奈瑟球菌蛋白質的雜合和串聯表達的制作方法

專利名稱：：奈瑟球菌蛋白質的雜合和串聯表達的制作方法
技術領域：
：本發明屬于蛋白質表達領域。具體涉及奈瑟球菌(vVw'"er^)(如淋病奈瑟球菌(A^worrfoeaee)或優選腦膜炎奈瑟球菌(Ayz朋iA^'z^'o^s))的蛋白質表達。
背景技術：
：參考文獻1和2揭示了參考文獻3到6所述奈瑟球菌蛋白質表達的一種另和改進的方法。一個這種方法是生成"雜合性"蛋白質，此蛋白中兩種或多種奈瑟球菌蛋白質表達為一條多肽鏈。此方法有兩個優點。首先，自身表達可能不穩定或弱的蛋白質可通過加入適當的伴侶來協助克服其問題。第二，簡化工業生產，因為僅需采用一次表達和純化即可產生兩種單獨有用的蛋白質。本發明的一個目標是進一步提供另一種和改進的奈瑟球菌蛋白質表達方法。發明的概述雜合蛋白質因此發明提供同時表達兩種或多種(如3、4、5、6或更多)奈瑟球菌蛋白質的方法，其中連接所述兩種或多種蛋白質從而使它們被翻譯成一條多肽鏈。一般，本發明的雜合蛋白質可表示為公式NH2-A-[-X-L-]n-B-C00H，其中X是一條氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整數。n的值在2和x之間，x的值通常是3、4、5、6、7、8、9或10。n優選是2、3或4;更優選是2或3;最優選n二2。-X-部分本發明有兩種主要的雜合蛋白質組。這兩組不互相排斥。在第一組中，各-X-部分是(a)orfl、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、醒B1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列;(b)與(a)的氨基酸序列有序列相同性的氨基酸序列；或(c)含(a)的氨基酸序列片斷的氨基酸序列優選(a)的亞組是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961和983。更優選的(a)的亞組是orf46.1、287、741和961。圖3顯示優選的雜合蛋白質。在第二組中，該雜合蛋白質包括第一個-x-部分(-Xa-)和第二個-x-部分(-X「)。-X"部分具有下列氨基酸序列之一(d)參考文獻3所述的446個偶數序列編號SEQIDs(即2、4、6...890、892);(e)參考文獻4所述的45個偶數SEQIDs(即2、4、6...88、90);(f)參考文獻5所述的1674個偶數SEQIDs2-3020、偶數SEQIDs3040-3114和所有的SEQIDs3115-3241;(g)參考文獻7的2160個氨基酸序列，麗B0001到醒B2160;(h)參考文獻1或2所述的氨基酸序列。-Xh-部分與-Xa-的關系如下(i)-Xb-與-Xa-具有序列相同性和/或(j)-Xh-包括-x"的片斷。此第二種雜合性蛋白質例子包括的蛋白質中有兩個或多個相同的-x-部分，或它們是同一蛋白質的變體，如同一蛋白質的兩種多態，可表示為-Xa-三種多態型，可表示為-Xa-Xh-X。等。-Xa-Xh-部分可以是從N-末端到C-末端的任一順序。-Xa-部分優選是orfl、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、麗B1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列。-Xa-部分更優選是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961和983。-Xa-部分最優選是orf46.1、287、741或961氨基酸序列。這些蛋白質中，各n-X-部分與其它各-X-部分具有序列相同性，此蛋白質稱為"串聯蛋白質"。優選11=2的串聯蛋白質。(b)和(i)中的'序列相同性，程度優選大于50%(如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高直至100%)。這包括突變體、同源物、直向同源物、等位基因變體等(如參見參考文獻8)。相同性優選通過MPSRCH程序(OxfordMolecular)中應用的Smith-Waterman同源性檢索算法來確定，使用參數空格開放罰分(gap叩enpenalty)=12和空格延伸罰分(gapextensionpenalty)=1的相關空格檢索。通常，將兩個蛋白質間50%或更高的相同性視為功能相等的指征。(c)和(j)中所指'片斷，應包括(a)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的氨基酸序列的至少m個連續氨基酸，取決于具體序列。m是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更大)。這些片斷優選包含(a)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)氨基酸序列的抗原表位。優選的片斷見參考文獻9和10所述。優選的(c)和(j)片斷是C-和/或N-末端的截短物(如Al-287、A2-287等)。優選的(b)、(c)和(j)序列刪除了聚甘氨酸序列。已發現這樣有助于表達[參考文獻2]。聚甘氨酸序列可表示為(GlyK，其中g》3(如4、5、6、7、8、9或更大)。如果-X-部分包含其野生型中的聚甘氨酸序列，在本發明的雜合蛋白質中優選刪除此序列。這可以通過破壞或去除(Gly)g，如通過缺失(如CGGGGS—CGGGS、CGGS、CGS或CS)、通過取代(如CGGGGS—CGXGGS、CGXXGS、CGXGXS等)禾口/或通過插入(如CGGGGS—CGGXGGS、CGXGGGS等)而實現。優選缺失(Gly)g，缺失直至包含聚甘氨酸序列的蛋白質N-末端部分(如缺失SEQID1中的殘基1-32)本文稱為'AG'。刪除聚甘氨酸序列具體用于蛋白質287、741、983和Tbp2(AG287、△G741、AG983和AGTbp2-參考文獻1和2)。優選的(c)和(j)片斷刪除了整個蛋白質結構域。這具體用于蛋白質961、287和0RF46。一旦蛋白質在概念上分成結構域，(c)和(j)片斷可刪除一個或多個這些結構域(如287B、287C、287BC、0RF46剛、0RF4643:!—卿、961c-參考文獻2;本文圖4和5)。287蛋白質在概念上分成三個結構域，稱為A、B和C(參見參考文獻2的圖5)。結構域B具有IgA蛋白酶的排列，結構域C具有轉鐵蛋白-結合蛋白的排列，結構域A顯示與數據庫序列無強排列。287的多態型排列見參考文獻8所述。0RF46在概念上分成兩個結構域種和血清型之間非常保守的第一結構域(氨基酸1-433:0RF46.1)和不很保守的第二結構域(氨基酸433-608)。優選缺失該第二結構域，留下0RF46.1。0RF46的多態型排列見參考文獻8所述。961蛋白質在概念上分成幾個結構域(圖4)。如果-x-部分含有野生型的前導肽序列，可將它包含在本發明的雜合蛋白質中或刪除。當刪除此前導肽時，這是(c)和(j)中氨基酸序列的優選例子。在一個實施方案中，缺失此前導肽，除了位于雜合蛋白質N-末端的-X-部分，即保留X,的前導肽，但出去刪去X2…X。的前導肽。這相當于缺失所有前導肽并采用X,的前導肽作為部分-A-。當『2時，-X-部分的優選配對是AG287和230;AG287和936;AG287和741;961c和287;961c和230;961c和936;961cL和287;961cL和230;961cL和936;0RF46.l和936;0RF46.1和230;230和961;230和741;936和961;936和741。當n=2時，串聯蛋白質的-X-部分優選配對是AG741和741;AG287和287。更具體的是，當『2時優選下列X^PX2的組合x2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中287以全長形式使用，優選287位于雜合蛋白質的C-末端；如果287要用于N-末端，優選使用287的AG形式。類似的，當741以全長形式使用時，優選位于雜合蛋白質的C-末端；如果它要用于N-末端，優選使用741的AG形式。-L-部分對于[-X-L-]的各n實例，接頭氨基酸序列-L-可以存在或沒有。例如，當11=2時，雜合物可以是麗廠X,-L-X2-L2-C00H、NH2-X,-X廠C00H、NH2-X廣L,-X2-C00H、NH2-X「X2-L2-C00H等。接頭氨基酸序列-L-通常較短(如20個或更少氨基酸即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括能促進克隆的短肽序列、聚甘氨酸接頭(即Gly。，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)和組氨酸尾(即His。，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它適合的接頭氨基酸序列是本領域技術人員懂得的。有用的接頭是GSGGGG(SEQID27)，其中Gly-Ser二肽形成自Aadn限制性酶切位點從而有助于克隆和操作，Gl^四肽是典型的聚甘氨酸接頭。如果X。+,是AG蛋白質且L。是甘氨酸接頭，這相當于不是AG蛋白質且沒有Ln的Xn+i。-A-部分-A-是任選的N-末端氨基酸序列。它通常較短(如40個或更少氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導蛋白質運輸的前導序列，或者有利于克隆或純化的短肽序列(如含有組氨酸尾即His。，其中r^3、4、5、6、7、8、9、IO或更大)。其它適合的N-末端氨基酸序列是本領域技術人員懂得的。如果X,缺乏自身的N-末端甲硫氨酸，-A-可以是甲硫氨酸殘基。-B-部分-B-是任選的C-末端氨基酸序列。它通常較短(如40個或更少氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指導蛋白質運輸的序列、有利于克隆或純化的短肽序列(如包含組氨酸尾即Hi&，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。或提高蛋白質穩定性的序列。其它適當的c-末端氨基酸序列是本領域技術人員懂得的。蛋白質的多態型形式本發明可使用任何腦膜炎奈瑟球菌菌株的氨基酸序列。因此涉及的具體蛋白質(如'287'或'0RF46.1')包括任何菌株的蛋白質。菌株間的序列變化包括在(b)、(c)、(i)和(j)中。腦膜炎奈瑟球菌血清群B的參考序列包括:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>參考文獻8揭示了蛋白質0RF4、0RF40、0RF46、225、235、287、519、726、919和953的多態型形式。961的多態形式見參考文獻11和12所述。任何這些多態形式可用于本發明。本文所列序列包括己鑒定的蛋白質741(SEQIDs1-22)和NMB1343(SEQIDs23-24)的多態形式。血清群和菌株本發明的優選蛋白質包括-X-部分，其具有腦膜炎奈瑟球菌血清群B中發現的氨基酸序列。在本發明的單個蛋白質中，各個-X-部分可以來自一種或多種菌株。例如當n-2時，X2可以來自與X,相同或不同的菌株。當『3時，菌株可以是(i)X,=X2=X3(ii)X產X2#X3(iii)X#X2=X3(iv)X^X^X^(v)Xt=&#2等。在血清群B中，優選的-X-部分來自菌株2996、MC58、95N477或394/98。菌株95N477有時在本文中稱為'ET37'，這是其電泳形式。菌株394/98有時在本文中稱為'nz'，因為它是新西蘭菌株。當使用287的一種形式時，優選來自菌株2996或來自菌株394/98。當使用741的一種形式時，優選來自血清群B的菌株MC58、2996、394/98或95N477,或者血清群C的菌株90/18311。當使用961的一種形式時，優選來自菌株2996。菌株以下標表示，如741^8是菌株MC58的蛋白質741。除非另有說明，本文所提及的蛋白質(如沒有下標)來自腦膜炎奈瑟球菌菌株2996，它可作為'參考'菌株。然而要理解的是本發明一般不受菌株的限制。如上所述，一般涉及的蛋白質(如'287，或'919，等)包括任何菌株的蛋白質。通常與2996有90%或更高的序列相同性(如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。蛋白質961的結構域為基礎的表達參考文獻1和2揭示了蛋白質如何在概念上分成結構域且蛋白質如何以這些結構域的基礎進行操作。本發明將此方法擴展應用于蛋白質961(也稱為'NadA'[11、12])。在腦膜炎奈瑟球菌血清群B的菌株2996中，NadA有405個氨基酸。此蛋白質在概念上分成下列九個結構域(圖4):<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>此信息可用于定位其它961形式中的相同結構域已用各種方法從菌株2996中的961缺失掉這些結構域(圖5)。961的優選片斷刪除了些幾個結構域如下的一個或多個-961-2到961-5('961a，)-961-6到961-9('961b，)-961-1到961-8('961cL，)-961-2到961-8('961c，)-961-2到961-6和結構域961-7的氨基酸287-325('961d，)-961-2到961-8和結構域961-9的氨基酸351-383('961Al，)-961-1到961-8和結構域961-9的氨基酸351-383('961A1L，)-961-1到961-7和結構域961-8的氨基酸331-343('961cL-Aaro，)961-1到961-6和結構域961-7的氨基酸287-315('961cL-Acc，)-961-1到961-5('961aL，)-961-1到961-4('961aL-Al，)-961-l到961-3('961aL-A2，)-961-1到961-2('961aL-A3，)這13個片斷(和其一端或兩端缺少l、2、3、4或5個氨基酸的亞片斷)是優選的(c)和(j)片斷，但它們也可自身表達，即不是本發明的雜合蛋白質形式。因此本發明提供含這些片斷之一的蛋白質，此蛋白質不是全長961且不是參考文獻1或2具體描述的蛋白質。此蛋白質可以是融合蛋白(如GST-融合或His-尾融合)序列本發明還提供具有SEQIDs1—24的氨基酸序列的蛋白質。也提供與這些蛋白質具有序列相同性的蛋白質和核酸。如上所述，'序列相同性'程度優選大于50%(如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)。本發明還提供編碼這些蛋白質的核酸。此外，本發明提供優選在'高嚴緊性，條件下(如65'C在0.lxSSC、0.5%SDS溶液中)可與此核酸雜交的核酸，發明也提供編碼本發明蛋白質的核酸。還應理解的是本發明提供的核酸包含與上述序列互補的序列(如用于反義或探測目的)。本發明的核酸當然可以許多方法制備(如通過化學合成，從基因組或cDNA文庫，從生物體本身制備等)，并可采用各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。此外，術語"核酸"包括DNA和RNA以及它們的類似物，如含修飾主鏈的類似物和肽核酸(PNA)等。混合物本發明還提供一種組合物，該組合物包含兩種或多種(即2、3、4、5、6或7)以下蛋白質(1)287(2)741(3)0RF46.1(4)961(5)NH2-A-[-X-L—]n-B-C00H，其中n=2，X產287，X2=953(6)NH2—A—[-X-L—]—B-COOH，其中n=2，X產287，X2=919(7)NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n=2，X產287，X2=961此混合物可包含一種或兩種下列蛋白質，與(1)到(7)的兩種或多種或僅與(1)到(7)中的一種蛋白質組合(8)NH2—A-[-X—L-]n-B—C00H，其中n=2，X,=287，X2=741(9)NH廠A-[-X-L-]n-B-C00H，其中n=2，X產936，X2=741當蛋白質287和741包括在此混合物中時(即在蛋白質1、2、5、6、7或8中)，它們可能是'AG'形式。當包括蛋白質961時，優選'961c'形式，其中沒有N-末端前導序列和c-末端膜錨定序列。優選的混合物包含下列三種蛋白質(5)961c，優選961c鵬6(如本文的SEQID31);(6)NH2-A-[-X-L-]n-B-C00H，其中n為2，-X「是AG287(優選AG287股)，-X廠是缺乏前導肽的953(優選953，)，-L,-是GSGGGG且-A-包括N-末端甲硫氨酸(如-A-是M或MA)(如本文的SEQIDs28和29);(7)NH2-A-[-X-L-]-B-C00H，其中n=2，X^936(優選936腦)，X2=AG741(優選AG741MCM)，L'=GSGGGG(如本文的SEQID30)。此混合物也可包含腦膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡。異源宿主當本發明的蛋白質在奈瑟球菌中表達時，本發明優選使用異源宿主。異源宿主可以是原核生物(如細菌)或真核生物細胞。優選大腸桿菌，但其它適當的宿主，包括枯草芽孢桿菌(萬aci77^swZ"7i\s)、霍亂弧菌(K2'Zjri0c力o7arae)、傷寒沙門桿菌(5"3〗7z7朋e7〗3Ot力j')、鼠傷寒沙門桿菌(5^2歷tMeWatyp力、乳酰胺奈瑟菌(射m"'3hcz^肌'c3)、脊髓灰質炎奈瑟菌(Afej'臟i3ci臟ea)、分枝桿菌(#yCo/de^is)(如結核分枝桿菌)、酵母等。載體等本發明提供(a)編碼上述蛋白質的核酸(b)含有這些核酸序列的載體(c)含所述載體的宿主細胞(d)含本發明蛋白質或核酸的組合物，也許其適合用作免疫原性組合物(如疫苗)或用作診斷試劑(e)這些組合物作為藥物(如疫苗)或作為診斷試劑的用途(f)這些組合物在生產(1)治療或預防奈瑟球菌感染的藥物(2)檢測奈瑟球菌或抗奈瑟球菌抗體存在的診斷試劑，和/或(3)提高抗奈瑟球菌抗體的制劑的用途，以及(g)治療病人的方法，包括給予病人治療有效量的這些組合物。實施本發明通常包括以下基本步驟獲得編碼第一種蛋白質的第一種核酸；獲得編碼第二種蛋白質的第二種核酸；連接第一種和第二種核酸。可將所得核酸插入表達載體中或可作為表達載體的一部分。為改進溶解性，純化雜合蛋白質時可包括本文所述重折疊技術。免疫原性組合物和藥物本發明的組合物優選是免疫原性組合物，更優選疫苗組合物。該組合物的pH值優選在6和7之間。此pH值可通過采用緩沖液來維持該組合物可以是無菌的。本發明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即治療感染)，但一般是預防性的。本發明也提供本發明的組合物作為藥物用途。藥物優選能提高哺乳動物免疫應答(即它是免疫原性組合物)，更優選是疫苗。本發明也提供本發明組合物在生產能提高哺乳動物免疫應答的藥物中的用途。藥物優選是疫苗。本發明也提供提高哺乳動物免疫應答的方法，該方法包括給予有效量的本發明組合物的步驟。免疫應答優選是保護性的。此方法可提高加強的免療應答。哺乳動物優選是人。當此疫苗用于預防時，優選的人是兒童(如初學走路的孩子或嬰兒)；當疫苗用于預防時，優選的人是成年人。針對兒童的疫苗也可給予成人，以例如評估安全性、劑量、免疫原性等。這些用途和方法優選用于預防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血病、淋病等)。優選預防和/或治療細菌腦膜炎。此組合物的其它成分除上述成分外，本發明的組合物通常包含一種或多種'藥學上可接受的遠載體'，包括自身不誘導接受此組合物的個體產生有害抗體的任何遠載體。適當的遠載體一般是大的代謝緩慢的大分子、如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖(W000/56365)和脂類凝聚物(如油滴或脂質體)。這種遠載體是本領域技術人員熟知的。此疫苗也可包含稀釋液，如水、鹽水、甘油等。此外，輔助物質如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等可存在。藥學上可接受賦形劑的完整論述可獲自《Remington藥物科學》(Remington'sPharmaceuticalSciences)。用作疫苗的免疫原性組合物包括免疫有效量的抗原以及任何其它需要的上述成分。'免疫有效量'指將此劑量以單劑量或作為系列劑量的一部分給予個體，能有效地治療或預防。此劑量的變化取決于待治療個體的健康和身體情況、年齡、待治療個體的分類(如非人靈長類動物、靈長類動物等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需保護的程度、疫苗的配方、治療醫生對醫療情況的評估和其它相關因素。預期此劑量有相對寬的范圍，可通過常規試驗確定。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括強化劑量)。此疫苗可結合其它免疫調節劑施用。疫苗可結合其它免疫調節劑施用。除(或取代)鋁鹽外，該組合物可包含其它佐劑。能提高該組合物效果的優選佐劑包括但不限于(1)水包油乳劑(含有或沒有其它特定免疫刺激劑如胞壁酰肽(見下)或細菌細胞壁成分)，例如(a)MF59(W090/14837;參考文獻中的第10章)，含5°/。鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%Span85(任選含MTP-PE)，用微流化劑制成亞微米顆粒、(b)SAF，含10%鯊烯、0.4%吐溫80和5%pluronic-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亞微米乳劑或旋渦混合產生較大顆粒大小的乳劑、(c)Ribi"佐劑系統(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton,MT)，含2%鳘烯、0.2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁成分，選自單磷酰脂質A(MPL)、海藻糖dimycolate(TDM)和細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(Detox);(2)皂角苷佐齊U，如可使用QS21或Stimulon(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或它們所產生的顆粒如ISCOMs(免疫刺激復合物)，ISCOMS可避免采用其它去污劑，如WO00/07621;(3)弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA);(4)細胞因子，如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(W099/44636)等)、干擾素(例如Y干擾)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷酰脂質A(MPL)或3-0-脫酰基MPL(3dMPL)，如GB-2220221、EP-A-0689454;(6)3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑的組合，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231;(7)含CpG基序的寡核苷酸[KriegFsc"'/7e2000，19，618-622;KriegC〃rr0p2V2#W77er20013:15-24;Roman等.，TfeL#e《1997，3，849-854;Weiner等.，/WA〃5"j，1997，94，10833-10837;Davis等.，//Mff"y70丄，1998，160，870-876;Chu等，/#eo^1997,186，1623-1631;Lipford等.，i5kr.i"腳朋o丄，1997，27，2340-2344;Moldoveanu等.，Facc^e,1998，16.1216-1224，Krieg等.，7fet"re,1995，374，546-549;Klinman等.，/WA〃M，1996，93,2879-2883;Ballas等.，/，M9^^5/斜。-^^'Co^err/iyzyz7朋t^756",457。-75",〃a&ei77等Ce777腳朋o丄，1996，167,72-78;Yamanoto等.，,C朋cer7e5.，1988，79，866-873;Stacey等.，/.，1996，157，2116-2122;Messina等，/T/fflz"/o丄，1991，147，1759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清群B菌株中，屬于高毒性譜系ET-5、ET-37和A4簇，但該基因在所有測試的譜系3菌株中缺乏。即使不屬于高毒性譜系，大部分測試的血清群C菌株為陽性。對于含血清型2a和2b的血清群B菌株也同樣如此。對于血清群A，屬于亞群III的一菌株為陽性，而另兩種屬于亞群IV-1的菌株為陰性。淋病奈瑟菌中和乳酰胺奈瑟菌與脊髓灰質炎奈瑟球菌的共生種類中缺乏961。圖4和5顯示蛋白質961中的結構域。當蛋白質961的錨定區域(結構域9)缺失并在大腸桿菌中表達時，此蛋白質被輸出到周質，分泌于培養物的上清中。為進一步研究，在結構特征基礎上(就961cAaro突變體而言缺失芳香族殘基，和其它情況中缺失巻曲螺旋區)構建了缺失961C-末端區域的突變體(961cL-△aro、961cLAcc、961aL、961aL-Al、961aL-A2、961aL-A3)。分析這些突變體表達和分泌入周質和培養物上清中的情況。在所有這些缺失突變體中，蛋白質大量產生、存在于周質組分中且釋放到培養物上清中。△G287-雜交菌株的殺菌活性克隆了5個不同腦膜炎奈瑟球菌血清群B菌株的287并對其進行操作以去掉N-末端至聚甘氨酸區域末端并引入C-末端組氨酸尾。這產生了5種AG287蛋白質。這些蛋白質用FCA作佐劑用于產生小鼠免疫血清，隨后測試了血清對所有5種血清群B菌株以及血清群A和C菌株的殺菌活性。殺菌滴度如下<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*抗同源菌株的滴度以粗體表示重折疊為改進一些雜合蛋白質的可溶蛋白質水平，采納了參考文獻2所述的另外重折疊方案。包含體(IBs)的分離如下1.細胞(5mg濕重)用ultraturrax(1000rpm)4。C在25ml0.1MTris-HC1pH7.1、lmMEDTA中勻漿。2.每克細胞加入1.5ml溶菌酶，用ultraturrax簡單混合，4。C孵育30分鐘。3.用超聲波或高壓勻漿(Frenchpress)破裂細胞。4.為消化DNA，加入MgCl2到3mM終濃度和加DNA酶到10ug/ml終濃度，25。C孵育30分鐘。5.加入0.5體積的60mMEDTA、6%TritonX-100、1.5MNaClpH7到溶液中，4。C孵育30分鐘。6.4°C31000g(20,OOOrpm)離心10分鐘沉降包含體。7.用ultraturrax重懸浮沉淀于40ml0.1Mtris-HC1pH7、20mMEDTA中。8.重復離心步驟6。9.可使用包含體沉淀或-2(TC凍存。雜合蛋白質如下在大腸桿菌中表達<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>溶解沉淀、重折疊、超濾、透析，隨后純化得到蛋白質:0RF46.1-961-HisIBs溶解如下將IB蛋白質重懸浮于4ml6M鹽酸胍、ImMEDTApH8.5緩沖液中到lmg/ml的蛋白質終濃度。為重折疊此蛋白質，取2ml溶解的蛋白質在400ml重折疊緩沖液(0.lMTris-HCl、1ML-精氨酸、2mMEDTApH8.2)中稀釋并15"C孵育1小時，得到5yg/ml濃度的蛋白質。隨后，另加入2ml溶解的蛋白質并在相同溫度再孵育l小時，得到10wg/ml終濃度的蛋白質。該物質用300mlAraicon超濾裝置(8400)超濾，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴壓力，產生130ral的終體積。超濾后物質用12-14kDa截留值的再生纖維素管狀(Cellus印-St印bio)膜以10L0.1MTris-HC1pH8.2緩沖液透析24小時。進行第二次透析，以10L300mMNaCl、50mM磷酸鈉pH8.0緩沖液透析24小時。透析后物質在Beckman離心機轉子JA25.5中以22000rpm4。C離心45分鐘。離心后分離的上清用于進行His-尾純化。orf46.1-961cHisIBs溶解如下將IB蛋白質重懸浮于4ml6M鹽酸胍、lmMEDTApH8.5緩沖液中到lmg/ral的蛋白質終濃度。為重折疊此蛋白質，取2ral溶解的蛋白質在400ml重折疊緩沖液(0.5MTris-HCl、lML-精氨酸、2mMEDTApH8.2)中稀釋并15"C孵育1小時，得到5ug/ml濃度的蛋白質。隨后，另加入2ral溶解的蛋白質并在相同溫度下再孵育1小時，得到10ug/ml終濃度的蛋白質。該物質用300mlAmicon超濾裝置(8400)超濾，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴壓力，產生150ml的終體積。超濾后物質用12-14kDa截留值的再生纖維素管狀(Cellus印-St印bio)膜以10L0,1MTris-HClpH8.2緩沖液透析24小時。進行第二次透析，以10L300函NaCl、50mM磷酸鈉pH8.0緩沖液透析24小時。透析后物質在Beckman離心機轉子JA25.5中以22000rpm4。C離心45分鐘。離心后分離的上清用于進行His-尾純化。961c-orf46.1HisIBs溶解如下將IB蛋白質重懸浮于4ml6M鹽酸胍、lmMEDTApH8.5緩沖液中到lmg/ml的蛋白質終濃度。為重折疊此蛋白質和2ml溶解的蛋白質在400ml重折疊緩沖液(0.lMTris-HC1、0.5ML-精氨酸、2mMEDTApH8.2)中稀釋并15'C孵育1小時，得到5iig/ml濃度的蛋白質。隨后，另加入2ml溶解的蛋白質并在相同溫度下再孵育1小時，得到10ug/ml終濃度的蛋白質。該物質用300mlAmicon超濾裝置(8400)超濾，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴壓力，產生150ml的終體積。超濾后物質用12-14kDa截留值的再生纖維素管狀(Cellus印-St叩bio)膜以10L0.1MTris-HClpH8.2緩沖液透析24小時。進行第二次透析，以10L300mMNaCl、50mM磷酸鈉pH8.0緩沖液透析24小時。透析后物質在Beckman離心機轉子JA25.5中以22000rpm4"C離心45分鐘。離心后分離的上清用于進行His-尾純化。orf46.1-741HisIBs溶解如下將IB蛋白質重懸浮于4ml6M鹽酸胍、lmMEDTApH8.5緩沖液中到10mg/ml的蛋白質終濃度。為重折疊此蛋白質，取2ral溶解的蛋白質在400ml重折疊緩沖液(0.5MTris-HC1、0.7ML-精氨酸、2mMEDTApH7.2)中稀釋并15。C孵育1小時，得到50yg/ml濃度的蛋白質。隨后，另加入2ml溶解的蛋白質并在相同溫度再孵育1小時，得到100ug/ml終濃度的蛋白質。該物質用300mlAmicon超濾裝置(8400)超濾，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴壓力，產生120ml的終體積。超濾后物質用12-14kDa截留值的再生纖維素管狀(Cellus印-St印bio)膜以10L0.1MTris-HClpH8.2緩沖液透析24小時。進行第二次透析，以10L300mMNaCl、50mM磷酸鈉pH8.0緩沖液透析24小時。透析后物質在Beckman離心機轉子JA25.5中以22000rpm4。C離心45分鐘。離心后分離的上清用于進行His-尾純化。與參考文獻2所述純化的蛋白質相比，殺菌試驗滴定度如下:蛋白質參考文獻2重折疊后CFA氫氧化鋁氫氧化鋁MF59磷酸鋁0RF46.1-961-His8192819232768——0RF46.卜961c-His8192128<648192—961c-0RF46.1His32768102416384—orf46.卜741His<416<4256—當沒有His-尾表達時(，46.1K，)，將類似過程用于0RF46.1以從IBs純化此蛋白質蛋白質培養物體積(升)燒瓶體積(升)溫度('C)最終的產生的包含體(w/w)280RF46.IK553713.729.4將IB蛋白質重懸浮于4ml6M鹽酸胍、ImMEDTApH8.5緩沖液中到lOmg/ml的蛋白質終濃度。為重折疊，取2ml溶解的蛋白質在400ml重折疊緩沖液(0.5MTris-HC1、0.7ML-精氨酸、2mMEDTApH7,2)中稀釋并15。C孵育1小時，得到50iig/ml濃度的蛋白質。隨后，另加入2ml溶解的蛋白質并在相同溫度下再孵育1小時，得到100ug/ral終濃度的蛋白質。該物質用300mlAmicon超濾裝置(8400)超濾，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴壓力，產生120ml的終體積。超濾后物質用12-14kDa截留值的再生纖維素管狀(Cellus印-St印bio)膜以10L50mM磷酸鈉、2mMEDTApH7.2緩沖液透析12小時。以10L相同緩沖液進行第二次24小時透析。透析后物質在Beckman離心機轉子JA25.5中以22000rpm4。C離心45分鐘。離心后分離的上清用于陽離子交換層析。純化在AKTA探測器層析系統(Amershara-PharmaciaBiotech)上進行，釆用5mlHiTrapSP瓊脂糖HP柱(Amersham-PharmaciaBiotech)。應用流速為1.5ml/每分鐘。尾析柱用35ml50mM磷酸鈉緩沖液pH7.2洗滌。用50raM磷酸鈉緩沖液pH7.2進行線性梯度(0-1MNaCl)洗脫。蛋白質洗脫在92mM和320mMNaCl的兩個峰中。收集含各個峰的組分并分別命名為合并液1和合并液2。與參考文獻2所述純化的蛋白質相比，用氫氧化鋁作佐劑時殺菌試驗滴度從〈4提到到1024。此重折疊蛋白質用磷酸鋁作佐劑的滴度為2048。ELISA滴度如下蛋白質鋁佐劑Elisa(M7)SBA(2996)0rf46.lk(合并液1)氫氧化鋁3.3mg/ml1212512磷酸鋁0.6mg/ml15410240rf46.lk(合并液2)氫氧化鋁3.3mg/ml10851024磷酸鋁0.6mg/ml2501024應理解本發明僅通過實施例作了描述，可進行修改且同時使這些修改保持在本發明的范圍和思路內。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>M986-ET371000(5)-其它NGE28(13)-其它載體NGH38(14)-其它載體BZ232(18)-其它F6124(23)-subIIIA:-.-Cll-C:-畫B-nd8047-ndISS759-ndC:2b:P1.2ISS1113-ndC:2:P1.565/96-nd4:P1,142996(96)-ndB:2b:P1.5，2參考文獻(其內容納入本文供參考)1-W001/64920.2-國際專利申請WOO1/64922.3-國際專利申請W099/24578.4-國際專利申請W099/36544.5-國際專利申請W099/57280.6-國際專利申請WO00/22430.7-Tettelin等，(2000)Science287:1809-1815.8-國際專利申請WO00/66741.9-國際專利申請W000/71574.10-國際專利申請W001/0431611-國際專利申請PCT/IB02/03396.12-Comanducci等，(2002)JExpMed195:1445-1454.13-VaccineDesign:subunit&amp;adjuvantapproach(1995)Powell&Newman(ISBN:030644867X).14-國際專利申請W001/52885.15-Bjune等，(1991)Lancet338(8775):1093-1096.16-Fukasawa等，(1999)Vaccine17:2951-2958.17-Rosenqvist等，(1998)Dev.Biol.Stand.92:323-333.18-Costantino等，(1992)Vaccine10:691-69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able>245<210〉5<211〉279<212〉PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220〉<223〉741,來自菌株2996〈400〉5MetThrArgSerLys15LeuThrAlaAlaLeu20ValAlaAlaAsplie35LeuAspHisLysAsp50ValArgLysAsnGlu65ThrTyrGlyAsnGly85LysValSerArgPhe100LeulieThrLeuGlu115SerAlaValValAla130lieAspSerLeulie145GlyGluHisThrAla165HisGlyLysAlaPhe180ThrlieAspPheAla195LysThrProGluGin210AspGluLysSerHis225GluGluLysGlyThr245GlulieAlaGlySer260lieGlylieAlaGly275<210>6〈211>229〈212〉PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)〈220〉〈223〉741,來自菌株30/00<400〉6LysAspLysGlyLeuGinSerI>euThrLeuAspGinSerValArgLys151015ProlieGlyLysLys70AspAspSerleuAsn150PheSerAlaAsnAla230丁yrAlaValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerLysVal215ValHisThrGinAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinAspGin200GlulieLeuValArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAsp185GlyLeuLeuAlaLys265Thr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170AlaHisAlaGlyLeu250lieAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155AspGlyGlyAlaAsp235PheGlyPheCysCysSerAlaThr60GinLysGlu丁yrAsn140ValGlyGlyLysAla220ThrGlyGluGlyGly30LeuThr45LeuAspGlyAlaLeuLysVslAsp110LysGin125AsnProSerGly[>ysAlaLysLeu190lieGlu205GluLeuArgTyrAspArgLysVal270LeuSer15GlyGlyAlaProGinSerGluLys80AsnAsp95GlyGinAspHisAspLysLeuGly160GluTyr175ThrTyrHisLeuLysAlsGlySer240AlaGin255HisGluAsnAsnArgLeu65ThrMetThrThrAsp145ProLysLysAlaLeu225GluGlyPhe50GluAlaValSerAla130PheGluArgGlyGly210Ala<210><211><212><213〉<220>〈223〉ValLeuVal65ThrLysLeuSerlie145GlyHisThrAlaAsp50ArgTyrVallieAla130AspGluGlyAsp35AspSerPheAlaPhe115PheAlaLeuHisSer195SerAlaLeu20SerPheGlyGin匕ys100AspGlyAlaAsnAla180TyrAlaLysLysLeulieGluThr85Arg[>ysSerLysVal165ValSerGluGinLeuAsnArgPhe70GluGinLeuAspGin150AsplieLeuValAlaThrGin55GinGinPheProAsp135GlyLeuSerGlyLys215AlaGly40lieVallieArgGlu120AlaAsnAlaGlylie200ThrGin25LysGluTyrGinlie105GlyGlyGlyAlaSer185PheValGlyLeuVallysAsp90GlyGlyGlyLysAlaLysAspGin75SerAspArgLyslie155Al3Asp170ValLeuGlyGlyAsnGlyGluAsnGly60SerGlulieAlaLeu140GlulieTyrLyslie220279PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株312294<400>MetThr1LeuArgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerHisSerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrAlaLys5LeulieAspGluGly85PheGluAlalieAla165PheProlieGlyLysLys70AspAspSerLeuAsn150PheSerValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinAspArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAspThr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170AlaAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155AspGlyLysAsp45GinHisHisAlaThr125ThrHisLysAsnAla205ArgPheSerAlaThr60GinLysGlu丁yrAsn140ValGlyGlyCyGlyLeu45LeuGlyLeuValLys125AsnSerLysLysThr30LysLeuSerSerGly110TyrTyrLeuProGin190GinHissCysGly30ThrAspAlaLysAsp110GinProGlyAlaLeuTyrVallieAlaGly95GluArgThrLysAsp175AlaGlulieGlySerThrLeu80LysHisGlylieSer160GlyGluValGlyLeu15GlyAlaGinGluAsn95GlyAspAspLeuGlu175ThrSerGlyProSerLys80AspGinHisLysGly160Tyr丁yr39ThrlieLysThr210AspGlu225GluGluGlulielieGly〈210〉<211〉<212〉<213><220〉<223><400>Asp!>ys1GluLysGlyAspPheAsp50GluSer65AlaPheValAlaSerPheAlsPhe130PheAls145GluLeuArgHisGlySerGlySer210AlaAla225<210〉<211〉<212〉<213〉<220〉<223>180185AspPheAlaAlaLysGinGly195200ProGluGinAsnValGluLeu215LysSerHisAlaVallieLeu230LysGly丁hrTyrHisLeuAla245AlaGlySerAlaThrValLys260265lieAlaGlyLysGin275190HisGlyLyslieGluHisLeu205AlaAlaAlaGluLeuLysAla220GlyAspThrArgTyrGlySer235240LeuPheGlyAspArgAlaGin250255lieGlyGluLysValHisGlu2708228PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株39/998GlyLeuLeuLys20SerLeu35PhelieGlyGluGinThrLysArg100AspLys115GlySerAlsLysAsnValAlaVal180TyrSer195AlaGluLysGinGin5LeuAsn/\rgPheGlu85GinLeuAspGinAsp165lieLeuValSerAlaThrGinGin70GinPheProAspGly150LeuSerGlyLysLeuAlaGlylie55VallieArgGluAla135AsnAlaGlylieThr215ThrGinLys40GluTyrGinlieGly120GlyGlyAlaSerPhe200ValLeuGly25LeuValLysAspGly105GlyGlyLysAlaVal185GlyAsnAsp10AlaLysAspGinSer90AspArgLyslieAsp170LeuGlyGlyGinGluAsnGlySer75GlulieAlaLeuGlu155lie丁yrLyslieSerLysAspGin60HisHisAlaThrThr140HisLysAsnAlaArg220ValThrLys45LeuSerSerGlyTyr125TyrLeuProGinGin205HisArgTyr30VallieAlaGlyGlu110ArgThrLysAspAla190GlulieLysAsn15GlyAsnSerArg丁hrLeuLeuThr80LysMet95HisThrGlyThrlieAspSerPro160GlyLys175GluLysValAlaGlyLeu9279PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株5/99<400>MetThr1LeuValLeuVal65ThrLysLeuSerlie145GlyHisSerlysAsp225GluGlulieThrAlaAsp50ArgTyrVallieAla130AspGluGlylieThr210GluGlulieGly9ArgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerHisLysAsp195ProLysLysAlalie275SerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrAla180PheGluSerGlyGly260Ala匕ys5LeulieAspGluGly85PheGluAlalieAla165PheThrGinHisThr245SerGlyProlieGlyLysLys70AspAspSerLeuAsn150PheSerLysAsnAla230TyrAlaLysValLeuAlaGly55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerLysVal215ValHisThrGinAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinAspGin200GlulieLeuValArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAsp185GlyLeuLeuAlaLys265Thr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170ProTyrAlaGlyLeu250lieAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155SerAsnGlySerAsp235PheArgPheCysSerGlyAlaLeu45丁hrLeu60GinGlyLysLeuGluValTyrLys125AsnAsn140ValSerGly匕ysGlyArgArglie205AlaGlu220ThrArgGlyAspGluLysCysGly30ThrAspAlaLysAsp110GinProGlyAlaLeu190GluLeu丁yrArgVal270Leu15GlyAlaGinGluAsn95GlyAspAspLeuGlu175HisHisLysGlyAla255HisSerGlyProSerLys80AspGinHisLysGly160丁yrTyrLeuAlaGly240GinGlu<210〉10<211>280〈212〉PRT<213〉腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)〈220〉<223>741,來自菌株67/00<400>MetThrLeuValLeuVal65ThrThrAlaAsp50ArgTyr10ArgAlaAla35HisLysGlySerAla20AspLysAsnAsnLys5LeulieAspGluGly85ProlieGlyLysLys70AspValAsnArgLeuAlaSer55LeuSerThrAla25GlyLeu40LeuGinLysLeuLeuAsnThr10CysAlaSerAlaThr90AlaSerAspLeuAla75GlyPheCysSerGlyAlaLeu45ThrLeu60GinGlyCysGly30ThrAspAlaLysLeuLysPhe15GlyAlaGinGluAsn95SerGlyProSerLys80AspSerSer145GlyTyrTyrLeuVallieAla130GlyGluArgThrLys210AspPro225GinAspGinGluHislieSerThr115LeuLysHisGlylie195SerGluGluValGly275Arg100LeuThrMetThrThr180AspProLysLysAla260LeuPheGluAlaValSer165AlaPheGluHisGly245GlyAlaAspSerLeuAla150PhePheAlaLeuHis230SerSerAlaPheGlyGin135LysAspGlyAlaAsn215AlaTyrAla匕yslieGlu120ThrArgLysSerLys200ValValSerGluGin280Arg105PheGluArgLeuAsp185GinGlulieLeuVal265GinGinGinPhePro170AspGlyLeuSerGly250GlulieGluValTyrGluGin140Lyslie155LysAspAlaGlyHisGlyAlaThr220GlySer235liePheThrAlaValLys125AspGlyValGlyLys205AlaAsp110GinProAspMetLys190lieTyrValLeuGlyGlyAsnGly270GlySerGlulieAla175LeuGlulieTyrGin255lieGinHisHisAla160ThrThrHisLysAsn240AlaHis<210>11<211>225<212>PRT<213〉月畝膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)〈220〉<223〉741,來自菌株BZ169<400>LeuGin1LysLeulieGlu65ThrArgLysSertys145ValValSerLeuAsnArg50PheGluGinLeuAsp130GinAsplieLeu11SerAlaThr35GinGinGinPhePro115AspGlyLeuSerGly195LeuAla20GlylieVallieArg100GluAlaAsnAlaGly180lieThr5GinLysGluTyrGin85lieGlyGlyGlyAla165SerPheLeuGlyLeuValLys70AspGlyGlyGlyLys150AlaValGlyAspAlaLysAsp55GinSerAspArgLys135lieAspLeuGlyGinGluAsn40GlySerGlulieAla120LeuGlulieTyrLys200SerLys25AspGinHisHisAla105ThrThrHisLysAsn185AlaVal10丁hrLysLeuSerSer90GlyTyrTyrLeuPro170GinGinArgLysAsnGluTyrGlyValSerlieThr60AlaLeu75GlyLysGluHisArgGlyThrlie140LysSer155AspGlyAlaGluGluValAsnGly30ArgPhe45LeuGluThrAlaMetValThrSer110ThrAla125AspPheProGluLysArgLysGly190AlaGly205Lys15AspAspSerPheAla95PhePheAlaLeuHis175SerSerLeuSerPheGlyGin80LysAspGlyAlaAsn160AlaTyrAlaGluValLysThrValAsnGlylieArgHislieGlyLeuAlaAlaLys210215220Gin225<210〉<211〉<212〉<213><220><223〉〈400〉LeuGin1LysLeuLeuAsnlieArg50GluPhe65ThrGluArgGinLysLeuSerAsp130LysGin145ValAspVallieSerLeuGluVal210Gin22512225PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株72/0012SerLeuThrLeuAsp5GinGlyAla20ThrGly35GinlieGinValGinliePheArg100ProGlu115AspAlaGlyAsnLeuAlaSerGly180Glylie195LysThrLysLeuLysGluValAsp55TyrLysGin70GinAspSer85lieGlyAspGlyGlyArgGlyGlyLys135GlyLyslie150AlaAlaAsp165SerValLeuPheGlyGlyValAsnGly215GinSerValArgLysAsnGluLysLeu1015GluLysThrTyrGlyAsnGlyAspSer2530AsnAspLysVsSerArgPheAspPhe4045GlyGinLeulieThrLeuGluSerGly60SerHisSerAlaLeuThrAlaPheGin7580GluHisSerGlyLysMetValAlaLys9095lieAlaGlyGluHisThrSerPheAsp105110AlaThrTyrArgGlyThrAlaPheGly120125LeuThrTyrThrlieAspPheAlaAla140GluHisLeuLysSerProGluLeuAsn155160lieLysProAspGlyLysArgHisAla170175TyrAsnGinAlaGluLysGlySerTyr185190LysAlaGinGluValAlaGlySerAla200205lieArgHislieGlyLeuAlaAlaLys220<210〉13<211〉280<212>PRT〈213〉腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220><223>741,來自菌株93/114<400>13MetThrArgSerLysProValAsnArgThrAlaPheCysCysPheSer151015LeuThrAlaAlaLeulieLeuThrAlaCysSerSerGlyGlyGlyGly202530ValAlaAlaAsplieGlyAlaGlyLeuAlaAspAlaLeuThrAlaPro354045LeuAspHisLysAspLysSerLeuGinSerLeuThrLeuAspGinSerVal65ThrLysLeuSerSer145GlyTyrTyrLeuPro225GinGinHis50ArgTyrVallieAla130GlyGluArgThrLys210AspAspGlulie<210〉<211〉<212>〈213〉<220〉<223〉<400>Met1LeuValLeuVal65ThrLysLeuSerlie145GlyThrThrAlaAsp50/\rgTyrVallieAla130AspGlulysGlySerThr115LeuLysHisGlylie195SerGluGluValGly275AsnAsnArg100LeuThrMetThrThr180AspProLysLysAla260LeuGluGly85PheGluAlaValSer165AlaPheGluHisGly245GlyAlaLys70AspAspSerLeuAla150PhePheAlaLeuHis230SerSerAla55LeuSerPheGlyGin135LysAspGlyAlaAsn215AlaTyrAlaLysLeulieGlu120ThrArgLysSerLys200ValValSerGluGin280LeuAsnArg105PheGluArgLeuAsp185GinGlulieLeuVal265AlaThr90GinGinGinPhePro170AspGlyLeuSerGly250GluAla75GlylieValGluLys155LysAlaHisAlaGly235lieThr60GinLysGluTyrGin140lieAspGlyGlyThr220SerPheAlaGlyAlaLeu[>ysVslAsp110LysGin125AspProGlyAspValMetGlyLys190Lyslie205AlaTyrValLeuGlyGlyAsnGly27014279PRT月畝膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株95N47714ArgAlaAla35His!>ysGlySerThr115ValSerHisSerLys5L_euAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrlieAspGluGly85PheGluAlalieAla165ProlieGlyLysLys70AspAspSerLeuAsn150PheValI>euAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuThr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170AlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155SerPheCysCysSerAlaThr60GinLysGluTyrAsn140ValGlyGlyGly30LeuThr45LeuAspGlyAlaLeuLysValAsp110LysGin125AsnProSerGlyLysAlaGluAsn95GlySerGlulieAla175LeuGlulieTyrGin255lieLeu15GlyAlaGinGluAsn95GlyAspAspLeuGlu17580AspGinHisHisAla160ThrThrHisLysAsn240AlaHisSerGlyProSerLys80AspGinHisLysGly160丁yrHisSerLysAsp225GluGlulieGlylieThr210GluGlulieGly〈210〉<211〉〈212〉<213〉<220〉<223〉<400〉Met1LeuValLeuVal65ThrLysLeuSerlie145GlyHisThrLysAsp225GluGlulieThrThrAlaAsp50ArgTyrVallieAla130AspGluGlylieThr210GluGlulieGlyLysAsp195ProLysLysAlalie275Ala180PheGluSerGlyGly260AlaPheThrGinHisThr245SerGlySerLysAsnAla230TyrAlaLysSerLysVal215ValHisThrGinAspGin200GlulieLeuValAsp185GlyLeuLeuAlaLys265ProTyrAlaGlyLeu250lieAsnGlyArgGlySerAsp235PheArgArglie205AlaGlu220ThrArgGlyAspGluLys15279PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株9621715ArgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerHisLysAsp195ProLysLysAlalie275Serl-ys5LeuAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrAla180PheGluSerGlyGly260AlalieAspGluGly85PheGluAlalieAla165PheAlaGinHisThr245SerGlyProlieGlyLystys70AspAspSerLeuAsn150PheSerAlaAsnAla230TyrAlaLysValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerLysVal215ValHisThrGinAsnThrGly40LeuLys[>eulieGlu120lieArgGinAspGin200GlulieLeuValAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAsp185GlyLeuLeuAlaLys265Thr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170AlaHisAlaGlyLeu250lieAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155AspGlyGlyAlaAsp235PheGlyPheCysSerGlyAlsLeu45ThrLeu60GinGlyLysLeuGluValTyrLys125AsnAsn140ValSerGlyLysGlyLysLyslie205AlaGlu220ThrArgGlyAspGluLysLeu190GluLeuTyrArgVal270CysGly30ThrAspAlaLysAsp110GinProGlyAlaLeu190GluLeuTyrArgVal270HisHisLysGlyAla255HisLeu15GlyAlaGinGluAsn95GlyAspAspLeuGlu175ThrHis匕ysGlyAla255HisTyrLeuAlaGly240GinGluSerGlyProSerLys80AspGinHisLysGly160TyrTyrLeuAlaSer240GinGlu45<210〉<211><212〉<213><220〉<223〉16280PRT月齒膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株BZ133<400〉MetThr1LeuValLeuVal65ThrLysLeuSerSer145GlyTyrTyrLeuPro225GinGinHisThrAlaAsp50ArgTyrValHeAla130GlyGluArgThrLys210AspAlaGlulie16ArgAlaAla35His匕ysGlySerThr115LeuLysHisGlylie195SerLysGluValGly275SerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuThrMetThrThr180AspProLysLysAla260LeuLys5LeulieAspGluGly85PheGluAlaValSer165AlaPheGluArgGly245GlyAlaProlieGlyLysLys70AspAspSerLeuAla150PhePheAlaLeuHis230SerSerAlaValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135LysAspGlyAlaAsn215AlaTyrAlaLysAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120ThrArgLysSerLys200ValValSerGluGin280ArgThr10AlaCys25LeuGinLeuAsnArg105PheGluGinLeuAsp185GinAsplieLeuVal265AlaSerAlaThr90GinGinGinPhePro170AspGlyLeuSerGly250GluAlaSerAspLeuAla75GlylieValValArg155GluAlaHisAlaGly235lieThrPheCysCysSerAlaThr60GinLysGluTyrGin140lieGlySerGlyAla220SerPheAla<210>17<211〉279<212〉PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220〉<223><400>MetThr1LeuThr741,來5菌株BZ23217GlyGly30LeuThr45LeuAspGlyAlaLeuLysValAsp110LysGin125AspSerGlyAspGlyArgGlyLys190Lyslie205SerAspValLeuGlyGlyAsnGly270Leu15GlyAlaGinGluAsn95GlySerGlulieAla175LeuGlulie丁yrGin255lieSerGlyProSerLys80AspGinHisHisAla160ThrThrHisLysAsn240AlaArgArgSerLysProValAsnArgThrAlaPheCysCys510AlaAlaLeulieLeuThrAlaCysSerSerGlyGly202530ValAlaAlaAsplieGlyAlaGlyLeuAlaAspAlaLeuThr354045Leu15GlyAlaSerGlyProLeuVal65ThrLysThrSerlie145GlyHisSerLysAsp225GluGlulieAsp50Arg丁yrVallieAla130AspGluGlylieThr210GluGlulieGly<210><211><212>〈213><220〉<223〉ValLeuVal65ThrLysLeuSerlie145GlyHisLysGlySerThr115ValSerHisLysAsp195ProLys[>ysAlalie275LysAsnAsnArg100LeuValLeuThrAla180PheGluSerGlyGly260AlaLysLys70AspAspSerLeuAsn150PheSerLysAsnAla230TyrAlaGlyLysAspGluGly85PheAlaAlalieAla165PheThrGinHisThr245SerSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerLysVal215ValHis丁hrGinLeuLysLeulieGlu120lieArgGinAspGin200GlulieLeuValGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAsp185GlyLeuLeuAlaLys265SerAlaThr90GinGinLysPhePro170ProTyrAlaGlyLeu250lieLeuAla75GlylielielieLeu155AspThr60GinLysGluTyrAsn140ValGlyGlyLeuValLys125AsnSer匕ysAsnGlyArgGlySerAsp235PheArgArglie205AlaGlu220ThrArgGlyAspGluLys18279PRT朋i膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來6菌株C11<400>MetThr1LeuThrAlaAsp50ArgTyrVallieAla130AspGlu18ArgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerHisSerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrLys5LeulieAspGluGly85PheGluAlalieAlaProlieGly[>ysLys70AspAspSerLeuAsn150PheValleuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuThr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPheProAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155SerAspAlaLysAsp110GinProGlyAlaLeu190Glu[>euTyrArgVal270PheCysSerGlyAlaLeu45ThrLeu60GinGlyLysLeuGluValTyrLys125AsnAsn140ValSerCysGly30ThrAspAlaLysAsp110GinGinGluAsn95GlyAsnAspLeuGlu175HisHisLysGlyAla255HisProGlyGlyLysAlaLeu15GlyAlaGinGluAsn95GlyAspAspLeuGluSerLys80AspGinHisLysGly160TyrTyrLeuAlaGly240GinGluSerGlyProSerLys80AspGinHisLysGly160TyrHisSerLysAsp225GluGlulieGlylieThr210GluGlulieGlyLysAsp195Pro匕ysLysAlalie275Ala180PheGluSerGlyGly260Ala165PheThrGinHisThr245SerGlySerLysAsnAla230TyrAlaLysSerLysVal215ValHisThrGinAspGin200GlulieLeuValAsp185GlyLeuLeuAlaLys265170Pro丁yrAlaGlyLeu250lieAsnGlyArgGlySerAsp235PheArgArglie205AlaGlu220ThrArgGlyA印GluLys<210>19〈211〉279<212>PRT〈213〉腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220><223〉<400〉MetThr1Leu741，來自菌株M1090ValLeuVal65ThrLysLeuSerlie145GlyHisThrLysAsp225GluGlulieThrAlaAsp50ArgTyrVallieAla130AspGluGlylieThr210GluGlulieGly19/\rgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerHisLysAsp195ProLysLysAlalie275SerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrAla180PheGluSerGlyGly260AlaLys5LeulieAspGluGly85PheGluAlalieAla165PheAlaGinHisThr245SerGlyProlieGlyLysLys70AspAspSerLeuAsn150PheSerAlaAsnAla230TyrAlaLysValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerLysVal215ValHisThrGinAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinAspGin200GlulieLeuValArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAsp185GlyLeuLeuAlaLys265Thr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170AlaHisAlaGlyLeu250lieAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155SerGlyGlySerAsp235PheArgPheCysSerGlyAlaLeu45ThrLeu60GinGlyLysLeuGluValTyrLys125AsnAsn140ValSerGlyLysGlyLysLyslie205AlaGlu220ThrArgGlyAspGluLysLeu190GluLeuTyrArgVal270CysGly30ThrAspAlaLysAsp110GinProGlyAlaLeu190GluLeuTyrArgVal270175HisHisLysGlyAla255HisLeu15GlyAlaGinGluAsn95GlyAspAspLeuGlu175ThrHisLysGlyAla255HisTyrLeuAlaGly240GinGluSerGlyProSer匕ys80AspGinHisLysGly160TyrTyrLeuAlaGly240GinGlu<210〉<211〉<212〉<213〉<220〉<223〉<400>MetThr1LeuThrValAlaLeuAsp50ValArg65ThrTyrLysValThrlieSerAla130lieAsp145GlyGluHisGlySerlieLysThr210AspGlu225GluGluGlulielieGly20279PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株M109620ArgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerHisLysAsp195ProtysLysAlalie275SerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuThrAla180PheGluSerGlyGly260Alalys5LeulieAspGluGly85PheAlaAlalieAla165PheThrGinHisThr245SerGlyProlieGlyLysLys70AspAspSerI>euAsn150PheSerLysAsnAla230TyrAlaValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnSerLysVal215ValHisThrGinAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgGinAspGin200GlulieLeuValArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerLeuAsp185GlyLeuLeuAla匕ys265Thr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPhePro170ProTyrAlaGlyLeu250lieAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155AspAsnGlySerAsp235PheArgPheCysSerGlyAlaLeu45ThrLeu60GinGlyl>ysLeuGluValTyrLys125AsnAsn140ValSerGlyLysGlyArgArglie205AlaGlu220ThrArgGlyAspGluLysCysLeuSer15GlyGlyGly30丁hrThrProAspGinSerAlaGluLys80LysAsnAsp95AspGlyGin110GinAsnHisProAspLysGlyLeuGly160AlaGluTyr175LeuHisTyr190GluHisLeuLeuLysAlaTyrGlyGly240ArgAlaGin255ValHisGlu270<210〉21〈211〉280〈212〉PRT<213〉腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220〉<223>741，來自菌株M198/172<400>21MetThrArgSerLysProValAsnArgThrAlaPheCysCysLeuSer151015LeuThrAlaAlaLeulieLeuThrAlaCysSerSerGlyGlyGlyGly202530ValAlaAlaAsplieGlyAlaGlyLeuAlaAspAlaLeuThrAlaProLeuVal65ThrLysLeuSerSer145Gly丁yrTyrleuPro225GinGinHisAsp50ArgTyrVallieAla130GlyGluArgThrLys210AspAlaGlulie〈210><211〉<212><213〉〈220><223〉<400〉Met1LeuValLeuVal65ThrLysThrSerlie145ThrThrAlaAsp50ArgTyrVallieAla130Asp35HisLysGlySerThr115LeuLysHisGlylie195SerLysGluValGly275LysAsnAsnArg100LeuThrMetThrThr180AspProLysLysAla260LeuAspGluGly85PheGluAlaValSer165AlaPheGlutogGly245GlyAlaLys匕ys70AspAspSerLeuAla150PhePheAlaLeuHis230SerSerAlaSer55LeuSerPheGlyGin135LysAspGlyAlaAsn215Ala丁yrAla40LeuLysLeulieGlu120ThrArgLysSerLys200ValValSerGluGin280GinLeuAsnArg105PheGluGinLeuAsp185GinAsplieLeuVal265SerAlaThr90GinGinGinPhePro170AspGlyLeuSerGly250GluLeuAla75GlylieValValArg155GluAlaHisAlaGly235lieThrThr60GinLysGluTyrGin140lieGlySerGlyAla220SerPheAla22279PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)741,來自菌株NGH3845LeuAspGlyAlaleuLysValAsp110LysGin125AspSerGlyAspGlyArgGlyLys190Lyslie205SerAspValLeuGlyGlyAsnGly27022ArgAlaAla35HisLysGlySerThr115ValSerSerAla20AspLysAsnAsnArg100LeuValLeuLys5LeulieAspGluGly85PheAlaAlalieProlieGlytys匕ys70AspAspSerLeuAsn150ValLeuAlaSer55LeuSerPheGlyGin135GinAsnThrGly40LeuLysLeulieGlu120lieArgArgAla25LeuGinLeuAsnArg105PheGluSerThr10CysAlaSerAlaThr90GinGinLysPheAlaSerAspLeuAla75GlylielielieLeu155PheCysCysSerAlaThr60GinLysGluTyrAsn140ValGlyGly30LeuThr45LeuAspGlyAlaLeuLysGinGluAsn95GlySerGlulieAla175LeuGlulieTyrGin255lieValAsp110LysGin125AsnProLeu15GlyAlaGinGluAsn95GlySerLys80AspGinHisHisAla160ThrThrHisLysAsn240AlaArgAsnAspSerGlyLeuSerGlyProSerLys80AspGinHisLysGly16050GlyGluHisThrAlaPheAsnGinLeuProAspGlyLysAlaGluTyr165170175HisGlyLysAlaPheSerSerAspAspProAsnGlyArgLeuHisTyr180185190SerlieAspPheThrLysLysGinGlyTyrGlyArglieGluHisLeu195200205LysThrProGluGinAsnValGluLeuAlaSerAlaGluLeuLysAla210215220AspGluLysSerHisAlaVallieLeuGlyAspThrArgTyrGlyGly225230235240GluGluLysGlyThrTyrHisLeuAlaLeuPheGlyAspArgAlaGin245250255GlulieAlaGlySerAlaThrValLyslieArgGluLysValHisGlu260265270lieGlylieAlaGlyLysGin275<210>23<211〉145<212〉PR丁<213〉月商膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220><223〉NMB1343來自10種腦膜炎球菌菌株<400〉MetGly1AsnAsnArgTyrSerVal50AspGly65PheAlaArgAspProGluGlyCys130Asn14523AsnPhel>euTyr5GlyGinLeuI>ys20AspGlyLysPhe35LysAsnAlaValCysTyrlieSer70ThrSerSerGly85LeuPheGlyGin100AsnProAsnGlu115lieProGluGluArgProLysTyr55ThrlieTyrLysVal135GlytysTyr40AlaThrGluSerGlu120lielieGly25AspHisThrAsnlie105VallieSer10AsnGlyGinAspGly90PheThrAlaCysLysLyslieLys75TyrGlulieLysGinGinAlaGluAlaThr45GluThr60GlulielieTyrTyrGluArgAla125GluLeu140AspGluGin15ValAlalie30HisGlyProGlyLeuTyrAlaLysLys80ValLeuAsn95ValGluHis110GluAspCyslieGlulie<210>24<211>150<212〉PRT〈213>淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)<220〉<223〉NMB1343來自淋球菌<400>24lieAsnAsnLeuTrpGlulieSerTyrLeuTyrArgGlylieSerCys151015GinGinAspGluGinAsnAsnGlyGinLeuLysProLysGlyAsnLys202530AlaGluValAlalieArgTyrAspGlyLysPheLysTyrAspGlyLysAlsThr50GluThr65GlulielieTyrTyrGluArgAla130GluLeu14535HisAspAlaValVal115GlulieGlyLeuLysLeu100GluAspGluProTyrLys85AsnHisCyslieSerAsp70PheArgProGlyAsn150Val55GlyAlaAspGiuCys13540LysCysThrLeu120lieAsnAlaValTyrlieSer75SerSerGly90PheGlyGin105ProAspGluProGluGluTyr60ThrlieTyrLysVal14045AlaHisThrThrGluAsnSerlie110GluVal125lielieGinlieAspLys80GlyTyr95PheGluThrlieAlaLys<210〉25<2U〉634<212>飄<213〉淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)<220〉<223〉NMB1343核酸序列(淋球菌)<400〉25tccgccgcattaccttstaaaataaaacattgcttgagattgatgagtgatggtgttaaaatttcttatttatatagaggcattagttgcaaacctaaaggtaataaagctgaagttgcaggtaaagctacacatggtccaagtgtgaaggatctatatgacggatgttatatatctacggcaacaagctccggcatcgaaaatggctatcaatattctatttttgaatatgaggttgaaac犯tcagagctgaagattgtggctgtattatagaaattaactaagttgaaaggtcaataacattggcggacacgaaaatgtagatattaccctctcaagcagtctgataatgtttggat60ttcaaactttaaattaataacttatgggaa120caacaagatgagcaaaataatggacagtta180attcgttatgatggtaagtttaaatatgat240aatgcagtttacgcccatcaaattgaaaca300acaacagacaaggaaattgccaagaaattt360atatatgttttaaatagagatttgtttggt420catccagaaaacccagatgag犯ggaagta480cctgaagaagtgattattgctaaagagttg540taatggctttagttgaattgaaagtgcccg600tcgc634<210>26<211>630<212>誰<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)<220><223>NMB1343核酸序列(腦膜炎球菌)<400>26tccgccgcattgcttgagatatttcttatactaaaggtaat3tatgscggcaagttccggattctatttttcagagctgatggcggacactaccttataatgatgagtaatagaggcatttaaagctgaaatgttatatacatcgaaaattgaatatgag卿ttgtggcagttga犯gggaaaatgtagtggtgttaaaagttgccaacgttgcaattcgtgaagaatgtctacgacaaggctatatatgttgaacatctgtattcctgtcaatataatatattatcgcccctctcaagttcaacctttaagatgagcagttatgatggcagtttacgccagacaaggaatgttttaaacagaaaacccaagaagtgatggctttagttcagtctgataaaattaataataagtttaaaccatcaaat"taattgcc犯gtagggatttgtattgctaaagaattgaaagatgtttggatcttatgggaacagttaa犯ctatgatggtagaaacaggtc3Mtttgca3tttggtcaatg朋gtaacaagagttgatagtgcccgacat60120180240300360420480540600630〈210〉27〈211〉6<212〉PRT<213〉<220>〈223〉<400>GlySer1<210><211〉<212〉<213><220><223〉<400>MetAla1AlaProGinAlaAspMet50ThrThr65ProGinAl3AspGlyGlyAspGly130CysAsn145PheGluGlyLysAsnGlySerSer210ProAla225ValAspAlsProProGlyGluMet290His丁hr305LysValAspAsp人工序列聚甘氨酸接頭27GlyGlyGlyGly528579PRT腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)優選AG287-953雜交體28SerProAspValLysSerAlaAspThrLeuSerLysProAla51015ValValAlaGluLysGluThrGluValLysGluAspAlaPro202530GlySerGinGlyGinGlyAlaProSerThrGinGlySerGin354045AlaAlaValSerAlaGluAsnThrGlyAsnGlyGlyAlaAla5560AspLysProLysAsnGluAspGluGlyProGinAsnAspMet707580AsnSerAlaGluSerAlaAsnGinThrGlyAsnAsnGinPro859095SerSerAspSerAlaProAlaSerAsnProAlaProAlaAsn100105110SerAsnPheGlyArgValAspLeuAlaAsnGlyValLeulie115120125ProSerGinAsnlieThrLeuThrHisCysLysGlyAspSer135140GlyAspAsnLeuLeuAspGluGluAlaProSerLysSerGlu150155160AsnLeuAsnGluSerGluArglieGluLysTyrLysLysAsp165170175SerAspLysPheThrAsnLeuValAlaThrAlaValGinAla180185190ThrAsnLys丁yrVallielieTyrLysAspLysSerAlaSer195200205SerAlaArgPheArgArgSerAlaArgSerArgArgSerLeu215220GluMetProLeulieProValAsnGinAlaAspThrLeulie230235240GlyGluAlaValSerLeuThrGlyHisSerGlyAsnliePhe245250255GluGlyAsnTyrArgTyrLeuThrTyrGlyAlaGluLysLeu260265270GlySerTyrAlaLeuArgValGinGlyGluProAlaLysGly275280285LeuAlaGlyThrAlaValTyrAsnGlyGluValLeuHisPhe295300GluAsnGlyArgProTyrProThrArgGlyArgPheAlaAla310315320AspPheGlySerLysSerValAspGlylielieAspSerGly325330335LeuHisMetGlyThrGinLysPheLysAlaAlalieAspGlyAsnGly丁yr385LysAspSerAspAsn465Asp匕ysThrAsniiig545AsnGlyArg370ArgLysGluThrGin450LeuliePheMetCys530SerValPhe355PheProGluTyrAsn435AlaGinPheAsnHis515Tyr11j丄Gly340LysTyrThrGinHis420ValLysSerAspPhe500GlyGinThrMetGlyGlyAspAsp405AlaGlyArgGlyAla485AsnLysSerlieThr565ThrProAla390GlyAsnGlyAspSer470AlaGlyThrProAsp550LysTrpAla375GluSerAlaPheGly455GinGinLysAlaMet535ArgSerThr360GlyLysGlyArgTyr440LysHisTyrLysPro520AlaThrVal345GluGluGlyGlyPhe425GlyliePheProLeu505ValLysLysArgAsnGluGlyGly410AlaLeuAspThrAsp490ValLysThrTrplie570GlyValPhe395GlylieThrlieAsp475lieSerLeuGluGly555AspGlyGly365AlaGly380GlyValAlaThrAspHisGlySer445Thrlie460HisLeuArgPheValAspLysAla525ValCys540VslAsplieGin350AspValLysTyrPheAlaTyrLys415PheAsn430ValGluProValLysSerValSer495GlyAsn510GluLysGlyGlyTyrLeulieGlu575SerSerGly400ValThrPheAlaAla480ThrLeuPheAspVal560AlaAlaLysGin<210〉<211〉<212〉<213〉<220><223>29644PRT月S膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)AG287NZ-953雜交體<400>MetAla1AlaGinAspAla65ProAlaGlyAspAsn145ProAlaMet50ThrGinSerGluGly130Thr29SerValGly35AlaAspAsnAsnSer115MetAlaProVal20SerAlaLysAlaMet100GluGinAlaAsp5SerGinValProAla85ProGinGlyGinValGluGlySerLys70AspAlaProAspGly150LysLysGinGlu55AsnThrGlyAlaAsp135ThrSerGluGly40GluGluAspAsnAsn120ProAsnAlaThr25AlaAsnAspSerMet105GinSerGinAsp10GluProThrGluLeu90GluProAlaAlaThrAlaSerGlyGly75ThrAsnAspGlyGlu155LeuSerLysGluAlaGin45AsnGly60AlaGinProAsnGinAlaMetAla125GlyGlu140AsnAsnLysPro15AspAla30GlyGlyGlyAlaAsnAspHisThr95ProAsp110AsnThrAsnAlaGinThrAlaProGinAlaMet80ProAlaAlaGlyAla16054GlyGlyGlySerGlu225LysValProLeulie305PheLeuGlyPheAla385GlyGlySerSerGly465ValThrPheAlaAla545ThrLeuPheAspVal625AlaSerGlyProGly210LysAsnGinThrPro290ValAlaProGluHis370LysAspAsnGlyTyr450LysAspSerAspAsn530AspLysThrAsnPhe610AsnAlaGinAspSer195AsnLeuAspMetSer275AlaAspProGlyMetq匚cOddThrValGlyGlyLys435ArgLysGluThrGin515LeuliePheMetCys595SerValLysAsnPhe180GinAsnSerGlyLys260PheGluGlyGluGly340leuGluAspLeuPhe420PheProGluTyrAsn500AlaGinPheAsnHis580丁yrThrGlyGinPro165GlyAsnPheAspLys245GlyAlaMetGluGly325SerAlaAsnPheHis405LysTyrThrGinHis485ValLysSerAspPhe565GlyGinThrMetAlaArglieLeuAla230AsnlieArgProAla310AsnTyrGlyGlyGly390MetGlyGlyAspAsp470AlaGlyArgGlyAla550AsnLysSerlieThr630SerThrThrAsp215AspAspAsnPheLeu295ValTyrAla丁hrArg375SerGlyThrProAla455GlyAsnGlyAspSer535AlaGlyThrProAsp615LysSerAsnLeu200GluLysLysGinArg280lieSerArgLeuAlaProLysThrTrpAla440GluSerAlaPheGly520GinGinLysAlaMet600ArgSerThrVal185ThrGluliePheTyr265ArgProLeuTyrArg345ValSerSerGinThr425GlyLysGlyArgTyr505LysHisTyrLysPro585AlaThrValAsn170GlyHisValSerVal250lieSerValThrLeu330ValTyrProValLys410GluGluGlyGlyPhe490GlyliePheProLeu570ValLysLysArgProAsnCysGinAsn235GlylieAlaAsnGly315ThrGinAsnSerAsp395PheAsnGluGlyGly475AlaLeuAspThrAsp555ValLysThrTrplie635SerSerLysLeu220丁yrLeuPheArgGin300His丁yrGlyGlyArg380GlyLysGlyValPhe460GlylieThrlieAsp540lieSerLeuGluGly620AspAlaValGly205LysLysValTyrSer285AlaSerGlyGluGlu365GlylieAlaGlyAla445GlyAlaAspGlyThr525HisArgValLysVal605VallieThrVal190AspSerLysAla匕ys270ArgAspGlyAlaPro350ValArglieAlaGly430GlyValThrHisSer510lieLeuPheAspAla590CysAspGinAsn175lieSerGluAspAsp255ProArgThrAsnGlu335SerLeuPheAsplie415AspLysPheTyrPhe495ValProLysValGly575GluGlyTyrlieSerAspCysPheGly240SerLysSerLeulie320LysLysHisAlaSer400AspValTyrAlaLys480AsnGliiValSerSer560AsnLysGlyLeuGlu640<210〉<211〉〈212〉〈213〉<220〉<223〉<400〉MetLys1SerValAspLeu65ValGlyGi'jGlyLeu145TyrAlalieValLeu225ValThrLysLeuSer305SerGlyTyrTyrLeu38530456PRT月齒膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)936-AG741雜交體LeuGlyAsp50ArgGlyGluC-lyAsp130LeuGlyGinThrAla210AspArgTyrVallie290AlaGlyGluArgThr370Lys30ProAlaAla35AsnGinTyrLysyal115lieGlyAsnlieLeu195AlaHisLysGlySer275ThrLeuLysHisGly355lieSerLysLeu20LysValAsnAsnGin100TyrAlalieValThr180TyrAspLysAsnAsn260ArgLeuThrMetThr340ThrAspProPro5SerSerMetAsnArg85PheAsnGlySerThr165GinGinlieAspGlu245GlyPheGluAlaVal325SerAlaPheGluHisGlyAlaAlaGin70HisValiyrAspPro150丁yrLysAsnGlyLys230LysAspAspSerPhe310AlaPhePheAlaLeu390ThrCysValLeu55ThrLeuGlyT，丄丄GThr135AlaValValTyrAla215GlyLeuSerPheGly295GinlysAspGlyAla375AsnValValAsp40ArgLysLeuGinTl___120TrpThrMetSerVal200GlyLeulysleulie280GluThrArgLysSer360LysValArgSer25ArglieGlyLeulie105，,_iVfcl丄AsnGinGlyThr185GinLeuGinLeuAsn265ArgPheGluGinLeu345AspGinAspThr10AlaArgGluTyrLeu90AlaAliiThrAlalie170ThrArgAlaSerAla250ThrGinGinGinPhe330ProAspGlyLeuLeuValThrThrThr75GlyArgSerSerArg155LeuValGlyAspLeu235AlaGlylieVallie315ArgGluAlaAsnAla395lielieThrThr60ProGinSerLeuLys140ValThrGlySerAla220ThrGin匕ysGluTyr300GinlieGlyGlyGly380AlaAlaGlyGly45AlaGinValGluPro125ValLysProValGly205LeuLeuGlyLeuVal285!>ysAspGlyGlyGly365LysAlaAlaSer30AlaArglieAlaGin110ArgArglieGluGin190GlyThrAspAlalys270AspGinSerAspArg350I>yslieAsplie15AlaGinSerSerThr95AlaThrAlaValGlu175LysGlyAlaGinGlu255AsnGlySerGlulie335Ala[>euGluliePheAlaThrTyrVal80GluAlaAlaThrThr160GinValGlyProSer240LysAspGinHisHis320AlaThrThrHisLys400ProAspGlyLysArgHisAlaVallieSerGlySerValLeuTyrAsn405410415GinAlaGluLysGlySerTyrSerLeuGlyliePheGlyGlyLysAla420425430GinGluValAlaGlySerAlaGluValLysThrValAsnGlylieArg435440445HislieGlyLeuAlaAlaLysGin450455<210><211><212>〈213〉<220><223〉<400>MetAla1AlsAlaGluThrAlaThr50LysLys65AsnValThrThrAla匕euThrThr130LysLeu145AsnAspAlaValGinAsnAlaGlu210AlaVal225LysAspGluGluThrGluAspHis290ArgLys305LeuPhe31328PRT月S膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)961c31ThrAsnAspAspAspValLyslysAlaAlaThrValAlalie51015AlaTyrAsnAsnGlyGinGlulieAsnGlyPheLysAlaGly202530lieTyrAsplieAspGluAspGlyThrlieThrLysLysAsp354045AlaAlaAspValGluAlaAspAspPheLysGlyLeuGlyLeu5560ValValThrAsnLeuThrLysThrValAsnGluAsnLysGin707580AspAlaLysValLysAlaAlaGluSerGlulieGluLysLeu859095LysLeuAlaAspThrAspAlaAlaLeuAlaAspThrAspAla100105110AspAlaThrThrAsnAlaLeuAsnLysleuGlyGluAsnlie115120125PheAlaGltiGluThrLysThrAsnlieValLyslieAspGlu135140GluAlaValAlaAspThrValAspLysHisAlaGluAlaPhe150155160lieAlaAspSerLeuAspGluThrAsnThrLysAlaAspGlu165170175LysThrAlaAsnGluAlaLysGinThrAlaGluGluThrLys180185190ValAspAlaLysValLysAlaAlaGluThrAlaAlaGlyLys195200205AlaAlaAlaGlyThrAlaAsnThrAlaAlaAspLysAlaGlu215220AlaAlaLysValThrAsplieLysAlaAsplieAlaThrAsn230235240AsnlieAlaLysLysAlaAsnSerAlaAspValTyrThrArg245250255SerAspSerLysPheValArglieAspGlyLeuAsnAlaThr260265270LysLeuAspThrArgLeuAlaSerAlaGluLysSerlieAla275280285AspThrArgLeuAsnGlyLeuAsplysThrValSerAspLeu295300GluThrArgGinGlyLeuAlaGluGinAlaAlaLeuSerGly310315320GinProTyrAsnValGly32權利要求1.一種具有以下分子式的雜合蛋白質NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其特征在于，其中L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整數，X是(a)orf1、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、NMB1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列；(b)與(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列；或(c)含有(a)的氨基酸序列片斷的氨基酸序列2.—種具有以下分子式的雜合蛋白質NH2-A-[-X-L-]n-B-C00H，其特征在于，其中X是一氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，n是大于l的整數，其中第一種X部分(-Xa-)具有下列氨基酸序列之一(d)參考文獻3所述的446個偶數編號序列SEQIDs(即2、4、6...890、892);(e)參考文獻4所述的45個偶數編號序列SEQIDs(即2、4、6…88、90);(f)參考文獻5所述的1674個偶數編號序列SEQIDs2-3020、偶數編號序列SEQIDs3040-3114和所有的編號序列SEQIDs3115-3241;(g)參考文獻7的2160個氨基酸序列，醒BOOOl至NMB2160;(h)參考文獻1或2所述的氨基酸序列。和第二種-X-部分(-Xb-)，其中-X「與-Xa-具有序列相同性，和/或-Xb-包括-Xr的片斷。3.如權利要求1或2所述的雜合蛋白質，其中，n=2。4.如權利要求2所述的雜合蛋白質，其中，-Xa-是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961或983氨基酸序列。5.如權利要求2所述的雜合蛋白質，其中，Xk。。X。都相互具有序列相同性。6.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，n=2，其中-X-部分是AG287和230;AG287和936;AG287和741;961c和287;961c和230;961c和936;961cL和287;961cL和230;961cL和936;0RF46.1和936;0RF46.1和230;230和961;230和741;936和961;936和741;AG741和741;或AG287和287。7.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，L具有20個或較少的氨基酸。8.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，L是一種聚甘氨酸接頭。9.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，A具有40個或較少的氨基酸。10.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，B具有40個或較少的氨基酸。11.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，-X-部分具有腦膜炎奈瑟球菌血清群B中發現的氨基酸序列。12.如任何前述權利要求所述的雜合蛋白質，其中，至少一個-X-部分是961氨基酸序列，但該序列中缺失了一個或多個結構域。13.—種蛋白質，其中，所述蛋白質含的氨基酸序列選自SEQIDs1至38。14.一種核酸，其中，所述核酸編碼任何前述權利要求的所述蛋白質。15.—種組合物，其中，所述組合物包含任何前述權利要求所述的蛋白質或核酸。16.—種組合物，其中，所述組合物包含兩種或多種下列蛋白質(1)287(2)741(3)0RF46,1(1)961(2)NH2-A-[-X-L-]n--B-COOH，其中n=2，X產287，X2=953(3)NH2-A-[-X-L-]n-B—C00H，其中n=2，X產287，X2=919(4)NH廠A-[-X-L-]n-B-C00H，其中n=2，X產287，X2=961(8)NH2-A-[-X-L-]n--B-COOH，其中n=2，X產287，X2=741(9)NH2-A—[—X—L—]n-B-COOH，其中n=2，X產936，X2=74117.如權利要求16所述的組合物，其中，所述組合物包含蛋白質(4)、(5)和(9)。18.如權利要求17所述的組合物，其中，蛋白質(4)包含SEQID31，蛋白質(5)包含SEQID28或SEQID29，蛋白質(9)包含SEQID30。19.如權利要求15到18中任一項所述的組合物，其中，所述組合物還包括-腦膜炎奈瑟球菌蛋白質抗原；-腦膜炎奈瑟球菌外膜泡囊(OMV)制品；-腦膜炎奈瑟球菌糖抗原；-肺炎鏈球菌糖抗原；-甲肝、乙肝或丙肝病毒抗原；-百日咳桿菌抗原；-白喉抗原；-破傷風抗原；-幽門螺桿菌蛋白質抗原-流感嗜血桿菌(vfee歷o;力i7〃si'"/7i/e/7^3e)糖抗原；-淋病奈瑟球菌抗原；-肺炎衣原體抗原；-沙眼衣原體抗原；-尸or/力7r，。朋51w'/^'ra^'s的抗原；-polio抗原；-狂犬病毒抗原；-麻疹、流行性腮腺炎和/或風疹病毒抗原；-流感病毒抗原；-卡定性莫拉菌(J/。ra^/7scstarr/Wis)抗原；一無乳鏈球菌(5Yrep"cocc"5"agaiactiae)抗原；-化膿性鏈球菌(5^repfococctApyogenes)抗原；-金黃色葡萄球菌抗原。20.如權利要求15至.19中任一項所述的組合物，其中，所述組合物還包括藥學上可接受的載體。21.如權利要求20所述的組合物，其中，所述組合物可用作藥物。22.—種治療病人的方法，其中，所述方法包括給予病人治療有效量的權利要求20所述的組合物。全文摘要連接兩種或多種奈瑟球菌蛋白質從而使它們被翻譯成一條多肽鏈。提供分子式為NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH的雜合蛋白質，其中X是一種氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整數。蛋白質中各n-X-部分的序列與其它-X-部分具有序列相同性，這種蛋白質是一種串聯蛋白質。文檔編號C07K19/00GK101260148SQ20081009210公開日2008年9月10日申請日期2002年9月6日優先權日2001年9月6日發明者M·皮扎申請人:啟龍有限公司