使用結合EphB4的人源化抗體的癌癥治療的制作方法

專利名稱：使用結合EphB4的人源化抗體的癌癥治療的制作方法
使用結合EphB4的人源化抗體的癌癥治療相關申請本申請要求2007年8月13日提交的美國臨時申請號60/964，496的優先權的權 益，其全部教導以其全文引用合并入本文。
背景技術：
血管生成，新血管從預先存在的脈管系統的上皮發展，是宿主內實體瘤的生長、進 展和轉移中至關重要的過程。在生理學上正常的血管生成期間，血管內皮與其周圍間質組 分的自分泌、旁分泌和雙重分泌(amphicrine)相互作用在空間和時間上受到緊密調節。此 外，促血管生成(proangiogenic)和抑制血管生成(angiostatic)細胞因子和生長因子的 水平和活性保持平衡。相反地，活躍的腫瘤生長所必需的病理性血管生成是持續和持久的， 代表了正常血管生成系統的失調。實體瘤和造血組織腫瘤類型特別地與高水平的異常血管 生成相關。通常認為，腫瘤的發展由連續并且相關的步驟組成，所述步驟導致具有攻擊性生 長潛能的自主克隆(autonomous clone)的產生。這些步驟包括持續生長和無限的自我更 新。腫瘤中的細胞群體的特征通常在于生長信號的自足(self-sufficiency)、降低的對生 長抑制信號的敏感性以及對細胞凋亡的抗性。起始異常生長的遺傳或細胞遺傳事件通過阻 止細胞凋亡來支持細胞維持在延長的“穩定”狀態。發明概述本申請除其他以外提供了結合EphB4的細胞外結構域的抗體，例如其修飾抗體或 抗原結合片段。修飾抗EphB4抗體或其抗原結合片段與它們的未修飾的親本抗體相比較在 給定的物種例如人中免疫原性更低。抗體和抗原結合片段用于治療性治療以影響EphB4功 能，從而抑制血管生成和腫瘤生長。在一個實施方案中，本申請提供了結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的 (deimmunized)抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中各可變區與 結合EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，在構架區中具有2至20個氨基酸置換。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段具有一個或更多個來自結 合EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體的互補決定區(CDR)。在一個實施方案中，互補 決定區(⑶R)中存在1至5個置換。在一個實施方案中，一個或更多個置換，與非人或親本抗體相比較，減少了解除免 疫的抗體或其抗原結合片段中的T細胞表位的數目。在一個實施方案中，一個或更多個置 換，與非人或親本抗體相比較，減少了解除免疫的抗體或其抗原結合片段中的B細胞表位 的數目。在一個實施方案中，一個或更多個置換，與非人或親本抗體相比較，在解除免疫的 抗體或其抗原結合片段中導入了一個或更多個調節T細胞表位。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有20個或更少的氨基酸置換。在另一 個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區，與結合EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有19個或更少，18個或更少，17個或更少，16個或更 少，15個或更少，14個或更少，13個或更少，12個或更少，11個或更少，10個或更少，9個或 更少，8個或更少，7個或更少的氨基酸置換。在一個實施方案中，重鏈可變區，與非人或親 本抗體相比較，具有至少2個，至少3個，至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，至少8 個，至少9個，至少10個，至少11個，至少12個，至少13個氨基酸置換。在一個實施方案中，與結合EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，解 除免疫的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區具有20個或更少的氨基酸置換。在另一個 實施方案中，與結合EphB4的細胞外結構的非人或親本抗體相比較，解除免疫的抗體或其 抗原結合片段的重鏈可變區具19個或更少、18個或更少、17個或更少、16個或更少、15個 或更少、14個或更少、13個或更少、12個或更少、11個或更少、10個或更少、9個或更少、8個 或更少、7個或更少的氨基酸置換。在一個實施方案中、與非人或親本抗體相比較，輕鏈可變 區具有至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、 至少10個、至少11個、至少12個、至少13個氨基酸置換。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段以與小鼠單克隆抗體 #131 (ATCC保藏號PTA-6214)相似或更大的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段中的置換導致抗體或抗原 結合片段的構架區和與所述構架區同源的人種系基因序列之間的序列同一性的增加。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制培養的內皮細胞形成 管。在另一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段在體內抑制組織的血管化 作用(vascularization)。在另一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段減少 小鼠中人腫瘤異種移植物(xenograft)的生長。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體 或其抗原結合片段抑制植入動物的角膜中的組織的血管化作用或植入動物的基質組織栓 (Matrigel tissue plug)的血管化作用。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結 合片段促進細胞凋亡。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能被改變。在 另一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能得到增強。在另一個 實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能被減弱。在一些實施方案中， 解除免疫的抗體或抗原結合片段包含重鏈恒定區。在一些實施方案中，除去Fc區域中的 N-糖基化。在一些實施方案中，Fc區域在N-糖基化識別序列中包含突變，從而抗體或多肽 的Fc區域未被N-糖基化。在一些實施方案中，將Fc區域PEG化。在一些實施方案中，重 鏈恒定區是包含下列殘基的人重鏈IgGh恒定區位點330和331上的絲氨酸。在一些實 施方案中，重鏈恒定區是包含下列突變的人重鏈IgG4 位點233上的脯氨酸、位點234上的 纈氨酸和位點235上的丙氨酸。這些氨基酸位點基于Kabat編號。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制EphB4的二聚化或 多聚化。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制肝配蛋白B2刺激的 EphB4的自磷酸化作用。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段刺激EphB4 激酶的活性。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段結合EphB4的第一纖連蛋 白樣結構域。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段結合EphB4的第二纖連蛋白樣結構域。在一個實施方案中，將解除免疫的抗體或其抗原結合片段綴合至細胞毒性劑。在 一個實施方案中，細胞毒性劑選自放射性試劑、植物、真菌或細菌來源的分子例如皂草素、 生物蛋白質、長春堿、4-去乙酰長春花堿、長春新堿、異長春堿和長春地辛(vindesine)。在 某些實施方案中，將抗體或其抗原結合片段通過穩定的連接體綴合至細胞毒性劑，其在癌 細胞內釋放細胞毒素劑。在一個實施方案中，與結合細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，抗體或抗原 結合片段的可變區具有2至20個氨基酸置換，其中所述非人或親本抗體還在解除免疫的抗 體或其抗原結合片段中提供一個或更多個CDR。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其 抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中與結合EphB4的細胞外結構域的非人或 親本抗體相比較，各可變區具有2至20個氨基酸置換，并且解除免疫的抗體或其抗原結合 片段具有一個或更多個來自所述非人或親本抗體的互補決定區(CDR)。在另外的實施方案 中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段在人受試者中比所述非人或親本抗體的免疫原性更 低。在一個實施方案中，非人或親本抗體是小鼠單克隆#47或小鼠單克隆#131 ；ATCC
保藏指定編號分別為_和PTA-6214。在另外的實施方案中，重鏈可變區中的一個
或更多個置換在選自位點5、12、40、66、75和83 (根據Kabat編號系統)的氨基酸位點上發 生。在另外的實施方案中，重鏈可變區中的一個或更多個置換選自位點5上的纈氨酸、位點 12上的賴氨酸、位點40上的丙氨酸、位點66上的精氨酸、位點75上的蘇氨酸和位點83上 的精氨酸，所述位點根據Kabat編號系統。在另外的實施方案中，輕鏈可變區中的一個或更 多個置換在選自根據Kabat編號系統的位點45、74和100的氨基酸位點上發生。在另一個 實施方案中，輕鏈可變區中一個或更多個置換選自根據Kabat編號系統的位點45上的賴氨 酸、位點74上的蘇氨酸和位點100上的谷氨酰胺。在一個實施方案中，重鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :10 的 SEQ ID NO :13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12 禾口 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d) 選自 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 10 氨基酸 113 至 123 的 FR4。在一個實施方案中，輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO :6、SEQ IDN0:15和SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :15 禾口 SEQ ID NO :18 的氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；和 d)選自 SEQID NO 6 和 SEQ ID NO 15 的氨基酸 98-107 的 FR4。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含含有 SEQ ID NO 19 的 CDRl、含有 SEQ ID NO :20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO :21 的 CDR3 ；并且其中 輕鏈包含含有SEQ ID NO 22的CDRl、含有SEQ ID NO :23的CDR2和含有SEQ ID NO 24的 CDR3。在另外的實施方案，解除免疫的抗體或其抗原結合片段在人受試者中比小鼠單克隆 抗體#47的免疫原性更低。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段以為小鼠單克隆抗體#47對EphB4的細胞外結構域的結合的結合親和力的至少80%、至少90% 或至少100%的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制EphB4與肝配蛋白 B2的細胞外部分的結合。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制 EphB4的二聚化或多聚化。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制肝 配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原 結合片段刺激EphB4激酶的活性。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片 段結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域。在另外的實施方案中，其結合EphB4的第二纖連 蛋白樣結構域。在另外的實施方案中，將解除免疫的抗體或其抗原結合片段綴合至細胞毒性 劑。在另外的實施方案中，細胞毒素劑選自放射性試劑、植物、真菌或細菌來源的分子 例如皂草素、生物蛋白質、長春堿、4-去乙酰長春花堿、長春新堿、異長春堿和長春地辛 (vindesine)。在某些實施方案中，將抗體或其抗原結合片段通過穩定的連接體綴合至細胞 毒性劑，所述連接體在癌細胞內釋放細胞毒性劑。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制培養的內皮細胞形 成管。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段在體內抑制組織的血管化 作用。在另一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段減少小鼠中人腫瘤異種移 植物的生長。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制植入動物的角 膜中的組織的血管化作用或植入動物的基質組織栓的血管化作用。在另外的實施方案中， 解除免疫的抗體或其抗原結合片段促進細胞凋亡。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能被改變。在 另一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段效應子功能得到增強。在另一個實 施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段效應子功能被減弱。在一些實施方案中，解除 免疫的抗體或抗原結合片段包含重鏈恒定區。在一些實施方案中，除去Fc區域中的N-糖基化。在另外的實施方案中，抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO =USEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3, SEQ IDNO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由選自 SEQ IDNO 1 的氨基酸113-123組成的FR4 ；并且輕鏈可變區包含a)由SEQ IDNO 6的氨基酸1至23組 成的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的氨基酸 35 至 49 的 FR2 ； c)選自 SEQ ID NO 6,SEQ IDNO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57-88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 6的氨基酸98至107組成的FR4。在另外的實施方案中，抗體或抗原結合片段的重鏈可變區包括選自a)SEQ ID NO Kb) SEQ ID N0:2、c)SEQ ID N0:3、d)SEQ ID NO :4 和 e) SEQ ID NO :5 的氨基酸序列。在另外的實施方案中，抗體或抗原結合片段的輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID NO :6, b) SEQ ID N0:7、c)SEQ ID NO :8 和 d) SEQ ID NO :9 的氨基酸序列。在另外的實施方案中，抗體或抗原結合片段的重鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:l、b)SEQ ID N0:2、c)SEQ ID NO,3, d) SEQ ID NO :4 和 e) SEQ ID NO :5 的氨基酸序列；
14并且抗體或抗原結合片段的輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID NO :6,b) SEQ ID N0:7、c)SEQ ID NO 8和d) SEQ ID NO :9的氨基酸序列。在另外的實施方案中，抗體或抗原結合片段的重鏈可變區包含SEQ ID NO 3的氨 基酸序列，并且輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8的氨基酸序列。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，并且輕鏈可變 區包含選自:a) SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8的氨基酸序列。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，并且輕鏈可變 區包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗體或抗原結合片段的重鏈可變區包含含有SEQ ID N0:25的 CDRl、含有SEQ ID NO 26的CDR2以及含有SEQ IDNO 27的CDR3 ；并且輕鏈可變區包含含 有 SEQ ID NO 28 的 CDRl，含有 SEQ ID NO 丨9 的 CDR2，和含有 SEQ ID NO :30 的 CDR3。在另 外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段在人受試者中比小鼠單克隆抗體#131 的免疫原性更低。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段以為小鼠單克隆抗體 # 131對EphB4的細胞外結構域的結合的結合親和力的至少80%、至少90%或至少100%的 結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制EphB4與肝配蛋白 B2的細胞外部分的結合。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制 EphB4的二聚化或多聚化。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制肝 配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原 結合片段刺激EphB4激酶的活性。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片 段結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第二纖連蛋白樣結構域。在另外的實施方案中，將解除免疫的抗體或其抗原結合片段綴合至細胞毒性劑。 在另外的實施方案中，細胞毒性劑選自放射放射線的化合物、植物、真菌或細菌來源的分子 例如皂草素、生物蛋白質、長春堿、4-去乙酰長春花堿、長春新堿、異長春堿和長春地辛。在 某些實施方案中，將抗體或其抗原結合片段通過穩定的連接體綴合至細胞毒素劑，所述連 接體在癌細胞內釋放細胞毒性劑。在另外的實施方案中，抗體或抗原結合片段抑制培養的內皮細胞形成管。在另外 的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段在體內抑制組織的血管化作用。在另外 的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段減少小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。 在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制植入動物的角膜中的組織的 血管化作用或植入動物的基質組織栓的血管化作用。在另外的實施方案中，解除免疫的抗 體或其抗原結合片段促進細胞凋亡。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能被改變。在 另一個實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能得到增強。在另一個 實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的效應子功能被減弱。在一些實施方案中， 解除免疫的抗體或抗原結合片段包含重鏈恒定區。在一些實施方案中，除去Fc區域中的 N-糖基化。
在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含a) 選自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FR1，b)選自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2，c)選自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；禾口 d)選自 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123的FR4 ；并且其中輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的氨基酸1至23的FRl，b)選自SEQ ID NO 15和SEQID NO 18的氨基酸；35至49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO 15 和 SEQ IDNO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 15的氨基酸98至107組成的FR4。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:10、b)SEQ ID NO :11, c) SEQ ID NO : 12、d) SEQ ID NO :13 和 e) SEQ IDNO : 14 的氨基酸序列。在另外的實施方案中，輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:15、b)SEQ ID NO :16, c) SEQ ID NO 17 和 d) SEQ ID NO :18 的氨基酸序列。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列，并且輕鏈可 變區包含選自a)SEQ ID NO :17和b) SEQ ID N0:18的氨基酸序列。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，并且輕鏈可 變區包含選自a)SEQ ID N0:17和b)SEQ ID NO :18的氨基酸序列。在另外的實施方案中， 重鏈可變區包含SEQ ID N0:14的氨基酸序列，并且輕鏈可變區包含SEQ ID N0:18的氨基 酸序列。在一個實施方案中，以與親本或非人抗體相同或更大的親和力結合EphB4的細胞 外結構域的解除免疫的抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區。解除免疫的 抗體或抗原結合片段具有一個或更多個下列特征a)各可變區整個來源于一個或更多個 人抗體；b)各可變區，與親本或非人抗體相比較，具有減少的T細胞表位數目；和c)各可變 區，與親本或非人抗體相比較，具有減少的B細胞表位數目。在一個實施方案中，各可變區 是來自一個或更多個人抗體的區段的組合物。在一個實施方案中，人抗體區段在長度上為 2至35個氨基酸。在一個實施方案中，人抗體區段不包含完整的⑶R或單個的構架區。在 另外的實施方案中，一個或更多個下列殘基存在于重鏈可變區中位點5上的纈氨酸、位點 12上的賴氨酸、位點40上的丙氨酸、位點66上的精氨酸、位點75上的蘇氨酸以及位點83 上的精氨酸，所述位點根據Kabat編號系統。在另外的實施方案中，一個或更多個下列殘基 存在于輕鏈可變區中位點45上的賴氨酸、位點74上的蘇氨酸和位點100上的谷氨酰胺， 所述位點根據Kabat編號系統。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含含有SEQ ID NO 25的⑶Rl、含有SEQ ID NO 26的⑶R2和含有SEQ ID NO 27的⑶R3 ；并且輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO 28的 ⑶R1、含有SEQ ID NO 29的⑶R2和含有SEQ ID NO 30的⑶R3。在另外的實施方案中， 重鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO 10、SEQ ID NO :11和SEQ ID NO 13的氨基酸1至30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 15 和 SEQID NO 18 的氨 基酸35至49的FR2 ；c)選自SEQ ID NO 15和SEQ IDNO 17的氨基酸57至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 15的氨基酸98至107組成的FR4。在另一個實施方案中，重鏈可變區包含含有SEQ ID NO 19的⑶Rl、含有SEQ ID NO :20的CDR2和含有SEQ ID NO :21的CDR3 ；并且其中輕鏈包含含有SEQ ID NO :22的 ⑶R1、含有SEQ ID NO 23的⑶R2和含有SEQ ID N0J4的⑶R3。在另外的實施方案中，重 鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO =USEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的氨基酸1至30的FRl， b)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和d)由SEQ IDNO 1的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且輕鏈可變區包含a)由SEQ IDNO 6 的氨基酸 1 至 23 組成的 FR 1，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9的氨基酸35至49的FR2 ；c)選自SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7和SEQ ID NO 8的氨基酸 57至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107組成的FR4。在一個實施方案中，結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或其抗原結合 片段具有比從具有ATCC保藏號PTA-6214的雜交瘤獲得的#131抗體的免疫原性更低并且 以與獲自雜交瘤的抗體相同的或更大的親和力結合所述結構域。在另外的實施方案中， 解除免疫的抗體或抗原結合片段的重鏈可變區包含含有SEQ ID NO 25的⑶Rl、含有SEQ IDNO 26的CDR2和含有SEQ ID NO 27的CDR3 ；并且輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO 28的 CDR1、含有SEQ ID NO :29的CDR2以及含有SEQID NO :30的CDR3。在另外的實施方案中， 重鏈可變區包含a)選自SEQID NO :10、SEQ ID NO :11和SEQ ID NO 13的氨基酸1至30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO: 18 的氨 基酸35至49的FR2 ；c)由選自SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17的氨基酸57至88組成的 FR3 ；和d)由SEQ ID NO 15的氨基酸98至107組成的FR4。在一個實施方案中，結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或其抗原結合 片段具有低于獲自具有ATCC保藏號—的雜交瘤的#47抗體的免疫原性并且以與獲自 雜交瘤的抗體相同或更大的親和力結合所述結構域。在另外的實施方案中，解除免疫的抗 體或抗原結合片段的重鏈可變區包含含有SEQ ID NO 19的⑶Rl、含有SEQ ID NO :20的 CDR2和含有SEQ ID NO :21的CDR3 ；并且輕鏈包含含有SEQ IDNO 22的CDRl、含有SEQ ID NO 23的⑶R2和含有SEQ ID NO 24的⑶R3。在另外的實施方案中，重鏈可變區包含a)選 自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ IDNO 1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 1的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且輕鏈可變區包含a)由SEQ ID NO 6的氨基 酸 1 至 23 組成的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ； 和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107組成的FR4。在一個實施方案中，結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或抗原結合片 段具有重鏈可變區，所述重鏈可變區具有下列位點5上的纈氨酸、位點12上的賴氨酸、位點40上的丙氨酸、位點66上的精氨酸、位點75上的蘇氨酸和位點83上的精氨酸中的一個 或更多個，所述位點根據根據Kabat編號系統。在另外的實施方案中，解除免疫的抗體或抗 原結合片段具有輕鏈可變區，所述輕鏈可變區具有下列位點45上的賴氨酸、位點74上的 蘇氨酸以及位點100上的谷氨酰胺中的一個或更多個，所述位點根據Kabat編號系統。在一個實施方案中，提供了降低受試者中腫瘤的生長速度的方法。在另外的實施 方案中，方法包括對受試者施用治療有效量的本文中公開的解除免疫的抗體或其抗原結合 片段。在一個實施方案中，受試者是人受試者。在一個實施方案中，腫瘤包括與可供比較的 組織的非癌性細胞相比較，表達更高EphB水平的細胞。在一個實施方案中，申請提供了促進細胞凋亡，從而治療患有癌癥的受試者的方 法。在另外的實施方案中，方法包括對受試者施用治療有效量的本文中公開的解除免疫的 抗體或其抗原結合片段的方法。在一個實施方案中，受試者是人受試者。在一個實施方案 中，癌癥包括與可供比較的組織的非癌性細胞相比，以更高的水平表達EphB4的癌細胞。 癌癥可以是轉移癌。在另外的實施方案中，癌癥選自結腸癌、乳腺癌、間皮癌、前列腺癌、鱗 狀上皮細胞癌(squamous cell carcinoma)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、卵巢癌和白血 病。在一個實施方案中，癌癥是血管生成依賴性癌癥或不依賴于血管生成的癌癥。在一個 實施方案中，可將抗體或抗原結合片段與一種或更多種額外的抗癌化學治療劑共施用，所 述化學治療劑以累加或協同的方式與抗體或抗原結合片段一起抑制癌細胞。在某些實施方案中，本公開內容提供了用于治療患有癌癥的受試者的方法，包括 (a)鑒定受試者中具有多種表達EphB4和/或肝配蛋白B2的癌細胞的腫瘤；和(b)對受試 者施用結合EphB4蛋白的細胞外結構域的抗體或抗原結合片段。在一個實施方案中，提供了抑制受試者中血管生成的方法。在另外的實施方案中， 方法包括對有此需要的受試者施用有效量的本文中公開的抗體。在一個實施方案中，受試 者是人受試者。在另外的實施方案中，受試者被診斷為黃斑變性。在一個實施方案中，方法可包括將細胞與足以抑制血管生成的量的解除免疫的抗 體或抗原結合片段接觸。在某些方面，本公開內容提供了用于治療患有血管生成相關疾病的受試者 的方法，其包括對受試者施用結合EphB4蛋白的細胞外結構域的解除免疫的抗體或 抗原結合片段。可用藥學上可接受的載體配制抗體或抗原結合片段。血管生成相關 疾病或不期望的血管生成相關過程可選自血管生成依賴性癌癥、良性腫瘤、炎性病癥 (inflammatory disorder)、慢性關節風濕病和銀屑病、眼部新生血管性疾病(ocular angiogenicdisease) > Osler—ffebber 綜合|iE、j[>|j/L血管新生(myocardial angiogenesis) > 斑塊新生血管形成(plaque neovascularization)、毛細血管擴張、血友病關節 (hemophiliac joint)、血管纖維瘤、創傷肉芽形成(woundgranulation)、創傷愈合、毛細血 管擴張銀屑病硬皮癥(telangiectasiapsoriasis scleroderma)、膿性肉芽腫、冠狀動脈側 枝(cororany collateral)、肢端缺血血管再生(ischemic limb angiogenesis)、發紅、關 節炎、糖尿病新生血管化(diabetic neovascularization)、骨折、血管生成和造血作用。可 將抗體或抗原結合片段與至少一種額外的血管生成抑制劑共施用，所述血管生成抑制劑 以累加或協同的方式與抗體或抗原結合片段一起抑制血管生成。在治療方法的另外的實施方案中，全身性施用解除免疫的抗體或其抗原結合片段。在另外的實施方案中，局部施用解除免疫的抗體或其抗原結合片段。在一個實施方案中，提供了包含本文中公開的解除免疫的抗體或其抗原結合片段 的藥物組合物。在另外的實施方案中，組合物還可包含任何藥學上可接受的載體或賦形劑。在一個實施方案中，提供了本文中公開的解除免疫的抗體或其抗原結合片段在制 造用于治療癌癥的藥劑中的用途。在另外的實施方案中，癌癥選自結腸癌、乳腺癌、間皮癌、 前列腺癌、鱗狀上皮細胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病。在另外的實施方案中，提供了本 文中公開的人源化抗體或其抗原結合片段在制造用于抑制血管生成的藥劑中的用途。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段可抑制EphB4的活性。可設 計抗體使之抑制肝配蛋白B2與EphB4之間的相互作用。拮抗劑抗體通常影響Eph和/或 肝配蛋白的信號轉導。例如，抗體可抑制EphB4的成簇(clustering)或磷酸化。在一個實 施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段還可增加EphB4的活性。激動劑抗體例如可上 調EphB4的信號轉導。在某些方面，公開內容提供了抑制細胞中通過肝配蛋白B2/EphB4途徑的信號轉 導。方法可包括將細胞與有效量的結合EphB4蛋白的細胞外結構域并且抑制EphB4的活性 的抗體或抗原結合片段接觸。在某些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段可以是多克隆抗體、單克隆 抗體或抗體片段、重組抗體、雙價抗體(diabody)、嵌合的或嵌合型抗體或抗體片段、人源化 抗體或抗體片段、完全人抗體或抗體片段、CDR移植抗體或抗體片段、單鏈抗體、Fv、Fd、Fab、 Fab，或F(ab，)2,以及合成或半合成抗體。在某些實施方案中，解除免疫的抗體或抗體片段以對于EphB4蛋白的細胞外結 構域至少大約lxl(^M、至少大約lxl(T4M、至少大約1χ1(Γ5Μ、至少大約lxl(T6M、至少大約 1χ1(Γ7Μ、至少大約1χ1(Γ8Μ、至少大約1χ1(Γ9Μ、至少大約ΙχΙΟ,Μ、至少大約IxKT11M或至少 大約IxlO-12M的解離常數(Kd)結合EphB4蛋白的細胞外結構域。在某些方面，可將本文中公開的解除免疫的抗體或抗體片段與額外的功能性部 分例如賦予期望的藥物代謝動力學特性的標記物或部分共價連接(或與其穩定締合)。 示例性標記物包括適合于通過選自熒光檢測方法、正電子發射斷層掃描術(positron emission tomographydetection method)和核磁共振檢測法的方法檢測的標記物。標記物 可以例如選自熒光標記物、放射性標記物和具有獨特的核磁共振特征的標記物。可將部分 例如聚乙二醇(PEG)部分附著至抗體或其抗原結合部分以增加血清半衰期。在某些實施方案中，解除免疫的抗體或抗體片段包括改變的恒定區，其中所述抗 體或抗原結合片段展示與具有天然恒定區的抗Eph4B抗體相比，減弱的效應子功能。在某 些實施方案中，減弱的效應子功能包括一個或更多個下列類型的特征與具有天然恒定區 的抗Eph4B抗體相比較，減弱的抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(antibody-cbpendenT-ce 11-mediated cytotoxicity) (ADCC)和減弱的補體依賴細胞毒性(CDC)。在某些實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段包括改變的恒定區，其中 所述抗體或抗原結合片段展示相對于具有天然恒定區的抗Eph4B抗體，增強的效應子功 能。在某些實施方案中，增加的效應子功能包括一個或更多個下列類型的特征與具有天然 恒定區的抗Eph4B抗體相比較，增強的抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和增強的補 體依賴細胞毒性(⑶C)。
在某些實施方案中，解除免疫的抗體或其抗原結合片段具有抗癌活性。在某些實 施方案中，抗癌活性可抑制腫瘤生長、抑制癌細胞增殖、抑制癌細胞遷移、抑制癌細胞的轉 移、抑制血管生成或引起腫瘤細胞死亡。在一個實施方案中，本申請提供了包含用于檢測前列腺癌的本申請的抗體的診斷 組合物。在一個實施方案中，本公開內容提供了結合位于EphB4的細胞外部分的表位的 解除免疫的抗體或其抗原結合片段。解除免疫的抗體或其抗原結合片段可與位于

圖1的 EphB4序列的氨基酸16至198的表位結合。例如，表位可位于EphB4的結合肝配蛋白B2 的球狀結構域(圖1的氨基酸四至197)內。解除免疫的抗體或其抗原結合片段可抑制 EphB4與肝配蛋白B2的細胞外部分的結合。解除免疫的抗體或其抗原結合片段可結合位于 圖1的EphB4序列的氨基酸327至427或似8至537內的表位。例如，解除免疫的抗體或 其抗原結合片段可結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域(圖1的氨基酸3M至429)或第 二纖連蛋白樣結構域(圖1的氨基酸434至426)。在其他實施方案中，對人施用抗體或抗原結合片段在臨床上是可接受的。在其他實施方案中，提供了包含編碼本文中提供的解除免疫的抗體或其抗原結合 片段的核苷酸序列的多核苷酸。在其他實施方案中，提供了在嚴格雜交條件下與編碼本文 中公開的解除免疫的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸雜交的多核苷酸。在其他實施方案中，提供了包含一個或更多個編碼本文中公開的解除免疫的抗體 或其抗原結合片段的核苷酸序列的載體。在其他實施方案中，提供了包含表達本文中公開的解除免疫的抗體或其抗原結合 片段的載體的分離的細胞。本申請涉及任何上述方面和實施方案的組合。附圖概述圖1顯示EphB4前體蛋白的氨基酸序列。(Genbank登錄號NP_004435和SEQ ID NO 53)圖2A-2D顯示比較來自親本小鼠單克隆抗體和解除免疫的變體的可變區的氨基 酸比對。圖2A描述了與5個解除免疫的變體比對的小鼠單克隆抗體#47的重鏈可變區(SEQ ID NO 49)；圖2B描述了與4個解除免疫的變體比對的#47的輕鏈可變區(SEQ ID NO 50)； 圖2C描述了與5個解除免疫的變體比對的小鼠單克隆抗體#131的重鏈可變區(SEQID NO 51)；圖2D描述了與4個解除免疫的變體比對的#131的輕鏈可變區(SEQ ID NO :5 。陰 影標示的殘基表示與親本小鼠單克隆抗體不同的氨基酸。圖3A描述了將嵌合型#47抗體的結合與4個解除免疫的#47變異抗體的結合相比 較的細胞外EphB4夾心ELISA的結果。數字表示可變區的序列。例如“3/7”表示具有SEQ ID NO :3的重鏈可變區和EQ ID NO 7的輕鏈可變區的抗體。圖顯示其中在ELISA中達 到50%的結合的各抗體的濃度。圖4A描述了將嵌合型#131抗體的結合與4個解除免疫的#131變異抗體的結合 相比較的細胞外EphB4夾心ELISA的結果。圖4B顯示在于ELISA中達到50%結合的情況 下各抗體的濃度。圖5顯示用10mg/ml的抗體處理的載有來自細胞的裂解物的SDS凝膠的western印跡(泳道1 無抗體處理，脈道2 小鼠單克隆抗體#131，泳道3 嵌合型抗體 #131，泳道4 示例性解除免疫的#131抗體，泳道5 小鼠單克隆抗體#47，泳道6 嵌合型抗 體#47，泳道7 和示例性解除免疫的#47抗體，泳道8表示分子標記，分子量以Kda表示)。 印跡用抗EphB4 —抗進行探測。圖6A和6B描述了體內鱗狀上皮細胞癌異種移植物測定的結果。腫瘤體積在Y軸 上以mm3表示，X軸相應于在處理開始后的天數。將利用小鼠單克隆抗體#47和#131的處 理與示例性解除免疫的抗體和對照處理相比較。發明詳述I.定義“受試者”是指脊椎動物，例如，哺乳動物或人。雖然本發明的抗體或抗原結合片段 主要牽涉人受試者的治療，但它們還可在獸醫目的上用于其他哺乳動物受試者例如狗和貓 的治療。如本文中所使用的，術語“抗體”(免疫球蛋白)包括但不限于單克隆抗體(包括 全長單克隆抗體)、多克隆抗體、從至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異 性抗體)、人抗體、人源化抗體、cameIised抗體、嵌合型抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、單 結構域抗體、結構域抗體、Fab片段、F(ab' )2片段、展示期望的生物活性的抗體片段、二硫 鍵連接的Fvs (sdFv)、胞內抗體(intrabody)和任何上述抗體的表位結合片段或抗原結合 片段。抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學上有活性的片段，即含有抗原 結合部位的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型G^i^n，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA* IgY)、 種類(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。術語“抗原結合片段”是指保持與抗原結合的抗體的任何部分。抗體的示例性抗 原結合片段是重鏈和/或輕鏈CDR或重鏈和/或輕鏈可變區。術語“免疫原性”是指抗體或抗原結合片段，當對受者施用時，引發免疫應答(體 液或細胞)的能力，包括例如HAMA應答。當來自受試者的T細胞對施用的抗體作出免疫應 答時引起HAMA應答。然后T細胞招募B細胞，從而產生特異性“抗-抗體”抗體。術語“T細胞表位”是指以合理的效率結合MHC II類分子或能夠通過在MHC II類 上呈遞來刺激T細胞的特定肽序列。術語“B細胞表位”是指被B細胞識別的肽序列。通常，此類序列是溶劑可及的。術語免疫解除(deimmunization)是減少化合物對給定的物種的免疫原性的方 法。解除免疫的抗體是在給定的物種中比相應的親本或非人抗體的免疫原性更低的抗體。如本文中所用的，術語肝配蛋白(Ephrin)和Eph用于分別指配體和受體。它們 可來自多種動物的任一種(例如，哺乳動物/非哺乳動物、脊椎動物/無脊椎動物，包括 人)。該領域中的命名法已發生快速變化，本文中使用的命名法是作為Eph命名委員會(Eph NomenclatureCommittee)工作的結果提出的，可在eph-nomenclature. com上于萬維網上 訪問其以及之前使用的名稱。II.概述Eph家族受體是與Eph相關的受體蛋白質-酪氨酸激酶的家族，受體因其在產生促 紅細胞生成素的人肝細胞癌細胞系中表達而得名。基于它們的細胞外結構域序列與它們優 先結合肝配蛋白-A蛋白或肝配蛋白-B蛋白的能力的相關性，它們被分為兩個亞類。優選與肝配蛋白-A蛋白相互作用的受體是EphA受體，優先與肝配蛋白-B蛋白相互作用的宏觀 世界體是EphB受體。Eph受體具有由結合配體的球狀結構域組成的細胞外結構域、富含半胱氨酸的區 域，接著一對III型纖連蛋白重復。細胞質結構域由含有兩個保守酪氨酸殘基的近膜區域、 蛋白質酪氨酸激酶結構域、不育α-基序(SAM)和PDZ-結構域結合基序組成。EphB4對于 膜結合配體肝配蛋白B2是特異性的(Sakano，S.等人1996 ；BrambiIla R.等人19卯)。肝 配蛋白B2屬于具有跨膜結構域和細胞質區域(具有5個保守酪氨酸殘基)和PDZ結構域 的Eph配體的種類。Eph受體通過成簇的膜附著的肝配蛋白的結合來激活(Davis S等人， 1994)，這表明表達受體的細胞與表達配體的細胞之間的接觸是Eph的激活所必需的。在配體結合后，Eph受體二聚化并且自磷酸化近膜酪氨酸殘基以獲得完全激活 (Kalo MS等人，1999，Birms KS, 2000) 0除了通過Eph受體的正向信號轉導外，還可發生通 過肝配蛋白B的反向信號轉導。肝配蛋白的Eph銜接(engagement)導致保守的細胞內酪氨 酸的快速磷酸化(Bruckner K，1997)和稍微較慢的PDZ結合蛋白的招募(Palmer A 2002)。EphB4前體蛋白描述于圖1中。圖1的EphB4序列的氨基酸16至198相應于結合 肝配蛋白B2的球狀結構域(GD)。氨基酸239-321相應于富含半胱氨酸的結構域并且氨基 酸324-4 和434-5 分別相應于EphB4的第一纖連蛋白樣結構域(FNDl)和第二纖連蛋 白樣結構域(FND2)。幾個研究已顯示Eph/肝配蛋白的高表達與增加的腫瘤生長、腫瘤發生能力和轉 移的潛能相關(Easty DJ, 1999 ；Kiyokawa E, 1994 ；Tang XX, 1999 ；Vogt T, 1998 ；Liu W, 2002 ；Stephenson SA, 2001 ；Steube KG 1999 ；Berclaz G，1996)。申請 10/949，720 證明 EphB4抗體在異種移植頭頸癌腫瘤類型中引起細胞凋亡、減少血管生成和抑制腫瘤生長。本公開內容提供了可用于治療癌癥以及血管生成相關病癥和不期望的血管生成 相關過程的解除免疫的抗體和抗原結合片段。解除免疫的抗體和抗原結合片段可用于在體外和體內抑制EphB4的功能。本公開 內容提供了例如通過抑制EphB4與EphB2相互作用用作受體拮抗劑的抗體。本公開內容還 提供了用作激動劑并且激活EphB4激酶的活性(通常通過估計EphB4的磷酸化狀態來評 估的)的抗體和其抗原結合部分。令人驚訝地，此類抗體還在基于細胞的測定和體內測定 中抑制EphB4的功能。因此，此類抗體和抗原結合片段可用于在體外和體內抑制EphB4功 能，以及用于治療與不期望的血管生成相關的癌癥或病癥。雖然不希望受任何特定機制的 限定，但預期刺激EphB4激酶活性的抗體也影響從膜上除去EphB4，從而降低總的EphB4水 平。III.抗體抗體是由脊椎動物中稱為B細胞的淋巴細胞響應抗原引起的刺激而產生的蛋白 質。抗體(或更確切地免疫球蛋白(Ig))分子的基本結構單位由4條多肽鏈組成，其組合 在一起形成大寫字母“Y”的形狀。4條鏈中的2條是相同的輕(L)鏈，2條是相同的重(H) 鏈。存在5種不同類型(同種型)的重鏈，其將抗體分成5類，g卩IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。 此外，存在命名為κ和λ的兩種不同的同種型的輕鏈。每一類重鏈可與任一類輕鏈組合。 重鏈和輕鏈各自包含參與抗原識別的可變區(分別地，VH和VL)和恒定(C)區。抗原結合 部位由6個高變區(或確切地互補決定區(CDR))組成。來自重鏈的3個CDR和來自輕鏈的3個CDR分別位于各鏈上的4個相對保守的反向平行的β折疊片(其被稱為構架區) (FR1、FR2、FR3和FR4)之間。按慣例，已使用編號系統指示VH和VL鏈的構成部分的位置。 Kabat定義基于序列變異，Chothia定義基于結構環區域的定位。本文中使用Kabat定義進 行編號。在某些方面，本發明提供了抗EphB4的解除免疫的抗體和抗原結合片段。在一些 實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段結合EphB4的細胞外結構域。應理解，抗體可
和F(ab' )2、單克隆和多克隆抗體、基因工程抗體(包括嵌合型 抗體、單鏈抗體、CDR移植抗體、人源化抗體、完全人抗體和人工選擇的抗體)以及使用噬菌 體展示或備選技術產生的合成抗體或半合成抗體。在本申請的一個實施方案中，抗體片段是截斷的鏈(在羧基末端截斷的)。在某些 實施方案中，這些截斷的鏈具有一個或更多個免疫球蛋白活性(例如，補體結合活性)。截 斷的鏈的實例包括但不限于Fab片段(VL、VH、CL和CHl結構域組成)；Fd片段(由VH和 CHl結構域組成)；Fv片段(由抗體的單鏈的VL和VH組成)；dab片段(由VH結構域組 成)；分離的⑶R區域；(Fab' )2片段，二價體片段(包含由鉸鏈區上的二硫鍵連接的兩個 Fab片段)。截斷的鏈可通過其各自在本領域內是已知的常規生物化學技術例如酶切割或 重組DNA技術產生。此類多肽片段可利用本領域內熟知的方法通過蛋白水解切割完整的抗 體來產生，或使用定向誘變在載體中期望的位置上例如在CHl之后插入終止密碼子以產生 Fab片段或在鉸鏈區之后插入終止密碼子以產生(Fab' )2片段來產生。單鏈抗體可通過 用編碼連接VL和VH蛋白質片段的肽連接體的DNA連接VL-和VH-編碼區來產生。本申請還提供了抗EphB4抗體的片段，其可包含完整抗體的部分，例如，完整抗體 的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段；雙價抗體； 線性抗體(Zapata等人.，Protein Eng. 1995 ； 8(10) :1057-1062)；單鏈抗體分子；以及從 抗體片段形成的多特異性抗體。抗體的木瓜蛋白酶降解產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各自具有 單個抗原結合部位，和殘留的“Fe”片段，其名稱反映其容易結晶的能力。抗體的胃蛋白酶 片段產生具有抗原結合部位并且仍然能夠交聯抗原的F(ab’)2片段。“Fv”通常是指含有完整抗原識別和結合部位的最小抗體片段。該區域由以緊密 的非共價締合的一個重鏈和一個輕鏈可變區的二聚體組成。在該構型中，各可變區的3個 CDR相互作用以界二聚體的表面上的抗原結合部位。CDR共同地賦予抗體抗原結合 特異性。然而，甚至單個可變區(或含有3個特異于抗原的CDR的Fv的一半)也具有識別 和結合抗原的能力，雖然以可能以比完整結合部位更低的親和力結合。因此，在某些實施方案中，本申請中公開的抗體可包含1、2、3、4、5、6或更多個識 別EphB4的細胞外結構域的⑶R。Fab片段還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CHl)。Fab’片段與 Fab片段相異在于重鏈CHl結構域的羧基端上少數殘基的添加，包括一個或更多個來自抗 體鉸鏈區的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中恒定結構域的半胱氨酸殘基具有游離巰基 的Fab，的名稱(designation)。F (ab，)2抗體片段最初產生為成對的在其間具有鉸鏈半胱 氨酸的Fab’片段。抗體片段的其他化學偶聯也是知的。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包 含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在于單個多肽鏈中。在某些實施方案中，Fv多肽還在Vh和\結構域之間包含使得scFv形成用于抗原結合的期望的結構的多肽連接體。 關于 scFv 的綜述，參見 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore, eds. (Springer-Verlag :New York,1994), pp.269-315。SMIP是一類經基因工程改造而包含靶結合區和效應結構域(effector domain) (CH2和CH3結構域)的單鏈肽。參見例如，美國專利申請公開案20050238646。靶結合區 可來源于抗體例如本申請的抗EphB4抗體的可變區或CDR。備選地，靶結合區來源于結合 EphB4的蛋白質。術語“雙價抗體”是指具有兩個抗原結合部位的小抗體片段，所述片段包含連接至 相同多肽鏈(Vh-VJ中的輕鏈可變區的重鏈可變區(Vh)。通過使用太短而不能允許 相同鏈上的兩個結構域之間配對的連接體，迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從 而產生兩個抗原結合部位。在例如EP 404，097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger等人·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)中更全面地描述了雙價抗體。眾所周知，具有Fc區域的抗體對分子(或病原體)的結合幫助分子(或病原 體)的加工和清除。抗體的Fc部分被由免疫效應細胞表達的特化受體(specialized receptors)識別。IgGl和IgG3抗體的Fc部分被存在于吞噬細胞例如巨噬細胞和中 性粒細胞的表面上的Fc受體識別，所述吞噬細胞從而能夠結合并且吞噬包被有此類 同種型的抗體的分子或病原體(Janeway等人.，Immunobiology第5版，第147頁， GarlandPublishing(New York，2001))。本發明的抗EphB4抗體包括具有所有類型的恒定區的抗體，包括IgM、IgG、IgD、 IgA和IgE，和任何同種型，包括IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。抗體的輕鏈可以是κ 輕鏈或λ輕鏈。在某些實施方案中，包含來源于不同物種的部分的單鏈抗體和嵌合型抗體、人源 化抗體或靈長源化(CDR-移植)抗體以及嵌合型或CDR移植單鏈抗體也作為抗體的抗原 結合片段包括在本公開內容中。此類抗體的不同部分可通過常規技術化學地連接在一起， 或可使用基因工程技術制備為連續蛋白質。例如，可表達編碼嵌合型或人源化單鏈的核酸 來產生連續蛋白質。參見，例如，美國專利4，816，567和6，331，415 ；美國專利4，816，397 ； 歐洲專利O, 120，694 ；WO 86/01533 ；歐洲專利O, 194，276Β1 ；美國專利5，225，539 ；和歐洲 專利 0，239，400Β1。也參見，Newman 等人，BioiTechnology, 10 1455-1460 (1992)，關于靈 長源化抗體。參見，例如，Ladner等人，美國專利4，946，778 ；和Bird等人，Science, 242 423-426 (1988))，關于單鏈抗體。在某些方面，本申請提供了具有對于EphB4或EphB4的部分的結合特異性的抗體 和抗原結合片段。在一些方面，抗體和抗原結合片段結合一個或更多個EphB4的特定結構 域。例如，抗體或抗原結合片段結合EphB4的一個或更多個細胞外結構域(例如球狀結構 域、富含半胱氨酸的結構域以及第一纖連蛋白3型結構域以及第二纖連蛋白3型結構域)。 在一些方面，免疫球蛋白可以以至少大約1 X 10_6，1 X 10_7、1 X 10_8、1 X 10_9M或更小的解離 常數(Kd)結合EphB4。在某些實施方案中，本文中公開的抗體和抗原結合片段對于EphB4 是特異性的，對Eph或肝配蛋白家族的其他成員具有最低限度的結合。在某些實施方案中，本申請提供了 EphB4拮抗劑抗體。如本文中所述的，術語“拮 抗劑抗體”是指可抑制EphB4的一個或更多個功能例如結合活性(例如，配體結合)和信號轉導活性(例如，EphB4的成簇或磷酸化、細胞應答的刺激例如細胞遷移或細胞增殖的刺 激)的抗體。例如，拮抗劑抗體可抑制(減少或防止)EphB4受體與天然配體(例如，肝配 蛋白B2或其片段)的相互作用。在一些實施方案中，抗EphB4的拮抗劑抗體可抑制EphB4 介導的功能，包括內皮細胞遷移、細胞增殖、血管生成和/或腫瘤生長。在某些實施方案中， 拮抗劑抗體結合EphB4的細胞外結構域。在其他實施方案中，抗體或抗原結合片段是EphB4拮抗劑。在一些實施方案中，抗 體或抗原結合片段激活或增強EphB4激酶的活性，甚至不依賴于肝配蛋白B2。在一些情況 下，此類抗體可用于刺激EphB4。然而，申請者指出在大多數基于細胞的測定和體內測定中， 此類抗體令人驚訝地表現如拮抗劑抗體一樣。此類抗體似乎結合纖連蛋白III型結構域， 特別地圖1的氨基酸327至427的區域。在一些實施方案中，結合EphB4的纖連蛋白III型 結構域的抗體或抗原結合片段可抑制由EphB4介導的功能，包括內皮細胞遷移、細胞增殖、 血管發生和/或腫瘤生長。在某些實施方案中，包含來源于不同物種的部分的單鏈抗體和嵌合型抗體、人源 化抗體或靈長源化(CDR-移植)抗體以及嵌合型或CDR移植單鏈抗體也作為抗體的抗原結 合部分包括在本公開內容中。此外，還可產生抗體的抗原結合片段，包括嵌合型抗體、人源化抗體、靈長源化抗 體或單鏈抗體的片段。受試抗體的抗原結合片段保持它們所源自的全長抗體的至少一種結 合功能和/或調節功能。某些抗原結合片段保持抑制EphB4的一個或更多個功能特征例如 結合活性、信號轉導活性和/或細胞應答的刺激的能力。例如，在一個實施方案中，EphB4 抗體的抗原結合片段可抑制EphB4與一種或更多種其配體(例如肝配蛋白B2)的相互作用 和/或可抑制一種或更多種受體介導的功能例如細胞遷移、細胞增殖、血管生成和/或腫瘤 生長。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段是小鼠抗體。在一個方面，重鏈和輕 鏈可變區各自包含2至20個氨基酸置換。在一個方面，置換包括用至少一個相應的人氨基 酸置換至少一個小鼠氨基酸。在一個方面，基于鑒定與小鼠可變區同源的人種系基因來選 擇人氨基酸。在一個方面，就小鼠可變區的4個構架區中的每一個獨立地鑒定同源人種系 基因。如本文中所使用的，術語“人源化抗體和抗原結合片段”是指包含不同來源的抗體 的部分的抗體或抗原結合片段，其中至少一個部分是人來源的部分。因此，一個實施方案涉 及具有對于EphB4 (例如，人EphB4)的結合特異性的解除免疫的抗體，所述抗體包含非人來 源(例如，嚙齒動物)的抗原結合區和至少一部分人來源的抗體(例如，人構架區、人恒定 區或其部分)。例如，解除免疫的抗體可包含通過常規技術(例如，合成)化學地連接在一 起的或使用基因工程技術制備為連續多肽(例如，可表達編碼嵌合型抗體的蛋白質部分的 DNA以產生連續多肽鏈)的來源于具有需要的特異性的非人來源例如小鼠的抗體和來源于 人來源的抗體序列的部分(例如，嵌合型抗體)。在某些實施方案中，構架區來源于最接近的人種系構架區。在某些實施方案中，抗 體或抗原結合片段包含來自最接近的人種系基因的FR1、FR2、FR3和FR4區域。在某些實施 方案中，各構架區獨立地選自與特定構架區最接近的人種系基因。在某些實施方案中，用來 自非人或親本抗體的相應殘基置換影響構架區中抗原結合親和力的殘基。
在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段包含一個或更多個含有非人來源 的CDR(例如，一個或更多個來源于非人來源的抗體的CDR)和來源于人來源例如種系抗體 基因的輕鏈和/或重鏈的構架區的抗體鏈(例如，具有或不具有構架區變化的CDR移植抗 體)。在一個實施方案中，解除免疫的抗體可與鼠單克隆抗體競爭對EphB4多肽的結合。嵌 合型或CDR移植單鏈抗體還可包括在術語人源化抗體內。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段包含含有非人來源的CDR(例如，一 個或更多個來源于非人來源的抗體的CDR)和非人來源的構架區的抗體鏈。在一個實施方 案中，用至少一個來自相應的人構架區的氨基酸置換非人構架區。在一個實施方案中，人氨 基酸殘基對非人殘基的置換減少了抗體在人受試者中的免疫原性。在一個實施方案中，提供了結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或其抗 原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中與結合EphB4的細胞外結構域的非人 或親本抗體相比較，各可變區具有2至20個氨基酸置換。可變區包括其間散布4個構架區 的3個⑶R區。在一個方面，置換存在于構架區中。在一個實施方案中，將非人或親本抗體與人種系抗體基因的數據庫例如來自V BASE的數據庫相比較，鑒定高度同源的單個的構架區。可使用這樣的程序如SwissPdb， WAM(ffeb Antibody Modelling)和AbM產生非人或親本抗體可變區的結構模型。可用來自 人種系基因的相應的殘基置換殘基，例如在與CDR或抗原相互作用中不起作用或對抗原結 合親和力沒有貢獻的殘基。在一個實施方案中，將非人或親本抗體的可變區氨基酸序列中的單個的構架區而 非整個構架與人抗體集合中相應的序列相比較。選擇具有最高度同源性的人構架置換非人 或親本抗體的原始構架。該技術，稱為“framework patching”，詳細地描述于美國專利申請 案US2005/0033(^8中，其通過引用合并入本文。在一個實施方案中，將稱為“構架改組(framework shuffl ing) ”的具有來自 非人或親本抗體的CDR可變區的重組文庫按讀框融合至單個的人種系構架庫(pool) (Dall' Acqua等人，Methods，36 :43 ^)05))。然后篩選文庫以鑒定編碼人源化抗體的克 隆，所述人源化抗體以與非人或親本抗體相比較相似的或更大的結合親和力結合EphB4的 細胞外結構域。在一個實施方案中，分析非人或親本抗體以鑒定潛在的T細胞表位。可使用預測 MCH II類結合基序的肽縫合軟件(ρ印tide threadingsoftware)鑒定T細胞表位。計算機 結合預測算法包括iTope 、Tepitope, SYFPEITHI和MHCpred。在一個實施方案中，平行地 就潛在的T細胞表位分析同源單個的人構架區。可不管在非人或親本可變區和人種系基因 中鑒定的表位。然后就可能的置換標記只在非人或親本可變區中鑒定的表位。在一個實施方案中，分析非人或親本抗體以鑒定潛在的B細胞表位。可通過鑒定 非人或親本抗體構架區中為至少部分溶劑可及的并且與相應的同源人抗體構架殘基不同 的殘基來識別潛在的B細胞表位。在一個實施方案中，通過用相應的人殘基置換溶劑可及 的非人或親本抗體構架區殘基來消除潛在的B細胞表位。在一個實施方案中，被導入解除免疫的抗體的置換包括氨基酸置換、缺失或插入。 在一個實施方案中，各置換導致來自同源人種系基因或來自人可變區共有序列的相應氨基 酸對一個氨基酸的置換。在一個實施方案中，通過用來自同源人種系基因或來自人可變區共有序列的相應的氨基酸置換2至20個氨基酸來除去非人或親本抗體或抗原結合片段的 免疫原性。在一個實施方案中，置換可除去一個或更多個T細胞或B細胞表位。在另一個 實施方案中，置換可導入調節T細胞表位。在一個實施方案中，解除免疫的非人或親本抗體 或抗原結合片段，當對人受試者施用時，顯示高于非人或親本抗體或抗原結合片段的降低 的免疫原性應答。在一個實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段的重鏈和輕鏈可變區整個來 源于一個或更多個人抗體，如W02006/08246中所描述的。在一個實施方案中，可變區由來 自一個或更多個人抗體的氨基酸序列的區段組成。在一個實施方案中，人區段在長度上為2 或更多個氨基酸。在一個實施方案中，人區段在長度上為100個或更少的氨基酸。在另外 的實施方案中，人區段在長度上為50個或更少，40個或更少或30個或更少的氨基酸。在一個實施方案中，各可變區，與親本或非人抗體相比較，具有減少的T細胞表位
數目。在一個實施方案中，各可變區，與親本或非人抗體相比較，具有減少的B細胞表位數 目。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段包含小鼠單克隆抗體#47的CDR區。 在US2005/0M9736中已描述和表征了小鼠單克隆抗體#47，其以其全文通過引用合并入本 文。小鼠單克隆抗體#47的重鏈的CDR區定義為SEQ ID NO 19 (CDRl)、SEQ ID NO :20(CDR2) 和SEQ IDNO 21 (CDR3)。小鼠單克隆抗體#47的輕鏈的CDR區定義為SEQ IDNO 22 (CDRl)、 SEQ ID N0:23(CDR2)和SEQ ID NO :24 (CDR3)。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片 段包含小鼠單克隆抗體#47的一個或更多個構架區(FR1-FR4)。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段在人受試者中比小鼠單克隆抗體 #47的免疫原性更低(或更確切地，引起減少的HAMA應答)。測定免疫原性的測定法完全 在本領域技術人員的知識范圍之內。可進行確定免疫應答的本領域公認的方法以在特定受 試者中或在臨床試驗期間監控HAMA應答。可在所述治療的開始時和在整個施用過程中對 施用了解除免疫的抗體的受試者進行免疫原性評估。例如通過使用本領域技術人員已知的 方法(包括表面等離子體共振技術(BIAC0RE)和/或固相ELISA分析)檢測來自受試者的 血清樣品中抗解除免疫的治療劑的抗體來測量HAMA應答。備選地，設計用于測量T細胞活 化事件的體外測定也可顯示免疫原性。例如，一個測定是T細胞增殖測定。在該測定中，就 響應抗體或抗體片段的增殖篩選來自在世界上代表大于80%的HLA-DR等位基因的供體的 PBMC0在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段以為小鼠單克隆抗體#47的結合親 和力的至少80%或至少90%的親和力結合EphB4的細胞外結構域。在另一個實施方案中， 解除免疫的抗體或抗原結合片段以為小鼠單克隆抗體#47的結合親和力的至少100%或更 合適地更大的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。結合親和力的測定完全在本領域技術人員的知識范圍之內。本領域公認的方法包 括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫沉淀(RIP)測定和BIAcore生物傳感器測定。實施 例2更詳細地描述了使用夾心ELISA進行的結合親和力的測定。在另一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含 定義為 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQID NO 4 或 SEQ ID NO 5 的氨基酸 序列，所述輕鏈包含定義為SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的氨基酸序列。在一個實施方案中，重鏈是SEQ ID NO: 3并且輕鏈是SEQ ID NO :7。在一個實 施方案中，重鏈是SEQ ID NO :3并且輕鏈是SEQ ID NO :8。在一個實施方案中，重鏈是SEQ ID NO :4并且輕鏈是SEQ ID NO :7。在一個實施方案中，重鏈是SEQ ID NO :4并且輕鏈是 SEQ ID NO :8。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段結合EphB4的細胞外結 構域。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段對人受試者的免疫原性低于小 鼠單克隆抗體#47。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段包含小鼠單克隆抗體#131的CDR 區。已在US2005/0M9736(其以其全文通過引用合并入本文)中描述和表征了小鼠單克隆 抗體#131。小鼠單克隆抗體#131的重鏈的CDR區定義為SEQ ID NO 25 (CDRl)、SEQ ID NO: 26 (CDR2)和SEQID NO 27 (CDR3)。小鼠單克隆抗體#131的輕鏈的CDR區定義為SEQ IDNO 28(CDR1)、SEQ ID N0:29(CDR2)和 SEQ ID N0:30(CDR3)。在一個方面，解除免疫的抗體或 抗原結合片段包含小鼠單克隆抗體#131的一個或更多個構架區(FR1-FR4)。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段以為小鼠單克隆抗體#131的結合 親和力的至少80%或至少90%的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。在另一個實施 方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段以為小鼠單克隆抗體#131的結合親和力的至少 100%或更合適地更大的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。在一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段在人受試者中比小鼠單克隆抗體 #131的免疫原性更低(或更確切地，引起減少的HAMA應答)。在另一個方面，解除免疫的抗體或抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，所述重鏈含有 定義為 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 14 的 氨基酸序列，所述輕鏈含有定義為SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17或SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在一個實施方案中，重鏈是SEQ ID NO 13并且輕鏈是SEQ IDNO 17。 在一個實施方案中，重鏈是SEQ ID NO: 13并且輕鏈是SEQ IDNO 18。在一個實施方案中， 重鏈是SEQ ID NO :14并且輕鏈是SEQ IDNO 17。在一個實施方案中，重鏈是SEQ ID NO 14 并且輕鏈是SEQ IDNO :18。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段結合EphB4 的細胞外結構域。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段對人受試者的免疫 原性比小鼠單克隆抗體#131的更低。在一些實施方案中，解除免疫的抗體抑制培養的內皮細胞形成管。抑制可通過本 領域技術人員已知的任何方法(包括下列方法)來確定。將基質膠(60 μ 1的10mg/ml ； Collaborative Lab, Cat. No. 35423)置于冰冷的96孔板的各個孔中。讓板在室溫下靜置 15分鐘，然后在37°C下溫育30分鐘以使基質膠聚合。同時，以2xl05個細胞/ml的濃度 在EGM-2(Clonetic，Cat. No. CC3162)中制備人臍靜脈內皮細胞。在相同的培養基中以h 期望的濃度(5個濃度水平)制備解除免疫的抗體或抗原結合片段。將細胞(500 μ 1)和h 抗體(500 μ 1)混合，將200 μ 1該懸浮液以一式兩份置于聚合的基質膠上。在對小時的溫 育后，對于每一個濃度，使用Bioquant Image Analysis系統拍攝一式三份圖象。與未處理 的對照相比較，通過測量形成的束的長度和接點(junction)的數目來估量蛋白質相加作 用(Protein addition effect) (IC50)。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段在體內抑制組織的血管化作 用。抑制可通過本領域技術人員已知的任何方法(包括下列方法)來確定。可在小鼠中將體內血管生成測定為血管從皮下組織至含有解除免疫的抗體或抗原結合片段的基質膠栓內 的生長。基質膠在體溫下快速形成固體凝膠，從而捕獲因子以使能夠緩慢釋放至周圍組織 和延長對周圍組織的暴露。將在4°C以液體形式存在的基質膠(8. 13mg/ml，0.5ml)與內皮 細胞生長添加劑(Endothelial Cell Growth Supplement) (ECGS)、解除免疫的抗體+ECGS 或基質膠+單獨的載體(含有0. 25% BSA的PBQ混合。將基質膠(0. 5ml)沿著腹膜中間 線(peritoneal mid line)注射入雌性nu/nu小鼠(6周齡)的腹部皮下組織內。在第6 天，處死小鼠，回收栓，然后進行處理以進行組織學分析。通常除去覆蓋在上面的皮膚，通過 保留用于支持的腹膜襯里切取凝膠，將其固定在10%的PBS中的緩沖福爾馬林中，然后包 埋在石蠟中。切取3μπι的切片，用H&E或Masson' s三色染色法進行染色，在光學顯微鏡 下進行檢查。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段減少人腫瘤異種移植物在小 鼠中的生長。腫瘤生長的抑制可通過本領域技術人員已知的任何方法(包括實施例中描述 的方法)來確定。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段抑制植入動物的角膜的組織 的血管化作用。抑制可通過本領域技術人員已知的任何方法來確定，所述方法包括按照 由Kenyon等人，1996所述的方法進行的小鼠角膜微囊袋測定法(corneal micropocket assay)。(參見美國申請2005/0M9736，其通過引用合并入本文)。在一些實施方案中，解除免疫的抗體或抗原結合片段促進細胞凋亡。可使用不同 方法包括 TUNEL 染色和 Cell Death Detection ELISAplus 試劑盒(Roche, Piscataway, NJ)來檢查細胞凋亡。在某些方面，本申請提供了雜交瘤細胞系以及由這些雜交瘤細胞系產生的單克隆 抗體。公開的細胞系具有除了用于產生單克隆抗體外的用途。例如，可將細胞系與其他細 胞(例如合適的藥物標記的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠異源骨髓瘤(heteromyeloma) 或人淋巴樣干細胞)融合以產生另外的雜交瘤，從而提供編碼單克隆抗體的基因的轉移。 此外，細胞系可用作編碼抗EphB4免疫球蛋白鏈的核酸的來源，可分離和表達所述核酸(例 如，在使用任何適當的技術(參見例如，Cabi 1 Iy等人，美國專利4，816，567 ；Winter,美國專 利5，225，539)轉移至其他細胞后)。例如，可分離(例如，通過PCR)包含重排的抗EphB4 輕鏈或重鏈的克隆或可從從細胞系分離的mRNA制備cDNA文庫，以及可分離編碼抗EphB4 免疫球蛋白鏈的cDNA克隆。因此，可獲得編碼抗體的重鏈和/或輕鏈或其部分的核酸，并 且按照重組DNA技術將其用于在多種宿主細胞中或在體外翻譯系統中產生特定的免疫球 蛋白、免疫球蛋白鏈或其變體(例如，人源化免疫球蛋白)。例如，可將編碼變體例如人源化 免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的核酸包括cDNA或其衍生物置于合適的原核或真核載體(例 如，表達載體)中，然后通過適當的方法(例如，轉化、轉染、電穿孔、感染)導入合適的宿主 細胞中，以使核酸與一個或更多個表達控制元件有效連接(例如，在載體中或整合入宿主 細胞的基因組)。為了抗體的產生，可在適合于表達的條件下(例如，在誘導劑、補充有適 當的鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑等的合適的培養基存在的情況下)維持宿主細胞， 由此產生編碼的多肽。如果期望，可回收和/或分離(例如，從宿主細胞或培養基)回收編 碼的蛋白質。應當理解，產生的方法包括在轉基因動物的宿主細胞中的表達(參見例如，WO 92/03918，GenPharm hternational，于 1992 年 3 月出版的)。
本抗體和抗原結合片段可用于在體內直接殺死或除去癌細胞。直接殺死包括對需 要此種治療的受試者施用抗體(任選地將其融合至細胞毒性藥物)。在一些實施方案中，癌 癥包括以比可供比較的組織的非癌性細胞高的水平表達EphB4的癌細胞。因為抗體識別癌 細胞上的EphB4，因此破壞抗體所結合的任何此類細胞。在單獨使用抗體殺死或消除癌細 胞的情況下，此類殺死或消除可通過起始內源宿主免疫功能例如⑶C和/或ADCC來完成。 用于確定抗體是否以該方式殺死細胞的測定在本領域技術人員的能力范圍(purview)之 內。因此，在一個實施方案中，本公開內容的抗體可用于遞送多種細胞毒性化合物。可 將任何細胞毒性化合物融合至本抗體。可通過化學或遺傳學方法(例如，通過以單個融合 分子的形式表達)實現該融合。細胞毒性化合物可以是生物學的例如多肽或小分子。如本 領域技術人員將理解的，對于小分子，使用化學融合，而對于生物化合物，可使用化學或遺 傳學融合。細胞毒性化合物的非限定性實例包括治療性藥物、發射放射線的化合物、植物、真 菌或細菌來源的分子、生物蛋白質和其混合物。細胞毒性藥物可以是在細胞內起作用的細 胞毒性藥物例如短程輻射發射源(short-range radiation emitter)，包括例如短程高能 α發射源。酶促活性毒素和其片段以白喉毒素A片段、白喉毒素的非結合活性片段、外毒 素A(來自銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、 蒴蓮根毒素A鏈、α-sacrin、某些油桐蛋白質、某些石竹素蛋白質、美洲商陸蛋白質(PAP， PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑(Morodica charantia inhibitor)、瀉果素、巴豆毒素、石堿 草抑制劑(Saponaria officinalis inhibitor)、白樹毒素、米托胼(mitogillin)、局限曲 菌素、酚霉素和依諾霉素。用于制備免疫毒素的酶促活性多肽的方法描述于W084/03508和 W085/03508中，其通過引用合并入本文。某些細胞毒性部分來源于例如阿霉素、苯丁酸氮 芥、柔紅霉素、氨甲蝶呤、新制癌菌素(neocarzinostatin)和鉬。用于將抗體與細胞毒性劑綴合的方法之前已進行了描述，并且在本領域技術人員 的能力范圍之內。在某些實施方案中，還將抗體或抗原結合片段附著至能夠被檢測的標記物(例 如，標記物可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔助因子)。活性部分可以是放射性 試劑例如放射性重金屬例如鐵螯合物、釓或錳的放射性螯合物、氧、鐵、碳或鎵的正電子發 射體(positronemitter),43K,5￥e,57Co,67Cu,67Ga,68Ga, 1231 , 1251 , 131 1 , 132I ^ 99Tc 等。附著至 這樣的部分的結合劑可用作顯像劑并且以對于在哺乳動物例如人中的診斷用途上是有效 的劑施用，然后檢測顯像劑的定位和累積。顯像劑的定位和累積可通過放射性閃爍顯像術、 核磁共振成像、計算機斷層攝影術(computed tomography)或正電子發射斷層攝影術來檢 測。可使用利用抗EphB4的抗體或其他結合多肽的免疫閃爍成像術來檢測和/或診斷癌癥 和脈管系統。例如，用“锝、111銦、125碘標記的抗EphB4標記的單克隆抗體可有效地用于這 樣的成像。如對于本領域技術人員將是顯然的，待施用的放射性同位素的量取決于放射性 同位素。本領域技術人員可基于給定的用作活性部分的放射性核素的比放射性和能量容易 地配制待施用的顯像劑的量。通常，施用0. 1-100毫居里/劑量的顯像劑或1-10毫居里/ 劑量的顯像劑或2-5毫居里/劑量的顯像劑。因此，公開的組合物用作顯像劑，其包含綴 合至放射性部分的靶向性部分，所述放射性部分包含0. 1-100毫居里，在一些實施方案中1-10毫居里，在一些實施方案中2-5毫居里，在一些實施方案中1-5毫居里。本申請還提供了包含編碼解除免疫的抗EphB4抗體或其片段的核苷酸序列的多 核苷酸。由于遺傳密碼子的簡并性，因此多種核酸序列可編碼每一種抗體氨基酸序列。本 申請還提供了在嚴格或更低的嚴格性雜交條件(例如，如本文中所定義的)下與編碼結合 hEphB4的解除免疫的抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。嚴格雜交條件包括但不限于在大約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與濾 膜結合的DNA雜交，然后在大約50-65°C下在0. 2XSSC/0. 1% SDS中進行一次或更多次清 洗，高度嚴格雜交條件是例如在大約45°C下在6X SSC中與濾膜結合的DNA雜交，然后在 大約60°C下在0. IX SSC/0. 2% SDS中進行一次或更多次清洗，或本領域技術人員已知的 任何其他嚴格雜交條件(參見，例如，Ausubel, F. M.等人.，eds. 1989Current Protocols in Molecular Biology,第 1 卷，Green PublishingAssociates, Inc.a 禾口 John Wiley and Sons, Inc.，NY,在第 6. 3. 1 至 6. 3. 6 和 2. 10. 3 頁)。可通過本領域內已知的任何方法獲得多核苷酸，以及確定多核苷酸的核苷酸 序列。例如，如果抗體的核苷酸序列是已知的，則可從化學合成的寡核苷酸(例如，如 Kutmeier等人，Biokchniques 17:242(1994)中所描述的)裝配編碼抗體的多核苷酸，簡 而言之，這包括合成含有編碼抗體的序列的部分的重疊寡核苷酸，將此類寡核苷酸退火和 連接，然后通過PCR擴增連接的寡核苷酸。在一個實施方案中，所使用的密碼子包含通常用 于人或小鼠的密碼子(參見，例如，Nakamura, Y.，Nucleic AcidsRes. 28 :292(2000)) 編碼抗體的多核苷酸還可從來自適當來源的核酸產生。如果包含編碼特定抗體的 核酸的克隆是不可獲得的，但抗體分子的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可通過 化學方法合成，或通過PCR擴增(使用可與序列的3'和5'末端雜交的合成引物)或使用 寡核苷酸探針(所述探針是用以鑒定例如來自cDNA文庫的編碼抗體的cDNA克隆的特異于 特定基因序列的寡核苷酸探針)通過克隆從適當的來源(例如，從任何表達抗體的組織或 細胞例如選擇用于表達抗體的雜交瘤細胞產生的抗體cDNA文庫或cDNA文庫，或從所述組 織或細胞分離的核酸，優選polyA+RNA)獲得。然后使用本領域內熟知的任何方法將通過 PCR產生的擴增核酸克隆入可復制的克隆性載體。本申請明還提供了編碼本文中描述的抗體的重鏈和輕鏈構架區和CDR的多核苷 酸序列以及用于它們在哺乳動物細胞中有效表達的表達載體。IV.具有改變的效應子功能的抗Eph4B抗體具有基因工程改造的或變異的恒定區或Fc區的抗體可用于調節效應子功能例 如，抗原依賴細胞毒性(ADCC)和補體依賴細胞毒性(CDC)。具有經基因工程改造的或變異 的恒定區或Fc區的此類抗體在例如其中Eph4B在正常組織中表達的情況下是有用的；在這 些情況下不具有效應子功能的解除免疫的抗體和抗原結合片段可引起期望的治療反應而 不損傷正常組織。在另一個實施方案中，給抗體或抗原結合片段提供增強的效應子功能，從 而其可用于直接的細胞殺傷。因此，本公開內容的某些方面和方法涉及具有改變的效應子功能的抗Eph4B抗 體，所述抗體包含一個或更多個氨基酸置換、插入和/或缺失。在某些實施方案中，這樣的 變異的抗Eph4B抗體展示減弱的效應子功能或無效應子功能。具有減弱的效應子功能的抗Eph4B抗體可通過在抗體的某些區域的氨基酸序列中導入其他類型的變化來產生。此類氨基酸序列變化包括但不限于由Bluestone等人描述 的 Ala-Ala 突變。(參見 WO 94/28027 和 WO 98/47531 ；也參見 Xu 等人.2000Cell Immunol 200;16-26)。因此，在某些實施方案中，在恒定區內具有突變(包括Ala-Ala突變)的抗 Eph4B抗體可用于減弱或消除效應子功能。根據此類實施方案，抗Eph4B抗體的恒定區包 含位點234上的至丙氨酸的突變或位點235上的至丙氨酸的突變。此外，恒定區可包含雙突 變位點234上的至丙氨酸的突變和位點235上的至丙氨酸的突變。在一個實施方案中，抗 Eph4B抗體包含IgG4構架區，其中Ala-Ala突變將描述位點234上從苯丙氨酸至丙氨酸的 突變和/或位點235上從亮氨酸至丙氨酸的突變。在另一個實施方案中，抗Eph4B抗體可 包含IgGl構架區，其中Ala-Ala突變將描述位點234上從亮氨酸至丙氨酸的突變和/或位 點235上從亮氨酸至丙氨酸的突變。抗-抗Eph4B抗體可備選地或額外地具有其他突變， 包括CH2結構域中的點突變K322A (Hezareh等人.2001J Virol. 75 :12161-8)。在恒定區 中具有所述突變的抗體還可以是封閉或非封閉抗體。鉸鏈區中的變化也可影響效應子功能。例如，鉸鏈區的缺失可減少對于Fc受體的 親和力和可減弱補體激活(Klein等人.1981Proc NatlAcad Sci U S Α. 78 :524-528)。因 而本公開內容還涉及在鉸鏈區中具有改變的抗體。在特定的實施方案中，可修飾抗Eph4B抗體以增強或抑制補體依賴細胞毒性 (⑶C)。可通過在抗體的Fc區域導入一個或更多個氨基酸置換、插入或缺失來獲得經調 節的⑶C活性(參見，例如，美國專利6，194，551)。備選地或額外地，可在Fc區域導入 半胱氨酸殘基，從而允許在該區域中形成鏈間二硫鍵。所產生的同型二聚體抗體可具有 提高的或減弱的內化(internalization)能力和/或增強的或減弱的補體介導的細胞殺 傷。參見 Caron 等人·，J. Exp Med. 176 :1191-1195(1992)和 Shopes, B. J. Immunol. 148 2918-2922(1992), W099/51642, Duncan&ffinterNature 322:738-40(1988)；美國專利 5, 648, 260 ；美國專利 5，624，821 ；和 W094/29351。還可使用 Wolff 等人.Cancer Research 53 :2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯劑制備具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體 抗體。備選地，可對具有雙重Fc區域的抗體進行基因工程，其從而可具有增強的補體溶血 和 ADCC 能力。參見，Stevenson 等人 Anti-CancerDrug Design 3 :219-230(1989).調節抗體的效應子功能的另一個可能的方法包括糖基化的改變。該主題最近已由 Raju進行了綜述，他概述和提及了人IgG上發現的低聚糖對它們的效應子功能的程度的重 要性(Raju,TS. BioProcess InternationalApril 2003. 44—53)。根據 Wright 禾口 Morrison， 人IgG低聚糖的微觀不均一性可影響生物學功能例如CDC和ADCC、與不同Fc受體的結合 以及與 Clq 蛋白的結合(Wright A. Morrison SL. TIBTECH 1997，15 J6-32)。已充分證 明，取決于產生性細胞和細胞培養條件，抗體的糖基化模式可以不同(Raju，TS. BioProcess International April 2003. 44-5 。此類差異可導致效應子功能和藥物代謝動力學的變 化(Israel 等人.Immunology. 1996 ；89 (4) :573-578 ；Newkirk 等人.P. Clin. Exp. 1996 ； 106(2) :259-64)。效應子功能的差異可能與IgG結合效應細胞上的Fc γ受體(Fe y R)的 能力相關。Siields，等人，已顯示在氨基酸序列中具有變異的IgG (其具有提高的與Fc γ R 的結合)可展示高至100%的增強的使用人效應細胞產生的ADCC(Shields等人.J Biol Chem. 2001276(9) =6591-604)。雖然此類變體包含未在結合界面上發現的氨基酸的變化，但 糖組分的性質以及其結構模式也可促成觀察到的差異。此外，IgG的低聚糖組分中巖藻糖的存在或不存在可提高結合和 ADCC (Shields 等人.J Biol Chem. 2002 ；277 (30) :26733-40)。 缺乏連接至Asn297的巖藻糖基化的碳水化合物的IgG展示正常的與Fc y受體的受體結合。 相反地，與Fc γ RIIA受體的結合提高了 50%并且伴隨增強的ADCC，特別地在更低的抗體濃度上。由Shinkawa，等人進行的工作顯示，在大鼠雜交瘤中產生的抗人IL-5受體的 抗體，當與中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中產生的抗體相比較時，顯示50%以上的更高的 ADCC (Shinkawa 等人.J Biol Chem. 2003278 (5) :；3466_7；3)。單糖組成和低聚糖特征顯示大 鼠雜交瘤產生的IgG具有比CHO產生的蛋白質更低的巖藻糖含量。作者得出IgGl的巖藻 糖基化的缺乏在ADCC活性的增強中具有至關重要的作用。Umana,等人采用不同的方法，他們改變chCE7 (嵌合型IgGl抗成神經細胞瘤抗體) 的糖基化模式(Umana等人.Nat Biotechnol. 1999Feb ；17(2) :176-80)。通過使用四環素， 它們調節對牽涉于ADCC活性的低聚糖的糖基轉移酶(&mll)的活性。親本抗體的ADCC活 性勉強高于本底水平。在不同四環素水平上產生的chCE7的ADCC活性的測量顯示對于最大 的chCE7的體外ADCC活性的&1TIH表達的最佳范圍。該活性與恒定區相關的對切的復合低 聚糖的水平相關。最近最優化的變體展示充分的ADCC活性。類似地，feight和Morrison 在具有糖基化缺陷的CHO細胞系中產生抗體(1994J Exp Med 180 :1087-1096)并且顯示在 該細胞系中產生的抗體不能進行補體介導的細胞裂解。因此所知的影響效應子功能的改 變包括糖基化模式的修飾或糖基化殘基的數目的改變，本公開內容涉及Eph4B抗體，在所 述抗體中使糖基化改變以增強或減弱效應子功能，包括ADCC和⑶C。改變的糖基化包括糖 基化殘基的數目的減少或增加以及糖基化殘基的模式或位置的改變。仍然存在用于改變抗體的效應子功能的其他方法。例如，抗體產生性細胞可以是 高突變的，從而產生在整個抗體分子中具有隨機改變的核苷酸和多肽殘基的抗體(參見WO 2005/01173 。高突變宿主細胞包括在DNA錯配修復上具有缺陷的細胞。以該方式產生的 抗體可具有較小的抗原性和/或具有有益的藥物代謝動力學特性。此外，可就特征例如增 強的或減弱的效應子功能選擇此類抗體。還應理解，效應子功能可根據抗體的結合親和力變化而變化。例如，與具 有相對低的親和力的抗體相比較，具有高親和力的抗體可在激活補體系統中更有效 (Marzocchi-Machado 等人· 1999Immunol Invest 28 :89-101) 因此，可改變抗體以使對于 其抗原的結合親和力減小(例如，通過使用方法例如一個或更多個氨基酸殘基的置換、添 加或缺失改變抗體的可變區)。具有減少的親和力的抗Eph4B抗體可展示減弱的效應子功 能，包括例如減弱的ADCC和/或⑶C。V.產生抗體的方法結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或抗原結合片段可通過本領域技 術人員已知的許多不同方法來產生。在一個實例中，使非人抗EphB4抗體解除免疫以增加 T或B細胞表位的數目或引入調節T細胞表位。可修飾起始非人或親本抗EphB4抗體；例 如，其可以是嵌合型抗體、人源化抗體或靈長源化抗體的任何形式。備選地，在不進行人源 化或靈長源化化(primatization)步驟的情況下，解除起始非人或親本抗EphB4抗體的免 疫原性。非人EphB4抗體
抗EphB4抗體對于本領域技術人員來說是已知的，包括例如美國專利5，635，177 以及美國申請2006/0134118和2005/0M9736中描述的抗體。這些文獻中的每一篇合并入本文。產生新型抗EphB4抗體的方法對于本領域技術人員來說也是已知的。例如，用于 產生特異性結合EphB4多肽的單克隆抗體的方法可包括對小鼠施用一定量的包含有效地 刺激可檢測的免疫應答的EphB4多肽的免疫原性組合物，從小鼠獲得抗體產生性細胞，將 抗體產生性細胞與骨髓瘤細胞融合以獲得抗體產生性雜交瘤，以及檢測抗體產生性雜交瘤 以鑒定產生特異性結合EphB4多肽的單克隆抗體的雜交瘤。當獲得后，在細胞培養中，任選 地在其中雜交瘤來源的細胞產生特異性結合EphB4多肽的單克隆抗體的條件下繁殖雜交 瘤。可從細胞培養物中純化單克隆抗體。此外，用于篩選抗體以鑒定期望的抗體的技術可影響獲得的抗體的性質。用于檢 測抗體抗原相互作用以鑒定特別期望的抗體的多種不同技術是可獲得的。此類技術包括 ELISA、表面等離子體共振結合測定(surface plasmon resonance binding assay)(例如， Biacore 結合測定，Bia-core AB,Uppsala, Sweden)、夾心測定(例如，IGEN International, Inc.，Gaithersburg，Maryland的順磁珠粒系統)、western印跡、免疫沉淀測定和免疫組織 化學。可使用產生或分離具有需要的特異性的抗體的其他合適的方法，包括例如從 文庫中選擇重組抗體的方法或依賴于能夠產生完全的人抗體庫的轉基因動物(例如， 小鼠)的免疫的方法。參見，例如，Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551-2555(1993) Jakobovits 等人，Nature，362 :255-258(1993) ；Lonberg 等人，美國專利 5，545，806 ；Surani 等人，美國專利 5，545，807。可以以許多方法對抗體進行基因工程。可將它們制備為單鏈抗體(包括小型免 疫藥物制劑(small modular immuno pharmaceutical)或 SMIPs )、Fab 和 F(ab，)2 片段 等。抗體可以是人源化抗體、嵌合型抗體、解除免疫的抗體或完全人抗體。許多出版物列出 了許多類型的抗體以及對此類抗體進行基因工程的方法。例如，參見美國專利6，355，245, 6，180，370,5, 693，762,6, 407，213,6, 548，640,5, 565，332,5, 225，539,6, 103，889 和 5，260, 203。本申請提供了能夠結合EphB4受體或其部分的抗原結合片段，包括但不限于Fv、 Fab.Fab'和F(ab' )2片段。此類片段可通過酶促切割或通過重組技術來產生。例如，木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分別產生Fab或F(ab' ) 2片段。還可使用其中已在天然終止 位點上游導入了一個或更多個終止密碼子的抗體基因以多種截斷的形式產生抗體。例如， 可設計編碼F(ab' ) 2重鏈部分的嵌合基因以包括編碼重鏈的CHl結構域和鉸鏈區的DNA 序列。嵌合型抗體還可通過本領域內已知的重組DNA技術產生。例如，用限制性酶降 解編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區的基因以除去編碼鼠Fc的區域， 然后用編碼人Fc恒定區的基因的等價部分替代(參見Robinson等人，國際專利公開 案PCT/US86/02269 ；Akira,等人，歐洲專利申請184，187 ；Taniguchi, M.，歐洲專利申請 171,496 ；Morrison 等人，歐洲專利申請 173，494 ；Neuberger 等人，國際申請 W086/01533 ； Cabilly等人，美國專禾Ij 4,816, 567 ；Cabilly等人，歐洲專利申請125,023 ；Better等人· (1988Science 240 :1041-1043) ；Liu 等人· (1987)PNAS 84 :3439-3443 ；Liu 等人， 1987，J.Immunol. 139 :3521-3526 ；Sun 等人· (1987)PNAS 84 :214-218 ；Nishimura 等人， 1987，Cane. Res. 47 :999-1005 ；Wood 等人· (1985) Nature 314 :446-449 ；和 Shaw 等人， 1988，J. NatlCancer Inst. 80 :1553-1559)。用于人源化抗體的方法已在本領域內進行了描述。在一些實施方案中，人源化抗 體，除了非人CDR外，具有一個或更多個導入的來自為非人來源的氨基酸殘基。可基本上 按照 Winter 和同事的方法(Jones 等人.，Nature，321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人， Nature, 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等人，Science, 239 1534-1536 (1988))，通過用高 變區序列替代人抗體的相應序列來進行人源化。因此，此類“人源化的”抗體是其中用來自 非人物種的相應序列替代絕明顯少于完整人可變區的嵌合型抗體(美國專利4，816，567)。 實際上，人源化抗體通常是其中一些高變區殘基和可能地一些構架區殘基被來自嚙齒類動 物抗體中的類似位點取代的人抗體。屬于Queen等人的美國專利5，693，761公開了對用于人源化抗體的Winter的改 進，該專利基于將親合力的丟失歸因于人源化構架區中結構基序中的問題的前提，所述人 源化構架區中的結構基序，由于立體化學或其他化學不相容性，干擾CDR折疊入小鼠抗體 中發現的能結合構象(binding-capable conformation)。為了解決該問題，Queen教導使用 在線性肽序列上與待人源化的小鼠抗體的構架序列緊密同源的人構架序列。因此，Queen 的方法集中在比較物種之間的構架序列上。通常，將所有可獲得的人可變區序列與特定的 小鼠序列相比較，并且計算相應的構架殘基之間的百分比同一性。選擇具有最高百分比的 人可變區來提供用于人源化方案的構架序列。Queen還教導來自對于在能結合構象中支持 ⑶R是至關重要的小鼠構架的某些氨基酸殘基保留在人源化構架中是非常重要的。根據分 子模型估量可能的臨界狀態(criticality)。保留的候選殘基通常是在線性序列上與CDR 鄰接或在物理上在任何CDR殘基的6埃距離內的殘基。在其他方法中，一旦獲得低親合力人源化結構，通過將單個殘基回復至小鼠序列， 然后如由Riechmarm等人，(1988)所述，測定抗原結合來經驗地確定特定構架氨基酸殘基 的重要性。用于鑒定構架序列中重要的氨基酸的另一個示例性方法由屬于Carter等人的 美國專利5，821，337和由屬于Adair等人的美國專利5，859，205公開。這些參考文獻公開 了構架中特定Kabat殘基的位置，所述位置，在人源化抗體中可能需要用相應的小鼠氨基 酸來置換以保持親合力。人源化抗體的另一種方法，稱為“構架改組”，依賴于用按讀框融合入單個的人種 系構架庫的非人CDR可變區產生組合文庫(Dair Acqua等人，Methods，36 :43(2005))。然 后篩選文庫以鑒定編碼保持良好結合的人源化抗體的克隆。用于產生人源化抗體的的人可變區(輕鏈和重鏈的)的選擇對于減少抗原性是 非常重要的。根據所謂的“最適”方法，針對整個已知的人可變結構域序列文庫篩選嚙齒類 動物抗體的可變區的序列。然后將與嚙齒類動物的序列最接近的人序列接受為用于人源 化抗體的人構架區(framwork 區)(Sims 等人.，J. Immunol.，151 :2296(1993) ；Chothia 等 人.，J. Mol. Biol. ,196 :901 (1987))。另一個方法使用來源于具有特定亞群的輕鏈或重鏈 可變區的所有人抗體的共有序列的特定構架區。相同的構架可用于幾種不同的人源化抗體 (Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 (1992) ；Presta 等人，J. Immunol. , 151 2623(1993))ο用于替代入人可變區的非人殘基的選擇可受許多因素影響。這些因素包括例如氨 基酸在特定位點中的稀有性、與CDR或抗原相互作用的概率以及參與輕鏈和重鏈可變結構 域界面之間的界面的概率。(參見，例如美國專利5，693，761、6，632，927和6，639，055)。分 析這些因素的一個方法是通過使用非人和人源化序列的三維模型。三維免疫球蛋白模型 通常是可獲得的并且對于本領域技術人員來說是很熟悉的。圖解說明和展示選擇的候選免 疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序是可獲得的。這些展示的觀察允許分析 殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如，分析影響候選免疫球蛋白結合其 抗原的能力的殘基。這樣，可選擇非人殘基并且用其替代人可變區殘基以獲得期望的抗體 特征，例如增加的對靶抗原的親和力。免疫解除解除抗EphB4抗體或抗原結合片段的免疫以使其對給定的物種無免疫原性或免 疫原性更小。免疫解除可通過對抗EphB4抗體進行結構改變來實現。在一個實施方案中， 抗EphBr是小鼠單克隆抗體。可使用本領域技術人員已知的任何免疫解除技術。在WO 00/34317(其公開內容以其全文通過引用合并入本文)中描述了例如用于使抗體解除免疫 的一個合適的技術。概括地說，本文中描述的一般方法中的典型方案包括下列步驟。1.確定抗體或其部分的氨基酸序列；2.通過任何方法確定抗體的氨基酸序列中的潛在T細胞表位，包括肽與MHC分子 的結合的確定、肽HLA復合物與來自接受治療性蛋白的物種的T細胞受體的結合的確定， 使用轉基因動物，用接受治療性蛋白的物種的HLA分子檢測抗體或其部分，或檢測用來自 接受治療性蛋白的特種的免疫系統細胞重建的此類轉基因動物；3.通過基因工程或用于產生修飾抗體的其他方法，改變抗體以除去一個或更多個 潛在T細胞表位，從而產生這樣的用于檢測的改變的抗體。在一個實施方案中，可就MHC II類結合基序的存在分析抗體或抗原結合片段的 可變區的序列。例如，可以使用MHC結合基序的數據庫，例如通過在sitewehil. wehi. edu. au上搜索萬維網上的“基序”數據庫來進行比較。備選地，可使用計算機縫合方法例如由 Altuvia等人.(J. Mol. Biol. 249244-250 (1995))設計的方法鑒定AHC II類結合肽，從而就 它們與MHC II類蛋白的結合能檢測來自可變區序列的連續重疊的肽。計算機結合預測算 法包括i^Tope 、!1印itope、SYFPEITHI和MHCpred。為了幫助鑒定MHC II類結合肽，可尋找 與成功呈遞的肽例如兩親性和Rothbard基序相關的相關序列特征和組織蛋白酶B和其他 加工酶的切割位點。在已鑒定了潛在的第二物種(例如人)T細胞表位后，然后通過改變一個或更多個 氨基酸(當需要時)以消除T細胞表位來消除這些表位。通常，這將包括T細胞表位本身 中一個或更多個氨基酸的改變。這可包括改變在蛋白質一級結構上與表位相鄰的氨基酸或 改變在一級結構上不相鄰但在分子的二級結構上鄰近的氨基酸。預期的常見改變將是氨基 酸置換，但可能在某些情況下氨基酸添加或缺失也將是適當的。所有改變可通過重組DNA 技術來實現，這樣可以例如利用已良好建立的方法通過從重組宿主表達來制備終分子，但 也可使用蛋白質化學或任何其他進行分子改變的方法。實際上，已公認，當使用MHC結合基序的數據庫進行比較時，甚至可在人種系可變區的構架序列中鑒定潛在的人T細胞表位。由于人通常不引發抗它們自已的抗體的免疫應 答，因此人對于這些表位是耐受的或這些潛在表位不能被人APC呈遞，因為它們不能被恰 當地加工。因此，種系可變區序列中代表的這樣的潛在T細胞表位實際上可保留在解除免 疫的抗體中。為了在從治療性抗體序列消除潛在的T細胞表位的過程中使額外T細胞表位的 產生降至最少，可通過置換特定的氨基酸來消除T細胞表位，這導致T細胞表位中非人或 親本抗體(通常小鼠)的氨基酸至在位點上相應于人種系氨基酸的位點上的氨基酸的轉 變。Tomlinson, I. A.等人· (1992) J. Mol. Biol. 227 :776-798 ；Cook, G. P.等人· (1995) Immunol. Today 第 16 卷(5) :237-242 ；Chothia, D.等人· (1992) J. Mol. Bio. 227 :799-817 中公開了人種系序列。V BASE目錄提供了人免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄(由 Tomlinson, I. A.等人· MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK 匯編)。在一個方法中，鑒定與非人或親本序列同源的人種系序列。備選地，可鑒定與非人 或親本序列的各構架區(FR1-FR4)同源的人種系序列。在一個方法中，平行地就MHC II類 結合肽分析非人或親本序列以及同源人種系序列。可鑒定其中MHC II類結合特征譜在非 人或親本序列與人種系序列之間相異的區域。可就至相應的人氨基酸的轉變選擇非人或親 本序列的這些區域中的氨基酸。當除去鑒定的T細胞表位后，可再次分析解除免疫的序列以確保未產生新的T細 胞表位并且，如果產生，可如上所述使表位缺失；或通過將非人或親本氨基酸轉變成相應的 人氨基酸來改變之前至相應的人種系氨基酸的轉變，直至所有T細胞表位被消除。并非所有計算機鑒定的T細胞表位都需要去除。本領域技術人員將認識到特定表 位的“強度”或更確切地潛在免疫原性的意義。各種計算機方法產生潛在表位的評分。本 領域技術人員將認識到只有高評分表位才需要除去。本領域技術人員也將認識到在除去潛 在表位與保持原始非人可變區序列之間存在平衡，所述平衡可影響抗原結合。因此，一個策 略是將置換相繼地導入非人或親本抗體，然后就抗原結合和免疫原性對其進行檢測。關于治療性抗體的⑶R，一個或更多個潛在的T細胞表位與⑶R重疊或落入其中是 很普遍的，因此表位的除去需要改變CDR中的殘基。為了消除T細胞針對此類表位的應答 的誘導，可能期望消除這些表位(雖然這可能減小所得抗體的結合親和力)，從而可能需要 就所得的抗原結合的任何改變檢測CDR的任何潛在改變。在一個實施方案中，改變解除免疫的抗體的序列以除去一個或更多個B細胞 表位。為了 除去人 B 細胞表位，可利用 Padlan (Padlan E. A. , MolecularImmunology 28489-498(1991)和 EP-A-0519596)的“鑲飾(veneering) ” 或“表面重建”方法。在鑲飾 非人抗原結合部位中存在兩個一般步驟。開始時，將目的抗體分子的可變區的構架區與可 獲得的人可變區數據庫的相應構架區序列相比較。然后將最同源的人可變區逐個殘基地與 相應的非人氨基酸相比較。使用本領域內熟知的重組技術用存在于人部分的殘基置換非人 構架區中與人對應物(counterpart)不同的殘基。使用至少部分暴露(溶劑可及的)的部 分進行殘基轉換，并且在可對可變區結構域的三級結構具有重大影響的氨基酸殘基例如脯 氨酸、甘氨酸和帶電荷的氨基酸的置換中要特別小心。外部殘基的置換通常對內部結構域 或對結構域間接觸具有極小的影響或沒有影響。(參見，例如，美國專利6，797，492)。通過這種方式，從而設計所得的“鑲飾的”非人抗原結合部位以使之保留非人CDR殘基、十分鄰近CDR的殘基、鑒定為隱蔽或基本上隱蔽(溶劑不可及的)的殘基、據信參與 重鏈和輕鏈結構域之間非共價(例如，靜電和疏水)接觸的殘基以及來自構架區的保守結 構區的據信影響⑶R環的“經典(canonical)”三級結構的殘基。然后將這些設計標準用于 制備將非人抗原結合部位的重鏈和輕鏈的CDR組合入存在人類中(human-appearing)的構 架區的重組核苷酸序列，所述序列可用于轉染哺乳動物細胞以表達展示非人抗體分子的抗 原特異性的重組人抗體。在一個實施方案中，將調節T細胞表位導入抗體或抗原結合片段。 W006/082406(其通過引用合并入本文)描述了產生抗體的方法，在所述方法中，修飾抗體 的可變區以導入調控T細胞表位，所述表位反過來刺激CD4+CD25+T細胞并且誘導抑制性 細胞因子的分泌，從而減少免疫原性(參見，例如，Praliken BJ，等人.Proc Natl Acad Sci USA 94 :3284-3289(1997)。抗體或抗原結合片段的構建一般說來，使用遺傳工程技術中所使用的公認的操作來實現本文中公開的抗體的 構建。例如，用于分離DNA、制備和選擇用于表達DNA的載體、純化和分析核酸的技術，用于 制備重組載體DNA(例如PCR)、用限制性內切酶切割DNA、連接DNA、通過穩定或瞬時方法將 DNA(包括載體DNA)導入宿主細胞、在選擇或非選擇培養基中培養宿主細胞以選擇和維持 表達DNA的細胞的方法在本領域內通常是已知的。可使用合成和/或重組核酸制備編碼期望的解除免疫的鏈的基因(例如，cDNA)來 產生此類解除免疫的免疫球蛋白。例如，可使用PCR誘變方法改變編碼解除免疫的鏈的DNA 序列例如來自之前人源化的可變區的DNA模板來構建編碼解除免疫的可變區的核酸(例 如，DNA)序列(參見，例如 Kamman，M.，等人，Nucl. Acids Res.，17 :5404 (1989)) ；Sato, K., 等人，Cancer Research, 53 :851-856 (1993) ；Daugherty, B. L.等人，Nucleic Acids Res., 19(9) :2471-2476(1991)；和 Lewis，A. P.和 J. S. Crowe，Gene，101 :297-302 (1991))。通過 使用此類或其他合適的方法，還可容易地產生變體。在一個實施方案中，可誘變克隆的可 變區，然后可選擇(例如，從噬菌體文庫；參見，例如，Krebber等人，美國專利5，514，548 ； Hoogenboom等人，WO 93/06213，1993年4月1日出版的))編碼具有期望的特異性的變體 的序列。幾個可能的載體系統可獲得用于在哺乳動物細胞中表達克隆的重鏈和輕鏈基 因。一類載體依賴于期望的基因序列至宿主基細胞基因組中的整合。通過同時導入藥 物抗性基因例如大腸桿菌(E. coli)gpt (Mulligan，R. C.和 Berg，P.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 78 :2072 (1981))或 Tn5neo (Southern, P. J.禾口 Berg，P.，J. Mol. App 1. Genet.， 1 :327(1982))選擇具有穩定地整合的DNA的細胞。可將選擇標記基因連接至待表達的DNA 序列或通過共轉染將其導入相同的細胞(Wigler,M.等人，Cell，16:77(1979))。第二類載 體利用賦予染色體外質粒自主復制能力的DNA元件。此類載體來源于動物病毒例如牛乳 頭瘤病毒(bovine papillomavirus) (Sarver, N.等人· , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79 7147(1982))、多瘤病毒(Deans, R. J.等人· , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,81 :1292(1984)) 或 SV40 病毒(Lusky, Μ. and Botchan, Μ.，Nature, 293 :79 (1981))。因為免疫球蛋白cDNA只由代表編碼抗體的成熟mRNA的序列組成，因此需要調控 基因的轉錄和RNA的加工的額外的基因表達元件來分析免疫球蛋白mRNA。這些元件可包括剪接信號、轉錄啟動子，包括誘導型啟動子增強子和終止信號。整合此類元件的cDNA表達 載體包括由 Okayama, H.和 Berg, P.，Mol. Cell Biol.，3 :280(1983) ；C印ko，C. L.等人·， Cell,37 :1053(1984)；和 Kaufman，R. J. , Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA, 82 :689(1985)描述的載體。任選地可將可變序列融合至人恒定區，例如，人IgGl或κ恒定區。可將重組解除 免疫的抗體或抗原結合片段轉染入用于表達的合適的宿主細胞例如NSO或CHO細胞以產生 完全重組抗體。VI.診斷應用抗體和抗原結合片段用于多種應用，包括研究、診斷和治療性應用。例如，它們可 用于分離和/或純化受體或其部分，以及用于研究受體結構(例如，構象)和功能。在某些方面，公開的不同抗體可用于檢測和測量EphB4受體例如在內皮細胞(例 如，靜脈內皮細胞)或在用EphB4受體基因轉染的細胞上的表達。因此，它們還用于應用例 如用于診斷或研究目的細胞分選和成像(例如，流式細胞術和熒光激活細胞分選術)。在某些實施方案中，可就診斷目的標記或不標記抗體或抗原結合片段。通常，診斷 測定使得必需檢測由于抗體與EphB4的結合而引起的復合物的形成。可直接標記抗體。可 使用多種標記物，包括但不限于放射性核素、熒光劑、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑和 配體(例如，生物素、半抗原)。許多合適的免疫測定法對于本領域技術人員來說是已知的 (參見，例如，美國專利3，817，827,3, 850，752,3, 901，654和4，098，876)。當未標記時，抗 體可用于測定，例如凝集試驗。還可將未標記的抗體與另一種(一種或更多種)可用于檢 測抗體的適當的試劑例如與一抗(例如，對于未標記的免疫球蛋白是特異性的抗獨特型抗 體或其他抗體)反應的標記抗體(例如，二抗)或其他適當的試劑(例如，標記A蛋白)一 起使用。在一個實施方案中，抗體和抗體片段可用于酶免疫測定，其中將受試抗體或二抗 綴合至酶。當將包含EphB4蛋白的生物樣品與受試抗體組合時，在抗體與EphB4蛋白之間發 生結合。在一個實施方案中，將包含表達EphB4蛋白的細胞(例如，內皮細胞)的樣品與受 試抗體組合時，在抗體與具有含有被抗體識別的表位的EphB4蛋白的細胞之間發生結合。 可將此類結合細胞與未結合的試劑分離，并且可以例如通過將樣品與酶的底物(所述底物 當通過酶作用時產生顏色或其他可檢測變化)接觸來確定與細胞特異性結合的抗體-酶綴 合物的存在。在另一個實施方案中，可以不標記受試抗體，以及可加入識別受試抗體的第二 標記抗體。在某些方面，還可制備用于檢測EphB4蛋白在生物樣品中的存在的試劑盒。此類 試劑盒將包括結合EphB4蛋白或所述受體的部分的抗體以及一種或更多種適用于檢測抗 體與EphB4或其部分之間的復合物的存在的輔助試劑(ancillary reagent)可以以凍干的 形式單獨地或與另外的特異于其他表位的抗體組合來提供公開的抗體組合物。可將可以是 標記的或未標記的抗體與輔助成分(adjunct ingredient)(例如，緩沖液，例如Tris、磷酸 鹽和碳酸鹽、穩定劑、賦形劑、殺生物劑(biocide)和/或惰性蛋白質例如牛血清白蛋白) 一起包括在試劑盒中。例如，可將抗體與輔助成分以凍干的混合物形式提供，或可分開提供 輔助成分以待用戶組合。通常這些輔助材料將以低于大約5%的基于活性抗體的量的重量 存在，通常將以至少大約0. 001 %的基于抗體濃度的重量的總量存在。在使用能夠結合單克隆抗體的二抗的情況下，可以將這樣的抗體例如在分開的小瓶或容器中提供于試劑盒中。 通常標記第二抗體(如果存在的話)，并且可以以與上文所述的抗體制劑類似的方式配制其。類似地，抗體或抗原結合片段可用于檢測和/或定量EphB4或受體的部分在細胞 中的表達的方法，其中將包含細胞或其級分(例如，膜級分)的組合物與抗體接觸，所述抗 體在適合于抗體與EphB4或受體的部分結合的條件下與EphB4或受體的部分結合，并且監 控抗體結合。指示抗體與EphB4或其部分之間的復合物的形成的抗體的檢測表示受體的存 在。可通過標準方法例如工作實施例中描述的方法測定抗體與細胞的結合。方法可用于檢 測EphB4在來自個體的細胞上的表達。任選地，可以例如通過流式細胞術估計內皮細胞表 面上EphB4的定量表達，并且可使染色強度與疾病易感性、進展或風險發生關系。抗體或抗原結合片段還可用于檢測哺乳動物對某些疾病的易感性的方法。為了 舉例說明，方法可用于檢測哺乳動物對其進展基于細胞上存在的EphB4的量和/或哺乳動 物中EphB4陽性細胞的數目的疾病的易感性。在一個實施方案中，本申請提供了檢測哺乳 動物對腫瘤的易感性的方法。在該實施方案中，將待檢測的樣品與抗體接觸，所述抗體在適 合于所述抗體與EphB4或其部分結合的條件下與其結合，其中樣品包含在正常個體中表達 EphB4的細胞。檢測抗體的結合和/或結合的量，所述結合和/或結合的量顯示個體對腫瘤 的易感性，其中更高的受體水平與增加的個體對腫瘤的易感性相關。本申請者和其他小組 已發現EphB4的表達與腫瘤生長和進展相關。還可將公開的抗體用于進一步闡明EphB4表 達與個體中血管生成相關疾病的進展的相關性。IIV.治療應用在某些實施方案中，本申請提供了抑制血管生成的方法和治療血管生成相關疾病 的方法。在一些實施方案中，本申請提供了用于促進細胞凋亡的方法。在其他實施方案中， 本申請提供了抑制或減少腫瘤生長的方法和治療患有癌癥的個體的方法。這些方法包括對 個體施用治療有效量的上文所述的解除免疫的抗體或抗原結合片段。此類方法的目標特別 是針對動物，更特別地針對人的治療性和預防性治療。在一個實施方案中，當對人受試者施 用時，用于本方法的抗體或抗原結合片段比小鼠單克隆抗體#47的免疫原性更低。在另一 個實施方案中，用于本方法的抗體或抗原結合片段，當對人受試者施用時，比小鼠單克隆抗 體#131的免疫原性更低。本申請還提供了用于治療血管生成相關疾病的藥物組合物。在一些實施方案中， 藥物組合物包含本文中描述的抗體或抗原結合片段和可接受的藥物載體。本申請提供了促進細胞凋亡的方法，其包括將細胞與有效量的解除免疫的抗體或 抗原結合片段接觸。在一些實施方案中，細胞是內皮細胞。本申請提供了抑制血管生成的方法，其包括將內皮細胞與有效量的解除免疫的抗 體或抗原結合片段接觸。在某些實施方案中，所述血管生成由癌細胞誘導。可將抗體或抗 原結合片段在體外、離體地或在體內(例如，在受試者中)與內皮細胞接觸。在另一個實施 方案中，抗體抑制癌細胞的血管生成例如至少10%、至少25%、至少50%、至少75%或至少 90%。可通過本領域內已知的基于體外細胞的測定例如內皮細胞管形成測定或本領域內已 知的體內動物模型測定來檢查血管生成的抑制。如本文中所述，血管生成相關疾病包括但不限于血管生成依賴性癌癥，包括例如實體瘤、血液傳播瘤(blood born tumor)例如白血病，和瘤轉移；良性腫瘤，例如血管瘤、聽 神經瘤、神經纖維瘤、沙眼和膿性肉芽腫；炎性病癥例如免疫和非免疫炎癥；慢性關節風濕 病和銀屑病；眼新生血管性疾病(ocular angiogenic disease)例如糖尿病性視網膜病、 早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶狀體后纖維組織增生 癥(retrolental fibroplasia)、發紅；Osier-Webber綜合征；心肌血管新生、斑塊新生血 管形成、毛細血管擴張、血友病關節、血管纖維瘤；和創傷肉芽形成和創傷愈合、毛細血管擴 張銀屑病硬皮癥、膿性肉芽腫、冠狀動脈側枝、肢端缺血血管再生、角膜疾病、發紅、關節炎、 糖尿病新生血管化、骨折、血管生成和造血作用。應理解，公開的方法和組合物還用于治療任何不依賴于血管生成的癌癥(腫瘤)。 如本文中所使用的，術語“不依賴于血管生成的癌癥”是指其中腫瘤組織中不存在或存在極 少的新生血管形成的癌癥(腫瘤)。特別地，公開的抗體治療劑用于治療或預防癌癥(腫瘤)，包括但不限于結腸癌、 乳腺癌、間皮瘤、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck) (HNSCC)、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病。本申請提供了抑制受試者中癌細胞的生長的方法，包括將有效量的解除免疫的抗 體或抗原結合片段施用入受試者。調節可減少或防止所述受試者的癌細胞的生長例如至 少10 %、至少25 %、至少50 %、至少75 %或至少90 %。作為結果，在癌細胞是實體瘤的情況 下，調節可減少實體瘤的大小至少10%、至少25%、至少50%、至少75%或至少90%。癌細胞增殖的抑制可通過基于細胞的測定例如溴脫氧尿苷(BRDU)摻入(Hoshino 等人，Int. J. Cancer 38,369(1986) ；Campana 等人，J. Immunol. Meth. 107 :79(1988))； [3H]-胸苷摻入(Chen，J.，0ncogenel3 :1395-403(1996) Jeoung, J.，J. Biol. Chem. 270 18367-73(1995)；染料阿爾瑪藍(可從 Biosource hternational 獲得)(Voytik-Harbin 等人，In VitroCell Dev Biol Anim 34 =239-46(1998))來測量。通過在軟瓊脂中進行的 集落形成，例如通過計數在軟瓊脂上面形成的癌細胞集落的數目(參見實施例和Sambrook 等人，Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989)來估量癌細胞的非停泊性生長 (anchorage independent growth)。受試者中癌細胞生長的抑制可通過監控受試者中例如動物模型或人受試者中 癌細胞生長來估量。一個示例性監控方法是腫瘤發生能力的測定。在一個實例中，異種 移植物包含來自預先存在的腫瘤或來自腫瘤細胞系的人細胞。腫瘤異種移植物測定在 本領域內是已知的并且在本文中進行了描述(參見，例如，Ogawa等人，Oncogene 19: 6043-6052(2000))。在另一個實施方案中，使用中空纖維測定法監控腫瘤發生能力，該方法 描述于美國專利5，698，413，其以其全文通過引用合并入本文。通過將在調節劑處理的條件下的癌細胞增殖、非停泊性生長或癌細胞生長與在陰 性對照條件(通常在調節劑處理不存在的情況下)下的相比較來計算抑制百分比。例如，在 癌細胞或癌細胞集落(集落形成測定)的數目或PRDU或[3H]-胸苷摻入是A (在調節劑處 理的條件下)和C(在陰性對照條件下)的情況下，抑制百分比可以是(C-A)/C乘以100%。在此類方法的某些實施方案中，可將一種或更多種抗體治療劑一起(同時)或在 不同的時間(相繼)施用。此外，可將抗體治療劑與另一種類型的用于治療癌癥或抑制血 管發生的化合物一起施用。
在某些實施方案中，可單獨使用公開的受試方法。備選地，可將受試方法與用于治 療或預防增殖病癥(例如，腫瘤)的其他常規抗癌療法結合使用。例如，此類方法可用于預 防性癌癥預防、癌癥復發和手術后的轉移的預防，以及用作其他常規癌癥療法的輔助療法。 本申請承認可通過使用抗體或抗原結合片段增強常規癌癥療法(例如，化學療法、放射療 法、光線療法、免疫療法和手術)的功效。已顯示許多常規化合物具有抗腫瘤活性。此類化合物已在化學治療中用作縮小實 體瘤、防止轉移和進一步生長或減少白血病或骨髓惡性腫瘤中惡性細胞的數目的藥劑。雖 然化學療法在治療各種類型的惡性腫瘤中是有效的，但許多抗腫瘤化合物誘導不期望的副 作用。已顯示，當組合兩種或更多種不同治療時，治療可協同作用并且可使減少每一種治療 的劑量，從而減小由各化合物在更高劑量上產生的有害副作用。在其他情況下，難以治療的 惡性腫瘤可對兩種或更多種不同治療的組合作出反應。當將本文中公開的抗體或抗原結合片段與另一種常規抗腫瘤劑同時或相繼地組 合施用時，此類抗體或抗原結合片段可增強抗腫瘤劑的治療效果或克服對該抗腫瘤劑的細 胞抗性。這使得能夠減少抗腫瘤劑的劑量，從而減小不期望的副作用，或恢復抗腫瘤劑在抗 性細胞中的功效。可用于組合抗腫瘤療法的藥物化合物包括(只用于舉例說明)氨魯米特、安丫 啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、beg、比卡魯胺、博來霉素、乙基酰胺、白消安、喜樹堿、卡培他濱、 卡鉬(carboplatin)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、秋水仙素、環磷酰 胺、去乙酰環丙氯地孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、雙烯雌酚、己烯雌酚、 多烯紫杉醇、阿霉素、表柔比星、雌二醇、磷雌氮芥、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟達拉 濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、金雀異黃酮、戈舍瑞林、羥基脲、伊 達比星、異磷酰胺、伊馬替尼、干擾素、依立替康、伊立替康、來曲唑、甲酰四氫葉酸、醋酸亮 丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、安宮黃體酮、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、甲氨 蝶呤、絲裂霉素C、米托坦、鹽酸米托蒽醌、尼魯米特、諾考達唑、奧曲肽、奧沙利鉬、紫杉醇、 氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、普卡霉素、嚇菲爾鈉、甲基芐胼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈脲佐 菌素、蘇拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪酮、硫鳥嘌呤、塞替派、二氯二茂鈦、拓撲替 康、曲妥珠單抗、維甲酸、長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。此類化學治療抗腫瘤化合物可根據它們的作用機制分類為例如下列類型抗代 謝產物/抗癌劑例如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脫氧核苷、卡培他濱、吉西他濱和 阿糖胞苷)和嘌呤類似物、葉酸拮抗劑和相關抑制劑(巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁和 2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱))；抗增殖/抗有絲分裂劑，包括天然產物例如長春花生物堿(長 春堿、長春新堿和長春瑞濱)、微管干擾劑(microtubule disruptor)例如紫杉烷(紫杉醇、 多烯紫杉醇、長春新堿、長春堿、諾考達唑、埃博霉素和諾維本、印idipodophyllotoxins (依 托泊苷、替尼泊苷)，DNA損傷劑(放線菌素、安吖啶、蒽環類藥、博來霉素、白消安、喜樹堿、 卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬、環磷酰胺、環磷酰胺、放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、表柔比星、 六甲基三聚氰胺奧沙利鉬、異環磷酰胺、美法侖、merchlorehtamine、絲裂霉素C、鹽酸米 托蒽醌、亞硝基脲、普卡霉素、鹽酸甲基芐胼、泰素、泰素帝、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷酰 胺和依托泊苷(VP16))；抗生素例如放線菌素(放線菌素D)、柔紅霉素、阿霉素(阿霉素 (adriamycin))、依達比星、蒽環類藥、鹽酸米托蒽醌、博萊霉素、普卡霉素(光神霉素)和絲裂霉素C ；酶(全身性引起L-天冬酰胺代謝并且剝奪不具有合成它們自身的天冬酰胺的能 力的細胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑例如氮芥(雙氯乙 基甲胺(mechlorethamine)、環磷酰胺和類似物、美法侖、苯丁酸氮芥、乙撐亞胺和甲基三聚 氰胺(六甲密胺和噻替派)、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝基脲(卡莫司汀BCNU)和類似物，鏈 脲佐菌素、trazenes-dacarbazinine (DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物例如葉酸類似 物(氨甲蝶呤)；鉬配位絡合物(順鉬、卡鉬、甲基芐胼、羥基脲、米托坦、氨魯米特；激素、激 素類似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳香酶抑制劑(來曲唑、 阿那曲唑)；抗凝血劑(肝素、合成肝素鹽(synthetich印arin salt)和凝血酶的其他抑制 劑)；纖維蛋白溶解劑(例如組織纖維蛋白溶酶原激活物、溶栓霉和尿激酶、阿司匹林、雙嘧 達莫、氯芐噻唑啶、氯吡格雷、阿昔單抗；抑制遷移劑(antimigratory agent)；抑制分泌劑 (antisecretory agent) (breveldin)，免疫抑制劑(環孢霉素A、他克莫司(Π(-506)、西羅 莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯；抗血管生成化合物(ΤΝΡ-470，染料木黃酮)和生長 因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、成纖維細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管 緊張素體阻斷劑(angiotensin receptor blocker)；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體 (曲妥單抗)；細胞周期抑制劑和分化誘導劑(維甲酸)；mTOR抑制劑、拓撲異構酶抑制劑 (阿霉素(adriamycin)、安吖啶、喜樹堿、柔紅霉素、放線菌素、去羥桅子苷、表柔比星、依 托泊苷、依達比星和鹽酸米托蒽醌、拓撲替康、伊立替康、皮質激素(可的松、地塞米松、氫 化可的松、甲基強的松龍、潑尼松和潑尼松龍)；生長因子信號轉導激酶抑制劑；線粒體機 能障礙誘導劑和半胱天冬酶(caspase)激活物；和染色質干擾劑(chromatin disrupter)。在某些實施方案中，可用于組合抗血管生成療法的藥物化合物包括(1) “血管 生成分子”例如bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)的釋放抑制劑；( 血管生成分子的中 和劑例如抗^bFGF抗體；和(3)內皮細胞對血管生成刺激物的應答的抑制劑，包括膠原 酶抑制劑、基底膜周轉抑制劑(basement membrane turnover inhibitor)、血管生成抑制 甾醇(Angiostatic steroids)、真菌來源的血管生成抑制劑、血小板因子4、血小板反應蛋 白(thrombospondin)、關節炎藥物例如D-青霉胺和硫代硫酸金(gold thiomalate)、維生 素D3類似物、α干擾素等。關于另外提及的血管生成的抑制劑，參見，Blood等人，Bioch. Biophys. Acta.，1032 :89-118 (1990)，Moses 等人，Science, 248 :1408-1410(1990)，Ingber 等人，Lab. Invest. ,59 :44-51 (1988)，和美國專利 5, 092, 885,5, 112, 946,5, 192，744、 5，202，352和6573256。此外，存在可用于抑制血管生成的多種化合物例如阻斷VEGF介導 的血管生成途徑的肽或試劑、內皮他丁蛋白或衍生物、血管他丁的賴氨酸結合片段、黑色素 或促黑色素化合物、血纖蛋白溶酶原(例如，血纖蛋白溶酶原的Kringles 1_3)、肌鈣蛋白 亞基、玻連蛋白αν β 3的拮抗劑、來源于Saposin B的肽、抗生素或類似物(例如，四環素 或新霉素)、含有地諾孕素的組合物、含有偶聯至肽的MetAP-2抑制性核心的化合物、化合 物EM-138、查耳酮(chalcone)和其類似物以及二肽酶抑制劑(naaladase inhibitor)。參 見，例如，美國專利 6，395，718,6, 462，075,6, 465，431,6, 475，784,6, 482，802,6, 482，810、 6，500，431,6，500，924,6，518，298,6，521，439,6，525，019,6，538，103,6，544，758, 6，544，947,6, 548，477,6, 559，126 和 6，569，845。取決于組合療法的性質，在施用其他療法的同時和/或之后，可繼續施用EphB4解 除免疫的抗體或抗原結合片段。可以以單個劑量或更多個劑量進行EphB4解除免疫的抗體或抗原結合片段的施用。在一些情況下，在常規療法之前至少7天開始EphB4解除免疫的 抗體或抗原結合片段的施用，然而在其他情況下，在即將施用常規療法之前或同時開始施用。VIII.施用和配制的模式在某些實施方案中，用藥學可接受的載體配制EphB4解除免疫的抗體或抗原結合 片段。可單獨或作為藥物制劑(組合物)的成分施用此類抗體或抗原結合片段。可以以用 于人或獸醫藥劑的任何常規方法配制用于施用的抗體或抗原結合片段。濕潤劑、乳化劑和 潤滑劑例如硫酸月桂酯鈉和硬脂酸鎂以及著色劑、釋放劑、包衣衣料、甜味劑、調味劑和芳 香劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。EphB4解除免疫的抗體或抗原結合片段的制劑包括適合于口服/經鼻、局部、胃腸 外、直腸和/或陰道內施用的制劑。制劑可以常規地以單位劑型的形式存在，以及可通過藥 學領域內熟知的任何方法來制備。可與載體材料組合以產生單個劑型的活性成分的量可視 治療的宿主，特別地施用模式而變化。可與載體材料組合以產生單個劑型的活性成分的量 通常是產生治療效果的化合物的量。在某些實施方案中，制備此類制劑或組合物的方法包括將另一種類型的抗腫瘤或 抗血管生成治療劑和載體以及任選地，一種或更多種輔助成分組合。一般而言，可用液體載 體或固體載體粉末或兩者制備制劑，然后如果需要，為產物塑形。用于口服施用的制劑可以以膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用有味道的基 質，通常蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠(tragacanth))、粉劑、粒劑的形式存在或以水性或非水 性液體中的溶液或懸浮液的形式存在，或以水包油或油包水液體乳劑的形式存在，或以酏 劑或糖漿劑的形式存在，或以錠劑(使用惰性基質例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)和/ 或口腔洗劑等的形式存在，各自包含預先確定量的EphB4解除免疫的抗體或抗原結合片段 作為活性成分。在用于口服施用的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、錠劑、粉劑、粒劑等)中，可將 一種或更多種EphB4解除免疫的抗體或抗原結合片段與一種或更多種藥學上可接受的載 體例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或任何下列物質混合(1)充填劑或增充劑例如淀粉、乳 糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯 吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；⑶濕潤劑例如甘油；⑷崩解劑例如瓊脂、碳酸鈣、馬 鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；( 溶液阻滯劑例如石蠟；(6)吸收促進 劑(absorption accelerator)例如季胺類化合物；(7)濕潤劑例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油 酯；(8)吸收劑例如高嶺土和膨潤土粘土； (9)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體 聚乙二醇、月桂基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)和其混合物；和(10)著色劑。在膠囊 劑、片劑和丸劑的情況下，藥學上可接受的組合物還可包含緩沖劑。相似類型的固體組合 物還可用作軟填充膠囊和硬填充膠囊的填充劑，所述膠囊使用這樣的賦形劑如乳糖或奶糖 (milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等。用于口服施用的液體劑型包括藥學可接受的乳劑、微乳劑、溶液、混懸液、糖漿劑 和酏劑。除了活性成分以外，液體劑型可包含本領域內常用的惰性稀釋劑例如水或其他溶 劑、增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、 1，3_ 丁烯醇、油(特別地棉籽油、落花生油、玉米油、胚油、橄體油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀釋劑外，口服 組合物還可包含佐劑例如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調味料、著色劑、香味劑和防腐 劑。除了活性化合物以外，懸浮液可包含懸浮劑例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山 梨醇(polyoxyethylene sorbitol)和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤土、瓊脂和黃芪膠和其混合物。特別地，可對皮膚或對粘膜例如子宮頸和陰道上的粘膜局部施用公開的方法。這 為在誘導副作用的可能性最小的情況下直接遞送至腫瘤提供了最大的可能性。局部制劑還 可包含已知作為有效的皮膚或角質層穿透促進劑的許多試劑中的一種或更多種試劑。此類 試劑的實例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲乙酰胺、二甲基酰胺、丙二醇、甲醇 或異丙醇、二甲基亞砜和氮酮(azone)。還可包含另外的試劑以配制化妝上可接受的制劑。 此類試劑的實例是脂肪、蠟、油、染料、香料(fragrance)、防腐劑、穩定劑和表面活性劑。還 可包含角質層分離劑例如本領域內已知的角質層分離劑。實例是水楊酸和硫磺。用于局部或經皮膚施用的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶 液、patches和吸入劑。將EphB4解除免疫的抗體或抗原結合片段與藥學上可接受的載體， 以及與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或噴射劑在無菌條件下混合。除了受試多肽試劑外， 軟膏、糊劑、乳膏和凝膠還可包含賦形劑例如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、 纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅或其混合物。粉劑和噴霧劑可包含，除了受試多肽治療劑外，賦形劑例如乳糖、滑石、硅酸、氫氧 化鋁、硅酸鈣和聚酰胺或此類物質的混合物。噴霧劑可額外地包含常規噴射劑例如氯氟烴 和揮發性未取代烴例如丁烷和丙烷。適合于胃腸外施用的藥物組合物可包含一種或更多種EphB4解除免疫的抗體和 抗原結合片段與一種或更多種藥學上可接受的無菌等滲水性或非水性溶液、分散體、懸浮 液或乳劑或可在即將使用前可重建成無菌注射液或懸浮液的無菌粉劑組合，其可包含抗氧 化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與期望的受者的血液等滲的溶質或懸浮劑或增稠劑。可用于 公開的藥物組合物的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙 二醇、聚乙二醇等)和其適當的混合物、植物油例如橄欖油和可注射有機酯例如油酸乙酯。 可以例如通過使用包衣材料例如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需顆粒大小以通過 使用表面活性劑來保持適當的流動性。此類組合物還可包含佐劑例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可通過包含各種 抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸酚(phenol sorbic acid)等來確 保免受微生物的作用。還可期望在組合物中包含等滲劑例如糖、氯化鈣等。此外，可注射藥 物形式的延長的吸收可通過包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來產生。通過在生物可降解的聚合物例如聚乳酸-乙醇酸交酯 (polylactide-polyglycolide)中形成一種或更多種EphB4解除免疫的抗體和抗原結合片 段的微囊化基質來制備可注射depot形式。取決于藥物對聚合物的比例以及使用的特定聚 合物的性質，可控制藥物釋放的速度。其他生物可降解的聚合物的實例包括多正酯類和聚 酐。還可通過將藥物俘獲在與身體組織相容的脂質體或微乳劑中來制備Depot可注射制 劑。
用于陰道內或直腸施用的制劑可以以栓劑的形式存在，其可通過將一種或更多種 公開的化合物與一種或更多種合適的無刺激性賦形劑或載體(包含例如可可脂、聚乙二 醇、栓劑蠟(suppository wax)或水楊酸酯)混合來制備，并且其在室溫下是固體，但在體 溫下是液體，從而將在直腸或鞘膜腔熔化，并且釋放活性化合物。適合使用的藥物組合物包括其中以有效地實現它們的期望的目的的量包含一種 或更多種EphB4解除免疫的抗體和抗原結合片段的組合物。更特別地，治療有效量是指有 效地預防、減輕或改善疾病的癥狀或延長正在治療的受試者的存活時間的抗體的量。特別 地根據本文中提供的詳細公開內容，治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力之 內。治療有效量可通過使用體外和體內方法來確定。
實施例實施例1 解除免疫的抗體的產生如美國申請2005/0M9736中所述制備小鼠單克隆抗體#47和#131。簡而言之，在 小鼠中產生抗EphB4的細胞外結構域(EOT)的抗EphB4單克隆抗體。將EphB4的E⑶克隆 入pGEX-4T-l以產生GST-融合ECD (GST-ECD)。通過親和層析純化在BL21大腸桿菌中表達 為GST融合蛋白的EphB4E⑶，并且用凝血酶切割GST結構域。通過標準方案產生單克隆抗 體并且通過A蛋白層析從雜交瘤上清液純化所述抗體。使用用EphB4穩定地轉染的293細 胞的全細胞裂解物，通過Western印跡再次確認抗體的靈敏性和特異性。在序列表中提供 了 #47和#131的序列。使用Swiss Pdb產生鼠序列的結構模型以鑒定參與抗原結合親和力的氨基酸。只 鑒定 Kabat 和 Chothia CDR。然后在芯片上分析鼠序列以鑒定MHC II類結合表位。平行地，就各單個的鼠構架 區鑒定最接近的人種系抗體。通過在鼠序列中進行置換消除潛在表位。從同源人種系基因 獲得置換的殘基。產生一系列變體，通常4或5個，以檢測各種置換對抗原結合親和力的影 響。使用標準方法從重疊的寡核苷酸合成變異的可變區。然后克隆可變區并且表達為 人IgGl/κ抗體。獨立地產生#47和#131的重鏈和輕鏈變體的所有組合。將組合瞬時轉 染入CHO-Kl細胞，收獲細胞和上清液以檢測活性。表1描述了用于親本和解除免疫的可變區的SEQ ID NO。列出了解除免疫的變體 的重(H)鏈和輕(K)鏈可變區(V)的蛋白質和核苷酸序列。還列出了小鼠單克隆#47和 #131(m47,ml31)抗體的可變區以及重(H)鏈和輕⑷鏈的單個CDR的蛋白質序列。圖2A-D 還描述了小鼠單克隆親本抗體對解除免疫的變體的可變區的比對。表 1.
權利要求
1.結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變 區和輕鏈可變區，其中各可變區在構架區中具有2至20個氨基酸置換。
2.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中構架區中的2至20個置換是 與結合EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較的。
3.利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其具有與小鼠單克隆抗體#131， ATCC#PTA-6214相似或更大的結合親和力。
4.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中一個或更多個所述置換，與 非人或親本抗體相比較，減少解除免疫的抗體或其抗原結合片段中的T細胞表位的數目。
5.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中一個或更多個所述置換，與 非人或親本抗體相比較，減少解除免疫的抗體或其抗原結合片段中的B細胞表位的數目。
6.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中一個或更多個所述置換，與 非人或親本抗體相比較，在解除免疫的抗體或其抗原結合片段中導入調節T細胞表位。
7.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中一個或更多個置換增加抗體 或抗原結合片段的構架區與與所述構架區同源的人種系基因序列之間的序列同一性。
8.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中1至5個氨基酸存在于互補 決定區(CDR)。
9.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有多至18個氨基酸置換。
10.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有多至17個氨基酸置換。
11.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有至少5個氨基酸置換。
12.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有至少7個氨基酸置換。
13.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有至少9個氨基酸置換。
14.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有多至18個氨基酸置換。
15.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有多至16個或更少的氨基酸置換。
16.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有多至14個或更少的氨基酸置換。
17.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有至少3個氨基酸置換。
18.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有至少5個氨基酸置換。
19.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區，與結合 EphB4的細胞外結構域的非人或親本抗體相比較，具有至少7個氨基酸置換。
20.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原結合片段抑制培養的內皮細胞形成管。
21.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段在體內抑制組織的血管化作用。
22.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段減少小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。
23.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片 段包含含有Fc區域的重鏈恒定區。
24.權利要求23的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc區域具有改變的效 應子功能。
25.權利要求對的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述效應子功能得到增強。
26.權利要求對的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述效應子功能被減弱。
27.權利要求25的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中除去Fc區域中的N-糖基化。
28.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其包含一個或更多個來自非人 或親本抗體的互補決定區(CDR)。
29.權利要求觀的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段 在人受試者中比所述非人或親本抗體的免疫原性更低。
30.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制EphB4的二聚化或多聚化。
31.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。
32.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段刺激EphB4激酶的活性。
33.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域。
34.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第二纖連蛋白樣結構域。
35.權利要求1的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中將解除免疫的抗體或其抗 原結合片段綴合至細胞毒性劑。
36.權利要求35的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述細胞毒性劑選自放射 性試劑、植物、真菌或細菌來源的分子、生物蛋白質、長春堿、4-去乙酰長春花堿、長春新堿、 異長春堿和長春地辛。
37.權利要求觀的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述非人或親本抗體是小 鼠單克隆抗體#47或小鼠單克隆抗體#131。
38.權利要求37的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區中一個或更 多個所述置換在選自根據Kabat編號系統的位點5、12、40、66、75和83的氨基酸位點上發 生。
39.權利要求38的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區中一個或更多個所述置換選自位點5上的纈氨酸、位點12上的賴氨酸、位點40上的丙氨酸、位點66上的 精氨酸、位點75上的蘇氨酸和位點83上的精氨酸。
40.權利要求37的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區中一個或更多 個所述置換在選自根據Kabat編號系統的位點45、74和100的氨基酸位點上發生。
41.權利要求40的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區中一個或更多 個所述置換選自位點45上的賴氨酸、位點74上的蘇氨酸、位點100上的谷氨酰胺。
42.權利要求37的抗體，其中所述重鏈可變區包含a)選自SEQID NO=USEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl， b)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :10 的 SEQ ID NO :13 的氨基 酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)選自 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 10 氨基酸 113 至 123 的 FR4。
43.權利要求37的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區包含a)選 自 SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 18 的氨基酸 35 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :15 和 SEQ ID NO :17 的 氨基酸57至88的FR3 ；和d)選自SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 15的氨基酸98-107的FR4。
44.權利要求37的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含含有 SEQ ID NO 19 的 CDR1、含有 SEQ ID NO 20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 21 的 CDR3 ；并且其 中輕鏈包含含有SEQ IDNO 22的CDRl、含有SEQ ID NO :23的CDR2和含有SEQ ID NO 24 的 CDR3。
45.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段在人受試者中比小鼠單克隆抗體#47的免疫原性更低。
46.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段以為小鼠單克隆抗體#47對EphB4的細胞外結構域的結合親和力的至少80%的結 合親和力結合EphB4的細胞外結構域。
47.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段以為小鼠單克隆抗體#47對EphB4的細胞外結構域的結合親和力的至少90%的結 合親和力結合EphB4的細胞外結構域。
48.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段以為小鼠單克隆抗體#47對EphB4的細胞外結構域的結合親和力的至少100%的 結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。
49.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制EphB4與肝配蛋白B2的細胞外部分的結合。
50.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制EphB4的二聚化或多聚化。
51.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。
52.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原結合片段刺激EphB4激酶的活性。
53.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域。
54.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第二纖連蛋白樣結構域。
55.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中將解除免疫的抗體或其抗 原結合片段綴合至細胞毒性劑。
56.權利要求55的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述細胞毒性劑選自放 射性試劑、植物、真菌或細菌來源的分子、生物蛋白質、長春堿、4-去乙酰長春花堿、長春新 堿、異長春堿和長春地辛。
57.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制培養的內皮細胞形成管。
58.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段在體外抑制血管化作用。
59.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段減少小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。
60.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段包含含有Fc區域的重鏈恒定區。
61.權利要求60的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc區域具有改變的效 應子功能。
62.權利要求61的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述效應子功能得到增加。
63.權利要求61的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述效應子功能被減弱。
64.權利要求63的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中除去Fc區域中的N-糖基化。
65.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含a) 選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 1的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且其中所述輕鏈可變區包含a)由SEQ ID NO 6 的氨基酸 1 至 23 組成的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的 氨基酸 35 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57 至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107組成的FR4。
66.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含選 自:a) SEQ ID NO 1 ；b)SEQ ID NO 2 ；c)SEQ ID NO :3,d) SEQ ID NO :4和 e) SEQ ID NO :5 的 氨基酸序列。
67.權利要求44的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區包含選 自:a) SEQ ID NO 6 ；b)SEQ ID NO 7 ；c)SEQ ID NO 8 和 d) SEQ ID NO 9 的氨基酸序列。
68.權利要求66的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區包含選自:a) SEQ ID NO 6 ；b)SEQ ID NO 7 ；c)SEQ ID NO :8 禾口 d) SEQ ID NO 9 的氨基酸序列。
69.權利要求68的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8 的氨基酸序列。
70.權利要求68的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8 的氨基酸序列。
71.權利要求69的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列。
72.權利要求37的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變 區，其中所述重鏈可變區包含含有SEQ ID NO 25的⑶Rl，含有SEQ ID N0J6的⑶R2和含 有SEQ ID NO 27的⑶R3 ；并且其中所述輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO 28的⑶R1，含有 SEQ ID NO 29 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 30 的 CDR3。
73.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段在人受試者中比小鼠單克隆抗體#131的免疫原性更低。
74.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段以為小鼠單克隆抗體#131對EphB4的細胞外結構域的結合的結合親和力的至少 80%的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。
75.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段以為小鼠單克隆抗體#131對EphB4的細胞外結構域的結合的結合親和力的至少 90%的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。
76.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段以為小鼠單克隆抗體#131對EphB4的細胞外結構域的結合的結合親和力的至少 100%的結合親和力結合EphB4的細胞外結構域。
77.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制EphB4與肝配蛋白B2的細胞外部分的結合。
78.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制EphB4的二聚化或多聚化。
79.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。
80.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段刺激EphB4激酶的活性。
81.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域。
82.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段結合EphB4的第二纖連蛋白樣結構域。
83.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中將解除免疫的抗體或其抗 原結合片段綴合至細胞毒性劑。
84.根據權利要求83的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述細胞毒性劑選自放射性試劑、植物、真菌或細菌來源的分子、生物蛋白質、長春堿、4-去乙酰長春花堿、長春 新堿、異長春堿和長春地辛。
85.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段 抑制培養的內皮細胞形成管。
86.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段管在體內抑制組織的血管化作用。
87.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段減少小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。
88.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中解除免疫的抗體或其抗原 結合片段包含含有Fc區域的重鏈恒定區。
89.權利要求88的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc區域具有改變的效 應子功能。
90.權利要求89的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述效應子功能得到增加。
91.權利要求89的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述效應子功能被減弱。
92.權利要求91的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中除去Fc區域中的N-糖基化。
93.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含a)選 自 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :10、 SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且其中所述輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 18 的 氨基酸35至49的FR2 ；c)選自SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17的氨基酸57至88的FR3 ； 和d)由SEQ ID NO 15的氨基酸98至107組成的FR4。
94.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含選 自:a) SEQ ID NO :10 ；b) SEQ ID NO 11 ；c)SEQ ID NO :12,d) SEQ ID N0:13*e)SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。
95.權利要求72的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區包含選 自:a) SEQ ID NO :15 ;b) SEQ ID NO: 16，c) SEQ ID NO :17 和 d) SEQ ID NO :18 的氨基酸序 列。
96.權利要求94的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:17*b)SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
97.權利要求94的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區包含選自a)SEQ ID N0:17*b)SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
98.權利要求97的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含SEQ ID N0:14的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
99.結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可 變區和輕鏈可變區，其中所述抗體或抗原結合片段以與親本或非人抗體相同或更大的親 和力結合，并且其中所述抗體或其抗原結合片段具有一個或更多個下列特征a)各可變區 完全來源于一個或更多個人抗體；b)各可變區，與所述親本或非人抗體相比較，具有減少 的T細胞表位數目；和c)各可變區，與所述親本或非人抗體相比較，具有減少的B細胞表位 數目。
100.權利要求99的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中一個或更多個下列殘基 存在于重鏈可變區中位點5上的纈氨酸、位點12上的賴氨酸、位點40上的丙氨酸、位點66 上的精氨酸、位點75上的蘇氨酸以及位點83上的精氨酸，所述位點根據Kabat編號系統。
101.權利要求99的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中一個或更多個下列殘基 存在于輕鏈可變區中位點45上的賴氨酸、位點74上的蘇氨酸和位點100上的谷氨酰胺， 所述位點根據Kabat編號系統。
102.權利要求99的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含含 有 SEQ ID NO 25 的 CDRl、含有 SEQ ID NO 26 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 27 的 CDR3 ；并且 其中所述輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO 28的⑶Rl、含有SEQ ID NO 29的⑶R2和含有 SEQ ID NO 30 的 CDR3。
103.權利要求102的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含a) 選自 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO IUSEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO :14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 10 的氨 基酸113至123組成的FR4 ；并且其中所述輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的氨基酸1至23的FRl，b)選自SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO 18的氨基酸；35至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 15的氨基酸98至107組成的FR4。
104.權利要求99的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含含 有 SEQ ID NO 19 的 CDRl、含有 SEQ ID NO 20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO :21 的 CDR3 ；并且 其中所述輕鏈包含含有SEQ ID NO :22、含有SEQ ID NO 23的CDR2和含有SEQ ID NO 24 的 CDR3。
105.權利要求104的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含 a)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FR1，b)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d) 由SEQ ID NO 1的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且其中所述輕鏈可變區包含a)由SEQ ID NO 6 的氨基酸 1 至 23 組成的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107組成的FR4。
106.解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其結合EphB4的細胞外結構域并且免疫原性 低于從具有ATCC保藏號PTA-6214的雜交瘤獲得的#131抗體，并且以與所述從雜交瘤獲得 的抗體相同的或更大的親和力結合。
107.權利要求106的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含含 有 SEQ ID NO 25 的 CDRl、含有 SEQ ID NO 26 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 27 的 CDR3 ；并且 其中所述輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO 28的⑶Rl、含有SEQ ID NO 29的⑶R2以及含 有 SEQ ID NO 30 的 CDR3。
108.權利要求107的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含a) 選自 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO IUSEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO :14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO: 10 的氨 基酸113至123組成的FR4 ；并且其中所述輕鏈可變區包含a)選自SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的氨基酸1至23的FRl，b)選自SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO 18的氨基酸；35至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 15的氨基酸98至107組成的FR4。
109.解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其結合EphB4的細胞外結構域并且免疫原性 低于從具有ATCC保藏號PTA-6211的雜交瘤獲得的#47抗體，并且以與所述從雜交瘤獲得 的抗體相同的或更大的親和力結合。
110.權利要求109的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含含 有 SEQ ID NO 19 的 CDR1、含有 SEQ ID NO 20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 21 的 CDR3 ；并且 其中所述輕鏈包含含有SEQID NO 22的CDRl、含有SEQ ID NO 23的CDR2和含有SEQ ID NO 24 的 CDR3。
111.權利要求110的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區包含a) 選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 1的氨基酸113至123組成的FR4 ；并且其中所述輕鏈可變區包含a)由SEQ ID NO 6 的氨基酸 1 至 23 組成的 FRl，b)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的 氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)選自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57 至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107組成的FR4。
112.結合EphB4的細胞外結構域的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可 變區和輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含下列位點5上的纈氨酸、位點12上的賴氨 酸、位點40上的丙氨酸、位點66上的精氨酸、位點75上的蘇氨酸和位點83上的精氨酸中 的一個或更多個，所述位點根據根據Kabat編號系統。
113.權利要求112的解除免疫的抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區包含下 列位點45上的賴氨酸、位點74上的蘇氨酸以及位點100上的谷氨酰胺中的一個或更多 個，所述位點根據Kabat編號系統。
114.降低減少受試者中腫瘤生長速率的方法，其包括對所述受試者施用治療有效量的 權利要求1至113的任一項的解除免疫的抗體或其抗原結合片段。
115.權利要求114的方法，其中所述受試者是人受試者。
116.治療患有癌癥的受試者的方法，其包括對所述受試者施用治療有效量的權利要求 1至113的任一項的解除免疫的抗體或其抗原結合片段。
117.權利要求116的方法，其中所述受試者是人受試者。
118.權利要求116的方法，其中所述受試者被診斷患有選自結腸癌、乳腺癌、間皮瘤、 前列腺腫瘤、鱗狀上皮細胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病的癌癥。
119.權利要求116的方法，其中全身性施用解除免疫的抗體或其抗原結合片段。
120.權利要求116的方法，其中局部施用解除免疫的抗體或其抗原結合片段。
121.抑制受試者中血管生成的方法，所述方法包括對有此需要的受試者施用有效量的 權利要求1至113的任一項的抗體。
122.權利要求121的方法，其中所述受試者被診斷患有黃斑變性。
123.權利要求121的方法，其中所述受試者是人受試者。
124.包含權利要求1至113的任一項的解除免疫的抗體或其抗原結合片段的藥物組合物。
125.權利要求1至113的任一項的解除免疫的抗體或其抗原結合片段用于制備用于治 療癌癥的藥劑的用途。
126.權利要求125的用途，其中所述癌癥選自結腸癌、乳腺癌、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗 狀上皮細胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病。
127.權利要求1至113的任一項的解除免疫的抗體或其抗原結合片段用于抑制受試者 中血管生成的用途。
全文摘要
在某些實施方案中，本申請提供了結合EphB4蛋白的人源化抗體以及所述抗體用于治療目的的用途。
文檔編號C07K16/30GK102083861SQ200880111128
公開日2011年6月1日 申請日期2008年8月11日 優先權日2007年8月13日
發明者F·J·卡爾, P·吉爾, S·W·基恩, T·D·瓊斯, V·克拉斯諾佩羅夫 申請人:瓦斯基因治療公司