專利名稱：一種蛋白質及其在制備抗微生物產品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質及其在制備抗微生物產品中的應用。
背景技術：
與簡單的無機分子或是由微生物產生的抗生素類不同，抗菌肽是由基因編碼的，因而高等生物可以根據其表面的微生物對這些肽類抗生素的敏感性的變化來靈活調節其自身的分子結構，有廣譜、高效的殺菌活性。目前抗菌肽的潛在應用價值受到了國內外學者的廣泛關注。迄今發現的抗菌肽中，主要是小分子抗微生物肽(一般小于100個氨基酸)，這些內源性的短肽分子能夠破壞微生物細胞膜的結構或功能。在過去的20年里，在植物以及軟體動物和人等一系列多細胞動物的細胞和體液中發現了數百個這類抗微生物肽。大體上，可以粗略地將這些短肽分類為Cecropin樣抗菌肽、富含脯氨酸殘基的抗菌肽、含甘氨酸殘基的抗菌肽和富含半胱氨酸殘基的抗菌肽，其中富含半胱氨酸殘基的堿性抗菌肽被命名為防御素(defensin)。防御素具有廣譜及強力的抗微生物(細菌、真菌、病毒、寄生蟲等)特性，是人粘膜、皮膚以及上皮細胞的重要免疫作用分子。人防御素包括α、β和Θ三個家族，分子大小為29-45個氨基酸，含有六個半胱氨酸殘基，從而形成三對二硫鍵。其中，防御素家族在人基因組上約有40個成員，人β-防御素I (hBD-Ι)于1995年被發現，隨后在2000年左右hBD-2、hBD-3和hBD-4也相繼被發現。防御素具有廣譜的抗微生物活性。在體外，防御素在毫摩爾濃度下對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰 性菌均具有殺滅作用。其中，微克級水平的hBD-3對金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌等革蘭氏陽性致病菌，綠膿桿菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，以及酵母，都具有強烈的殺傷作用，并且對多重抗藥性的金黃色葡萄球菌和抗萬古霉素的糞腸球菌也可在較低濃度下發揮殺傷作用。hBD-4可以抑制革蘭氏陽性菌(如葡萄球菌)和革蘭陰性菌(如大腸埃希菌)的生長，同時抗綠膿桿菌的活性也很強。此外，β -防御素對病毒、真菌(如酵母等)等微生物也有抑制作用。β -防御素的直接殺菌作用是由于β -防御素分子呈陽性、帶正電荷，能夠與帶負電荷、呈陰性的細菌表面結合，結合后其分子中的疏水區可插入到細菌的胞膜，而其帶電區(帶正點荷)則與細菌胞膜上帶負電荷的磷脂頭部和水分子相互作用。在細胞膜上多個β -防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內，而胞內重要的鹽類、大分子等則泄漏到胞外，最終導致不可逆性的菌體死亡。β -防御素在細胞膜上的通道形成過程與膜的磷脂組成成分和所處的溫度環境等因素有關。然而，一旦β -防御素在膜上形成了通道，上述因素便不會對其通道的活動構成本質的影響。防御素的表達水平和活力受作用環境的鹽濃度和離子種類的影響。過高的鹽濃度(如IOOmM以上PBS緩沖液)會導致防御素活性水平急劇下降。一價離子對防御素活性影響較小，二價離子(如鈣、鎂離子)則可顯著降低防御素的活性。分析認為較高的鹽濃度(>50mM)可能會影響防御素的帶電量，進而降低其抗菌效果，而人體生理環境鹽濃度約為150mM，一定程度限制了防御素的臨床應用。因此，提升防御素的活性和耐鹽能力可推動防御素的實際應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種蛋白質及其在制備抗微生物產品中的應用。本發明提供的多肽，如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發明還保護具有所述多肽的蛋白質(包括將所述多肽進行一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白質，也包括將所述多肽與其他標簽蛋白或功能蛋白進行融合得到的融合蛋白)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發明還保護所述多肽、所述蛋白質、所述衍生物或所述組合物在制備抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產品中的應用。本發明還保護一種抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產品，其活性成分為所述多肽、所述蛋白質、所述衍生物或所述組合物。本發明提供的產品，除了所述有效成分外，可以添加藥學上允許的稀釋劑、賦形齊 、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、增效劑、添加劑等。本發明提供的產品，可為片劑、散劑、顆粒劑、液劑、乳劑或懸濁劑等，亦可為粉劑、
水劑、油劑、軟膏、硬膏、噴霧劑等。
本發明還保護所述多肽、所述蛋白質、所述衍生物或所述組合物在抑制微生物生長和/或殺滅微生物中的應用。以上任一所述的微生物可為細菌，具體可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌，更具體可為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌或表皮葡萄球菌。本發明通過改變現有防御素的氨基酸組成和部分序列，設計新的抗菌肽，通過影響多肽或其部分區域的二級結構、帶電荷量、疏水性等特性，從而保持或提高其抗微生物活性，并具有更好的耐鹽能力。本發明對于微生物，特別是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大價值。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次獨立重復實驗，結果取平均值。PBS緩沖液的制備方法:將8mmol Na2HPO4和2moI NaH2PO4溶于水并用水定容至IL0LB培養基的制備方法:取胰化蛋白胨(0X0ID，批號804054) 10g、酵母提取物(0X0ID,批號1173143)5g、NaCl (西隴化工股份有限公司，批號1207032) 10g，用蒸餾水定容至 1L，pH7.4。
MH培養基(水解酪蛋白培養基):青島海博生物技術有限公司，批號20121105。實施例1、抗菌肽的設計已報道的β -防御素3 (hBD-3)和β -防御素4 (hBD-4)的序列如下:β防御素3、4的氨基酸序列為:hBD-3:GI INTLQKYYCRVRGGRCAVLSC !LPKHHQI(；k| CSTRGRKCCRRKKhBD-4:EFELDRICGYGTARCRKKC jRSQEYR IGR CPNTYACCLRKffDESLLNRTKP根據已報道的β -防御素3和β -防御素4，設計新的抗菌肽如下:Η4 (序列表的序列 2):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSC bSQR￥Rlfiw| CSTRGRKCCRRKK。H4中，用hBD-4中的方框部分取代了 hBD_3中的方框部分。3N4I (序列表的序列 I):QKYYCRVRGGRCAVLSCRSQEYRIGRCSTRGRKCCRRKK。3N4I中，刪除了 H4中的下劃線部分。MIX-M (序列表 的序列 3):GIIAVLAKWCRVRKKRCAVLSCPRRAKRIGKCSTRGRKCCRRKK。MIX-M中，對H4中的若干氨基酸殘基進行了突變，見粗體字母。HBD3-M (序列表的序列 4):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEESISKCSTRGRKCCRRKK。HBD3-M中，對H4中的若干氨基酸殘基進行了突變，見粗體字母。實施例2、抗菌肽的合成委托上海波泰生物技術有限公司，采用9-芴甲氧羰基法(Fmoc固相合成法)分別合成 hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M 和 HBD3-M。合成工藝簡述如下:1、NovaSyn TGA樹脂(0.25mmol/g)作為固相載體；將10份的首個氨基酸以N，N- 二異丙基碳二亞胺(DIC) /4- 二甲氨基吡啶(DMAP)法加入到樹脂中(10份的Fmoc-氨基酸，5份的DIC，0.1份的DMAP);后續的氨基酸，以四倍于固相載體的量，同時加入 I 份的 Fmoc-氨基酸，I 份的 2- (lH-benzotriazole-1-yl) I, I, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate,I 份的 N-hydroxybenzotriazole,以及 2 份的N, N-diisopropylethylamine。2、Fmoc基團用30%的哌唳/NMP洗脫，合成后的多肽用含5%thioanisole,3%ethandithiol及2%anisole的三氟乙酸(TFA)去保護并從樹脂上分離；洗脫下的多肽用冰冷的乙醚沉淀，過濾后溶于水中，凍干，并用DTT還原。3、合成的多肽用反向高效液相層析(RP-HPLC)進行純化,樣品注入PhenomenexC18層析柱(25cm，內徑5mm)，用含0.1%TFA的蒸餾水(A液)和0.1%TFA的乙腈(B液)洗脫，收集下的組分凍干干燥并進行RP-HPLC分析。實施例3、抗菌肽的對微生物的抑制活性實驗菌株如下:大腸桿菌(Escherichiacoli):ATCC 編號為 25922 ；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia):ATCC 編號為 700603 ；銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosa):ATCC 編號為 1δ442 ；福氏志賀菌(ShigellafIexneri):CICC 編號為 21534 ;宋氏志賀菌(Shigellasonnei):CICC 編號為 21535 ;
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium):CICC 編號為 21484 ；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus):ATCC 編號為 29213 ;幾腸球菌(Enterococcusfaecalis):ATCC 編號為 29212 ;屎腸球菌(Enterococcusfaecium):ATCC 編號為 6057 ；表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis):ATCC 編號為 12228。CICC即中國工業微生物菌種保藏管理中心，網址為:http://www.china-cicc.0rg/οATCC即美國模式培養物集存庫，網址為:http://www.atcc.0rg/0實驗方法:(I)用液體培養基培養待測菌株至OD6tltol約為0.6，然后用PBS緩沖液稀釋，得到濃度為106CFU/ml的菌液；(2)在步驟(I)得到的菌液中加入待測多肽(即實施例2制備得到的hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M或HBD3-M ；H4即序列表的序列2所示的多肽，3N4I即序列表的序列I所示的多肽，MIX-M即序列表的序列3所示的多肽，HBD3-M即序列表的序列4所示的多肽)，37°C孵育3h ；(3)將步驟(2)得到的混合液用PBS緩沖液稀釋至1000倍體積后取100 μ I均勻涂布在固體培養基平板上，37°C培養12小時，觀察細菌生長與存活狀況，對活菌進行計數，采用Logit回歸模型計算LD90數值(即90%細菌死亡時對應的多肽濃度)。采用LB培養基(包括液體培養基和固體培養基)的實驗菌株為:大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌和鼠傷寒沙門氏菌。采用MH培養基(包括液體培養基和固體培養基)的實驗菌株為:金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和表皮葡萄球菌。各個多肽對各個細菌的LD90數值見表I。表I各個多肽對各個細菌的LD90數值(μ g/ml)
權利要求
1.多肽，如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。
2.具有權利要求1所述多肽的蛋白質、權利要求1所述多肽的衍生物或含有權利要求1所述多肽的組合物。
3.權利要求1所述多肽、權利要求2所述蛋白質、權利要求2所述衍生物或權利要求2所述組合物，在制備抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產品中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述微生物為細菌。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:所述細菌為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。
6.一種抑制微生物生長和/或殺滅微生物的產品，其活性成分為權利要求1所述多肽、權利要求2所述蛋白質、權利要求2所述衍生物或權利要求2所述組合物。
7.如權利要求6所述的產品，其特征在于:所述微生物為細菌。
8.如權利要求7所述的產品，其特征在于:所述細菌為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。
9.權利要求1所述多肽、權利要求2所述蛋白質、權利要求2所述衍生物或權利要求2所述組合物，在抑制微生物生長和/或殺滅微生物中的應用。
10.如權利要求9所述的 應用，其特征在于:所述微生物為細菌。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質及其在制備抗微生物產品中的應用。本發明提供的多肽，如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發明還保護具有所述多肽的蛋白質、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發明對于微生物，特別是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大價值。
文檔編號C07K14/47GK103193877SQ201310135178
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月18日 優先權日2013年4月18日
發明者王慧, 李濤, 劉雄, 郭峰, 郭通 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所