糖蛋白和糖基化的細胞以及其制備方法

專利名稱：：糖蛋白和糖基化的細胞以及其制備方法
技術領域：
：本申請公開了新的糖蛋白和相關的適合于制備糖肽(特別是糖蛋白和糖基化的細胞)的糖基甲氨酰化方法，以及此類糖蛋白在醫學中，例如作為藥物和診斷劑或在診斷試劑盒中的用途。
背景技術：
：適合于制備糖綴合物例如糖肽、糖蛋白、糖脂、糖基化的細胞表面、糖基化的細胞膜和其他糖基化的非生物學表面的技術在藥物發現和糖生物學中具有巨大的重要性。通過將免疫原性的和非免疫原性的糖部分綴合至化學和/或生物學實體，此類使之能能夠實現的技術在糖藥物(glycopharmaceuticals)的開發中發揮著至關重要的作用。通常，最先進的技術基于連接化學的使用，其中在將連接探針(ligatingprobes)綴合至靶化學和生物學實體的過程中免除了保護基團的輔助。在科學文獻中已描述了幾種連接方法，其集中于肽和蛋白質的N-末端和賴氨酸側鏈的取代，以便遞送所希望的糖部分。眾所周知，伯氨基官能團在所有種類的生物學樣品例如器官、皮膚、毛皮、蠶絲、細胞表面中都是豐富的，并且還可以容易地展示在合成聚合物上。因此，伯胺選擇性連接方法具有為眾多工業提供許多種類的產品的最大潛力。伯胺連接化學必須在水或其他水性溶液中提供適當的反應性、化學選擇性、常令人滿意的位點選擇性，而同時消除嚴重的副產物形成的發生。伯胺特異性連接的副產物形成是由于在連接探針和所靶向的多功能分子/生物學實體中存在的眾多親核官能團例如仲氨基、醇和酚羥基、羧基等處的不希望的反應所致。過去已介紹了幾種伯胺特異性連接方法。就所達到的取代度和選擇性而言，這些連接方法具有嚴重的缺點。由于使用非常具有反應性的連接探針例如混合酐，上面所提及的伯胺連接技術經常遭受低取代度和低程度的化學選擇性的問題。在幾種情況下，活化試劑的使用也是必需的，從而使操作程序復雜化并且降低了產物純度(混合酐方法，還原性胺化)。此外，在一些連接方法中，可以形成有毒的或難以除去的縮合副產物，從而在敏感的生物學實體的衍生化中造成嚴重的問題(2-亞氨基甲氧基甲硫基連接，酰基疊氮化物連接，方形酸連接)。在大多數情況下，所開發出的方法使用包含人工和/或毒性殘基的接頭系統(用芳基異硫氰酸酯進行偶聯，方形酸連接)，從而通過引入非必需的連接部分而限制了連接的范圍。因此，鑒于目前技術的限制，存在有開發新的適合于將糖類綴合至蛋白質的連接方法的需要。新的方法必須滿足下列標準-連接反應應當優選地在水性溶液中，優選地在水中進行；-應當優選地建立在所綴合的部分之間的直接鍵合，由此消除人工接頭的使用；-可以接受天然和非毒性的接頭部分；-在連接反應過程中應當避免偶聯試劑；-應當消除縮合副產物形成；-連接化學應當能夠在寬的pH范圍內工作；-連接探針的反應性應當支持化學選擇性和位點選擇性，而同時可以達到迅速的￡雙口οEP441192A2公開了反電子等排的(retroisosteric)二肽和其作為凝乳酶抑制劑的用途。WO88/02756A2公開了具有延長的作用持續時間的生物活性肽的糖衍生物。發明簡述本發明提供了所希望的理想連接程序，其通過在寬的pH范圍內并且不使用任何偶聯試劑，在水中將未經保護的糖類直接連接至肽/蛋白質/生物學實體。此外，該新開發出的方法提供了優異的化學選擇性和位點選擇性。因此，本發明的一個方面涉及用于制備糖-肽綴合物的方法，參見權利要求1。本發明的另一個方面涉及糖-肽綴合物，參見權利要求7、8和10。本發明的第三個方面涉及用于在醫學中使用的此類糖-肽綴合物，參見權利要求15。本發明的第四個方面涉及糖-肽綴合物作為藥物、診斷劑或在診斷試劑盒中的用途，參見權利要求17。本發明的第五個方面涉及新的寡糖的環狀氨基甲酸酯。附圖簡述圖1使用二糖連接探針來進行的糖環狀氨基甲酸酯連接的具體反應流程。圖2對于人胰島素的糖基化，使用二糖連接探針來進行的糖環狀氨基甲酸酯連接的具體反應流程。圖3對于腫瘤細胞，使用二糖連接探針來進行的糖環狀氨基甲酸酯連接的具體反應流程。圖4三糖與癌細胞的一般性綴合。圖5乳糖的糖環狀氨基甲酸酯的制備。圖6經由膦亞胺中間體來制備糖N，0-環狀氨基甲酸酯。圖7免疫原性的糖的糖N，0-環狀氨基甲酸酯的制備。圖8經由無環氨基甲酸酯的分子內環的形成來制備糖N，0-環狀氨基甲酸酯。圖9衍生化的糖N，0-環狀氨基甲酸酯的制備。圖10經放射性標記的具有N，0-環狀氨基甲酸酯的三糖的制備。圖11和12用經FITC標記的GS1B4對細胞涂片進行的染色。發明詳述如上面所提及的，本發明尤其涉及用于制備糖-肽綴合物的方法，所述方法包括使環狀氨基甲酸酯(4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；并且R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X_(CH丄-，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數；與肽反應的步驟，所述肽包含至少一個伯氨基基團。生物學和化學實體的化學修飾是最重要的反應之一，其可以提供以新的物理、化學、生物學和生理學特性為特征的產物。生物聚合物和生物學實體的最所希望的結構修飾之一是糖基化。糖綴合物是給肽/蛋白質和生物學細胞表面提供新特性的天然結構。例如，糖-肽綴合物可以穩定所考慮的肽(例如，蛋白質)的最佳構象，從而保持所希望的功能。糖-肽綴合物還可以表現出蛋白質的增加的半壽期、水溶性和提高的穩定性。共價連接的糖還可以作為病毒、原核細胞和真核細胞表面上的免疫決定簇。已知幾種糖部分抑制微生物的粘附，而其他的擔當用于結合微生物的受體。因此，糖綴合物在病毒和細菌感染中發揮著重要的作用，并且某些衍生物可以用作抗感染劑。綴合物，例如在下文中通過通式1和2的綴合物所概括的(參見進一步的下文)。應當理解，綴合物包含一個或多個糖部分以及肽部分。此類糖部分本身可以是單糖、二糖或寡糖。實際上，術語“糖部分”(也稱為糖基部分)，當在本文中使用時，意在包括(但不限于)衍生化的和未衍生化的單糖、二糖、寡糖、N-糖苷、S-糖苷和C-糖苷。糖部分可以具有由單糖單元組成的線性或支化的(通常高度支化的)結構。一些較大量使用的單糖單元包括葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖、神經氨酸、N-乙酰-神經氨酸等。術語“肽”，當在本文中使用時，意在包括較小的肽，例如具有最少5個氨基酸單元的寡肽，和直到具有最少30個氨基酸單元的多肽和蛋白質。通常，肽/肽部分包含總共至少30個氨基酸單元，通常是通過酰胺鍵(肽鍵)連接在一起的α-氨基酸。在更令人感興趣的實施方案中，氨基酸單元的總數目通常為至少60，例如至少100，或者至少150。較大的肽/肽部分甚至可以由兩個或更多個對于生物學上有活性的肽/蛋白質例如酶、治療上相關的蛋白質等的形成來說相關的結構域組成。環狀氨基甲酸酯(4)代表了用于形成糖-肽綴合物的關鍵試劑。在該環狀氨基甲酸酯中，R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；此外，R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)廠，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數。應當理解，在最引人興趣的實施方案中，環狀氨基甲酸酯代表二糖、三糖或寡糖，即R3、R4和X中的至少一個表示糖部分。作為環狀氨基甲酸酯化合物的令人感興趣的變體的例子，可以提及在二糖和寡糖的還原端的1，2-N，0-位置處具有環狀氨基甲酸酯部分的化合物(4a)、(4b)和(4c)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中，R6和R7如上面對于R3和R4所定義的，R9如上面對于R5所定義的，并且R8和R10獨立地選自羥基、CV6-烷氧基、C2_2(l-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。術語“Cu-烷氧基”表示“Cu-烷基-氧基”，其中"(V6-烷基”意指具有1至6個碳原子的線性或支化的烴基團，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基。術語“C2_2(|-酰氧基”表示"C1,-烷基_C(=0)-0_”，其中"C1,-烷基”意指具有1至19個碳原子的線性或支化的烴基團，例如乙酰氧基、乙基羰基氧基、丙基羰基氧基、異丙基羰基氧基、丁基羰基氧基、戊基羰基氧基、辛基羰基氧基等，以及其不飽和的變體，例如其中“C2_2(l-酰氧基”具有含義"C1,-烯基-C(=οχ-”、、，-二烯基-C(=0)-0_”、"(V19-三烯基-c(=ο)-O-W^19-四烯基-c(=ο)-ο-”、“(ν19-炔基-c(=0)-0-”等的那些，等等。環狀氨基甲酸酯與肽之間的反應在本文中相關的肽是具有至少一個可以與環狀氨基甲酸酯進行反應的伯氨基基團的那些肽。將會意識到，有些肽包含幾個伯胺，例如源自賴氨酸單元的側鏈伯胺和源自各種氨基酸(但將脯氨酸排除在外)的N-末端伯胺。使環狀氨基甲酸酯(4)與肽反應的步驟牽涉在促進一個或多個伯氨基基團和相應數目的環狀氨基甲酸酯分子之間的反應的條件下使所述種類相接觸。連接反應可以通過下面的反應流程來舉例說明，其中(4)表示1，2_N，0-環狀氨基甲酸酯(R3、R4和R5如上所定義)和⑵表示肽(E1)的一個伯氨基基團(H2N),和所得的糖-肽綴合物由⑶表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>糖環狀氨基甲酸酯⑷與在肽/蛋白質、生物學實體等(2)中存在的伯胺的N-親核體的開環反應是該新型連接方法的關鍵化學。在環狀氨基甲酸酯(4)以反式-反式稠合的二環體系為特征的情況下，連接變得非常強有力。這樣的極具張力的環體系傾向于通過開環過程來穩定化。諸如(4)的環狀氨基甲酸酯的制備將在后面進行討論。通常，糖類的相應的環狀氨基甲酸酯與表現出伯氨基基團的化學和生物學實體的化學選擇性和位點選擇性新型連接反應在酸性、中性或堿性反應條件中，在0-40°C的溫度范圍內，在有機或水性溶液中進行。包括但不限于下列的溶劑可以用于此類化學轉化甲醇、水、乙醇、丙酮、甲苯、苯、1，4_二噁烷、DMF、吡啶等及其混合物。為了控制pH、催化過程和位點選擇性，堿性物質例如無機/有機堿(尤其是N，N-二異丙基乙胺、三乙胺等)及其鹽在取代過程中可以是優選的。可以使用酸性物質，例如無機/有機酸，優選地，HC1、乙酸、甲酸等，及其鹽例如NaH2PCV通常，取決于底物的結構、所設置的溫度和糖的環狀氨基甲酸酯，取代的反應時間在3至24小時之間變化。通常，以80至95%的產率獲得經綴合的糖綴合物產物。重要的是強調，N-末端和賴氨酸側鏈取代之間的位點選擇性可以通過pH調整和設定適當的反應條件而容易地保持。因此，在PH4-7下進行的連接反應通常展示出優異的N-末端選擇性。在較高pH8-10下的綴合主要提供賴氨酸側鏈經修飾的產物。所述新型連接在PH7下在水中進行，而不需添加任何堿/酸或任何其他活化試劑。此外，所得的產物具有天然的糖基脲鍵，其不能被認為對生命體系是毒性的或有害的。因此，在根據本發明的方法的一個實施方案中，反應在極性溶劑例如水中進行。在根據本發明的方法的某些實施方案中，所述反應在6.5-10.5的范圍內的pH下進行。備選地，所述反應在4.7-7.O的范圍內的pH下進行以促進在N-末端處的選擇性連接，或者在8.0-10.O的范圍內的pH下進行以促進在賴氨酸側鏈處的選擇性連接。所述方法可應用于任何類型的肽，例如單鏈肽、多鏈肽、折疊的肽、聚集的肽、細胞表面結合蛋白、細胞膜結合蛋白等。在一個特別令人感興趣的實施方案中，所述肽是細胞表面或細胞膜結合蛋白。該方法產生了大量的新的糖-肽綴合物，優選地包括下面進一步定義和描述的那些(參見“新的糖-肽綴合物”)。新的糖-肽綴合物一類新的糖-肽綴合物是由通式1所定義的那些，其中一個或多個糖部分通過其糖苷位置經由羰基接頭而連接至肽/蛋白質的賴氨酸殘基的ε_氨基官能團。因此，本發明還涉及糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式1的部分，和其藥學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中R1和R2連同間插性賴氨酸部分一起表示肽部分；R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)廠，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數。關于此的例子是這樣的糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式la、Ib和Ic中任一個的部分，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中，R6和R7如上面對于R3和R4所定義的，且R9如上面對于R5所定義的，并且R8選自羥基、C1^6-烷氧基、C2_2(1-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。另一類新的糖_肽綴合物是由通式2所定義的那些，其中糖部分通過其糖苷位置經由羰基接頭而連接至肽/蛋白質的N-末端氨基官能團。因此，本發明還涉及糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式2的部分，和其藥學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R11是氨基酸側鏈；R2連同-NH-CHR11-C(=0)-—起表示氨基酸單元總數目為至少30的肽部分；R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X_(CH義_，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數。關于此的例子是這樣的糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式2a、2b和2c中任一個的部分，<image>imageseeoriginaldocumentpage13</image>其中，R6和R7如上面對于R3和R4所定義的，R9如上面對于R5所定義的，并且R8選自羥基、Cp6-烷氧基、C2_2(1-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。應當理解，上述類別的由通式1和通式2所表示的糖-肽綴合物是部分重疊的，因為可以容易地想象一個或多個糖部分通過其糖苷位置經由羰基接頭而連接至肽的賴氨酸殘基的氨基官能團；以及在同一肽內，糖部分通過其糖苷位置經由羰基接頭而連接至肽的N-末端氨基官能團。所述肽可以，如果其由兩條或更多條鏈組成，甚至具有兩個或更多個N-末端連接的糖部分。在一些最引人興趣的實施方案中，所述肽是細胞表面或細胞膜結合蛋白。術語“氨基酸側鏈”意指通常包含在肽(包括合成肽)中的氨基酸的側鏈基團，并且不限于大約20種必需氨基酸。氨基酸側鏈的例子為氫(表示甘氨酸)、甲基(丙氨酸)、2-丙基(纈氨酸)、2_甲基-1-丙基(亮氨酸)、2_丁基(異亮氨酸)、甲硫基乙基(甲硫氨酸)、芐基(苯丙氨酸)、3_吲哚基甲基(色氨酸)、羥甲基(絲氨酸)、1_羥基乙基(蘇氨酸)、巰基甲基(半胱氨酸)、4_羥基芐基(酪氨酸)、氨基羰基甲基(天冬酰胺)、2_氨基羰基乙基(谷氨酰胺)、羧甲基(天冬氨酸)、2_羧基乙基(谷氨酸)、4_氨基-1-丁基(賴氨酸)、3_胍基-1-丙基(精氨酸)和4-咪唑基甲基(組氨酸)。術語“藥學上可接受的鹽”意在包括酸加成鹽和堿式鹽。酸加成鹽的舉例說明性例子為與無毒性的酸形成的藥學上可接受的鹽。此類有機鹽的例子為與下列酸形成的那些鹽馬來酸、富馬酸、苯甲酸、抗壞血酸、琥珀酸、草酸、亞甲基雙水楊酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、乙酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡糖酸、乳酸、蘋果酸、扁桃酸、肉桂酸、檸康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、衣康酸、乙醇酸、對氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸和茶堿乙酸，以及8-鹵代荼堿，例如8-溴荼堿。此類無機鹽的例子為與下列酸形成的那些鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸。堿式鹽的例子為這樣的鹽，其中(其余的)抗衡離子選自堿金屬，例如鈉和鉀；堿土金屬，例如鈣；和銨離子(+N(R)3R'，其中R和R'獨立地表示任選地經取代的CV6-烷基、任選地經取代的C2_2(l-烯基、任選地經取代的芳基或任選地經取代的雜芳基)。藥學上可接受的鹽為，例如，在Remington'sPharmaceuticalSciences，第17版.AlfonsoR.Gennaro(編輯)，MackPublishingCompany,Easton,PA,U.S.Α.，1985禾口更近版本中以及在EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology中所描述的男β些。因此，本文中所使用的術語“酸加成鹽和其堿式鹽”意在包括這樣的鹽。此外，所述化合物以及任何中間體或起始材料還可以以水合物的形成存在。此外，應當理解，所述化合物可以作為外消旋混合物或者單獨的立體異構體例如對映異構體或非對映異構體而存在。本發明包括每一種此類可能的立體異構體(例如對映異構體和非對映異構體)以及外消旋物和就可能的立體異構體之一而言豐富的混合物。環狀氨基甲酸酯的制備環狀氨基甲酸酯衍生物⑷(以及(4a)、(4b)和(4c))的制備基于在三烷基/芳基膦存在下用二氧化碳處理相應的糖基疊氮化物或相應的其他疊氮基_脫氧_寡糖衍生物。通常，反應在中性反應條件下于0-40°C的溫度范圍下在無水有機溶液中進行。包括但不限于下列的溶劑可以用于此類化學轉化丙酮、甲苯、苯，1，4_二噁烷、DMF、四氫呋喃等及其混合物。取決于底物的結構、所設置的溫度和所使用的三烷基/芳基膦的性質，環狀氨基甲酸酯形成的反應時間通常在3至24小時之間變化。通常，以80至95%的高產率獲得環狀氨基甲酸酯產物。備選地，環狀氨基甲酸酯衍生物⑷(以及(4a)、(4b)和(4c))的制備基于用三烷基/芳基膦處理相應的糖基疊氮化物或相應的其他疊氮基_脫氧_寡糖衍生物，其牽涉膦亞胺衍生物的分離。在第二步中，使膦亞胺衍生物與二氧化碳反應，從而提供所希望的寡糖的環狀氨基甲酸酯。通常，反應在中性反應條件下于0-40°C的溫度范圍下在無水有機溶液中進行。包括但不限于下列的溶劑可以用于此類化學轉化丙酮、甲苯、苯、1，4_二噁烷、DMF、四氫呋喃等及其混合物。取決于所使用的三烷基/芳基膦的性質，膦亞胺形成的反應時間為3-10小時。取決于底物的結構、所設置的溫度，環狀氨基甲酸酯的形成通常在3至24小時之間變化。通常，以80至95%的高產率獲得環狀氨基甲酸酯產物。備選地，環狀氨基甲酸酯衍生物(4)(以及(4a)、(4b)和(4c))的制備牽涉用光氣或其他合適的光氣衍生物(例如雙光氣或三光氣)處理相應的糖基胺或其他氨基-脫氧-寡糖。通常，反應在中性或堿性反應條件下于0-40°C的溫度范圍下在有機或水性溶液中進行。包括但不限于下列的溶劑可以用于此類化學轉化水、丙酮、甲苯、苯、1，4_二噁烷、DMF、四氫呋喃、吡啶等及其混合物。取決于底物的結構和所設置的溫度，環狀氨基甲酸酯的形成通常在3至24小時之間變化。通常，以80至95%的高產率獲得環狀氨基甲酸酯產物。備選地，環狀氨基甲酸酯衍生物⑷(以及(4a)、(4b)和(4c))的制備基于用堿例如氫化鈉或DBU處理相應的無環氨基甲酸酯衍生物，從而引發分子內環閉合程序。通常，反應在堿性反應條件下于0-40°C的溫度范圍下在無水有機溶液中進行。包括但不限于下列的溶劑可以用于此類化學轉化甲苯、苯、1，4_二噁烷、DMF、四氫呋喃等及其混合物。取決于底物的結構和所設置的溫度，環狀氨基甲酸酯的形成通常在3至24小時之間變化。通常，以80至95%的高產率獲得環狀氨基甲酸酯產物。重要的是強調，環狀氨基甲酸酯衍生物⑷(以及(4a)、(4b)和(4c))在幾種反應條件下顯示出優異的穩定性，從而允許廣泛的化學衍生化，例如0-酰化、0-烷基化、環狀縮醛形成、環狀縮酮形成、未經保護的衍生物的氫解。這樣的獨特選擇擴展了環狀氨基甲酸酯連接探針的用處，并且可以用于將眾多的衍生化實體連接至肽/蛋白質、生物學實體和復雜的化學實體。相信，寡糖的環狀氨基甲酸酯(4a)、(4b)和(4c)，即<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(4a)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中R6和R7如上面對于R3和R4所定義的，并且R9如上面對于R5所定義的；R8和Rltl獨立地選自羥基、CV6-烷氧基、Cp6-酰氧基、乙酰氨基和糖部分，是如此地新，并因此本發明還涉及這樣的實體，其在通式2a、2b、2c、3a、3b和3c的化合物的制備中是有用的，尤其是作為中間體。糖-肽綴合物的用途一般地，本文所定義的糖-肽綴合物的用途為用作藥物、診斷試劑或在診斷試劑盒中使用。特別地，相信本文所定義和描述的糖-肽綴合物(包括根據本文所定義和描述的方法而制備的那些)在醫學領域內提供了大量的可能性。在一種變化形式中，糖-肽綴合物的糖基部分(糖部分)表示非免疫原性的糖。在一個優選的實施方案中，可以將幾種非免疫原性的糖例如葡聚糖、麥芽糖糊精、麥芽糖、纖維二糖、全-0-甲基化的寡糖、硫-聯寡糖綴合至治療性肽/蛋白質，以增加后者的半壽期并提供有益的物理、生物學和生理學特性，例如增加的溶解度、熱穩定性和酶學穩定性等。在另一種變化形式中，糖-肽綴合物的糖基部分(糖部分)表示免疫原性的糖。在該變化形式中，可以將幾種免疫原性的糖，例如ABO血型抗原、Lewis型抗原、腫瘤特異性抗原、α"Gal-表位、α-甘露糖基-表位、多聚唾液酸，綴合至-肽/蛋白質，以便通過主動疫苗接種來下調特定的肽/蛋白質。-病毒(活的、滅活的或病毒顆粒)，例如HIV、乙型肝炎病毒、皰疹病毒、流感病毒、禽流感病毒等，以便制備針對感染的疫苗。-細菌，例如分枝桿菌(Mycobacterium)、螺桿菌(Heliobacter)等，以便制備抗細菌的疫苗。-腫瘤細胞，以便改變免疫學特性并通過自身癌癥疫苗接種來產生強的免疫應答。-癌細胞膜，以便制備自身腫瘤疫苗。在進一步的實施方案中，可以將親脂性寡糖用于通過附著至白蛋白來增加肽/蛋白質的穩定性。實施例部分1連接實施例1:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(參見圖1)。通過添加三乙胺和乙酸將pH調整至ρΗΞ9.44。將混合物在室溫下保持4小時，并且隨后將反應混合物轉移至透析膜中并逆蒸餾水透析2天，然后進行凍干，從而獲得作為白色粉末的3。質譜法:MALDI-T0F糖基化的BSA68333，BSA參照66134。實施例2:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(參見圖1)。通過添加三乙胺和乙酸將pH調整至pH三8.57。將混合物在室溫下保持4小時，并且隨后將反應混合物轉移至透析膜中并逆蒸餾水透析2天，然后進行凍干，從而獲得作為白色粉末的3。質譜法:MALDI-T0F糖基化的BSA69099，BSA參照66134。實施例3:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(參見圖1)。通過添加三乙胺和乙酸將pH調整至ρΗΞ8.10。將混合物在室溫下保持4小時。將反應混合物轉移至透析膜中并逆蒸餾水透析2天，然后進行凍干，從而獲得作為白色粉末的3。質譜法:MALDI-T0F糖基化的BSA68329，BSA參照66134。實施例4:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(40mg)和BSA(牛血清白蛋白，50mg)2溶解在水(5mL)中(參見圖1)。通過添加三乙胺和乙酸將pH調整至ρΗΞ7.45。將混合物在室溫下保持4小時。將反應混合物轉移至透析膜中并逆蒸餾水透析2天，然后進行凍干，從而獲得作為白色粉末的3。質譜法:MALDI-T0F糖基化的BSA67679，BSA參照66134。實施例5:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(IOmg)和人胰島素4(50mg)溶解在水(13mL)中(參見圖2)。通過添加二異丙基-乙胺和水性NaH2PO4將pH調整至pEfelO.OO。將混合物在室溫下保持2.5小時，然后將反應混合物凍干，從而以大于90%的位點選擇性獲得B29糖基化的胰島素5。質譜法MALDI-T0F:B_29_糖基化的人胰島素6171，人胰島素5805。實施例6:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(IOmg)和人胰島素4(50mg)溶解在水(13mL)中(參見圖2)。通過添加二異丙基-乙胺和水性NaH2PO4將pH調整至ρΗΞ8.00。將混合物在室溫下保持2.5小時，然后將反應混合物凍干，從而提供經修飾的胰島素(5)。質譜法MALDI-T0F糖基化的人胰島素6171，人胰島素5804。實施例7:將麥芽糖基環狀氨基甲酸酯1(IOmg)和人胰島素4(50mg)溶解在水(13mL)中(參見圖2)。通過添加二異丙基-乙胺和水性NaH2PO4將pH調整至pHs7.00。將混合物在室溫下保持2.5小時，然后將反應混合物凍干，從而以大于90%的位點選擇性獲得B-I糖基化的人胰島素5。質譜法MALDI-T0F:B_1-糖基化的人胰島素6171，人胰島素5804。實施例8:在PBS緩沖液(5ml)中混合α-Gal表位-環狀氨基甲酸酯6(二糖)(25mg)和人乳腺癌細胞系7(2XIO6的細胞數目)(參見圖3)。將混合物在37°C下保持3小時，然后對混合物進行離心以將細胞與介質分開。用經熒光標記的凝集素處理所述經修飾的細胞，并通過流式細胞術來證實所述修飾。實施例9:在PBS緩沖液(5ml)中混合α-Gal表位-氨基甲酸酯6(二糖)(25mg)和人乳腺癌細胞系7(1XIO6的細胞數目)(參見圖3)。將混合物在37°C下保持3小時，然后對混合物進行離心以將細胞與介質分開。用經熒光標記的凝集素處理所述經修飾的細胞，并通過流式細胞術來證實所述修飾。實施例10在PBS緩沖液(5ml)中混合α-Gal表位-氨基甲酸酯6(二糖)(25mg)和人乳腺癌細胞系7(5XIO5的細胞數目)(參見圖3)。將混合物在37°C下保持3小時，然后對混合物進行離心以將細胞與介質分開。用經熒光標記的凝集素處理所述經修飾的細胞，并通過流式細胞術來證實所述修飾。從實施例11至實施例15，化合物9稱為“三糖探針(trisaccharicbprobe)”。參見圖4。在實施例14和15中，帶有記號的碳原子用C13同位素進行標記。實施例11將三糖探針綴合至B16BL6細胞系細胞的準備對于該實驗，使用兩瓶(300cm2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)匯合的B16.BL6黑素瘤細胞，所述B16.BL6黑素瘤細胞于37.5°C在5%CO2中在含有10%胎牛血清(無P/S)的DMEM中生長。從細胞中除去生長培養基，并且向細胞中添加25mLPBS(無Mg2+和Ca2+)(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)并立即再次除去。添加另外IOmLPBS并除去，然后用CellDissociationSolutionC5914(Sigma-aldrich,SaintLouis,Missouri)(3mL/瓶)收獲細胞并轉移到IOmL管(TPP，TrasadingenSwitzerland)中。細胞于20°C以300G離心5分鐘，并棄去上清液。隨后，在PBS(無Mg2+和Ca2+)中洗滌細胞，如上述那樣進行離心，并重懸浮在PBS(無Mg2+和Ca2+)中。測定細胞懸浮液的濃度。將α-gal表位綴合至B16.BL6黑素瘤細胞將500mgα-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)溶解在PBS(無Mg2+和Ca2+)(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)中，并通過無菌濾器(SartoriusMillisart,0.20my)(Sartorius,Goettingen,Germany)。制備8種不同濃度的綴合物。將2mL的每種綴合物稀釋物添加到具有2mLPBS(無Mg2+和Ca2+)和600μ1含IO6個Β16.BL6細胞的細胞懸浮液的瓶中。瓶中的終體積為4.6mL。將瓶編號為1至10。瓶1和10不含綴合物并用作對照。將細胞與綴合物在37°C和5%CO2下溫育3小時25分鐘。在綴合后，用IOmL的CellDissociationSolutionC5914(Sigma-Aldrich,SaintLouis,Missouri)收獲來自綴合反應1(未綴合的細胞)、2、4、6和8的細胞并轉移到IOmL管(TPP,TrasadingenSwitzerland)中。細胞于20°C以300G離心5分鐘，并重懸浮在PBS(無Mg2+和Ca2+)中。最后，如前述那樣離心細胞，并重懸浮在含BSA的100μ1TBS中。通過經錐蟲藍染色的細胞樣品的顯微術評價來測定細胞的濃度和生存力。次日，如上面所描述的那樣收獲來自綴合反應3、5、7、9和10(未綴合的細胞)的細胞。細胞于20°C以300G離心一次5分鐘，并重懸浮在含BSA的100μ1TBS中。通過經錐蟲藍染色的細胞樣品的顯微術評價來測定細胞的濃度和生存力。用經FITC標記的GS1B4對細胞涂片進行染餼將來自綴合反應1(未綴合的對照細胞)、2、4、6和8的細胞的涂片與在TBS中以1200稀釋的經FITC標記的GS1B4—起在室溫下溫育1小時。在TBS中進行漂洗之后，將一滴FluorescentMountingMedium(DAKO)放置在每一個細胞樣品上并在上面放上蓋玻片。通過熒光顯微術來評估經FITC標記的GS1B4與在經綴合的細胞上的Galal，3Gal的纟口口。流式細胞術分析通過流式細胞術來分析來自綴合反應1(未綴合的細胞)、2、4、6和8的B16.BL6細胞。將100μL包含IXIO5個細胞的細胞懸浮液與10μg/mL(l100稀釋度)的在含1%BSA的TBS中的經FITC標記的GS1B4—起于4°C溫育15分鐘。通過流式細胞術來測定經染色的細胞的比例、平均的細胞熒光強度和中值的細胞熒光強度。然后，將細胞在PBS中洗滌一次，并重復進行測量。使用已知表達2X106Galal，3Gal表位/細胞的兔紅細胞(RRBC)用于進行比較。經綴合的B16.BL6細胞和RRBC的分析在不同日進行。在綴合后的細胞的濃度和牛存力在綴合程序結束時，對于所有綴合反應，通過錐蟲藍染色所評估的細胞的數目和生存力均顯著地降低。然而，觀察到在不同綴合反應之間的相當大的變化。從每個綴合反應獲取100μ1至130μ1的體積的細胞懸浮液。表1.在綴合后的細胞的濃度和生存力<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>女)在綴合程序后1天測得的細胞的濃度和生存力表2.在綴合后的細胞生存力<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>綴合反應編號用經FITC標記的GS1B4對細胞涂片講行染餼在來自所有所測試的綴合反應(綴合反應2、4、6和8)的細胞上發現了Galα1，3Gal表位，其通過經FITC標記的GS1B4的結合來檢測。沒有任何未綴合的細胞(綴合反應1)被染色。參見圖11和12。流式細胞術在來自所有所測試的綴合反應(綴合反應2、6和8)的B16.BL6細胞上發現了Galαl,3Gal表位，其通過經FITC標記的GS1B4的結合來檢測。沒有任何未綴合的對照細胞(綴合反應1)被染色。對于所述綴合反應中的每一個，測定具有可檢測量的Gala1，3Gal_表位的細胞的比例。表3.具有可檢測量的Galal，3Gal_表位的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>測量了在其表面上具有可檢測量的Galal，3Gal_表位的細胞的熒光強度。結果強烈地表明，在經綴合的細胞上的Galal,3Gal-表位的數目大大高于已知存在于兔紅細胞上的2XIO6Galαl,3Gal表位。下面顯示了經洗滌的和未經洗滌的細胞的細胞熒光強度的平均值和中值。表4.熒光強度，未經洗滌的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*)已知兔紅細胞表達2XIO6Galαl，3Gal表位/細胞在來自綴合反應2的經綴合的B16.BL6黑素瘤細胞上的Galal，3Gal表位的可視化。用與細胞表面上的Galal,3Gal表位相結合的經FITC標記的GS1B4，細胞膜被深重地染色。表5.熒光強度，經洗滌的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6.熒光強度，未經洗滌的細胞<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image>綴合反應編號實施例12將α-Gal三糖-氨基甲酸酯探針綴合至B16BL6細胞系減少綴合時間細胞的準備參見實施例11。將α-gal表位綴合至B16.BL6黑素瘤細胞將α-Gal三糖-氨基甲酸酯探針(9)溶解在PBS(無Mg2+和Ca2+)(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)禾口HBSS(含D_葡萄||)(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)中，并通過滅菌濾器(SartoriusMinisart，0.20my)(Sartorius,Goettingen，Germany)。在PBS和HBSS中均制備3種不同濃度的三糖探針。準備8個小瓶(25cm2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)，每瓶包含IO6個B16.BL6細胞，并添加三糖探針。瓶中的總體積為4.6mL。將細胞與綴合物在37°C和5%CO2下溫育1小時。表7.綴合反應I<image>imageseeoriginaldocumentpage22</image><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在綴合后，將來自每個瓶的上清液轉移到分開的IOmL管(TPP，TrasadingenSwitzerland)中。用CellDissociationSolution(2mL/瓶)(Sigma-aldrich,SaintLouis,Missouri)收獲細胞，并轉移到IOmL管中。細胞于20°C以300G離心5分鐘，并重懸浮在0.5mLPBS或HBSS中。通過經錐蟲藍染色的細胞樣品的顯微術評價來測定細胞的濃度和生存力。在與三糖探針溫育1小時后，大多數細胞是活的并且貼附至瓶的底表面。但是，非常難以收獲這些細胞，并且它們中的大多數在該程序過程中喪失了。表8.細胞生存力<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表9.細胞生存力<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例13將α-Gal三糖-氨基甲酸酯探針(9)綴合至B16BL6細胞系減少綴合時間細胞的準備參見實施例11。將α-gal表位綴合至B16.BL6黑素瘤細胞將α-Gal三糖探針(9)溶解在HBSS(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)中，并通過無菌濾器(0.2μmSuporAcrodisc13，GelmanSciences，AnnArbor，Michigan)制備3種不同濃度的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)。準備5個小瓶，其具有606μL的包含總共IO6個Β16.BL6細胞的細胞懸浮液以及4mL的所述綴合物溶液之一。每瓶包含4.6mL的總體積。將細胞與“Glycom綴合物”在37°C下溫育3或1.5小時。表10.綴合反應<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在綴合后，將來自每個瓶的上清液轉移到分開的IOmL管(TPP，TrasadingenSwitzerland)中。通過向瓶中添加PBS并立即再次除去來洗滌細胞。用CellDissociationSolution(2mL/瓶)(Sigma-aldrich,SaintLouis,Missouri)來收獲細胞。在5分鐘后，將細胞轉移到IOmL試管中。細胞于20°C以300G離心5分鐘，并重懸浮在0.5mLPBS中。通過經錐蟲藍染色的細胞樣品的顯微術評價來測定細胞的濃度和生存力。流式細胞術分析來自綴合反應1的細胞將100μL包含IXIO5個細胞的細胞懸浮液與10μg/mL(l100稀釋度)的在PBS中的經FITC標記的GS1B4—起于4°C溫育15分鐘。使用兔紅細胞(A)用于進行比較。來自綴合反應2、3、4和5的細胞因為可用于流式細胞術分析的細胞非常少，所以沒有測定準確的細胞濃度。取而代之，估計所使用的細胞的量為0.4X105。將細胞與4μg/mL的在PBS中的經FITC標記的GS1B4一起于4°C溫育15分鐘。使用兔紅細胞⑶用于進行比較。通過流式細胞術來測定平均和中值細胞熒光強度。流式細胞術分析在來自所有綴合反應的B16.BL6細胞上發現了Galal，3Gal表位，其通過經FITC標記的GS1B4的結合來檢測。來自綴合反應2和4的細胞的分析顯示出了具有不同細胞熒光強度的兩個細胞群。由未綴合的細胞(綴合反應5)的熒光強度值所指明的相對高的背景染色可能是由于因高估了所使用的細胞數目從而造成所添加的經FITC標記的GS1B4大大過量而引起的。表11.熒光強度，來自綴合反應1的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*)已知兔紅細胞表達2X106Galal，3Gal表位/細胞13表12.熒光強度，來自綴合反應2、3、4和5的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*)已知兔紅細胞表達2XIO6Galαl,3Gal表位/細胞女±)從綴合反應2和4中均觀察到具有不同熒光強度的兩組細胞，因此值是對于這兩個組而給出的實施例14將放射性探針綴合至B16BL6細胞系該實驗的目的是估計綴合至B16.BL6黑素瘤細胞的Galαl,3Gal表位的數目，以及比較通過閃爍測量術和流式細胞術所獲得的結果。細胞的準備對于該實驗，使用9瓶(300cm2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)匯合的B16.BL6黑素瘤細胞，所述B16.BL6黑素瘤細胞于37.5°C在5%CO2中在含有10%胎牛血清(無P/S)的DMEM中生長。從細胞中除去生長培養基，并且向細胞中添加20mL含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)并立即再次除去。添加另外IOmL含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)并除去，然后用CellDissociationSolutionC5914(Sigma-aldrich,SaintLouis,Missouri)(IOmL/瓶)收獲細胞并轉移到50mL管(TPP,TrasadingenSwitzerland)中。細胞于20°C以300G離心3分鐘，并棄去上清液。隨后，在含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)中洗滌細胞兩次，如上述那樣進行離心，并重懸浮在含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)中。測定細胞懸浮液的濃度。將Galαl,3Gal表位綴合至B16.BL6黑素瘤細胞將經放射性標記的和常規的三糖探針溶解在含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+禾口Ca2+)(Gibco，Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并通過無菌濾器(0.2μmSuporAcrodisc13,GelmanSciences,AnnArbor，Michigan)。帝[J備4禾中不同濃度的每種“Glycom綴合物”(25mg、5mg、Img和0.Img)。準備12個瓶(150em2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)，每個瓶包含總共10XIO6個B16.BL6細胞。添加三糖探針，并用含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)將總體積調整至20mL。將細胞與“Glycom綴合物”在37°C下溫育1.5小時。在綴合后，將來自每個瓶的上清液轉移到分開的50mL管(TPP,TrasadingenSwitzerland)中。用CellDissociationSolutionC5914(5mL/Μ)(Sigma-Aldrich,SaintLouis,Missouri)來收獲細胞，并轉移到含有上清液的50mL管中。細胞于20°C以300G離心3分鐘，并重懸浮在5mLPBS(無Mg2+和Ca2+)中。這重復3次，隨后通過經錐蟲藍染色的細胞樣品的顯微術評價來測定細胞的濃度和生存力。閃爍測量術用經放射性標記的三糖探針進行綴合的細胞于20°C以1000G離心5分鐘。排出上清液，并使剩余的粒狀沉淀干燥。隨后，將粒狀沉淀溶解在400μ1Mili-QH2O中，并添加1.5mL閃爍液。通過向3個對照細胞樣品中添加500pCi、0.5pCi和OpCi來制備關于所述閃爍測量術的標準。將樣品在室溫下貯存3天，隨后將細胞懸浮液轉移至閃爍管并進行計數。流式細胞術分析通過流式細胞術來分析用常規的三糖探針進行綴合的細胞。將400μ1包含2XIO5個細胞的每種細胞懸浮液與ομg/mL的經FITC標記的GS1B4—起于4°C溫育15分鐘。通過流式細胞術來測量用GS1B4染色的細胞的平均熒光強度。在綴合后的細胞的濃度和牛存力在收獲程序過程中，意外地合并了兩個不同級分的具有經放射性標記的三糖探針的細胞，因此不得不排掉。因此，從這些綴合反應獲得的結果與其余的是不可比較的。另外，對于包含用0.Img經放射性標記的三糖探針進行綴合的細胞的懸浮液，獲取到了異常的體積。如在先前的初步實驗中所觀察到的，所收獲的細胞的量和細胞生存力在與不同濃度的綴合物進行溫育的細胞之間，以及在與常規的綴合物和與經放射性標記的綴合物進行溫育的細胞之間都發生變化。表13.用常規的綴合物進行綴合的細胞所添加的綴合物細胞濃度*生存力*所收獲的細胞*^Omg(對照)5.OXlO576.0%2.5XIO6(25%)25mg9.OXlO577.8%4.5XIO6(45%)5mg7.OXlO591.4%3.5XIO6(35%)~Imi13.4X10579.1%6.7XIO6(67%)0.Img7.4X10567.6%3.7XIO6(37%)*)在α-gal綴合后所估計的表14.用經放射性標記的綴合物進行綴合的細胞所添加的綴合物I細胞濃度*I生存力所收獲的細胞*Omg(對照1)13.8X10587.0%6.9XIO6(69%)Omg(對照2)12.6X10590.5%6.3XIO6(63%)Omg(對照3)11.4X10587.8%5.7XIO6(57%)25mg**2.OXlO590.0%1.0X106(10%)5mg***10.8X10581.5%5.4X106(54%)所添加的綴合物I細胞濃度η生存力所收獲的細胞*~Im^14.8XIO593.2%7.4Χ106(74%)0.Img13.8Χ10591.3%6.9XIO6(69%)*)在α-gal綴合后所估計的-k)僅貼附的細胞***)僅來自上清液的細胞流式細胞術如在先前的初步實驗中所觀察到的，僅經綴合的細胞的級分結合了可檢測量的經FITC標記的GS1B4。用Img進行綴合的細胞的平均熒光強度出乎意料地低，而對于其余的綴合反應在綴合物劑量和平均熒光強度之間觀察到正相關。表15.平均熒光強度—濟添加的綴合物丨用GS1B4作上了標記的細胞平均滎光強度*Omg(對照)_77.9917mg31.86%2460.675mg__14.56%_1719,58_1mg_2.36%__342.05_^Tlmg17.64%I1025.86女)用GS1B4作上了標記的細胞的平均熒光強度閃爍測量術在閃爍計數和綴合物劑量之間發現了正相關。但是，由于上面所提及的在收獲程序過程中產生的錯誤，所述結果與從流式細胞術分析獲得的結果不可比較，因此不能在這兩種定量方法之間建立聯系。表16.“表位/細胞”的估計所添加的綴合物表位/細胞~25mg*364.2XIO65mg**152.4X106~Imi28.3XIO60.Img3.6XIO6)僅貼附的細胞**)僅來自上清液的細胞表17.作為綴合物劑量的函數的“表位/細胞”<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例15將放射性探針綴合至B16BL6細胞系該實驗的目的是估計綴合至B16.BL6黑素瘤細胞的Galαl,3Gal表位的數目，以及比較通過閃爍測量術和流式細胞術所獲得的結果。細胞的準備對于該實驗，使用12瓶(300cm2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)匯合的B16.BL6黑素瘤細胞，所述B16.BL6黑素瘤細胞于37.5°C在5%CO2中在含有10%胎牛血清(無P/S)的DMEM中生長。從細胞中除去生長培養基，并且向細胞中添加20mL含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)(GibcoInvitrogen,Taastrup,Denmark)并立即再次除去。添加另外IOmL含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)并除去，然后用CellDissociationSolutionC5914(Sigma-aldrich,SaintLouis,Missouri)(IOmL/瓶)收獲細胞并轉移到50mL管(TPP,TrasadingenSwitzerland)中。細胞于20°C以300G離心3分鐘，并棄去上清液。隨后，在含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)中洗滌細胞兩次，如上述那樣進行離心，并重懸浮在含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)中。測定細胞懸浮液的濃度。將α-gal表位綴合至B16.BL6黑素瘤細胞將經放射性標記的和常規的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)探針(在環狀氨基甲酸酯碳上進行標記)溶解在含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)(Gibco,Invitrogen,Taastrup,Denmark)中，并通過無菌濾器(0.2μmSuporAcrodisc13，GelmanSciences,AnnArbor,Michigan)。使用8種不同濃度的經放射性標記的α-Gal三糖-氨基甲酸酯(9)(1μg、10yg、100yg、lmg、5mg、10mg、15mg和20mg)和6種不同濃度的常規的"Glycom綴合物”(10μg、100μg、lmg、5mg、10mg、15mg和20mg)。準備12個瓶(300cm2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)，每瓶包含10XIO6個B16.BL6細胞，以用于用經放射性標記的三糖探針進行綴合；和8個瓶(150cm2)(TPP,TrasadingenSwitzerland)，每瓶包含5XIO6個B16.BL6細胞，以用于用無放射性的綴合物進行綴合。添加Glycom綴合物，并用含有D-葡萄糖的HBSS(無Mg2+和Ca2+)來調整總體積，從而使得每個大瓶(300cm2)包含20mL的終體積，和每個中瓶(150cm2)包含IOmL的終體積。將細胞與“Glycom綴合物”在37°C下溫育1.5小時。在綴合后，將來自每個瓶的上清液轉移到分開的50mL管(TPP，TrasadingenSwitzerland)中。用CellDissociationSolution(IOmL/大瓶，禾口5mL/中瓶)(Sigma-aldrich，SaintLouis,Missouri)來收獲細胞，并轉移到含有上清液的50mL管中。細胞于20°C以300G離心5分鐘，并重懸浮在5mLPBS(無Mg2+和Ca2+)中。這重復3次，隨后通過經錐蟲藍染色的細胞樣品的顯微術評價來測定細胞的濃度和生存力。閃爍測量術與經放射性標記的三糖探針一起進行溫育的細胞于20°C以1000G離心5分鐘。排出上清液，并使剩余的粒狀沉淀干燥。隨后，將粒狀沉淀溶解在450μ1Mili-QH2O中，并添加1.5mL閃爍液。通過向3個對照細胞樣品中添加500pCi、0.5pCi和OpCi來制備關于所述閃爍測量術的標準。將樣品在室溫下貯存3天，隨后將細胞懸浮液轉移至閃爍管并進行計數。流式細胞術分析通過流式細胞術來分析用常規的三糖探針進行綴合的細胞。將400μ1包含2XIO5個細胞的每種細胞懸浮液與ομg/mL的經FITC標記的GS1B4—起于4°C溫育15分鐘。通過流式細胞術來測量用GS1B4染色的細胞的平均熒光強度。表18.用常規的綴合物進行綴合的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*)在α-gal綴合后和在洗滌細胞一次后所測定的表19.用經放射性標記的綴合物進行綴合的細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*)在α-gal綴合后和在洗滌細胞4次后所測定的流式細胞術出乎意料地，沒有檢測到經FITC標記的GS1B4與來自任一綴合反應的細胞的高于背景水平的結合。向細胞中添加額外量的經FITC標記的GS1B4，并重復進行測量。然而，還是沒有發現染色，并因此不能通過流式細胞術分析來確證成功的α"gal綴合。閃爍測量術由于對于用Img經放射性標記的綴合物進行綴合的細胞的計數產生懷疑，因此省略了對于這些細胞所獲得的結果。對于其余的綴合反應，在閃爍計數和綴合物劑量之間發現了正相關。由于上面所提及的沒有通過流式細胞術來確證成功的α-gal綴合，因而不能在這兩種定量方法之間建立聯系。表20.用經放射性標記的綴合物進行綴合的細胞所添加的綴合物用于閃爍測量術的細胞表位/細胞20mg2.4X106515.2X10615mg1.7XIO6501.2XIO6~<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*)在α-gal綴合后和在洗滌細胞4次后所測定的表21.作為綴合物劑量的函數的“表位/細胞”<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>部分2包含糖類的環狀氨基甲酸酯的制備實施例16將乳糖基-疊氮化物12(1.5g)溶解在用CO2飽和的無水DMF(40mL)中，然后向該混合物中添加在無水DMF(5mL)中的三苯基膦(1.1當量)，經過20分鐘的時間段(參見圖5)。將CO2鼓泡通過該混合物5小時，并攪拌混合物8小時。過濾所形成的白色沉淀，并用冷的丙酮進行洗滌，從而得到所希望的產物13(Ig)。實施例17將乳糖基-疊氮化物12(1.8g)溶解在無水DCM(15mL)中，然后向該混合物中添加三苯基膦(1.1當量)，并攪拌3小時(參見圖6)。添加乙醚(50mL)，并且過濾所形成的白色沉淀，并用冷的乙醚進行洗滌，從而得到膦亞胺16(1.9g)。在室溫下，將CO2鼓泡通過膦亞胺衍生物(1.9g)在無水丙酮(40mL)中的溶液6小時。然后，收集所形成的白色沉淀，從而得到所希望的產物13。實施例18在0°C下，向α-gal三糖表位18(Ig)在EtOAc和飽和NaHCO3中的溶液之中添加三光氣(1.1當量)，并劇烈攪拌該混合物30分鐘(參見圖7)。然后，使相分離，并收集和濃縮有機相。殘留物的柱色譜法提供出了產物19。實施例19在DIPEA(1.3當量)存在下，向乳糖基胺20(lg)在DMF中的溶液之中添加Z-Cl(1.2當量)，并攪拌該混合物直至TLC顯示完全轉化為化合物21(參見圖8)。然后，添加NaOMe(1.3當量)，并在室溫下攪拌該混合物。用AmberliteIR120(H+)中和反應混合物，并進行濃縮。殘留物的柱色譜法提供出了產物13。實施例20向葡糖基氨基甲酸酯22(IOOmg)在DCM(3mL)和吡啶(4mL)中的溶液之中添加酰氯(4當量)，然后攪拌該混合物過夜，隨后進行濃縮，從而經過色譜法的殘留物提供出了產物23(參見圖9)。實施例21向三糖-疊氮化物24(50mg)在無水DMF(0.3mL)中的溶液之中添加在無水DMF(0.2mL)中的PPh3(31.4mg)。在惰性氣氛下攪拌該混合物2小時(參見圖10)。然后，向BaCO3(用C13進行標記)(39.4mg)中添加5mLccH2SO4,并將釋出的CO2轉移至所述糖混合物。并且，在室溫下攪拌該混合物8小時。然后，濃縮該混合物并用DCM(50mL)進行研磨，從而分離出作為白色固體的產物25。權利要求制備糖-肽綴合物的方法，所述方法包括使環狀氨基甲酸酯(1)其中R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；并且R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數；與肽反應的步驟，所述肽包含至少一個伯氨基基團。FPA00001088319800011.tif2.根據權利要求1的方法，其中所述反應在極性溶劑例如水中進行。3.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述反應在6.5-10.5的范圍內的pH下進行。4.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述肽包含至少30個氨基酸單元。5.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述肽是細胞表面或細胞膜結合蛋白。6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述糖-肽綴合物是如權利要求7-14中任一項之中所定義的化合物。7.通過根據權利要求1-6中任一項的方法可獲得的糖-肽綴合物。8.糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式1的部分，和其藥學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>通式1其中R1和R2連同間插性賴氨酸部分一起表示肽部分；R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2h-，其中X是糖部分并且r是選自O和1的整數。9.根據權利要求8的糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式la、lb和Ic中任一個的部分，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>通式la<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>通式lb<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>通式Ic其中，R6和R7如權利要求1中對于R3和R4所定義的，R9如權利要求1中對于R5所定義的，R8選自羥基、C1^6-烷氧基、C2_2(1-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。10.糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式2的部分，和其藥學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>通式2其中R11是氨基酸側鏈；R2連同-NH-CHR11-C(=0)-—起表示氨基酸單元總數目為至少30的肽部分；R3和R4獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；R5選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2h-，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數。11.根據權利要求10的糖-肽綴合物，其包含一個或多個具有通式2a、2b和2c中任一個的部分，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>通式2a<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>通式2b<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>通式2c其中，R6和R7如權利要求3中對于R3和R4所定義的，R9如權利要求11中對于R5所定義的，并且R8選自羥基、CV6-烷氧基、C2_20-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。12.根據權利要求7-11中任一項的糖-肽綴合物，其中所述糖基部分(糖部分)表示非免疫原性的糖。13.根據權利要求7-11中任一項的糖-肽綴合物，其中所述糖基部分(糖部分)表示免疫原性的糖。14.根據權利要求7-13中任一項的糖-肽綴合物，其中所述肽是細胞表面或細胞膜結合蛋白。15.權利要求7-14中任一項之中所定義的糖-肽綴合物，其中所述肽部分的氨基酸單元總數目為至少30，特別是至少100。16.權利要求7-15中任一項之中所定義的糖-肽綴合物，其用于在醫學中使用。17.根據權利要求7-15中任一項的糖-肽綴合物作為藥物、診斷劑或在診斷試劑盒中的用途。18.選自(4a)、(4b)和(4c)的寡糖的環狀氨基甲酸酯，和其藥學上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(4a)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(4b)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(4c)其中R3>R4>R6和R7獨立地選自羥基、乙酰氨基和糖部分；R5和R9獨立地選自氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基和X-(CH2)r-,其中X是糖部分并且r是選自O、1、2和3的整數；并且R8和Rw獨立地選自羥基、CV6-烷氧基、C^6-酰氧基、乙酰氨基和糖部分。全文摘要本申請公開了新的糖蛋白和相關的適合于制備糖肽(特別是糖蛋白和糖基化的細胞)的糖基甲氨酰化方法，以及此類糖蛋白在醫學中，例如作為藥物和診斷劑或在診斷試劑盒中的用途。所述用于制備糖-肽綴合物的方法包括使環狀氨基甲酸酯(1)(其中R3和R4為羥基、乙酰氨基或糖部分；并且R5為氫、甲基、羥甲基、乙酰氨基甲基、羧基或X-(CH2)r-，其中X是糖部分并且r是選自0、1、2和3的整數)與包含至少一個伯氨基基團的肽反應。文檔編號C07K14/765GK101821281SQ200880110687公開日2010年9月1日申請日期2008年9月24日優先權日2007年9月25日發明者G·戴卡尼,I·鮑伊佐,K·阿戈什頓,L·克勒格爾,M·博伊斯特拉普申請人:格禮卡姆股份公司