上述抗病毒蛋白質含有蛋白質純化標簽。蛋白質純化標簽可以是任何一種商業化標簽，優選6xHis標簽(即由六個組氨酸His組成的序列HHHHHH)或GST標簽(谷胱甘肽巰基轉移酶)。蛋白質純化標簽可以位于抗病毒蛋白質的N端或C端；也可以在抗病毒蛋白質的N端和C端各有一個蛋白質純化標簽。在本發明的一個實施方案中，公布了這種抗病毒蛋白質用鎳粒子親和層析進行純化的方法。由于這種抗病毒蛋白質在N端和C端各有一個組蛋白標簽(即6xHis標簽)，因此在用凝血酶將這種抗病毒蛋白質N端包括蛋白質純化標簽在內的17個氨基酸切除后，獲得的抗病毒蛋白質同樣能夠用鎳粒子親和層析法純化，并且由于減少了部分氨基酸序列，其穿膜活性會進一步得到提高而抗病毒活性不會降低。上述抗病毒蛋白質可以用原核表達系統、酵母表達系統或昆蟲細胞表達系統進行表達，也可以通過將其編碼基因連入腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘苗病毒載體、腺相關病毒載體或皰疹病毒載體在體內獲得表達，也可以通過將其編碼基因通過基因槍、脂質體轉染、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺或殼聚糖介導等方式進入體內而獲得表達。上述抗病毒蛋白質在制備治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的藥物中的應用，即上述抗病毒蛋白質可用于制備治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的藥物。上述抗病毒蛋白質在制備治療乙肝病毒(HBV)感染的藥物中的應用，即上述抗病毒蛋白質可用于制備治療乙肝病毒(HBV)感染的藥物。本發明抗病毒蛋白質中，穿膜肽結構域使抗病毒蛋白質具有穿膜能力，能夠在細胞之間進行自由穿梭，并以一種非受體、非能量依賴的方式進入細胞內；來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域使得抗病毒蛋白質在進入細胞之后，能夠有效抑制fflV和/或HBV的復制，并且，由于去除了APOBEC家族蛋白質分子中的非必需序列，因而不僅保留了APOBEC家族蛋白質分子的抗病毒活性，而且降低了抗病毒蛋白質的免疫原性，并提高了抗病毒蛋白質的穿膜效率；各結構域之間的柔性連接短肽可以保證各結構域能夠不受影響地發揮其各自特有的功能；蛋白質純化標簽能夠方便抗病毒蛋白質的純化或檢測。圖1是實施例1中抗病毒蛋白質的原核表達載體構建過程示意圖2是實施例1中抗病毒蛋白質的表達和純化結果示意圖3是實施例2中抗病毒蛋白質的Westernblot檢測結果示意圖4是實施例3抗病毒蛋白質的細胞內定位結果的照片(由熒光顯微鏡獲得)；圖5是實施例4中抗病毒蛋白質對細胞培養上清中核衣殼相關HBV-DNA的影響的檢測結果示意圖6是實施例4中抗病毒蛋白質對細胞漿中核衣殼相關HBV-DNA的影響的檢測結果示意圖7是實施例4中抗病毒蛋白質對細胞漿中包裹于衣殼內的HBV前基因組RNA的影響的檢測結果示意圖。具體實施例方式實施例1抗病毒蛋白質的制備本實施例抗病毒蛋白質的氨基酸序列為<sequence>seeoriginaldocumentpage11</sequence>這種抗病毒蛋白質包含一個穿膜肽結構域<sequence>seeoriginaldocumentpage11</sequence>和三個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域(這三個胞嘧啶脫氨酶結構域依次是來自hAPOBEC3G分子N端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisProGluMetArgPhePheHisTrpPheSerLysTrpArgLysLeuHisArgAspGlnGluTyrGluValThrTrpTyrlleSerTrpSerProCysThrLysCys、來自hAPOBEC3G分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisAlaGluLeuCysPheLeuAspValIleProPheTrpLysLeuAspLeuAspGlnAspTyrArgValThrCysPheThrSerTrpSerProCysPheSerCys、來自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisAlaGluArgCysPheLeuSerTrprProCysProGluCys)，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體，穿膜肽結構域和胞嘧啶脫氨酶結構域之間、相鄰兩個胞嘧啶脫氨酶結構域之間用柔性連接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)連接，抗病毒蛋白質的N端和C端各有一個蛋白質純化標簽(HisHisHisHisHisHis)。按下述步驟制備上述抗病毒蛋白質一、hAPOBEC3G全長cDNA(互補DNA，DNA為脫氧核糖核酸)和hAPOBEC3F全長cDNA的克隆對人外周血用淋巴細胞分離液進行處理，獲得單個核細胞，用PMA(乙酰肉豆蔻佛波醇)處理后，再用Trizol法提取總RNA，利用隨機引物法和AMV逆轉錄酶合成cDNA;然后分別以A3G-F和A3G-R、A3F-F和A3F-R為引物對，PCR(polymerasechainreaction,聚合酶鏈式反應)擴增，得到hAPOBEC3G全長cDNA和hAPOBEC3F全長cDNA;其中各引物具體設計如下A3G-F是5，畫CGAAAGCTTATGAAGCCTCACTTCAGAA-3，A3G-R是5，畫TTAGGTACCTCAGTTTTCCTGATTCTG-3'A3F-F是5，-GCTAAGCTTATGAAGCCTCACTTCAGA-3，A3F-R是5，-TATGGTACCTCACTCGAGAATCTCCTG-3，上述A3G-F、A3G-R、A3F-F和A3F-R中的下劃線部分為HindIII酶切位點(AAGCTT)或KpnI酶切位點(GGTACC)。上述二種PCR產物(即hAPOBEC3G全長cDNA和hAPOBEC3F全長cDNA)用HindIII和KpnI雙酶切，然后與經HindIII和Kpnl雙酶切并純化的商業化pcDNA3質粒連接，得到陽性質粒，得到的陽性質粒進一步測序驗證，分別命名為pcA3G質粒和pcA3F質粒。pcA3G質粒帶有hAPOBEC3G全長cDNA;pcA3F質粒帶有hAPOBEC3F全長cDNA。二、抗病毒蛋白質的原核表達載體的構建設計的各引物如下(1)Tat-MF:5'-GA3CCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCGGAGGCGGATCCGTCGACC-3':其中GATC(波浪線)是Tat-MF禾nTat-MR引物配對后懸掛出來的堿基，GGCGGAGGC(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列，GGATCCGTCGAC(雙下劃線)為引入的Bamffl和Sail酶切位點；(2)Tat-MR:5'-TCGAGGTCGACGGATCCGCCTCCGCCTTGAGGAGGTCTTCATCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCA-3，；其中TCGA(波浪線)是Tat-MF和Tat-MR引物配對后懸掛出來的堿基，GCCTCCGCC(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列，GTCGACGGATCC(雙下劃線)為引入的Sail和Bamffl酶切位點；(3)A3G-NF:5'-GGCAGATCTGGCGGAGGCGGATCACACCCAGAGATGAG-3';其中AGATCT(單下劃線)是BglII酶切位點，GGCGGAGGCGGATCA(雙下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列；(4)A3G-NR:5'-TATCTCGAGGTCGACGGATCCGCCTCCGCCACACTTTGTGCAG-3，；其中CTCGAG(波浪線)是Xhol酶切位點，GTCGACGGATCC(雙下劃線)是引入的Sail和Bamffl酶切位點，GCCTCCGCC(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列；(5)A3G-CF:5'-GGCAGATCTGGCGGAGGCGGATCACATGCAGAGCTGTGCTT-3';其中AGATCT(雙下劃線)是BglII酶切位點，GGCGGAGGCGGATCA(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列；(6)A3G-CR:5'-TATCTCGAGGTCGACGGATCCGCCTCCGCCACAGCTGAAGCA-3';其中CTCGAG(波浪線)是Xhol酶切位點，GTCGACGGATCC(雙下劃線)是引入的Sail和Bamffl酶切位點，GCCTCCGCC(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列；(7)A3F國CF:<sequence>seeoriginaldocumentpage14</sequence>，；其中AGATCT(雙下劃線)是BglII酶切位點，GGCGGAGGCGGATCA(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列；(8)A3F-CR:<sequence>seeoriginaldocumentpage14</sequence>;其中CTCGAG(波浪線)是Xhol酶切位點，GTCGACGGATCC(雙下劃線)是引入的Sail和Bamffl酶切位點，GCCTCCGCC(單下劃線)是引入的柔性連接肽序列的編碼序列；首先，Tat-MF和Tat-MR引物對經過退火形成雙鏈后，連入經Bamffl和Xhol雙酶切的商業化pET-28a載體，得到含Tat穿膜肽結構域編碼序列的pTM質粒。然后，在pTM質粒的基礎上，采用同尾酶法連續插入多個APOBEC來源的胞嘧啶脫氨酶結構域，其具體步驟是(1)以帶有hAPOBEC3G全長cDNA的pcA3G質粒為模板，A3G-NF和A3G-NR為引物，PCR擴增，得到hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列；然后利用Bamffl和BglII、Sail和Xhol互為同尾酶的特點，將該PCR產物(即hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列)經BglII和Xhol雙酶切后，連入經BamHI和Sail雙酶切的pTM質粒，得到pTM-N質粒。得到的pTM-N質粒，其酶切連接部位的BamHI和Bgin、Sail和Xhol位點會同時喪失，但被人為引入的BamHI位點和Sail位點(該Bamffl位點和Sail位點緊鄰hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列的末端)仍然存在。(2)與步驟(1)類似，以pcA3G質粒為模板，A3G-CF和A3G-CR為引物，PCR擴增，得到hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列；然后將該PCR產物(即hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列)經BglII和XhoI雙酶切后，連入經Bamffl和Sail雙酶切的pTM-N質粒，得到pTM-NC質粒。pTM-NC質粒同樣含有人為引入的BamHI位點和Sail位點，便于進行下一輪的酶切。(3)以pcA3F質粒為模板，A3F-CF和A3F-CR為引物，PCR擴增，得到hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列；然后將該PCR產物(即hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列)經BglII和Xhol雙酶切后，連入經BamHI和Sail雙酶切的pTM-NC質粒，得到pTM-NCC質粒，完成抗病毒蛋白質的原核表達載體的構建。pTM-NCC質粒含有一個Tat穿膜肽結構域編碼序列和三個胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列。最后得到的pTM-NCC質粒同樣含有人為引入的BamHI位點和Sall位點，依此類推，還可以得到更多胞嘧啶脫氨酶結構域的串聯拷貝。綜上所述，采用連續的酶切…-連接…-再酶切…-再連接的方式，一步步將外源DNA片段連入pET-28a原核表達載體。每一次連接后，其連接產物的兩端都會失去一些酶切位點，但同時又保留了Bamffl和SalI位點，有利于下一輪酶切和連接過程的。雖然每增加l個拷貝就得做l次克隆，但對于15拷貝的串聯基因，實驗過程并不復雜。上述抗病毒蛋白質的原核表達載體的構建過程可以用圖l表示，其中A3G-N、A3G-C、A3F-C分別表示hAPOBEC3G的N端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列、hAPOBEC3G的C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列和hAPOBEC3F的C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列。在相鄰的胞嘧啶脫氨酶結構域之間，我們還設計了柔性連接肽序列。它是基于如下的設計思路每一個PCR擴增片段的末端都引入了GCCTCCGCC序列(編碼GlyGlyGly)，而每一個PCR擴增片段的前端又被引入了GGCGGAGGCGGATCA序列(編碼GlyGlyGlyGlySer);當前一個片段的末端和后一個片段的前端分別經BamHI和Bgin酶切并連接后，用于連接位點處本身會形成GGATCT的序列(編碼GlySer);因此當兩個片段連接后，連接處就形成了GCCTCCGCCGGATCTGGCGGAGGCGGATCA編碼序列，可編碼GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer多肽序列，g卩(GGGGS》序列。由于Gly與Ser都是非極性、且側鏈較短的氨基酸，具有足夠的柔性與靈活度，所以保證了抗病毒蛋白質分子中各活性位點的充分暴露。最終，通過將各個基因片段逐次插入商業化的pET-28a質粒，我們得到了含一個Tat蛋白穿膜肽編碼序列和三個不同的胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列的原核表達質粒pTM-NCC，經測序驗證表明構建體的讀碼框架和基因序列完全正確。由于pET-28a本身在插入片段的上下游各有一個組蛋白標簽(即6xHis標簽)編碼序列，所以當該抗病毒蛋白質在原核表達后，其N端和C端會各帶有一個6xHis標簽編碼序列。上述抗病毒蛋白質的全長核苷酸編碼序列描述如下ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCTGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCGGAGGCGGATCAGGCGGAGGCGGATCACACCCAGAGATGAGATTCTTCCACTGGTTCAGCAAGTGGAGGAAGCTGCATCGTGACCAGGAGTATGAGGTCACCTGGTACATATCCTGGAGCCCCTGCACAAAGTGTGGCGGAGGCGGATCAGGCGGAGGCGGATCACATGCAGAGCTGTGCTTCCTGGACGTGATTCCCTTTTGGAAGCTGGACCTGGACCAGGACTACAGGGTTACCTGCTTCACCTCCTGGAGCCCCTGCTTCAGCTGTGGCGGAGGCGGATCAGGCGGAGGCGGATCACATGCAGAAAGGTGCTTCCTCTCTTGGTTCTGTGACGACATACTGTCTCCTAACACAAACTACGAGGTCACCTGGTACACATCTTGGAGCCCTTGCCCAGAGTGTGGCGGAGGCGGATCCGTCGACCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA三、抗病毒蛋白質的表達測序正確的pTM-NCC質粒轉化BL21(DE3)感受態大腸桿菌，挑取陽性克隆接種于含氨芐青霉素的2xYT液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。再以1:100接種量轉接到12瓶相同抗性的2xYT液體培養基中，振蕩培養至OD600達0.4左右時，其中6瓶加入誘導劑IPTG(isopropylthio-(3-D-galactoside，異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)至0.2mmol/L，另外6瓶加入誘導劑IPTG至lmmol/L;再分別按如下條件繼續振蕩培養37℃4h、37℃6h、30℃4h、30℃6h、25℃4h、25℃6h。即各瓶的誘導和培養條件分別為<table>編號</column></row><row><column></column><column>IPTG濃度</column><column>培養溫度</column><column>培養時間1</column></row><row><column></column><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>37℃</column><column>4h2</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>37℃</column><column>6h3</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>30。C</column><column>4h4</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>30°C</column><column>6h5</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>25°C</column><column>4h6</column></row><row><column></column><column>0.2mmol/L</column><column>25°C</column><column>6h7</column></row><row><column></column><column>1mmoI/L</column><column>37°C</column><column>4h8</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>37°C</column><column>6h9</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>30。C</column><column>4h10</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>30°C</column><column>6h11</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>25°C</column><column>4h12</column></row><row><column></column><column>1mmol/L</column><column>25°C</column><column>6h</column></row><table>完成振蕩培養后，分別離心收取誘導后的培養物，PBS(磷酸鹽緩沖液)重懸，加入溶菌酶至溶菌酶在培養物中的終濃度為0.5mg/L，并冰浴30min，然后間歇超聲3次，每次超聲2min。均取100μl超聲處理后的懸液，12500g離心10min后，各取沉淀、上清進行15%SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析。SDS-PAGE分析結果顯示，IPTG誘導的BL21(DE3)重組菌裂解物在22KD(22千道爾頓)附近有一明顯的新增蛋白質條帶，此結果與該抗病毒蛋白質的理論推算值相符(抗病毒蛋白質由198個氨基酸組成，理論推算的相對分子質量約22.6KD)。雖然各個溫度和IPTG濃度的條件下均能夠誘導抗病毒蛋白質的表達，但37℃誘導的抗病毒蛋白質主要以包涵體為主，30℃誘導條件下也有一定量的包涵體，而25℃誘導主要產生可溶性的抗病毒蛋白質。綜合分析，選擇IPTG濃度0.2mmol/L、25℃6h作為該抗病毒蛋白質的最適表達條件。四、抗病毒蛋白質的純化利用鎳離子親和層析柱，在非變性條件下純化重組菌體裂解上清中的可溶性抗病毒蛋白質，其具體步驟為首先，收集誘導后獲得的重組菌液500ml，按上述方法超聲離心(離心收取誘導后的培養物，PBS重懸，加入溶菌酶至溶菌酶的終濃度為0.5mg/L，并冰浴30min，然后間歇超聲3次，每次超聲2min，再12500g離心10min)收集上清，經0.45mum濾膜過濾；然后將Ni-NTABind樹脂懸于結合緩沖液(50mmol/LNaH2P04、300mmol/LNaCl、10mmol/L咪唑、PH8.0，即每升結合緩沖液含50mmolNaH2PO4、300mmolNaCl、10mmol咪唑)中進行平衡，再吸取過濾后的樣品加入此平衡后的樹脂，在4'C溫度下輕輕振蕩lh，使樣品和樹脂混勻；接著將樣品和樹脂的混合物轉移到層析柱內，待其沉降后，先用洗滌緩沖液(每升洗滌緩沖液含50mmolNaH2PO4、300mmolNaCl和20mmol咪唑，其PH值為8.0)分次洗漆，再用洗脫緩沖液(每升洗滌緩沖液含50mmolNaH2PO4、300mmo1NaCl和250mmo1咪唑，其PH值為8.0)分批洗脫，分管收集洗脫液并進行SDS-PAGE分析；最后將含有目的蛋白質的洗脫液用PBS在4。C溫度下透析48h，并參照Bradford法測定蛋白質的濃度，結果見圖2中的第5泳道，純度可達94﹪，得率約為300pg/ml。圖2表示抗病毒蛋白質的表達和純化結果，其中M代表蛋白分子量標準；泳道1.pET-28a質粒轉化BL21菌誘導后的上清；泳道2.重組質粒pTM-NCC轉化BL21菌誘導后的上清；泳道3.pET-28a質粒轉化BL21菌誘導后的沉淀；泳道4.重組質粒pTM-NCC轉化BL21菌誘導后的沉淀；泳道5.親和純化后的抗病毒蛋白質。實施例2實施例l制備的抗病毒蛋白質的Westernblot檢測經過純化的抗病毒蛋白質以IOpg/ml的終濃度加入到長成單層的HepG2,2.15細胞中(即最終每ml長成單層的HepG2.2.15細胞中含有10嗎經過純化的抗病毒蛋白質)，作為實驗組；對照組HepG2.2.15細胞中加入PBS。經過8h后，將細胞裂解提取總蛋白，以抗His標簽的小鼠單克隆抗體做Westernblot，利用化學發光法檢測。如圖3(圖3中，M代表蛋白分子量標準；泳道l.對照組HepG2.2.15細胞的Westemblot結果；泳道2.加入抗病毒蛋白質的實驗組HepG2.2.15細胞Westemblot結果)所示，實驗組細胞在22KD處出現了一明顯條帶A，與抗病毒蛋白質的分子量相符；而對照組細胞未出現條帶。實施例3實施例l制備的抗病毒蛋白質的細胞內定位分析將經過純化的抗病毒蛋白質以5pg/ml的終濃度加入到長成單層的HepG2.2.15細胞爬片中(即最終每ml長成單層的HepG2.2.15細胞爬片中含有5昭經過純化的抗病毒蛋白質)，作為實驗組；對照組HepG2.2.1518細胞爬片中加入PBS。經過8h后，用4%的多聚甲醛將細胞爬片在室溫下固定10min;再加入濃度為0.2G/o的Triton-X100(曲通-X100)，室溫下繼續固定5min;然后，用抗His標簽的小鼠單克隆抗體作為一抗，用Cy3標記的羊抗鼠抗體作為二抗，在熒光顯微鏡下觀察，如圖4所示(圖4中紅色部分顯示的是進入細胞槳中的抗病毒蛋白質)，結果發現，抗病毒蛋白質可以進入大多數細胞內，提示它具有很強的穿膜活性；同時，抗病毒蛋白質基本上都位于細胞漿內，與大多數研究所報道的hAPOBEC3G和hAPOBEC3F定位情況相符，提示該抗病毒蛋白質主要在細胞漿中發揮作用。實施例4實施例l制備的抗病毒蛋白質的抗病毒活性檢測一、檢測抗病毒蛋白質對細胞培養上清中核衣殼相關HBV-DNA的影響實驗組HepG2.2.15細胞中加入不同終濃度(分別為0.2pg/ml、0.5|xg/ml、2(ig/ml、5|ig/ml、10|ig/ml、20ng/ml，終濃度指最終加入到每mlHepG2.2.15細胞中的抗病毒蛋白質的總嗎數)的抗病毒蛋白質，陰性對照組只加PBS，陽性對照組中加入終濃度20nmol/L的3-TC(拉米夫定)。經過36h后，吸出上清，10000g離心30min，除去沉淀，隨后將溶液置于頂層為20%葡萄糖的TNE(10mmol/LTris-HCL、lmmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、100mmol/LNaCl，PH值為7.4，即每升TNE含lOmmolTris-HCL、lmmolEDTA、100mmolNaCl)上，65000g離心4h。離心后的沉淀經冷PBS重懸后，加入終濃度為10mmol/L的MgCl2，并用200pg/mL的DNaseI(脫氧核糖核酸酶I)和100pg/mL的RNaseA(核糖核酸酶A)在37。C的溫度下處理lh。14000g離心lmin后，在上清中加入終濃度為10mmol/L的EDTA、終濃度為1°/。的SDS、終濃度為100mmol/L的NaCl、終濃度為200pg/mL的蛋白酶K，在37'C的溫度下處理2h。隨后用酚氯仿抽提去除蛋白質，水相中的DNA用酒精沉淀。沉淀下來的DNA再用PH值為8.0的TE(10mmol/LTris-HCL、lmmol/LEDTA，即每升TE中含lOmmolTris-HCL、lmmolEDTA)溶解。利用引物HBV-DF、HBV-DR和SYBRGreenI染料進行實時定量PCR。其中HBV-DF:5，-TCACAATACCGCAGAGTC-3，HBV-DR:5,-AGCAACAGGAGGGATACA-3，如圖5所示(圖5中，-:陰性對照細胞(只加PBS的陰性對照組)；3TC:拉米夫定(加入拉米夫定的陽性對照組)；ANCC:抗病毒蛋白質(加入抗病毒蛋白質的實驗組))，檢測結果表明，該抗病毒蛋白質能夠降低細胞培養上清中核衣殼相關HBV-DNA的含量，并且隨著抗病毒蛋白質濃度的增高，該抗病毒蛋白質抑制HBV的能力也在逐漸增強。二、檢測抗病毒蛋白質對細胞漿內核衣殼相關HBV-DNA的影響實驗組HepG2.2.15細胞中加入不同終濃度(分別為0.2μg/ml、0.5μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml，終濃度指加入到每mlHepG2.2.15細胞中的抗病毒蛋白質的總μg數)的抗病毒蛋白質，陰性對照組只加PBS，陽性對照組中加入終濃度20μmol/L的3-TC(拉米夫定)。經過36h后，將細胞用冷PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌；洗滌后的細胞再用緩沖液A(10mmol/LHepes-NaOH、1.5mmol/LMgCl2、10mmol/LKC1、0.5mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)、PH8.0,即每升緩沖液A中含l0mmolHepes-NaOH、1.5mmolMgCl2、l0mmolKCl、0.5mmolDTT)冰上處理15min;再加入濃度為0.5%的NP40(nonidetP-40，非離子型去污劑NP40)渦旋10秒，12500g離心lmin，去除細胞核。上清中加入終濃度為10mmol/L的MgCl2(即加入MgCl2至MgCl2在上清中的最終濃度為10mmol/L)，并用200pg/ml的DNasel和lOOpg/ml的RNaseA在37℃的溫度下處理lh;14000g離心lmin，在離心后的上清中加入終濃度為10mmol/L的EDTA、終濃度為1%的SDS、終濃度為100mmol/L的NaCl、終濃度為200μg/ml的蛋白酶K(即在離心后的上清中，EDTA的最終濃度為l0mmol/L,SDS的最終濃度為1%，NaCl的最終濃度為100mmol/L，蛋白酶K的最終濃度為200μg/ml)，在37℃的溫度下處理2h。酚氯仿抽提去除蛋白質，水相中的DNA用酒精沉淀下來，再用PH值為8.0的TE(10mmol/LTris-HCL、lmmol/LEDTA)溶解。利用引物HBV-DF、HBV-DR和SYBRGreen染料進行實時定量PCR。其中HBV國DF:5，-TCACAATACCGCAGAGTC-3，HBV－DR:5'誦AGCAACAGGAGGGATACA-3'如圖6所示(圖6中，-:陰性對照細胞(只加PBS的陰性對照組)；3TC:拉米夫定(加入拉米夫定的陽性對照組)；ANCC:抗病毒蛋白質(加入抗病毒蛋白質的實驗組))，檢測結果表明，隨著抗病毒蛋白質濃度的增高，該抗病毒蛋白質表現出越來越強的抗病毒能力，位于HepG2.2.15細胞漿中的核衣殼相關HBV-DNA的含量逐步降低。三、分析抗病毒蛋白質對細胞漿中包裹于衣殼內的HBV前基因組RNA(核糖核酸)的影響實驗組HepG2.2.15細胞中加入抗病毒蛋白質，使其終濃度為10pg/ml(即每mlH印G2.2.15細胞中含10昭抗病毒蛋白質)，對照組只加PBS。經過36h后，用冷PBS洗滌細胞，再用裂解緩沖液(100mmol/LTris-HCL、l腿ol/LEDTA、l%NP-40、PH8.0,即每升裂解緩沖液含lOOmmolTris-HCL、lmmolEDTA、10mlNP-40)處理15min;14000g離心lmin，上清用抗核心抗原的抗體和Sepharose-A蛋白做免疫沉淀。為了破壞病毒的衣殼，將0.7ml裂解緩沖液(RNeasyKit,Qiagen公司)加入到0.2mlSepharose懸浮物中，劇烈渦旋后離心，去除Sepharose株，RNA用硅膠柱吸附，用無RNase(RNA酶)的DNasel(脫氧核糖核酸酶I)消化。利用引物HBV-RF、HBV-RR和SYBRGreen染料進行實時定量RT-PCR。其中HBV-RF為5，畫ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT隱3，HBV-RR為5，-ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3'如圖7所示(圖7中，HBV:帶有HBV基因組的HepG2.2.15細胞(對照組)；HBV+ANCC:加入了抗病毒蛋白質的HepG2.2.15細胞(實驗組))，檢測結果發現，終濃度IO)ig/ml的抗病毒蛋白質能夠使HBV感染細胞胞漿中包裹于衣殼內的HBV前基因組RNA的含量降低約IO倍左右。上述對實施例1制備的抗病毒蛋白質的抗病毒活性的第一三項檢測表明，實施例1制備的抗病毒蛋白質能夠有效抑制乙肝病毒(HBV)的復制，可用于制備治療乙肝病毒(HBV)感染的藥物。在其它實施例中，本發明還提供下述三種抗病毒蛋白質(1)這種抗病毒蛋白質的氨基酸序列是MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArg<formula>seeoriginaldocumentpage22</formula>這種抗病毒蛋白質包含一個穿膜肽結構域(GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgProProGin)和三個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域(這三個胞啼啶脫氨酶結構域依次是來自hAPOBEC3G分子N端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisProGluMetArgPhePheHisTrpPheSerLysTrpArgLysLeuHisArgAspGinGluTyrGluValThrTrpTyrlieSerTrpSerProCysThrLysCys、來自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisAlaGluArgCysPheLeuSerTrpPheCysAspAsplieLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrpSerProCysProGluCys、來自hAPOBEC3G分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisAlaGluLeuCysPheLeuAspVallieProPheTrpLysLeuAspLeuAspGinAspTyrArgValThrCysPheThrSerTrpSerProCysPheSerCys)，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體，穿膜肽結構域和胞嘧啶脫氨酶結構域之間、相鄰兩個胞嘧啶脫氨酶結構域之間用柔性連接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)連接，抗病毒蛋白質的N端和C端各有一個蛋白質純化標簽(HisHisHisHisHisHis)。(2)這種抗病毒蛋白質的氨基酸序列是<formula>seeoriginaldocumentpage22</formula><sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>這種抗病毒蛋白質包含一個穿膜肽結構域<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>和三個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域(這三個胞嘧啶脫氨酶結構域依次是來自hAPOBEC3G分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>、來自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>)，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體，穿膜肽結構域和胞嘧啶脫氨酶結構域之間、相鄰兩個胞嘧啶脫氨酶結構域之間用柔性連接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)連接，抗病毒蛋白質的N端和C端各有一個蛋白質純化標簽(HisHisHisHisHisHis)。(3)這種抗病毒蛋白質的氨基酸序列是<sequence>seeoriginaldocumentpage23</sequence>HeTyrArgValThrTrpPheHeSerTrpSerProCysPheSerTrpGlyCysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerHisValGluArgCysPheSerTrpPheCysAspAspHeLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrpSerProCysProGluCysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerHisValGluArgCysSerHeThrTrpPheLeuSerTrpSerProCysGlyGluCysGlyGlyGlyGlySerValAspLeuGluHisHisHisHisHisHis這種抗病毒蛋白質包含一個穿膜肽結構域(GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgProProGln)和四個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域(這三個胞嘧啶脫氨酶結構域依次是來自hAPOBEC3G分子N端的胞嘧咬脫氨酶結構域HisProGluMetArgPhePheHisTrpPheSerLysTrpArgLysLeuHisArgAspGinGluTyrGluValThrTrpTyrlieSerTrpSerProCysThrLysCys、來自hAPOBEC3B分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisAlaGluLeuArgPheLeuAspLeuValProSerLeuGinLeuAspProAlaGinlieTyrArgValThrTrpPhelieSerTrpSerProCysPheSerTrpGlyCys、來自hAPOBEC3F分子C端的胞嘧啶脫氨酶結構域HisAlaGluArgCysPheLeuSerTrpPheCysAspAsplieLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrpSerProCysProGluCys、來自rAPOBECl分子的胞嘧啶脫氨酶結構域HisValGluValAsnPhelieGluLysPheThrThrGluArgTyrPheCysProAsnThrArgCysSerlieThrTipPheLeuSerTrpSerProCysGlyGluCys)，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體，穿膜肽結構域和胞嘧啶脫氨酶結構域之間、相鄰兩個胞嘧啶脫氨酶結構域之間用柔性連接肽(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)連接，抗病毒蛋白質的N端和C端各有一個蛋白質純化標簽(HisHisHisHisHisHis)。上述三種抗病毒蛋白質的制備過程可參照實施例1。序列表<110>汕頭大學醫學院<120>—種抗病毒蛋白質及其應用<160>5<170>PatentinVersion3.3<210>1<211>597<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>CDS<222>(1)...(597)<220><221>misc—feature<222>(13)...(30)<223>N端6xHis標簽編碼序列<220><221>misc—feature<222>(103)...(141)<223>穿膜肽結構域編碼序列<220><221>misc—feature<222>(142)...(171)<223>柔性連接肽結構域編碼序列<220><221>misc—feature<222>(172》..(279)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列<220><221>misc—feature<222>(280)…(309)<223>柔性連接肽結構域編碼序列<220><221>misc一feature<222>(310),..(414)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列<220><221>misc—feature<222>(415)…(444)<223>柔性連接肽結構域編碼序列<220><221>misc—feature<222>(445)…(549)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域編碼序列<220><221>misc—feature<222>(577)…(594)<223>C端6xHis標簽編碼序列<400>1atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat60atggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatctggcaggaagaagcggaga120cagcgacgaagacctcctcsaggcggaggcggatcaggcggaggcggatcacacccagag180atgagattcttccactggttcagcaagtggaggaagctgcatcgtgaccaggagtatgag240gtcacctggtacatatcctggagcccctgcacaaagtgtggcggaggcggatcaggcgga300ggcggatcacatgcagagctgtgcttcctggacgtgattcccttttggaagctggacctg360gaccaggactacagggttacctgcttcacctcctggagcccctgcttcagctgtggcgga420ggcggatcaggcggaggcggatcacatgcagaaaggtgcttcctctcttggttctgtgac480gacatactgtctcctaacacaaactacgaggtcacctggtacacatcttggagcccttgc540ccagagtgtggcggaggcggatccgtcgscctcgagcaccaccaccaccaccactga597<210>2<211>198<212>PRT<213>人工序列<220><221>DOMAIN<222>(5)...(10)<223>N端6xHis標簽<220><221>DOMAIN<222>(35)…(47)<223>穿膜肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(48)…(57)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(58)...(93)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧徒脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(94)…(103)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(104)...(138)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧瞎脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(139)...(148)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(149),..(183)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(193)...(198)〈223〉C端6xHis標簽<400>2MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015<sequence>seeoriginaldocumentpage29</sequence><210>3<211>198<212>PRT<213>人工序列<220><221>DOMAIN<222>(5)...(10)<223>N端6xHis標簽<220><221>DOMAIN<222>(35)...(47)<223>穿膜肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(48)...(57)<223>柔性連接肽結構域<220><221〉DOMAIN<222>(58)...(93)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(94)...(103)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(104)...(138)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(139)...(148)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(149)...(183)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(193)...(198)〈223〉C端6xHis標簽<400>3<formula>seeoriginaldocumentpage31</formula><sequence>seeoriginaldocumentpage32</sequence>人工序列<sequence>seeoriginaldocumentpage32</sequence><sequence>seeoriginaldocumentpage32</sequence><221>DOMAIN<222>(48)...(57)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(58)...(92)<223>hAPOBEC3G分子C端胞嘧徒脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(93)...(102)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(103)...(137)<223>hAPOBEC3B分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(138)...(147)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(148)...(182)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(192)...(197)〈223〉C端6xHis標簽<400>4MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg202530GlySerGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgProProGinGly354045GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerHisAlaGluLeuCysPheLeu505560AspVallieProPheTrpLysLeuAspLeuAspGinAspTyrArgVal65707580ThrCysPheThrSerTrpSerProCysPheSerCysGlyGlyGlyGly859095SerGlyGlyGlyGlySerHisAlaGluMetCysPheLeuSerTrpPhe100105110CysGlyAsnGinLeuProAlaTyrLysCysPheGlnIleThrTrpPhe115120125ValSerTrpThrProCysProAspCysGlyGlyGlyGlySerGlyGly130135140GlyGlySerHisAlaGluArgCysPheLeuSerTrpPheCysAspAsp145150155160IleLeuSerProAsnThrAsnTyrGluValThrTrpTyrThrSerTrp165170175SerProCysProGluCysGlyGlyGlyGlySerValAspLeuGluHis180185190HisHisHisHisHis195<210>5<211>246<212>PRT<213>人工序列<220><221>DOMAIN<222>(5)…(10)23>N端6xHis標簽<220><221>DOMAIN<222>(35)...(47)<223>穿膜肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(48)…(57)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(58)...(93)<223>hAPOBEC3G分子N端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(94)…(103)<223>柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(104)...(140)<223>hAPOBEC3B分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(141)...(150)<223〉柔性連接肽結構域<220><221〉DOMAIN<222>(151)...(185)<223>hAPOBEC3F分子C端胞嘧啶脫氨酶結構域<220><221>DOMAIN<222>(186)...(195)<223〉柔性連接肽結構域<220><221>DOMAIN<222>(196)...(231)<223>rAPOBECl分子胞嘧啶脫氨酶結構域<220〉<221>DOMAIN<222>(241)…(246)〈223〉C端6xHis標簽<400>5<formula>seeoriginaldocumentpage36</formula><sequence>seeoriginaldocumentpage37</sequence>權利要求1、一種抗病毒蛋白質，其特征在于它是融合蛋白質，包含穿膜肽結構域和至少二個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體。2、根據權利要求l所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述抗病毒蛋白質包含至少三個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域。3、根據權利要求2所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述抗病毒蛋白質中的胞嘧啶脫氨酶結構域來自三種不同的APOBEC家族成員。4、根據權利要求2所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述抗病毒蛋白質包含至少四個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域。5、根據權利要求4所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述抗病毒蛋白質中的胞嘧啶脫氨酶結構域來自至少三種不同的APOBEC家族成員。6、根據權利要求15任一項所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域所具有的核心基序是H-X-E-(X)23-28-P-C-(X)2-4-C，其中H為組氨酸，E為谷氨酸，C為半胱氨酸，P為脯氨酸，X代表任意氨基酸。7、根據權利要求15任一項所述的抗病毒蛋白質，其特征是構成所述穿膜肽結構域的序列是下述具有穿膜肽活性的序列中的一種GRKKRRQRRRPPQ序列；DMTARGRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD序列；RKKRRQRRR序列；GALFLGWLGMGSTMGAWSQPKKKRKV序列；RQIKIWFQNRRMKWKK序列；GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL序列；KLALKLAALKAALKLA序列；RRRRRRRRR序列；AAVALLPAVLLALLAP序列。8、根據權利要求15任一項所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述抗病毒蛋白質中的胞嘧啶脫氨酶結構域是來源于AP0BEC家族中的人AP0BEC3G、人AP0BEC3F、人AP0BEC3B和大鼠AP0BEC1這四種蛋白質分子的胞嘧啶脫氨酶結構域。9、根據權利要求15任一項所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述抗病毒蛋白質中各結構域之間用柔性連接肽連接。10、根據權利要求9所述的抗病毒蛋白質，其特征是所述柔性連接肽是GGGG、GSSSG、GSGGSG、GGGGS、(GGGGS)2和(GGGGS)3中的一種或者任意多種的組合。11、權利要求110的抗病毒蛋白質在制備治療人類免疫缺陷病毒感染的藥物中的應用。12、權利要求110的抗病毒蛋白質在制備治療乙肝病毒感染的藥物中的應用。全文摘要一種抗病毒蛋白質，其特征在于它是融合蛋白質，包含穿膜肽結構域和至少二個來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域，穿膜肽結構域和各胞嘧啶脫氨酶結構域形成串聯體。本發明抗病毒蛋白質中，穿膜肽結構域使抗病毒蛋白質具有穿膜能力，能夠在細胞之間進行自由穿梭，并以一種非受體、非能量依賴的方式進入細胞內；來源于APOBEC家族的胞嘧啶脫氨酶結構域使得抗病毒蛋白質在進入細胞之后，能夠有效抑制人類免疫缺陷病毒和/或乙型肝炎病毒的復制；由于去除了APOBEC家族蛋白質分子中的非必需序列，因而不僅保留了APOBEC家族蛋白質分子的抗病毒活性，而且降低了抗病毒蛋白質的免疫原性，并提高了抗病毒蛋白質的穿膜效率。文檔編號C07K19/00GK101343327SQ20081003022公開日2009年1月14日申請日期2008年8月13日優先權日2008年8月13日發明者衡張,張丹桂,俊曾,李衛中,李康生,王革非,蕓蘇,崗辛,陳小璇,陳幼瑩申請人:汕頭大學醫學院