化合物二聚兔耳風萜a及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：：化合物二聚兔耳風萜a及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬醫藥
技術領域：
，具體涉及一種從植物大頭兔耳風中分離得到的新二聚倍半萜類化合物二聚兔耳風萜A(AinsliaidimerA)及其制備方法和應用。
背景技術：
：兔耳風屬(AinsliaeaDC)植物是菊科(Compositae)帚菊木族(MutisieaeCass)中的一屬，全世界70余種，我國有44種4變種，約占總數的37.5%。兔耳風屬植物藥用種類較多。廣泛用于治療感冒咳喘、風濕痹痛、跌打損傷、泌尿系統疾病等癥。我國的兔耳風植物資源主要分布在長江流域及西南華南各省。《上海市藥材標準》、《江西省中藥材標準》、《云南省藥品標準》、《衛生部藥品標準》均有收載。對兔耳風屬植物的化學成分研究始于20世紀80年代，主要集中在杏香兔耳風和械葉兔耳風上。據報道兔耳風屬植物主要含有倍半萜內酯、倍半萜苷、甾體、三萜類化合物，研究表明倍半萜內酯具有很好的抗腫瘤活性。且現代藥理及臨床應用表明該屬植物有很好的抗炎作用。目前對大頭兔耳風(卿croc印to/W化學成分的研究為空白。大頭兔耳風產于云南西北部和四川西南部，生于山坡林緣、針葉林下或山脊灌叢中，海拔26003100米，為多年生草本。《中國植物志》對大頭兔耳風的形態特征進行了詳細的描述。我們對采集自云南的大頭兔耳風進行了系統的化學成分研究，以期明確其化學成分，為天然藥物化學研究積累資料；發現具有良好活性的天然產物，為后續深入的研究開發提供物質基礎。
發明內容本發明的目的在于提供一種新的二聚倍半萜類天然化合物及其制備方法和其在制備抗炎、抗腫瘤中藥物中的應用。本發明是從大頭兔耳風(生長于中國云南麗江)中提取分離得到的一種新的二聚倍半萜類化合物，命名為二聚兔耳風萜A(AinsliaidimerA)，其化學結構式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>上述化合物的制備方法如下:(1)提取將大頭兔耳風干燥全草，粉碎，以8095%乙醇回流提取13次，每次12小時；合并提取液，對提取液減壓濃縮成流浸膏，加水稀釋后先以石油醚萃取，再以乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位；(2)分離將上述乙酸乙酯部位應用硅膠柱層析，以體積比為20:04:1的氯仿一甲醇系統梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含二聚兔耳風萜A的流分，再經葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為1:1的氯仿一甲醇洗脫，最后經C18反相柱層析，以體積比為4:66:4的甲醇一水進行洗脫，薄層層析檢測，得二聚兔耳風萜A。本發明的二聚倍半萜類化合物AinsliaidimerA為無色棱晶，由電噴霧離子質譜信號wA505[M-H]—，高分辨質譜得該化合物精密質量數為505.2170[M-H]—，推算其分子式為C30H34O7;該化合物結構通過X—衍射進一步確定。&和13(:核磁共振數據見表1。經實驗研究表明，本發明的化合物對腫瘤有明顯的抑制作用。因此，可用于制備抗腫瘤藥物。另外，該化合物對炎癥也有明顯的抑制作用，因此，可用于制備抗炎癥藥物。表lAinsliaidimerA的^和"C核磁共振數據<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>10147.10'150.011139.11'138.612170.12'169.013a6.19(d,3.0)119.13'a6.31(d，3.0)122,013b5.46(d,3.0)13'b5.61(d,3.0)14a5.15(brs)113.14'a4.96(brs)113.714b5.03(brs)14'b4.59(brs)152.19-2.30b33.115'2.04(m)26.3"Cand'HSppmrecordedat600MHz,偶合常數具體實施例方式下面通過實施例進一步描述本發明，使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例l:大頭兔耳風U/"s/^awacroce/^fe)全草5kg，以80%乙醇回流提取2次，每次2小時，提取液減壓濃縮成流浸膏，加水稀釋后先以石油醚萃取，再以乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位320g;將上述乙酸乙酯部位與300g硅膠混合拌樣，應用硅膠柱層析，以體積比為20:14:1的氯仿一甲醇系統梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含二聚兔耳風萜A的流分，再經葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為l:l的氯仿一甲醇洗脫，最后經C18反相柱層析，以體積比為4:66:4的甲醇一水進行洗脫，薄層層析檢測，得二聚兔耳風路A(AinsliaidimerA)純品198mg。實施例2:AinsliaidimerA的細胞毒活性實驗1、實驗材料1.1、受試樣品AinsliaidimerA用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000pg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用含DMSO的PBS(-)稀釋。1.2、細胞株A549(人肺癌細胞)LOVO(人腸癌細胞)6T-CEM(人T細胞白血病細胞)HL-60(人白血病細胞)HepG-2(人肝癌細胞)1.3、培養液RPMI1640+15。/。NBS+雙抗1.4、其他材料全自動酶標儀型號WellscanMK-2，生產廠商Labsystems進口96孔培養板等。2、試驗方法MTT法96孔板每孔加入濃度為46X1()4個/ml的細胞懸液10(^1，置37°C，5%C02培養箱內。24h后，加入樣品液，10)lU/孔，設雙復孔，37'C,5MC02作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20nl，作用4h后加入溶解液，100|^1/孔，置培養箱內，溶解后用MK-2全自動酶標儀測570nmOD值。3、試驗結果結果見表2，結果顯示，AinsliaidimerA對人肺癌細胞，人腸癌細胞，人T細胞白血病細胞，人白血病細胞和人肝癌細胞均有較好的抑制活性，AinsliaidimerA有很好的抗腫瘤作用，具有良好的開發前景。實施例3:AinsliaidimerA對小鼠S180肉瘤(實體型)的療效實驗1、實驗材料1.1受試樣品AinsliaidimerA用少量吐溫一80助溶后用0.5%CMC配成溶液。1.2動物品系昆明種小鼠來源第二軍醫大學實驗動物中心提供。合格證號滬動合證字107號體重18—20g性別雌性。1.3移植性腫瘤小鼠S180肉瘤，由上海醫藥工業研究院傳代維持。2、實驗方法取生長良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理鹽水以1:4稀釋，每只小鼠腋皮下接種0.2ml,隨機分組，分為對照組，環磷酰胺組(CTX組，20mg/kg，ipX7)、AinsliaidimerA(5mg/kg)組，接種后次日起給藥，給藥體積為0.5ml/20g體重，連續灌胃7天。接種后10日脫頸處死動物，稱動物體重后解剖取瘤塊，稱瘤重。結果判定根據以下公式對照組平均瘤重一給藥組平均瘤重腫瘤抑制率％=-x100%對照組平均瘤重3、實驗結果AinsliaidimerA有顯著的抑瘤作用。實驗結果見表3。表2AinsliaidimerA對人體腫瘤細胞的體外增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3AinsliaidimerA對小鼠S180肉瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。實施例4:AinsliaidimerA抗炎實驗小鼠耳腫脹模型1實驗動物Swiss種小鼠，雄性，體重20-24g。2.實驗模型和測試方法取小鼠50只，隨機分成5組，按表4所示的劑量灌胃給藥3d，于末次給藥后lh,用0.05ml的二甲苯將小鼠左耳致炎，用直徑為7mm的打孔器將雙耳重疊打孔，將打下的圓片在扭力天平(靈敏度為萬分之一)上稱量，用鼠耳兩圓片的重量差表示其腫脹度。3統計分析全部實驗結果均以均數土標準誤表示。用studentt-檢驗比較各組數據與空Q組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗結果表4.AinsliaidimerA對小鼠耳腫脹試驗的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01結果表明，陽性對照藥氫化可的松、AinsliaidimerA對小鼠耳腫脹模型引起的炎癥有顯著的抑制作用。實施例5:AinsliaidimerA抗炎實驗大鼠角叉菜膠足腫脹模型1實驗動物SD大鼠，雌雄兼用，體重180-220g。2.實驗模型和測試方法取大鼠50只，隨機分成5組，按表5所示的劑量灌胃給藥4d，于末次給藥前測量致炎前容積；末次給藥后30min,于大鼠右后肢足跎皮下注射1%角叉菜膠0.1ml致炎。分別于致炎后2、4、6h測量右踝關節以下容積。3統計分析全部實驗結果均以均數士標準誤表示。用studentt-檢驗比較各組數據與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗結果表5.AinsliaidimerA對大鼠角叉菜膠足腫脹試驗的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01結果表明，陽性對照藥地塞米松、AinsliaidimerA對大鼠角叉菜膠足腫脹模型所引起的炎癥有顯著的抑制作用。實施例6:AinsliaidimerA抗炎實驗小鼠腹腔毛細血管通透性試驗1實驗動物NH系小鼠，雌雄兼用，體重18-22g。2.實驗模型和測試方法取大鼠50只，隨機分成5組，按表6所示的劑量灌胃給藥lh，尾靜脈注射2%依文思藍生理鹽水溶液0.1ml/10g體重，隨即腹腔注射0.8y。醋酸生理鹽水溶液0.20ml/只，20min后脫頸椎處死小鼠，用5ml生理鹽水分數次洗滌腹腔，3000轉/分，離心15min;取上清液用酶標儀于570nm比色測定其光密度(OD)值。3統計分析全部實驗結果均以均數士標準誤表示。用studentt-檢驗比較各組數據與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗結果表6.AinsliaidimerA對小鼠腹腔毛細血管通透性試驗的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與空白組比較，*p<0.05,**P<0.01結果表明，陽性對照藥地塞米松、AinsliaidimerA對小鼠腹腔毛細血管通透性試驗引起的炎癥有顯著的抑制作用。權利要求1、一種化合物，名稱為二聚兔耳風萜A，其特征在于化學結構式如下2、如權利要求1所述的化合物二聚兔耳風萜A的制備方法，其特征在于具體歩驟如下(1)提取將大頭兔耳風干燥全草，粉碎，以8095%乙醇回流提取13次，每次12小時；合并提取液，對提取液減壓濃縮成流浸膏，加水稀釋后先以石油醚萃取，再以乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位；(2)分離將上述乙酸乙酯部位應用硅膠柱層析，以體積比為20:04:1的氯仿一甲醇系統梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含二聚兔耳風萜A的流分，再經葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為1:1的氯仿一甲醇洗脫，最后經C18反相柱層析，以體積比為4:66:4的甲醇一水進行洗脫，薄層層析檢測，得二聚兔耳風萜A。3、根據權利要求1所述的化合物二聚兔耳風萜A在制備抗炎藥物中的應用。4、根據權利要求1所述的化合物二聚兔耳風萜A在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發明屬于醫藥
技術領域：
，具體為一種化合物二聚兔耳風萜A及其制備方法和應用。本發明化合物二聚兔耳風萜A從大頭兔耳風中提取分離得到，為無色棱晶，其分子式為C₃₀H₃₄O₇。經實驗表明，該化合物具有明顯的抑制腫瘤和抑制炎癥的作用，因此，可用于制備抗腫瘤藥物和抗炎癥藥物。文檔編號C07D307/94GK101318946SQ200810035858公開日2008年12月10日申請日期2008年4月10日優先權日2008年4月10日發明者張衛東,徐希科,李慧梁,柳潤輝,沈云亨,娟蘇申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學