修飾糖、其綴合物及其制備方法

專利名稱：修飾糖、其綴合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及糖化學領域，是關于修飾糖、其制備方法以及綴合衍生物。具體地說， 本發明涉及含有接頭部分的修飾糖，所述接頭用于連接糖與蛋白質。
背景技術：
多糖是重要的生物分子，它們廣泛用于制藥，用于預防和治療疾病。例如，莢膜多 糖多年來被用于抗莢膜細菌如腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟氏球菌)、肺炎球菌(肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae))禾口Hib (流感嗜血桿菌B型(Haemophilus influenzae type B))的疫苗，。為增強這些多糖的免疫原性，特別是在兒童中的免疫原性，開發出了綴合物疫苗。 其中，莢膜多糖與載體蛋白綴合[例如美國專利4，711，779,4, 761，283和4，882，317]。綴 合分子中，多糖與蛋白質可以直接相連，也可以通過接頭連接。盡管已經開發出了多種不同類型的接頭，但仍然需要多功能的，以簡單、可靠的化 學作用即可與多糖和蛋白質偶聯的新型接頭。而且，還需要無毒的，無需強酸強堿之類苛性 試劑在溫和條件下即可形成的新型接頭。

發明內容
本發明的修飾糖發明所提供修飾糖包含結構式(I)所示的組成部分-A-NOO-L-Md)其中A是鍵，-C(0)-或-0C(0)-;R1 選自 11或(1-(6 烴基；！^是^-‘亞烴基；M是掩蔽醛基。“修飾的莢膜糖”指由天然莢膜糖經適當修飾而獲得的糖。因此，本發明的修飾莢 膜糖保留了天然莢膜糖中基本的單糖單元重復序列。“糖”包括寡糖(例如含2-39個單糖單元)和多糖(例如含40個或更多單糖單 元)。細菌中的天然莢膜糖一般為多糖。多糖將處理可產生較短的寡糖。獲得寡糖可通過 對天然多糖進行純化和/或分級(例如弱酸水解、加熱、大小排阻層析等)。通常，本發明的修飾糖是寡糖。寡糖可用上述任一種分級方法由多糖獲得。本發明的修飾莢膜糖可由天然莢膜糖獲得。然而，本發明不限于得自天然莢膜糖
5的修飾糖。本發明修飾莢膜糖還可用其它方法獲得，如全合成或部分合成。在本發明的修飾莢膜糖中，結構式(I)部分可由莢膜糖的非末端羥基形成，或由 莢膜糖的末端異構羥基形成。當結構式(I)部分由末端異構羥基形成時，較好的是，它通過例如還原氨基化反 應取代末端異構羥基。糖末端羥基上的還原氨基化反應是本領域熟知的。當結構式(I)部分由非末端羥基形成時，較好的是，它經例如氨基甲酸酯基團與 非末端羥基相連。因此，實施方式之一中，本發明的修飾莢膜糖包括結構式(la)所示的組 成部分-0C (0)N(R1)-L-M (la)其中R\L和M如前所述。制備這種化合物可通過對糖上的游離羥基進行例如⑶I衍生，隨后將該氨基甲 酸酯中間體與結構式HN (R1) -L-M所示的胺反應。R1優選H。L優選CrC12亞烴基，_CH2CH2CH2_更好。當結構式(I)所示組成部分用 于將糖與蛋白質連接成糖-蛋白綴合物時，L基團的作用是間隔基。據信，糖和蛋白質之間 的間隔基可提高綴合物的穩定性。本領域技術人員知道許多不同的易轉變成醛基的官能團。此類官能團都適合作為 掩蔽醛基M。掩蔽醛基M優選其中R2選自H、C「C12烴基、C3_C12環烴基、C5_C12芳基或C5_12芳基烴基(R2 不宜為H)；X和Y相同或不同，各自選自0或S ；R3和R4各自選自Q-Cu烴基、C3_C12環烴基、C5_C12芳基或C5_12芳基烴基；或 者，R3與R4連接成含雜原子X和Y的C3、C4、C5、C6、C7或C8環烴基環；R5和R6各自選自H、CrC12烴基、C3_C12環烴基、C5_C12芳基或C5_12芳基烴基； 或者，R5和R6連接成C3或C12環烴基環；R9和R1Q各自選自H、C「C12烴基、C3_C12環烴基、C5_C12芳基或C5_12芳基烴基； 或者，R9和R1Q連接成C3_12環烴基環；R7和R8各自選自CrC12烴基或C3_C12環烴基。“烷基”在此指直連和支鏈烴基，烴基內可內含1、2或3個雜原子，所述雜原子選 自-0-、-NH-或-S-。烴基還可含1、2或3個雙鍵和/或三鍵。然而，“烴基”一詞通常指不 含雜原子也不含雙鍵或三鍵的烷基。(V12烴基指所含碳原子數為1至12中任一個(例如
C2, C3> C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, Cn, C12)的烴基。類似的，(V6烴基指所含碳原子數為1至 6中任一個的(例如C” C2、C3、C4、C5、C6)的烴基。 “亞烴基”在此指直連或支鏈亞烴基。亞烴基可含1、2或3個雜原子，所述雜原子 選自-0-、-NH-或-S-。亞烴基還可含1、2或3個雙鍵和/或三鍵。然而，“亞烴基”一詞通 常指不含雜原子或雙鍵或三鍵的亞烷基。(V12亞烴基指所含碳原子數為1至12中任一個 (例如C” C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、Cn、C12)的亞烴基。類似的，(V6亞烴基指所含碳原 子數為1至6中任一個的(例如Q、C2、C3、C4、C5、C6)的亞烴基。“環烴基”在此包括環烷基、聚環烷基和環烯基，以及它們與烴基的組合，如環烴基 烴基。環烴基可含1、2或3個雜原子，所述雜原子選自-0-、-NH-或-S-。“環烷基”通常 指不含雜原子的環烴基。環烴基的例子包括環戊基、環己基、環己烯基、環己基甲基和金剛 烷基。C3-C12環烴基指所含碳原子數為3至12中任一個(例如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、 cn、c12)的環烴基。“芳基”在此指含碳和氫的芳族基團，如苯基或萘基。C5-C12芳基指所含碳原子數為 5 至 12 中任一個(例如 C5、C6、C7、C8、C9、C1Q、Cn、C12)的芳基。“C5_12芳基-Cm烴基”指例如芐基、苯乙基和萘甲基之類基團。掩蔽醛基優選-CH(0H)CH20H。較好的是，本發明的修飾莢膜糖優選包含結構 式-NH (CH2) 3CH (OH) CH20H 所示的部分，更好的是-0C (0) NH (CH2) 3CH (OH) CH20H 所示的部分。本發明提供具有掩蔽醛基的化合物。掩蔽醛基的益處在于避免莢膜糖修飾期間的 不利副反應。此外，當醛基解蔽后，它可與例如蛋白質上的氨基發生還原氨基化反應而與之 偶聯。一般說來，結構式(I)或(la)部分功能是供隨后與蛋白質上氨基反應所需。因此， 結構式(I)或(la)部分常用于形成糖-蛋白綴合物中的接頭基團。然而，結構式(I)或(la)部分，尤其是(la)部分，可用作保護基團以穩定糖而抵 抗降解，特別是酸解。結構式(la)部分可改作這一用途，也可在作為連接基團之外兼顧這 一用途。國際專利申請PCT/IB03/01436就描述了其作為保護基團用來穩定莢膜糖的用途。當結構式(la)部分用作穩定保護基團時，修飾糖優選含有一個以上該組成部分 以獲得穩定效果。例如，修飾糖中的所有或幾乎所有單糖單元都具有含結構式(la)的保護 基團。或者，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的單糖單元具有含 結構式(I)的保護基團。修飾糖中至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個單糖單元具有所述保護基團。類似的，各單糖單元上保護基團的數量可以不同。例如，單糖單元上保護基團的數 量可以是1、2、3、4、5或6個，優選1到4，更優選1或2。較好的是，本發明的修飾糖包含結構式(I)或(la)部分，該部分后來可轉變成醛。 因此，本發明還提供具有結構式(II)，優選(Ila)所示組成部分的修飾糖-A-N (R1) -L-C (0) H(II)-0C (0) N (R1) -L-C (0) H (II a)其中A、R1和L如前所述。結構式(I)或(la)中掩蔽醛轉變成結構式(II)或(Ila)中的醛用到一個簡單的 合成步驟。例如，二元醇可經氧化剪切轉變成醛(如用妝10418((^()4等)；醇可氧化轉變 成醛(如Swern氧化、Dess-Martin氧化、CrVI氧化等)；烯烴可經雙鍵的氧化剪切轉變成醛 (如先臭氧分解后再還原，0S04/NaI04、0S04/PB(0Ac)4等)；縮醛可酸解轉變成醛；硫縮醛可
7通過金屬配位、烷化或氧化轉變成醛(如Hg11、Ag1、Ag11、Cu11、Me1、N-溴代琥珀酰亞胺等)；羧酸酯、腈化合物和Weinreb酰胺可適當還原成醛(如用NaBH4、DIBAL等)。較好的是，掩蔽醛M是-CH(OH) CH20H。此二醇的優點在于可用溫和的高碘酸鹽氧 化劑轉變成對應的醛。據信，高碘酸鹽氧化劑，如NaIO4,能選擇性地形成醛而不影響莢膜糖 上的其它官能團。因此，實施方式之一中，修飾糖包括結構式-NH(CH2)3C(O)H所示的部分，更優 選-OC (O)NH (CH2)3C(O) H。糖-蛋白綴合物含結構式(II)或(IIa)部分的修飾糖可用于將該糖與載體蛋白偶聯。較好的是， 所述偶聯通過蛋白質上的氨基與包含結構式(II)或(IIa)所示部分的修飾糖上的醛基之 間的還原氨基化反應而實現。還原氨基化反應是公認的將糖與蛋白質偶聯的可靠方法。該 反應一般用NaBH3CN進行，但也可采用其它適當的還原劑。因此，本發明提供糖-蛋白綴合物，其中糖和蛋白質部分經結構式(IV)或優選的 (IVa)所示基團相連-A-N(R1)-L-NH(IV)-OC (O)N(R1)-L-NH (IVa)其中Aj1和L如前所述。在本發明綴合物中，L優選-(CH2)4-。實施方式之一中， 糖和蛋白質部分由-OC (0) NH- (CH2) 4-NH-相連。其中的-NH-通常由蛋白質上已有的例如在 賴氨酸殘基中的胺基團形成，。在本發明的蛋白質-糖綴合物中，蛋白質優選細菌毒素或類毒素，更優選白喉或 破傷風毒素或類毒素。它們是綴合物疫苗的常用組分。尤其好的是CRM197白喉類毒素[1]。 其它合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白質[2]、合成肽[3，4]、熱休克蛋白質 [5，6]、百日咳蛋白質[7、8]、流感嗜血桿菌的蛋白0[9]、細胞因子[10]、淋巴因子[10]、激 素[10]、生長因子[10]、艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或毒素B[ll]、鐵吸收蛋白[12] 等。可以使用載體蛋白的混合物。綴合后，游離糖和綴合糖能夠被分開。為此有許多合適的方法，包括疏水層析、切 向超濾(tangential ultrafiltration)、滲濾等[參見文獻 13、14 等]。同一載體蛋白可攜帶多種不同的糖[15]。修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖在上述所有實施方式中，所述修飾莢膜糖優選修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌糖，更好 的是修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖。修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖有下列結構 因此，本發明提供的如下所示的糖 其中T如結構式(A)或⑶所示 n是1到100的整數；各Z 基團各自選自 _011、-(^(；、-0((0)則1 1)-1^-]\1或-0((0)則1 1) (0)11;各Q 基團各自選自-011、-(^(；、-0((0)則1 1)-1^-]\1或-0((0)則1 1) (0)11;W 選自-OH、-OAc、_0C (0) N (R1) _L_M 或 _0C (0) N (R1) _L_C (0) H (ff 優選-OH)；V 是-N (R1) -L-M 或 _N (R1) _L_C (0) H ；其中R\L和M如前所述；條件是，所述糖包含結構式-N(R1) -L-M、_N (R1) _L_C (0) H、_0C (0) N (R1) -L-M 或-oc (0) N (R1) -L-C (0) H所示的組成部分中至少其一。n優選15到25的整數。T優選結構式(A)。所述糖優選包括結構式-OC^NOO-L-M或_0C(0) N (R1) -L-C (0) H所示組成部分至少其一。Q和Z優選是0H和OAc基團的混合物，兩者之比與天然腦膜炎奈瑟氏球菌A血清 群糖中的比例基本相同，所不同的是，Q基團之一或Z基團之一，優選Q基團之一，是-0C(0) N (R1) -L-M 或-0C (0) N (R1) -L-C (0) H。生成修飾糖的方法本發明還提供修飾莢膜糖的方法，包括(a)提供含羥基的莢膜糖；(b)羥基與雙官能試劑在有機溶劑中反應；(c)步驟(b)所得產物與結構式(III)所示氨基化合物反應，-HNOO-L-M (III)其中R\L和M如前所述。所述莢膜糖可以是天然莢膜糖(寡糖或多糖)。或者，所述莢膜糖可以是例如 脫-0-乙酰化莢膜糖、封閉莢膜糖(如PCT/IB03/01436所述)或含末端氨基的莢膜糖(如 還原氨基化反應所得的莢膜糖)。“雙官能試劑”在此指能夠行使以下雙重功能的任何試劑⑴提供第一親電碳原 子用于與糖上的羥基偶聯；(ii)提供第二親電碳原子用于與步驟(b2)所用的氨基偶聯。一 般，第二親電碳原子是由第一親電碳原子在步驟(b)中再生而成。雙官能試劑在多糖與氨 基化合物之間形成-c(o)-鍵。本發明所用雙官能試劑包括但不限于1，1’_羰基二咪唑(⑶I)、羰基二-1，2，4_三 唑(⑶T)、羰基二-1，2，3-苯并三唑(⑶B)、碳酸二苯酯、溴化氰、光氣或三光氣。本領域技 術人員可以看出，還有其它雙官能試劑與以上這些具有相同的功能。本發明優選CDI，因為 它是特別溫和的試劑，能夠避免產生強酸性氣體如HC1或HBr。有機溶劑優選非質子溶劑。非質子溶劑對本領域技術人員是熟知的，其不包含任
10何離子化的氫原子。此類溶劑的好處在于，它們通過增強羥基的親核性從而促進糖上的羥 基與雙官能試劑反應。合適的非質子溶劑包括但不限于二甲亞砜(DMS0)、二甲基甲酰胺 (DMF)、甲酰胺、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基三磷酰胺(圓 10、1，3-二甲基-3，4，5，6-四 氫-2 (1H)-嘧啶酮(DMPU)或二甲基乙酰胺(DMAC)，優選DMS0。步驟(c)中，步驟(b)產生的氨基甲酸酯化合物中間體與式(III)所示的胺反應。 式(III)所示的胺優選 tris-親核 H2N(CH2)3CH(0H)CH20H。本發明的優選方法如以下方案1所示 Sacc =多糖部分方案1方案1中，糖(例如Men A多糖或寡糖)首先在DMS0溶劑中用⑶I通過其羥基之 一被活化。所得咪唑氨基甲酸酯被tris-親核H2N(CH2) 3CH(0H) CH20H截獲，形成含掩蔽醛官 能團的修飾糖。圖2顯示腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖的活化步驟。或者，修飾糖也可一步制得莢膜糖上的一個或多個羥基與試劑XC(0) NOO-L-M反應，其中X是離去基團，R1、L和M如前所述。合適的離去基團包括但不限 于-CI、-Br、-CF3、-0C6H5 或 CC13。優選實施方式中，糖的修飾方法除以上所述之外還包括步驟(d)將掩蔽醛基M解 蔽，產生醛化合物；(e)通過還原氨基化反應將醛化合物與蛋白質相連。在這樣的方法中， 掩蔽醛基M優選是-CH (OH) CH20H,解蔽步驟優選高碘酸鹽剪切，還原氨基化反應中的還原劑 優選NaBH3CN。

圖1展示了這一優選實施方式。圖1中，PS代表天然腦膜炎奈瑟氏球菌A血 清群糖產生的多糖或寡糖。藥物組合物和方法發明提供的藥物組合物包含(a)發明的修飾糖和/或發明綴合物和(b)藥學上認 可的載體。包含綴合物時，組合物還可包含游離載體蛋白[16]。“藥學上認可的載體”包括各種載體，只要它本身不誘導產生對受主有害的抗體。 合適的載體通常是代謝速度慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨 基酸共聚物、海藻糖[17]脂類聚集體(如油滴或脂質體)和滅活病毒粒子。這些載體是 本領域普通技術人員熟知的。疫苗還可以包含稀釋液，如水、鹽水、甘油等。此外，還可以 包含輔助物質如潤濕劑或乳化劑，PH緩沖物質等。關于藥學上認可的賦形劑的全面討論可參見《雷明頓藥物科學》(Remington，s Pharmaceutical Science)，例如 2000 版(ISBN 0683306472)。通常，將本發明組合物制成液體溶液或懸浮液形式的注射劑；也可制成適合的固 體形式，在注射前溶解或懸浮于液體載體中。還可以將本發明制劑以脂質體乳化或包裹獲 得增強的佐劑效應。本發明組合物的直接傳遞一般是腸胃外傳遞(例如通過注射，皮下、腹 膜內、靜脈內或肌肉內注射，或者傳遞到組織間質間隙。本發明組合物也可以通過創傷給 藥。其它給藥方式包括經口和經肺給藥、直腸(栓劑)，透皮或經皮給藥[例如文獻18]、針 和無針注射器(hyposprays)。給藥可以是單劑次，也可以是多劑次(例如包括增強劑次)。
較好的是，本發明組合物無菌、經緩沖且/或無熱原。較好的是，本發明組合物是免疫原性組合物(例如疫苗)。以糖或糖-蛋白綴合物 為基礎的疫苗是本領域所熟知的。本發明免疫原性組合物包含免疫學有效量的糖抗原以及任何其它所需成分。“免 疫學有效量”指給劑量作為單劑次或多劑次中的部分劑次給予個體后具有治療或預防效 果。此量不固定，取決于待治療個體的健康和身體狀況、年齡、物種分類(如非人的靈長類 動物、靈長類動物等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需保護程度、疫苗制劑配方、主治 醫生對情況的評估，以及其它相關因素。該量具有較寬的范圍，通過常規試驗即可確定。給 藥可以是單劑次，也可以是多劑次(例如包括增強劑次)。疫苗可以與其它免疫調節劑聯 用。本發明組合物可以包含佐劑。提高組合物有效性的優選佐劑包括但不限于(A) 鋁化合物(例如氫氧化鋁、磷酸鋁、羥基磷酸鋁、羥基氫氧化鋁、正磷酸鋁、硫酸鋁等[參見 文獻19的第8，9章])或不同鋁化合物的混合物，這些化合物可以是任何適當的形式(如凝 膠、晶體、無定形等)，且具有良好的吸收性；(B)MF59 (5%鯊烯、0. 5%土溫80和0. 5% Span 85，用微流化器制成亞微粒子)[參見文獻19的第10章；另可參見文獻20] ； (C)脂質體[參 見文獻19的第13和14章];⑶ISCOMs [參見文獻19的第23章]，它可以不含其它洗滌劑 [21] ； (E)SAF，含 10%鯊烯、0. 4%土溫 80、5% pluronic-嵌段聚合物 L121 和 thr-MDP，微 流化成亞微乳劑或旋渦攪拌成較大顆粒的乳劑[參見文獻19的第12章];(F)Ribi 佐劑 系統(RAS) (Ribi Immuochem)，含2%鯊烯、0. 2%土溫80和選自單磷酸脂A(MPL)、雙分枝菌 酸藻糖(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁成分，優選MPL+CWS (Detox )； (G)皂角苷佐劑，如QuilA或QS21 [參見文獻19的第22章]，也稱為Stimulon ； (H)殼聚 糖[例如22] ； (I)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA) ； (J)細胞因子如白介素 (例如 IL-I、IL-2、IL-4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-12 等)、干擾素(例如干擾素-Y )、巨噬細 胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子等[參見文獻19的第27和28章];(K)可生物降解和無毒 材料(例如聚(α-羥酸)、多羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內酯等)微粒(即直徑約 100nm-150 μ m 的顆粒，更選約 200nm_30 μ m,最優選約 500nm_10 μ m) ； (L)單磷酸脂 A (MPL) 或3-0-脫酰MPL(3dMPL)[例如文獻19的第21章];(M) 3dMPL與例如QS21和/或水包油 乳劑的組合[23] ； (N)含CpG基序的寡核苷酸[24]，即含至少一個CG 二核苷酸，以5-甲基 胞苷取代胞嘧啶；(0)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯[25]；⑵聚氧乙烯山梨糖酯表面活性劑與 辛苯聚醇(octoxynol)的組合物[26]或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其 它非離子表面活性劑如辛苯聚醇的組合物[27] ； (Q)免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)和皂角苷[28] ； (R)免疫刺激劑和金屬鹽顆粒[29] ； (S)皂角苷和水包油乳劑[30]； (T)皂角苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(可選+固醇)[31] ； (U)大腸桿菌(E. coli)熱不穩 定腸毒素(“LT”)或其去毒突變體，如K63或R72突變體[例如文獻32的第5章];(V)霍 亂毒素(“CT”)或其去毒突變體[例如文獻32的第5章];(W)雙鏈RNA ；⑴單磷酸脂A 模擬物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯(aminoalkyl glucosaminide phosphate)衍生物， 如RC-529[33] ； (Y)聚磷腈(PCPP)；或(Z)生物粘合劑[34]如酯化透明質酸微球[35]或 粘膜粘著劑(mucoadhesive)，選自聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基 纖維素的交聯衍生物。也可采用能夠增強組合物效果的其它免疫刺激劑[例如參見文獻19 的第7章]。鋁鹽(特別是磷酸鋁和/或氫氧化鋁)是腸胃外免疫的優選佐劑。突變毒素 是優選的粘膜佐劑。胞璧酰肽包括N-乙酰-胞璧酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N_乙酰-去 甲胞璧酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞璧酰-L-丙氨酰-D-異谷氨 酰-L-丙氨酰-2-(1’-2’_ 二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)等。制成的本發明組合物可直接給予待治者，所述待治者可以是動物，尤其是人。本發 明疫苗特別適用于給」L童和青少年免疫接種。本發明疫苗可以是預防型(即用于預防感染)，也可以是治療型(即用于治療感染 后的疾病)，但通常是預防型。除修飾糖之外，本發明組合物還可包含抗原成分。例如，本發明組合物可包含一種 或多種其他糖(非修飾或如本發明所述經修飾)。例如，所述組合物可包含腦膜炎奈瑟氏 球菌血清群C、W135和Y的糖(如，在經修飾的MenA糖之外)。它們通常與載體蛋白綴合， 腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的糖可與相同或不同的載體蛋白綴合。如果混合物包括血清 群A和C的莢膜糖，MenA糖MenC糖之比(w/w)優選大于1 (例如2 1、3 1、4 1、 5 1,10 1或更高)。當MenA組分超過(質量/劑量)MenC組分時，MenA組分的免疫 原性提高。本發明組合物還可包含蛋白抗原。本發明組合物可包含的抗原包含-來自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的抗原，如 CagA[36_39]、VacA[40， 41]、NAP[42，43，44]、HopX[例如 45]、HopY[例如 45]和 / 或脲酶。-來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的蛋白抗原，如文獻46至52所述的抗原，優選 蛋白質‘287’(見后文)及其衍生物(例如‘ AG287’)。-來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊泡(0MV)制品，如文獻53、54、55、56等 所述。-來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C的糖抗原，如文獻57所述的血清群C寡糖[另 見文獻58]。-來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原[例如 59、60、61]。-來自甲肝病毒的抗原，如滅活病毒[例如62、63]。-來自乙肝病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如63、64]。-來自丙肝病毒的抗原[例如65]。-來自百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的抗原，如來自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，可以與百日咳桿菌粘附素(pertactin)和 /或凝集原2和3 [例如文獻66和67]。-白喉抗原，如白喉類毒素[例如文獻68第3章]，如CRM197突變體[例如文獻 69]。-破傷風抗原，如破傷風類毒素[例如文獻68第4章]。-來自流感嗜血桿菌B的糖抗原[例如58]。 -來自淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)的抗原[例如46、47、48]。-來自肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)的抗原[例如 70、71、72、73、74、75、 76]。-來自沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)的抗原[例如77]。_來自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[例如78]。-脊髓灰質炎抗原[例如79、80]，如IPV或0PV。-狂犬病抗原[例如81]，如凍干滅活病毒[例如82，RabAvert ]。-麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原[例如文獻68第9、10和11章]。-流感抗原[例如文獻68第19章]，如血凝素和/或神經氨酸酶表面蛋白質。-來自粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhal is)的抗原[例如83]。-來自無乳鏈球菌(Sti^ptococcusagalactiae) (B組鏈球菌)的抗原[例如84、 85]。-來自無乳鏈球菌(B組鏈球菌)的糖抗原。-來自膿鏈球菌(Sti^ptococcuspyrogenes) (A組鏈球菌)的抗原[例如85、86、 87]。-來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原[例如88]。-來自炭疽桿菌(Bacillusanthracis)[例如 89、90、91]的抗原。-來自黃病毒家族(黃病毒屬)病毒的抗原，如來自黃熱病病毒、日本腦炎病毒、四 種登革熱病毒亞型、蟬傳腦炎病毒、西尼羅河病毒的抗原。-瘟疫病毒抗原，如來自經典豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或羊邊界病毒 (borderdisease virus)。-細小病毒抗原，例如來自細小病毒B19。_朊病毒蛋白質(例如CJD朊病毒蛋白質)-淀粉樣蛋白質，如β肽[92]-癌抗原，如文獻93表1或文獻94表3和4所列。組合物可包括一種或多種上述其他抗原。可視必要將有毒蛋白抗原去毒(例如通過化學和/或遺傳方法將百日咳毒素去毒 [67])。當組合物包含白喉抗原時，宜同時包含破傷風抗原和百日咳抗原。同樣，當組合物 包含破傷風抗原時，宜同時包含白喉抗原和百日咳抗原。同樣，當組合物包含百日咳抗原 時，宜同時包含白喉抗原和破傷風抗原。較好的是，抗原吸附于鋁鹽。組合物中抗原各自的濃度通常至少1 μ g/ml。一般說來，任一特定抗原的濃度都足以弓I發針對該抗原的免疫反應。本發明組合物中也可以用編碼抗原的核酸代替蛋白抗原[例如文獻95-103]。因 此，本發明組合物的蛋白類成分可由編碼這些蛋白質的核酸(優選DNA，例如質粒DNA)取 代。本發明還提供增強哺乳動物抗體反應的方法，包括將本發明藥物組合物給予哺乳 動物，最好是人，例如成人或兒童，優選兒童。所述抗體反應最好是抗腦膜炎奈瑟氏球菌A 血清群感染的保護性反應。本發明還提供免疫哺乳動物的方法，包括將本發明藥物組合物給予哺乳動物。本發明還提供用作藥物的本發明修飾糖或綴合物。本發明還提供本發明修飾糖或綴合物用于制造預防或治療莢膜細菌(capsulate bacteria)所致疾病的藥物的用途。奈瑟氏球菌所致疾病包括例如腦膜炎、敗血病和淋病。 流感嗜血桿菌所致疾病包括中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎和腦膜炎。肺炎球菌 所致疾病包括腦膜炎、膿毒病和肺炎。因此優選預防和/或治療細菌性腦膜炎。附圖的概述圖1顯示由⑶I-活化糖開始合成糖_蛋白綴合物。圖2顯示腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖上的羥基與⑶I的反應。圖3顯示比較免疫原性研究的結果。圖表顯示(A)到(E)五種不同糖免疫原的 GMT值，表格列出了抗A血清群菌株F8238的血清殺菌效價。本發明實施方式免疫原性比較研究本發明提供改良型的糖-蛋白鍵。另外，本發明的糖-蛋白綴合物比其它類型 糖_蛋白綴合物具有更強的免疫原性。為了進行比較，制備了含其它鍵的糖-蛋白綴合物。制備修飾的腦膜炎奈瑟氏球 菌A血清群多糖對糖上的羥基進行⑶I-活化，接著用NH2- (CH2) 5-C02H淬滅⑶I氨基甲酸 酯中間體。用該修飾多糖通過EDAC-激活的羧基與CRM197偶聯制備糖-蛋白綴合物。這 樣，該多糖與CRM197通過接頭基團-0C (0) NH(CH2) 5-C (0) NH-偶聯。在本次比較研究中，制備 糖_蛋白綴合物的這一方法稱為“碳二亞胺法”。將碳二亞胺法制得的糖_蛋白綴合物與本發明的糖-蛋白綴合物比較。所以，制 備修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群多糖CDI-活化多糖上的羥基，接著用tris-親核體 NH2-(CH2)3_CH(0H)CH20H淬滅⑶I氨基甲酸酯中間體。高碘酸鹽剪切暴露醛基后，通過還 原氨基化將該修飾多糖與CRM197偶聯(如圖1所示)。這樣，該多糖與CRM197通過接頭基 團-OC(O)NH-(CH2)4-NH-偶聯。在本次比較研究中，制備糖_蛋白綴合物的這一方法稱為 “還原氨基化法”。在Balb/c小鼠中確定碳二亞胺法和還原氨基化法制備的綴合物(兩種不同比例) 的免疫原性。綴合物分2次給予(0和14天)，每次2 y g/劑(以糖的質量計)。在第二 5 天放血，測定IgG效價(GMT)。另外，評估抗MenA菌株F8238的血清殺菌抗體(SBA)效價。 為了比較，還測試本發明的寡糖綴合物和非綴合多糖。結果示于圖3。寡糖綴合物(C)具有最佳GMT值，SBA效價為1024。相比之下，純 多糖(E)的GMT效價較低(與鹽水對照相當)，SBA效價也較低(< 4)。用碳二亞胺法與CRM197綴合后(D)，兩效價都升高(SBA:128)。用還原氨基化法綴合CRM197后(E)，GMT和 SBA效價都升高(SBA =512-1024)。還原氨基化法所制綴合物的SBA效價與寡糖綴合物的效 價相當。用豚鼠模型進行的比較ELISA確認了用Balb/c小鼠所得的結果。以上只是為描述本發明所舉的例子，本發明的范圍和精神涵蓋了對所舉實施例的 各種改動。文獻(本發明對其內容進行了全面參考)[llResearch Disclosure,453077(Jan 2002)[2]EP-A-0372501[3]EP-A-0378881[4]EP-A-0427347[5]W093/17712[6]W094/03208[7]W098/58668[8]EP-A-0471177[9]W000/56360[10]W091/01146[ll]ff000/61761[12]W001/72337[13]Lei et al. 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權利要求
修飾的莢膜糖，它包含結構式(I)所述的組成部分-A-N(R1)-L-M (I)其中A是鍵，-C(O)-或-OC(O)-鍵；R1選自H或C1-C6烴基；L是C1-C12亞烴基；M是掩蔽醛基。
2.如權利要求1所述的修飾莢膜糖，A是-0C(0)-。
3.如權利要求1或2所述的修飾莢膜糖，R1是H。
4.如前述權利要求中任一項所述的修飾莢膜糖，L是Ci-C；亞烴基。
5.如權利要求4所述的修飾莢膜糖，L是-CH2CH2CH2-。
6.如前述權利要求中任一項所述的修飾莢膜糖，所述掩蔽醛基選自 其中R2選自H、CrC12烴基、C3-C12環烴基、C5-C12芳基或C5_12芳基烴基； X和Y相同或不同，各自選自0或S ；R3和R4各自選自CrC12烴基、C3-C12環烴基、C5-C12芳基或C5_12芳基烴基；或者， R3和R4連接成C3、C4、C5、C6、C7或C8含有雜原子X和Y的環烴基環；R5和R6各自選自H、C「C12烴基、C3-C12環烴基、C5-C12芳基或C5_12芳基烴基；或者， R5和R6連接成C3或C12環烴基環；R9和R10各自選自H、CrC12烴基、C3-C12環烴基、C5-C12芳基或C5_12芳基烴基；或 者，R9和R10連接成C3_12環烴基環；R7和R8各自選自Q-Cu烴基或C3-C12環烴基。
7.如權利要求6所述的修飾莢膜糖，所述掩蔽醛基是-CH(0H)CH20H。
8.如權利要求1或權利要求3至7中任一項所述的修飾莢膜糖，包含-NH(CH2)3CH(0H) CH20H所示的組成部分。
9.如權利要求1至7中任一項所述的修飾莢膜糖，包含-0C(0) NH (CH2) 3CH (OH) CH20H所 示的組成部分。
10.修飾的莢膜糖，它包含結構式(II)所示的組成部分 -A-^iR^-L-C (0)H (II)其中，A、R1和L如權利要求1至5中任一項所定義。
11.如權利要求10所述的修飾莢膜糖，A是-0C(0)-。
12.如權利要求10所述的修飾莢膜糖，包含_NH(CH2)3C(0)H所示的組成部分。
13.如權利要求10或11所述的修飾莢膜糖，包含-0C(0)NH(CH2)3C(0)H所示的組成部
14.如前述權利要求中任一項所述的修飾莢膜糖，所述莢膜糖是腦膜炎奈瑟氏球菌A 血清群糖。
15.修飾莢膜糖的方法，包括步驟(a)提供具有羥基的莢膜糖；(b)所述羥基與雙官能試劑在有機溶劑中反應；(c)步驟(b)的產物與結構式(III)所示氨基化合物反應；-HMRO-L-M (III)其中，R1、L和M如權利要求1至7中任一項所定義。
16.如權利要求15所述的方法，所述莢膜糖是腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖。
17.如權利要求15或16所述的方法，所述有機溶劑是非質子溶劑。
18.如權利要求17所述的方法，所述非質子溶劑選自二甲亞砜(DMS0)、二甲基甲酰胺 (DMF)、甲酰胺、六甲基磷酰胺(HMPA)、六甲基三磷酰胺(圓 10、1，3-二甲基-3，4，5，6-四 氫-2(1H)_嘧啶酮(DMPU)或二甲基乙酰胺(DMAC)。
19.如權利要求17或18所述的方法，所述非質子溶劑是DMS0。
20.如權利要求15至19中任一項所述的方法，所述雙官能試劑選自1，1’_羰基二咪 唑(CDI)、羰基二-1，2，4-三唑(⑶T)、羰基二-1，2，3-苯并三唑(⑶B)、碳酸二苯酯、溴化 氰、光氣或三光氣。
21.如權利要求20所述的方法，所述雙官能試劑是CDI。
22.如權利要求15至21中任一項所述的方法，步驟(c)中的氨基化合物是 H2N(CH2)3CH(0H) CH2OH。
23.如權利要求15至22中任一項所述的方法，還包括步驟(d)將掩蔽醛基M解蔽，產 生醛化合物。
24.如權利要求23所述的方法，所述掩蔽醛基M是CH(OH) CH20H，解蔽步驟是高碘酸鹽 剪切。
25.如權利要求23或24所述的方法，還包括步驟(e)通過還原氨基化n反應將所述醛 化合物與蛋白質相連。
26.如權利要求25所述的方法，所述還原氨基化反應中的還原劑是NaBH3CN。
27.糖-蛋白綴合物，其中，糖部分和蛋白質部分由結構式(IV)所示基團相連-A-NOO-L-NH (IV)其中A、R1和L如權利要求1至4中任一項所定義。
28.糖-蛋白綴合物，R1是H，A是-0C(0)且L是-(CH2)4-。
29.如權利要求27或28所述的綴合物，所述糖是腦膜炎奈瑟氏球菌A血清群糖。
30.如權利要求25或26所述的方法或權利要求27至29中任一項所述的綴合物，所述 蛋白質是細菌毒素或類毒素。
31.如權利要求30所述的方法或綴合物，所述細菌毒素或類毒素是白喉毒素或類毒o
32.如權利要求25或26所述的方法或權利要求30所述的綴合物，所述細菌毒素或類 毒素是crm197。
33.藥物組合物，包含權利要求27至32中任一項所述的糖_蛋白綴合物和/或權利要求丄至14中任一項所述的修飾糖，和(b)藥學上認可的載體。
34.如權利要求33所述的組合物，還包含疫苗佐劑。
35.如權利要求34所述的組合物，是抗腦膜炎奈瑟氏球菌所致疾病的疫苗。
36.增強哺乳動物抗體應答的方法，包括將權利要求33所述的藥物組合物給予哺乳動物。
37.權利要求27中32中任一項所述的綴合物或權利要求1至14中任一項所述的糖， 它們被用作藥物。
38.權利要求27中32中任一項所述的綴合物或權利要求1至14中任一項所述的糖用 于制造預防或治療一種或多種莢膜細菌所致疾病的藥物的用途。
39.如權利要求38所述的用途，所述疾病是細菌性腦膜炎。
全文摘要
本發明描述具有新型接頭的糖-蛋白綴合物。含新接頭的該綴合物由修飾糖制得，該修飾糖包含結構式(I)即-A-N(R1)-L-M所示的組成部分，其中，A是-C(O)-或-OC(O)-鍵，R1選自H或C1-C6烴基；L是C1-C12亞烴基；M是掩蔽醛基。新接頭特別適用于制備腦膜炎奈瑟氏球菌(N.menigitidis)A血清群糖的綴合物。具有此新接頭的綴合物比其它類型的綴合物具有更強的免疫原性。
文檔編號C08H1/00GK101863998SQ20101018255
公開日2010年10月20日 申請日期2003年9月1日 優先權日2002年8月30日
發明者A·吉亞諾齊, F·諾萊利, G·阿弗拉尼, P·科斯坦蒂諾 申請人:諾華疫苗和診斷有限公司