化學合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段及其表達、應用的制作方法

專利名稱：：化學合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段及其表達、應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種化學合成的單純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirus1，HSV1)糖蛋白B(glycoproteinB，gB糖蛋白)胞外區的全新基因片段，利用基因工程技術，制備重組HSV1病毒gB糖蛋白。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外區片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達，表達的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗體或抗原的檢測等，本發明涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。
背景技術：
：單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)是危害人類健康的常見病原體，容易導致復發性感染和潛伏感染，對人體危害嚴重，分為HSV-l及HSV-2兩型。l型單純皰疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和皰疹性腦炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宮頸癌的發生密切相關。近年HSV1的感染顯著增多，約占該病的10%40%。目前藥物治療HSV感染時常出現相應耐藥性,所以研制疫苗是切實可行的有效方法，它能使機體在抗HSV感染免疫中，發揮體液免疫和細胞免疫功能來消除HSV感染。至今已研制了多種HSV疫苗，已有兩種HSV糖蛋白疫苗進入III期臨床試驗，即Chiron公司研制的重組gD2/gB2糖蛋白與MF59佐劑配伍而成的疫苗以及GlaxoSmithKline(GSK)公司開發的重組gD2糖蛋白與另一佐劑(3-de-0-酰化單磷酸類脂A和明砜)配伍而成的疫苗，這兩種疫苗均有一定的保護作用，但臨床效果有限。國內目前對HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。HSV包膜糖蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激機體產生免疫應答及疫苗研制中具有重要地位。目前正式命名的HSV包膜糖蛋白有12種，其中gB糖蛋白在感染的細胞中含量最多，是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異較小，且與所有的皰疹類病毒亞群有較大的同源性，同時gB蛋白具有較強的免疫原性,可誘導機體產生中和抗體和細胞免疫反應，因此HSVlgB糖蛋白是構建HSV疫苗理想的目的基因。HSVlgB糖蛋白基因全長2712bp，編碼29個氨基酸序列的信號肽、696氨基酸序列的胞外區、69氨基酸序列的跨膜區、109氨基酸序列的胞內區。去除部分信號肽序列不影響其在原核細胞中的分泌表達。研究表明，為增強編碼抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性編碼序列，特別在完整抗原蛋白對宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對抗原蛋白進行截短表達就尤其重要。而截短后的gB基因構建的疫苗，與用完整gB基因構建的疫苗對HSV-1病毒攻擊具有相同的保護作用。目前應用的HSV1病毒抗體的酶聯免疫檢測試劑盒，其使用的抗原是全病毒抗原，具有生產較危險、成本高、與其它病毒有交叉反應等缺點。目前缺乏HSV1病毒疫苗。滅活疫苗的研究取得了較大進展，但是生產成本高、危險大。
發明內容本發明目的是針對上述不足之處提供一種化學合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區的全新基因片段，利用基因工程技術，制備重組HSVl病毒gB糖蛋白胞外區片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSVl病毒gB糖蛋白胞外區片段，第1個氨基酸一第696個氨基酸，共6%個氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達該基因。表達的蛋白可用于疫苗、HSVl病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSVl病毒單抗和多抗等。化學合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段及其表達、應用是采取以下方案實現的1.HSVl病毒gB糖蛋白胞外區抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析HSVl病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，篩選出gB糖蛋白的N端(第l氨基酸一第696氨基酸)含有較強的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，并且在5'端增加了酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(GC),在3'端增加了終止密碼子(TGA)和^boRI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(GC)，使該基因片段易于克隆至質粒pGEX4T-2內的5s/zHI和AcoRI酶切位點內。篩選的HSV1病毒gB糖蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第1個aa—第696個ProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProLysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla化學合成的含HSV1病毒gB糖蛋白胞外區抗原表位基因的DNA序列(2107bp):GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGAC(XTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCGACGCCTAAGAATTCGC2.表達HSVl病毒gB糖蛋白胞外區片段重組質粒的構建提取質粒pGEX4T-2,用HI和￡boRI雙酶切，電泳后回收酶切的質粒大片段，溶于去離子水內。同樣用及mHI和￡boRI雙酶切化學合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內。取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內用T4DNA連接酶連接，使HSVl病毒gB糖蛋白基因片段插入到載體pGEX4T-2內的fe/出I和￡boRI位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白。3.重組質粒的篩選與鑒定將重組質粒轉化大腸桿菌TGl，涂布含氨芐青霉素(100yg/ml)LB平板，置37°C過夜。次日隨機挑取轉化菌落和l個對照菌(質粒pGEX4T-2轉化菌)，分別提取質粒，以提取的質粒為模板，PCR擴增HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段,含HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段的陽性重組質粒，應擴增出長約2107bp的基因片段。將含有外源基因的質粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質粒含有合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段，序列完全正確CCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCC:GACGCCTGA構建的重組質粒表達HSV1的病毒gB糖蛋白胞外區片段(696個氨基酸)，在其N端融合了載體上的238個氨基酸，全長934個氨基酸,其氨基酸序列如下MetProMetlieLeuGlyTyrTrpAsplieArgGlyLeuAlaHisAlalieArg!LeuLeuLeuGluTyrThrAspSerSerTyrGluGluLysLysTyrThrMetGlyGlyAlaProAspTyrAspArgSerGinTrpLeuAsnGluLysPheLysLeuGlyLeuAspPheProAsnLeuProTyrLeulieAspGlyAlaHisLyslieThrGinSerAsnAlalieLeuCysTyrlieAlaArgLysHisAsnLeuCysGlyGluThrGluGluGluLyslieArgValAsplieLeuGluAsnGinAlaMetAspValSerAsnGinLeuAlaArgValCysTyrSerProAspPheGluLysLeuLysProGluTyrLeuGluGluLeuProThrMetMetGinHisPheSerGinPheLeuGlyLysArgProTrpPheValGlyAspLyslieThrPheValAspPheLeuAlaTyrAspValLeuAspLeuHisArgliePheGluProAsnCysLeuAspAlaPheProAsnLeuLysAspPhelieSerArgPheGluGlyLeuGluLyslieSerAlaTyrMet<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定將重組質粒轉化大腸桿菌TG1，涂布含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板，置37'C過夜，次日隨機挑取轉化菌落和含質粒pGEX4T-2的對照菌，提取質粒，以提取的質粒為模板，PCR擴增HSV1病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段，含HSV1病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段的陽性重組質粒，應擴增出長約2107bp的基因片段，將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含氨芐青霉素100yg/mL的LB培養基內，37'C振蕩培養3h，加IPTG至終濃度0.51.0mmol/L，繼續振蕩培養誘導46h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為96kD的HSV病毒gB糖蛋白，表達量約為30%，而對照菌TG1無此蛋白帶；5.表達HSVl病毒gB糖蛋白的純化1)表達HSV1病毒GB糖蛋白工程菌的超聲裂解將誘導表達融合蛋白的工程菌離心(8000rpm、20miru4'C)收菌，菌體重懸于原培養液1/10體積的裂解液內，裂解液為50mmol/LTris-HC1pH8.0、10mmol/LEDTA、10,ol/LDTT，冰浴超聲破菌10min，離心(8000rpm、20min、4'C)收集上清，棄沉淀。收集的上清用于下一步的親和層析純化。2)表達HSVl病毒gB糖蛋白的純化上清溶液加已經平衡的GlutathioneS印harose4B凝膠3ml，室溫結合60min，上樣，收集穿透液。用十倍柱床體積的1XPBS洗滌柱子，接著用15ml高濃度的GSH洗脫液，洗脫液為50,1/LTris-HCLpH8.0+10mraol/LGST，分三次洗脫目的蛋白，即為純化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區片段。6.純化的HSV1病毒gB糖蛋白的ELISA檢測將初步純化獲得的融合蛋白按l:10001:32000倍比稀釋，并將陰性對照以同樣濃度倍比稀釋，用HumanHSV-1ELISA試劑盒檢測表達蛋白的抗原性(具體操作方法見試劑盒說明書)。結果顯示(表l)此融合表達蛋白具有較好的抗原性和特異性。7.將表達的HSV1病毒gB糖蛋白片段，用于疫苗、HSV1病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSV1病毒單抗和多抗等。8.將合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段與其它基因片段連接，以融合蛋白的形式進行表達、制備。上述方法制備的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段在制備HSVl病毒亞單位疫苗中的應用。化學合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段，可利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表達、制備。本發明與現有技術相比具有的優點本發明表達的HSVl病毒的gB糖蛋白片段，有較多優點1.本發明表達的HSVl病毒gB糖蛋白胞外區片段用作抗原制備HSVl病毒抗體的酶聯免疫檢測試劑盒，具有生產較安全、成本低、與其它病毒交叉反應少等優點。2.HSV1病毒的gB糖蛋白在感染的細胞中含量最多，是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異較小，且與所有的皰疹類病毒亞群有較大的同源性，同時gB蛋白具有較強的免疫原性,可誘導機體產生中和抗體和細胞免疫反應,因此HSVlgB糖蛋白是構建HSV疫苗理想的目的基因。本發明選擇了其強抗原表位，利用基因工程技術表達制備，為研制基因工程疫苗奠定基礎。基因工程疫苗安全、成本低。3.本發明根據篩選出的HSVl病毒的gB糖蛋白胞外區片段氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，該基因適宜在真核和原核細胞內高表達。4.本發明構建的表達HSVl病毒的gB糖蛋白的工程菌，表達量可達菌體蛋白的30%，易于純化，可大量純化制備該蛋白。以下將結合附圖對本發明作進一步說明。圖1是本發明表達HSV1病毒的gB糖蛋白的重組質粒構建流程圖。圖2是本發明PCR擴增HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片斷的電泳圖。圖3是本發明用1.0%的Agarose凝膠檢測5個重組子的PCR擴增產物。附圖3中M:低分子量DNA標準(TaKaRa，500bp);15:5個轉化子均擴增出2107bp的目的基因片段。圖4是本發明表達HSV1病毒的gB糖蛋白重組菌的SDS-PAGE分析結果。附圖4中M:低分子量蛋白標準(Pharmacia);7:對照菌E.coliTGl;16表示16號重組菌，2號、5號2個重組子表達相對分子量約為96000的融合蛋白，1、3、4、6號4個轉化子無此蛋白帶。圖5是本發明表達HSV1病毒的gB糖蛋白純化前后的SDS-PAGE分析結果。附圖5中M:低分子量蛋白標準(Pharmacia);1:對照菌TG1;2:表達HSVl病毒的gB糖蛋白的工程菌；3:HSVl病毒的gB糖蛋白的包涵體；4:HSV1病毒的gB糖蛋白的純化過程中的穿過峰；5:GlutathioneS印harose4B親和層析柱純化后的的HSV1病毒的gB糖蛋白；6:HSVl病毒的gB糖蛋白的純化過程中的上清。具體實施例方式本發明實施方式的詳細說明HSVl病毒的gB糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及表達通過計算機分析HSV1病毒的gB糖蛋白的全部氨基酸序列，篩選出HSVl病毒的gB糖蛋白內的強抗原表位，選用細菌偏愛的密碼子，化學合成HSVl病毒的gB糖蛋白強抗原表位的全新基因片段。將基因片段克隆至質粒pGEX4T-2內的feMil/￡boRI位點，與載體上的起始密碼子的翻譯框架一致，可表達一個融合蛋白。將重組質粒轉化大腸桿菌TGI,篩選獲得了高效表達HSVl病毒的gB糖蛋白的工程菌，表達的HSVl病毒的gB糖蛋白約占菌體蛋白總量的30%左右。材料與方法1.菌種與質粒宿主菌TGl及表達載體pGEX4T-2為實驗室保存。2.分子生物學試劑限制性內切酶5』I、fcoRI、及T4DNA連接酶為市售TaKaRa公司產品。質粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內回收DNA片段的試劑盒為市售TaKaRa公司產品。DTT及IPTG為市售Promega公司產品。其它試劑為進口或國產分析純試劑。3.基因片段的合成由公司按設計合成。4.基因克隆方法DNA的酶切、連接、電泳；質粒的提取、轉化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常規方法進行。其它試劑盒按說明書進行操作。5.DNA序列分析用QIAGEN公司質粒純化試劑盒純化質粒，用DNA全自動測序儀測序。實施方式1.HSV1病毒的gB糖蛋白抗原表位篩選及基因片段的合成利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析HSVl病毒的gB糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank,接通號AY278488)，篩選出HSVl病毒的gB糖蛋白內的強抗原表位(圖1),即從第1個氨基酸到第696個氨基酸，其氨基酸序列如下ProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProLysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspleuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla根據篩選的HSV1病毒gB糖蛋白內的抗原表位氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，并且在5'端增加了^sWI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(GC)，在3'端增加了終止密碼子(TGA)和￡CORI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護堿基(GC)，使該基因片段易于克隆至質粒pGEX4T-2內的ife^il和￡C0RI酶切位點內。化學合成的含HSV1病毒gB糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(2107bp)如下GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCGACGCCTGAGAATTCGC2.表達HSVl病毒gB糖蛋白胞外區片段重組質粒的構建提取質粒pGEX4T-2，用^3/7HI和fcoRI雙酶切，電泳后回收酶切的質粒大片段，溶于去離子水內。同樣用^^I和fcoRI雙酶切化學合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內。取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內用T4DNA連接酶連接，使HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段插入到載體pGEX4T-2內的I和￡coRI位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白(構建流程見圖2)。3.重組質粒的篩選與鑒定將上步連接的重組質粒轉化到大腸桿菌TGl，將轉化產物涂布含氨芐青霉素(100Pg/ml)的固體LB培養基上，置37'C培養過夜。次日隨機挑選5個轉化子菌落(分別標記為l一5號)和1個對照菌(質粒pGEX4T-2轉化菌)，分別接種到含3ml液體LB培養基(含氨芐青霉素lOOPg/ml)的試管內，置37'C振蕩培養5h，取菌液lml，離心收菌。分別用50y1去離子水懸浮菌體，沸水煮5min,離心(4。C，12000rpm)5min,取上清(內有質粒)2u1用作PCR模板，PCR擴增插入載體內的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段，PCR反應濃度為質粒模板2ul、HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段的正鏈Pl(GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTC)和負鏈引物P2(GCGAATTCTTAGGCGTCGGC)各1n1、10Xpyrobestbuffer5.Oy1、2.5畫1/LdNTP4.0nl、PyrobestDNATaq酶O.5yl(2.5U)、去離子水36.1，總體積50u1。擴增條件為94°C30秒、55°C30秒、72。C4分鐘，35個循環；最后72。C延伸7分鐘。取PCR擴增產物5ul,用1.0X的Agarose凝膠檢測，結果，5個轉化子均擴增出2107bp的目的基因片段(見圖3)，而含質粒pGEX4T-2的對照菌沒有擴增出該基因片段。初步證實，這5個轉化子均含有HSVl病毒gB糖蛋白基因片段。提取l號重組子的質粒，測定質粒內的HSVl病毒gB糖蛋白基因序列，DNA序列分析證實，重組質粒含有合成的HSVl病毒gB糖蛋白基因片段，序列完全正確CCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGAGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCCCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCGACGCCTGA構建的重組質粒表達HSV1的病毒gB糖蛋白片段(696個氨基酸)，在其N端融合了載體上的238個氨基酸，全長934個氨基酸，其氨基酸序列如下MetProMetlieLeuGlyTyrTrpAsplieArgGlyLeuAlaHisAlalieArgLeuLeuLeuGluTyrThrAspSerSerTyrGluGluLysLysTyrThrMetGlyGlyAlaProAspTyrAspArgSerGinTrpLeuAsnGluLysPheLysLeuGlyLeuAspPheProAsnLeuProTyrLeulieAspGlyAlaHisLyslieThrGinSerAsnAlalieLeuCysTyrlieAlaArglysHisAsnLeuCysGlyGluThrGluGluGluLyslieArgValAsplieLeuGluAsnGinAlaMetAspValSerAsnGinLeuAlaArgValCysTyrSerProAspPheGluLysLeuLysProGluTyrLeuGluGluLeuProThrMetMetGinHisPheSerGinPheLeuGlyLysArgProTrpPheValGlyAspLyslieThrPheValAspPheLeuAlaTyrAspValLeuAspLeuHisArgliePheGluProAsnCysLeuAspAlaPheProAsnLeuLysAspPhelieSerArgPheGluGlyLeuGluLyslieSerAlaTyrMetLysSerSerArgPheLeuProLysProLeuTyrThrArgMetAlaValTrpGlyAsnLysProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPhelysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnCeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHisArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyLysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProCysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla4.表達HSVl病毒gB糖蛋白工程菌的篩選鑒定將含有重組質粒的5個陽性轉化子和1個對照菌(質粒pGEX4T-2轉化菌)，接種至含3mlLB培養基(含氨芐青霉素10(^g/ml)的試管內，37。C振蕩培養3h，加IPTG至終濃度1.0隱ol/L,繼續振蕩培養誘導5h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為96kD的HSV1病毒gB糖蛋白，表達量約為30%，而對照菌TG1無此蛋白帶(圖4)。表達HSV1病毒gB糖蛋白的純化根據表達HSVl病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定適當的純化方法。我們所表達的HSVlgB糖蛋白融合有載體上的GST蛋白，GST融合蛋白在表達時同時表達了谷胱甘肽s轉酶，可很方便用GST瓊脂糖凝膠FF分離，因此我們決定采用親和層析法，用GlutathioneS印harose4B凝膠進行純化。具體步驟如下材料和方法1.主要試劑-.GlutathioneS印harose4B凝膠為GEHeathcare公司產品，IPTG、DTT為Promega公司產品。其它試劑為國產或進口分析純試劑。2.表達HSVl病毒的gB糖蛋白的超聲裂解將培養的表達HSV1病毒的gB糖蛋白的工程菌離心(8000rpm,20mins,4'C),棄上清，菌體重懸于原培養液1/10體積的裂解液(50mmol/LTris-HClpH8.0、10mmol/LEDTA、10畫1/LDTT)內，冰浴超聲破菌10mins，離心(8000rpm、20mins，4°C)收集上清，棄沉淀。收集的上清用于下一步的親和層析純化。3.表達HSVl病毒gB糖蛋白的純化上清溶液加巳經平衡的GlutathioneS印harose4B凝膠3ml室溫結合60min，上樣，收集穿透液。用十倍柱床體積的1XPBS洗滌柱子，接著用15ml高濃度的GSH洗脫液(50畫l/LTris-HCLpH8.0+10畫1/LGST)分三次洗脫目的蛋白，即為純化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區片段。結果將從GlutathioneSepharose4B凝膠柱上洗脫的蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示(見圖5)，經誘導明顯表達出HSVlgB/GST融合蛋白，表達產物主要存在于上清液中。SDS-PAGE顯示表達產物約96kDa。純化HSV1病毒的gB糖蛋白的鑒定及應用將純化的重組HSV1病毒gB糖蛋白抗原，通過雙抗體夾心ELISA試驗方法檢測，以鑒定表達的HSVl病毒gB糖蛋白的抗原性和特異性。實驗結果顯示，該重組蛋白有很好的抗原性和特異性。材料和方法1.酶聯反應試劑盒HumanHSV-1ELISA試劑盒為美國Uscnlife公司產品。2.ELISA試驗將初步純化獲得的融合蛋白按1:10001:32OOO倍比稀釋，并將陰性對照以同樣濃度倍比稀釋，用HumanHSV-1ELISA試劑盒檢測表達蛋白的抗原性(具體操作方法見試劑盒說明書)。結果HSVlgB蛋白的ELISA檢測將初步純化獲得的融合蛋白按h10001:32000倍比稀釋，并將陰性對照以同樣濃度倍比稀釋，用HumanHSV-1ELISA試劑盒檢測表達蛋白的抗原性。結果顯示(表l)此融合表達蛋白具有較好的抗原性和特異性。表l表達蛋白的ELISA實驗結果Table1.EUSAresultsoftheexpressedprotein<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>化學合成的HSV病毒gB蛋白胞外區基因片段序列表〈110>李越希〈120>化學合成的HSV病毒gB蛋白胞外區基因片段及其表達、應用〈160〉2<210>1〈211〉696<212>PRT〈213>HSV病毒gB蛋白胞外區片段<220>〈223〉含強抗原表位的HSV病毒gB蛋白胞外區片段，第1個氨基酸一第696個氨基酸，共696個氨基酸。〈400>1ProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAla151015AsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaPro202530ThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThr354045ProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAla505560ThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAla65707580AsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPhe859095GluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThr100105110GluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPhe115120125LysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPhe130135140GlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaPro145150155160ValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCys165170175ArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPhe180185190HisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAla195200205AlaPro225lieValArgLysAla305ValLysPheThrAsp385ThrPheTyrThrLys465HisTrpLysSerVal545Thr210SerValLeuGluGin290ThrAlaTrpArgGlu370AlaHisLeuValPro450ThrlieCysLeuAla530AlaArgArgGluAlaGly275ValAlaTrpGinPhe355TyrArglielieArg435ProThrGinGluAsn515ArgAlaThrValGluThr260SerAspProAspGlu340SerProAspLysAla420GluProSerAsnLeu500ProMetAspSerGluVal245GlyHisGlyThrTrp325ValSerLeuAlaVal405TyrHisProSerHis485GinAsnLeuAsnArgAla230AspAspThrPheThr310ValAspAspSerMet390GlyGinLeuGlylie470ValAsnAlaGlyVal550Gly215PheAlaPheGluTyr295ArgProGluAlaArg375AspGinProArgAla455GluAsnHislieAsp535lieTrpHisThrThrHisArgValHis280AlaAsnLysMetlie360ValArgProLeuGlu440SerPheAspGluAla520ValArgSerTyr265ThrArgLeuArgLeu345SerAsplieGinLeu425GinAlaAlaMetl>eu505SerMetTyrVal250MetSerAspLeuPro330ArgThrLeuPheTyr410SerSerAsnArgLeu490ThrAlaAlaGly235TyrSerTyrLeuThr315SerSerThrGlyAla395TyrAsnProAlaLeu475GlyLeuThrValValGinAsnSer555Asp220ThrProProAlaThr300ThrValGluPheAsp380ArgLeuThrLysSer柳GinArgTrpValSer540MetLeuThrTyrPheAla285ThrProCysTyrThr365CysArgAlaLeuPro445ValPheValAsnGly525ThrArgLysValAspTyr270AspLysLysThrGly350ThrlieTyrAsnAla430ProGluThrAlaGlu510ArgCyslieTyrAsnGlu255GlyArgAlaPheMet335GlyAsnGlyAsnGly415GluAsnArgTyrlie495AlaArgValSerAsnCys240PheTyrPheArgThr320ThrSerLeuLysAla400GlyLeuProlieAsn480AlaArgValProSer560ArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuVaJSerPheArgTyrGlu565570575AspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeu580585590ArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArg595600605TyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyr610615620SerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelie625630635640AspLeuAsnlieThrMetLeuGluAspHisGluPheValProLeuGlu645650655ValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThr660665670GluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplie675680685AspThrVallieHisAlaAspAla690695<210>2<211>2107<212〉隨〈213〉人工序列<220〉<221>CDS<222〉(1)…(2104)<223〉人工合成的全新基因片段，編碼HSV病毒gB蛋白胞外區片段。<220〉<221>mis-feature<222>(2105)...(2107)<223>合成基因時增加的終止密碼子。<2CCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCT60ProSerSerProGlyThrProGiyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyPro15101520GCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAG120AlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLys25303540AACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCC180AsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAla45505560GCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCT240AlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAla65707580AACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGC300AsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArg859095100AGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAG360ArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLys105110115120GAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGC420GluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSer125130135140CAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCT480GinValT卬PheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGiyliePheGluAspArgAlaPro145150155160GTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCMCGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCT540ValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaAAGLysATGMetCTGLeuATClieGGTGlyACTThrACCThrGTGValGTGValTCCSerTGCCysACTThrTACTyrCAGGinTACTyrGAGGluAAGLysGTGValGACAspACCSerAAGLysGCTAlaGACAspACTThrATClieCACHisCAGGinAGCSerGTGValCTGLeuTACTyrGAGGluTTCPheTACTyrGCTAlaTGGTrpGAGGluACCThrGGTGlyATClieCCTProCGCProCGCArgAAGLysAACAsnGAGGluGTGValGCTAlaAGAArgGACAspATGMetTTCPheAAGLysAAGLysCTGLeuAAGLysGTGGAGCGCATC165AACAsn185CCTPro205CCTPro225GTGVal245TACTyr265GCTAla285GCCAla305TGGTrp325CTGLeu345ACTThr365GACAsp385GTGVal405CTGLeu425CCTPro445AAGAACAsnGCCAlaAGCSerGACAspATGMetGACAspACTThrGTGValCGCArgACCThrGCTAlaGGCGlyAGCSerCCTProCTGLeuAACAsnAGAArgGCTAlaTCTSerAGGArgGCTAlaCCTProTCCSerAACAsnCGCArgCAGGinAACAsnAACAsnGAGGluGCCAlaGTGValCGCArgCCTProTTCPheCCTProAAGLysGAGGluCTGLeuGACAspCCTProACTThrCCTProACCThrGCTAlaGAGGluAGCSerTTCPheAAGLysACCThrCGCArgTACTyrACCThrGCCAlaCAGGinCTGLeuACGThrACTACCTCTAGC170ACTThr190ACTThr210GCCAla230GTGVal250TACTyr270CAGGin290ACTThr310CCTPro330GGCGly350GAGGlu370ATGMet390TACTyr410GCTAla430CCTPro450ATCGCTAlaCGCArgTTCPheTACTyrGGCGlyGTGValAGGArgAGCSerGGTGlyTACTyrGACAspTACTyrGAGGluCCTProTTCPheACCThrCACHisCCTProTACTyrGACAspAACAsnGTGValTCCSerCCTProCGCArgCAGLeuCTGLeuCCTProCACHisAGCSerAGGArgTACTyrAGAArgGGCGlyCTCLeuTGCCysTTCPheCTGLeuATClieGCCAlaTACTyrCCCProAGAArgAGAArgTACTyrGACAspGAAGluTTCPheCTCLeuACCThrAGGArgTCCSerTTCPheAACAsnGTGValGGTGlyGAGTTCGCCAGG175GACAsp195GGCGly215GGCGly235GAGGlu255GGTGly275TACTyr295ACCThr315ATGMet335TTCPhe355AGAArg375GCTAla395GGTGly415AGAArg435GCTAla455CTGGATAspTGGTrpACCThrTTCPheAGCSerGCTAlaACTThrACCThrTCCSerGTGValCGCArgGGTGlyGAGGluAGCSerCACHisCACHisACCThrGTGValCACHisCGCArgCCTProAAGLysTCTSerGACAspAGGArgTTCPheCACHisGCCAlaGAGGluACCThrGTGValCTGLeuACCThrGACAspAAGLysTGGTrpGACAspCTGLeuTACTyrCTGLeuCTGLeuAACAsnACCThrACTThrAACAsnGCCAlaGAGGluCTGLeuTTCPheCAGGinGCTAlaGGTGlyAACAsnATClieAGAArgGCTAlaCAGTTCACCTAC180GACAsp200GACAsp220TGCCys240ACTThr260CACHis■280ACCThr300ACCThr320GAGGlu340ATClie360GACAsp380GCTAla400GCCAla420GAGGlu440TCCSer柳AAC6006607207808409009601020108011401200126013201380l柳<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>權利要求1、一種化學合成的HSV1病毒gB糖蛋白的胞外區基因片段，該基因片段編碼含強抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段，即第1個氨基酸至第696個氨基酸，共696個氨基酸，在該基因片段的5’端增加了BamHI酶切位點及兩個保護堿基GC，在3’端增加了終止密碼子TGA和EcoRI酶切位點及兩個保護堿基GC，化學合成的基因序列全長2107bp，序列如下GCGGATCCCCTACCTCTCCTGGTACTCCTGGTGTGGCTGCCGCTACCCAGGCCGCTAACGGTGGTCCTGCCACTCCTGCTCCTCCTCCTCTGGGTGCCGCTCCTACTGGTGACCCTAAGCCTAAGAAGAACAAGAAGCCTAAGAACCCTACTCCTCCTAGGCCTGCTGGTGACAACGCCACCGTGGCCGCTGGCCACGCCACTCTGAGAGAGCACCTGAGAGACATCAAGGCTGAGAACACCGACGCTAACTTCTACGTGTGTCCTCCTCCTACTGGTGCCACCGTGGTGCAGTTCGAGCAGCCTCGCAGGTGCCCTACCAGGCCTGAAGGTCAGAACTACACCGAAGGCATCGCCGTGGTGTTCAAGGAGAACATCGCTCCTTACAAGTTCAAGGCCACCATGTACTACAAGGACGTGACCGTGAGCCAGGTGTGGTTCGGCCACCGCTACTCCCAGTTCATGGGCATCTTCGAGGACCGCGCTCCTGTGCCTTTCGAGGAGGTGATCGACAAGATCAACGCCAAGGGTGTGTGTAGGTCCACCGCTAAGTACGTGCGCAACAACCTGGAGACCACTGCTTTCCACAGAGACGATCACGAGACCGACATGGAGCTGAAGCCTGCCAACGCCGCTACTCGCACCAGCAGAGGCTGGCACACCACTGACCTGAAGTACAACCCTAGCAGAGTGGAGGCCTTCCACAGGTACGGCACCACCGTGAACTGCATCGTGGAGGAGGTGGACGCTCGCAGCGTGTACCCTTACGACGAGTTCGTGCTGGCCACTGGTGACTTCGTGTACATGTCTCCTTTCTACGGCTACAGAGAAGGTAGCCACACCGAGCACACTACCTACGCTGCTGACAGGTTCAAGCAGGTGGACGGCTTCTACGCTCGCGACCTGACCACCAAGGCTAGAGCCACTGCTCCTACCACTAGGAACCTGCTGACCACTCCTAAGTTCACCGTGGCTTGGGACTGGGTGCCTAAGCGCCCTAGCGTGTGCACCATGACCAAGTGGCAGGAGGTGGACGAGATGCTGCGCTCCGAGTACGGCGGTTCCTTCAGGTTCTCCTCTGACGCTATCTCCACTACCTTCACTACCAACCTGACCGAGTACCCTCTGTCCAGAGTGGACCTGGGTGACTGCATCGGTAAGGACGCTCGCGACGCCATGGACCGCATCTTCGCTCGCAGGTACAACGCTACTCACATCAAGGTGGGCCAGCCTCAGTACTACCAGGCCAACGGTGGTTTCCTGATCGCCTACCAGCCTCTGCTGAGCAACACTCTGGCTGAGCTGTACGTGAGAGAGCACCTGAGAGAGCAGAGCCGCAAGCCTCCTAACCCTACGCCTCCTCCTCCCGGTGCTAGCGCCAACGCTTCCGTGGAGCGCATCAAGACTACCTCTAGCATCGAGTTCGCCAGGCTGCAGTTCACCTACAACCACATCCAGCGCCACGTGAACGACATGCTGGGTCGCGTGGCTATCGCTTGGTGCGAGCTGCAGAACCACGAGCTGACTCTGTGGAACGAGGCTCGCAAGCTGAACCCTAACGCTATCGCCAGCGTGACCGTGGGCAGGAGAGTGAGCGCTAGAATGCTGGGCGACGTGATGGCCGTGTCCACCTGCGTGCCTGTGGCTGCTGACAACGTGATCGTGCAGAACAGCATGCGCATCAGCTCCAGACCTGGTGCCTGCTACAGCAGACCTCTGGTGAGCTTCAGGTACGAGGACCAAGGTCCTCTGGTGGAAGGTCAGCTGGGTGAGAACAACGAGCTGAGGCTGACTCGCGACGCTATCGAGCCTTGCACCGTCGGTCACAGACGCTACTTCACCTTCGGTGGCGGTTACGTGTACTTCGAGGAGTACGCTTACTCTCACCAGCTGAGCCGCGCTGACATCACTACCGTGAGCACCTTCATCGACCTGAACATCACCATGCTGGAGGACCACGAGTTCGTGCCTCTGGAGGTGTACACCCGCCACGAGATCAAGGACAGCGGCCTGCTGGACTACACCGAGGTGCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGACCTGCGCTTCGCTGACATCGACACCGTGATCCACGCCGACGCCTGAGAATTCGC2、權利要求l所述的化學合成HSVl病毒gB糖蛋白胞外區的基因片段，其特征在于采用基因工程技術表達該基因序列編碼的HSVl病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段，純化表達的蛋白片段，具體方法如下.-表達HSVl病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段重組質粒的構建用勘/zHI和I雙酶切質粒pGEX4T-2和化學合成的HSVl病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段，電泳回收后，用T4DNA連接酶連接，使HSVl病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段插入到載體pGEX4T-2內的^s/出I和￡coRI位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白，全長934個氨基酸，該融合蛋白N端融合了載體上的238個氨基酸，C端包含HSVl病毒的gB糖蛋白內的第1個氨基酸至第696個氨基酸，全長氨基酸序列如下MetProMetlieLeuGlyTyrTrpAsplieArgGlyLeuAlaHisAlalieArgLeuLeuLeuGluTyrThrAspSerSerTyrGluGluLysLysTyrThrMetGlyGlyAlaProAspTyrAspArgSerGinTrpLeuAsnGluLysPheLysLeuGlyLeuAspPheProAsnLeuProTyrLeulieAspGlyAlaHisLyslieThrGinSerAsnAlalieLeuCysTyrlieAlaArgLysHisAsnLeuCysGlyGluThrGluGluGluLyslieArgValAsplieLeuGluAsnGinAlaMetAspValSerAsnGinLeuAlaArgValCysTyrSerProAspPheGluLysLeuLysProGluTyrLeuGluGluLeuProThrMetMetGinHisPheSerGinPheLeuGlyLysArgProTrpPheValGlyAspLyslieThrPheValAspPheLeuAlaTyrAspValLeuAspLeuHisArgliePheGluProAsnCysLeuAspAlaPheProAsnLeuLysAspPhelieSerArgPheGluGlyLeuGluLyslieSerAlaTyrMetLysSerSerArgPheLeuProLysProLeuTyrThrArgMetAlaValTrpGlyAsnLysProSerSerProGlyThrProGlyValAlaAlaAlaThrGinAlaAlaAsnGlyGlyProAlaThrProAlaProProAlaLeuGlyAlaAlaProThrGlyAspProLysProLysLysAsnLysLysProLysAsnProThrProProArgProAlaGlyAspAsnAlaThrValAlaAlaGlyHisAlaThrLeuArgGluHisLeuArgAsplieLysAlaGluAsnThrAspAlaAsnPheTyrValCysProProProThrGlyAlaThrValValGinPheGluGinProArgArgCysProThrArgProGluGlyGinAsnTyrThrGluGlylieAlaValValPheLysGluAsnlieAlaProTyrLysPheLysAlaThrMetTyrTyrLysAspValThrValSerGinValTrpPheGlyHisArgTyrSerGinPheMetGlyliePheGluAspArgAlaProValProPheGluGluVallieAspLyslieAsnAlaLysGlyValCysArgSerThrAlaLysTyrValArgAsnAsnLeuGluThrThrAlaPheHisArgAspAspHisGluThrAspMetGluLeuLysProAlaAsnAlaAlaThrArgThrSerArgGlyTrpHisThrThrAspLeuLysTyrAsnProSerArgValGluAlaPheHis3ArgTyrGlyThrThrValAsnCyslieValGluGluValAspAlaArgSerValTyrProTyrAspGluPheValLeuAlaThrGlyAspPheValTyrMetSerProPheTyrGlyTyrArgGluGlySerHisThrGluHisThrSerTyrAlaAlaAspArgPheLysGinValAspGlyPheTyrAlaArgAspLeuThrThrLysAlaArgAlaThrAlaProThrThrArgAsnLeuLeuThrThrProLysPheThrValAlaTrpAspTrpValProLysArgProSerValCysThrMetThrLysTrpGinGluValAspGluMetLeuArgSerGluTyrGlyGlySerPheArgPheSerSerAspAlalieSerThrThrPheThrThrAsnLeuThrGluTyrProLeuSerArgValAspLeuGlyAspCyslieGlyILysAspAlaArgAspAlaMetAspArgliePheAlaArgArgTyrAsnAlaThrHislieLysValGlyGinProGinTyrTyrLeuAlaAsnGlyGlyPheLeulieAlaTyrGinProLeuLeuSerAsnThrLeuAlaGluLeuTyrValArgGluHisLeuArgGluGinSerProLysProProAsnProThrProProProProGlyAlaSerAlaAsnAlaSerValGluArglieLysThrThrSerSerlieGluPheAlaArgLeuGinPheThrTyrAsnHislieGinAsnHisValAsnAspMetLeuGlyArgValAlalieAlaTrpCysGluLeuGinAsnHisGluLeuThrLeuTrpAsnGluAlaArgLysLeuAsnProAsnAlalieAlaSerAlaThrValGlyArgArgValSerAlaArgMetLeuGlyAspValMetAlaValSerThrCysValProValAlaAlaAspAsnVallieValGinAsnSerMetArglieSerSerArgProGlyAlaCysTyrSerArgProLeuValSerPheArgTyrGluAspGinGlyProLeuValGluGlyGinLeuGlyGluAsnAsnGluLeuArgLeuThrArgAspAlalieGluProCysThrValGlyHisArgArgTyrPheThrPheGlyGlyGlyTyrValTyrPheGluGluSerAlaTyrSerHisGinLeuSerArgAlaAsplieThrThrValSerThrPhelieAspLeuAsnlieThrMet丄euGluAspHisGluPheValProLeuGluValTyrThrArgHisGlulieLysAspSerGlyLeuLeuAspTyrThrGluValGinArgArgAsnGinLeuHisAspLeuArgPheAlaAsplieAspThrVallieHisAlaAspAla表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定將重組質粒轉化大腸桿菌TG1，涂布含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板，置37°C過夜，次日隨機挑取轉化菌落和含質粒pGEX4T-2的對照菌，提取質粒，以提取的質粒為模板，PCR擴增HSV1病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段,含HSVl病毒的gB糖蛋白胞外區基因片段的陽性重組質粒，應擴增出長約2107bp的基因片段，將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含氨芐青霉素IOOpg/mL的LB培養基內，37。C振蕩培養3h，加IPTG至終濃度0.51.0mmol/L,繼續振蕩培養誘導46h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為96kD的HSV病毒gB糖蛋白，表達量約為30%，而對照菌TGl無此蛋白帶；表達HSV1病毒gB糖蛋白的純化將誘導表達融合蛋白的工程菌離心收菌，菌體重懸于裂解液內，裂解液為50mmol/LTris-HClpH8.0、10mmol/LEDTA、10mmol/LDTT,超聲破菌10min，離心收集上清，上清溶液加己經平衡的GlutathioneS印harose4B凝膠3ml,室溫結合60min，上樣，收集穿透液；用十倍柱床體積的1XPBS洗滌柱子，接著用15ml高濃度的GSH洗脫液，洗脫液為50mmol/LTris-HCLpH8.0+10mmol/LGST，分三次洗脫目的蛋白，即為純化的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段。3、權利要求l所述的化學合成的HSVl病毒gB糖蛋白胞外區基因片段，其特征在于可利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表達、制備。4、權利要求2或3所述方法制備的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段在制備HSV1病毒亞單位疫苗中的應用。全文摘要本發明化學合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外區基因片段及其表達、應用涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。本發明是通過計算機分析，篩選出HSV1病毒gB糖蛋白內的強抗原表位，第1個氨基酸至第696個氨基酸，共696個氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術，表達該基因片段、制備HSV1病毒gB糖蛋白的強抗原表位片段。表達的HSV1病毒gB糖蛋白的強抗原表位片段可用于疫苗、HSV1病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSV1病毒單抗和多抗等。文檔編號C12N15/34GK101173290SQ20071013389公開日2008年5月7日申請日期2007年10月24日優先權日2007年10月24日發明者敏呂,菁戚,李越希,楊華鳳,潘明潔,王正茂申請人:李越希