專利名稱：燈盞花提取物中燈盞花乙素的吸附樹脂法分離工藝的制作方法
燈盞花提取物中燈盞花乙素的吸附樹脂法分離工藝
技術領域：
本發明屬于天然植物中單體活性成分的分離純化技術領域。特別是燈 盞花素提取物中兩種結構極為相近的單體成分——燈盞花乙素和燈盞花甲素的吸附分離 工藝，以及分離過程中所使用的高選擇性吸附樹脂的合成方法。
背景技術：
燈盞花，為菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬￡>/gera" 6m^cqp^ (Vant.) Hand. Mazz.的干燥全草，又名燈盞細辛、地頂草等，主要分布于我國西南地區的云南、廣西等 省。燈盞花乙素(Scutdlarin)是燈盞花提取物中的主要黃酮類活性成分，對心、腦、肝、腎 等具有明顯的保護作用。以燈盞花提取物為原料藥的各種制劑已被臨床廣泛應用，如高血 壓、冠心病、心肌梗塞、肝炎、糖尿病、腎病等疾病的治療，但是臨床應用中個別患者也 出現了冷熱反應、皮膚瘙癢等過敏反應，另外其注射劑在使用中也表現出穩定性差、儲存 時間短等缺陷，這都與制劑中仍含有一定量的雜質有關。因此，為了達到更為嚴格的質量 控制、減少藥物使用過程中無法預期的毒副反應，高純度燈盞花乙素的制備變得尤為重要。 目前，市售的燈盞花提取物(又稱燈盞花素)中，燈盞花乙素約占85%左右，此外還包括 10n/。左右的燈盞花甲素(Apigenin-7-O-glucuronide)及其它少量雜質，作為原料藥的燈盞花素 提取物中燈盞花乙素含量也僅為90%。研究表明，燈盞花素中的藥效成分為燈盞花乙素， 因此燈盞花甲素也作為無效的雜質應予以去除，但是，燈盞花乙素和甲素結構極為相近(如 下圖所示)，造成二者難以分離，分離成本大大提高。
OHO OH 0
OHH OH H
Scutellarin Apigenin-7-O-glucuronide
在燈盞花素提取純化的傳統方法中，溶劑萃取法仍是工業化生產中有效、成熟的方法(王 淑紅等，加速溶劑萃取法用于燈盞細辛中燈盞乙素的測定[J]，藥物分析雜志，2006， 26(5) :703)。但是溶劑萃取法的缺陷也顯而易見， 一方面在提取純化過程常需溶劑反復萃 取，不僅步驟繁雜，生產成本高，更重要的是經常在大量開放環境中使用甲醇、四氫呋喃 等低沸點、有毒的有機溶劑，損害操作人員的健康且環境污染嚴重；另一方面，溶劑萃取 法制備的燈盞花素提取物中，燈盞花乙素純度較低(純度低于85%)，且難以去除與燈盞 花乙素結構極為相近的燈盞花甲素，因此，目前市售的燈盞花素原料藥常為燈盞花乙素和 燈盞花甲素的混合物。
近年來，吸附分離技術因其操作簡便、環境友好、生產成本低、純化效率高等優勢越來越廣泛的用于天然植物有效成分的分離純化中。但是由于商品化的吸附樹脂骨架仍以聚 苯乙烯為主，結構單一，吸附機理也以疏水性吸附為主，這都造成吸附分離方法選擇性相 對較差。在燈盞花素的提取純化中，大孔吸附樹脂更多的是作為含量較低的有效成分的富 集材料，難以真正完成去除雜質，制備高純度提取物的要求，例如樓云雁等探討了利用商 品化的聚苯乙烯型大孔樹脂純化燈盞花素的可行性，研究表明，這些樹脂可有效的去除部 分雜質，但是難以制備高純度的燈盞花乙素(樓云雁等，靜態吸附法選擇純化燈盞花素的 大孔樹脂[J]，中醫藥學刊，2006， 24(6) :1129)。張人偉等公開了一項中國發明專利，使 用商品化的AB-8和D101大孔聚苯乙烯型吸附樹脂為分離材料，用于市售燈盞花素原料 藥的進一步純化，得到純度為90%左右的燈盞花乙素，但是在專利所公開的純化工藝中， 只經樹脂"吸附—解吸"一步過程得到的解吸液中，燈盞花乙素的純度難以達到要求，仍需 將解吸液調節pH值以使其中的燈盞花素以沉淀的形式析出而達到進一步純化的目的，因 此，操作工藝難以實現連續化，且較高酸性(pH=l~2)會破壞燈盞花素的結構穩定性。 更為重要的是，雖然經過樹脂吸附、析出沉淀兩步處理后，去除了大量雜質，使得燈盞花 乙素的純度從80%提高到90%，但是由于AB-8或D101樹脂的吸附選擇性較差，難以實 現結構相近的燈盞花甲素和乙素的分離，因此利用專利公開的分離工藝，無法得到純度更 高的、且不含燈盞花甲素的燈盞花乙素樣品(張人偉等，用大孔樹脂精制燈盞花素原料藥 的制備方法，申請號200710065713.6，公開號CN 101037461A)。
發明內容本發明目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種燈盞花提取物 中燈盞花乙素的吸附樹脂法分離工藝。
從燈盞花甲素、燈盞花乙素的結構特點我們發現，雖然兩個化合物結構極為相近，且 都具有能形成氫鍵的酚羥基結構，但是燈盞花乙素中兩個酚羥基處于鄰位，更易形成分子 內氫鍵，這將會大大削弱它形成分子間氫鍵的能力。因此，本發明從燈盞花乙素、燈盞花 甲素結構特征出發，設計合成了一種具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺 三元共聚物骨架的大孔吸附樹脂，通過疏水和氫鍵的協同作用，選擇性吸附燈盞花素提取 物中的單體有效成分一燈盞花乙素。
本發明提供的燈盞花提取物中燈盞花乙素的吸附樹脂法分離工藝的步驟如下
第l、將具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔 吸附樹脂裝入玻璃交換柱中(直徑:柱長=1:8~1:20)，用去離子水清洗樹脂柱，待用；
第2、將市售的燈盞花提取物(提取物中燈盞花乙素質量含量為80%~90%)溶解在 去離子水中，配成質量體積濃度為0.3~1.0mg/mL的燈盞花提取物溶液，調節溶液pH為 7.0~8.5,即為上柱液；
第3、室溫下，將l-8BV的上柱液以0.5 2.5BV/小時的流速通過樹脂柱吸附(其中 1BV為交換柱中樹脂的體積)，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用2-6BV 水清洗樹脂床層，同時接收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品；經HPLC檢測，燈盞花乙素質量含量高于98%，燈盞花甲素質量含量低于
0.5%;
將上述第3步吸附后的樹脂柱用2~5 BV的體積濃度為30~50%的乙醇水溶液再生后
可重復使用。
其中，第1步所述的具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物 骨架的大孔吸附樹脂由常規的正相懸浮聚合法制備，具體合成步驟如下
第l.l、將聚乙烯醇(PVA)和氯化鈉(NaCl)溶于水中配成水溶液作為懸浮聚合的 水相，保持聚乙烯醇的質量濃度為0.5%~5%，氯化鈉的質量濃度為3%~5%，并將水相加 熱至30~50°C;
第1.2、將質量分數為30%~50%的丙烯酸甲酯、15%~25%的苯乙烯及余量為二乙烯 苯配成反應的單體，同時加入單體質量的100%~150%的混合溶劑作為致孔劑，混合溶劑 的組成為甲苯:長鏈烷烴(如正庚垸、液蠟、200#汽油等)質量比為1:1 2:1，加入單體質 量的1~3%的偶氮二異丁腈(AIBN)或過氧化苯甲酰(BPO)作為引發劑，混合均后，成 為反應的油相；
第1.3、將上述第1.2步中的油相加入到第1.1步的水相中，其中水相與油相的體積 比為3:1 4:1;開動攪拌，同時將反應體系升溫至65 8(TC，反應4 6小時，再繼續升溫至 80~90°C，反應3-5小時，停止反應，過濾、洗漆、干燥，即得初始吸附樹脂； 反應過程如下式所示
<image>image see original document page 5</image>第1.4、加入上述第1.3步得到的樹脂質量的200%~500%的溶劑將其充分溶脹后，加 入含伯胺基的有機試劑H2N-(CH2)2-R，其用量為第1.3步得到的樹脂質量的30%~50%， 升溫至90 12(TC，充分反應8 15小時，停止反應，過濾、洗滌即得具有酰胺功能基的聚 苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附樹脂，簡稱為酰胺樹脂。
第1.4步所述的溶劑可為N,N-二甲基甲酰胺、二乙苯、苯乙酮等。
上述反應過程如下式所示<image>image see original document page 5</image>
(其中R基團可以為氫，胺基或酰胺基團)本發明的優點和積極效果
本發明根據燈盞花甲素、燈盞花乙素的結構特點，利用氫鍵和疏水作用的協同效應， 在大孔吸附樹脂骨架上引入能形成氫鍵作用的特殊功能基(如酰胺基等)，基于燈盞花甲 素和燈盞花乙素形成分子間氫鍵的能力不同，通過疏水和氫鍵的協同作用，成功分離了燈 盞花甲素和燈盞花乙素，同時由于樹脂只對具有酚羥基結構的黃酮類化合物有選擇性吸附 的能力，因此，通過本發明合成的樹脂，同時達到了去除其他雜質的目的，大大提高了樹 脂的吸附選擇性。
本發明在此基礎上建立的分離工藝，對市售的燈盞花素提取物僅通過"吸附一解吸" 一步連續工藝即可實現結構極為相近的燈盞花甲素和燈盞花乙素的分離，制備純度高于 98% (w%)的燈盞花乙素樣品，同時確保該樣品中燈盞花甲素含量低于0.5。/。(w。/。)，且該 工藝無需調節pH值析出沉淀、重結晶等其他步驟的輔助，有利于大規模的、連續化工業 化生產。
本發明所建立的吸附樹脂分離純化工藝操作簡便，無需使用低沸點、有毒的有機溶 劑，且樹脂可重復使用，這將大大降低生產成本，同時制備的樣品可滿足進一步提高燈盞 花素制劑的質量標準、減小臨床使用中的過敏反應、提高制劑的儲存穩定性等要求，有很 好的實際應用前景。
具體實施方式
實施例1:
酰胺樹脂的制備方法，通過以下步驟實現
第一步:在1L三口瓶中將4.5g聚乙烯醇(PVA)和22.5g氯化鈉(NaCl)溶于水，配 成500mL水溶液，并加熱至45。C。另外將24g丙烯酸甲酯、12g苯乙烯、24g二乙烯苯、 60g甲苯、30g正庚烷、1.2g偶氮二異丁腈(AIBN)混合均勻后，加入三口瓶中，開動攪 拌，同時將反應體系升溫至65°C反應5小時，再繼續升溫至80°C反應4小時。停止反應， 過濾、洗滌、干燥，即得初始吸附樹脂。
第二步:加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 150mL將得到的54.8g樹脂充分溶脹后，加 入20g的NH2(CH2)2NH2，混合均勻后，升溫至95°C，充分反應10小時，停止反應，過 濾、洗滌，即得帶有酰胺功能基的大孔吸附樹脂，即為酰胺樹脂。
實施例2:
第一步:在2L三口瓶中將23g聚乙烯醇(PVA)和32g氯化鈉(NaCl)溶于水中，配 成900mL水溶液，并加熱至35。C。另外將60g丙烯酸甲酯、18g苯乙烯、42g二乙烯苯、 90g甲苯、50g液蠟、1.2g過氧化苯甲酰(BPO)混合均勻后，加入三口瓶中，開動攪拌， 同時將反應體系升溫至78'C反應6小時，再繼續升溫至90'C反應4小時。停止反應，過 濾、洗滌得到初始吸附樹脂。第二步加入二乙苯400mL將得到的108.7g樹脂充分溶脹后，加入40g的 NH2(CH2)2NHCOCH3，混合均勻后，升溫至110°C，充分反應8小時，停止反應，過濾、 洗滌即得帶有酰胺功能基的大孔吸附樹脂，即為酰胺樹脂。
實施例3:
第一步:在5L三口瓶中將lOOg聚乙烯醇(PVA)、 100g氯化鈉(NaCl)溶于水中，配 成2000mL水溶液，并加熱至4(TC。另外將75g丙烯酸甲酯、62.5g苯乙烯、112.5g二乙 烯苯、150g甲苯、150g的20(f汽油、7.5g偶氮二異丁腈(AIBN)混合均勻后，加入三 口瓶中，開動攪拌，同時將反應體系升溫至65'C反應4小時，再繼續升溫至80°C反應5 小時。停止反應，過濾、洗滌得到初始吸附樹脂。
第二步:加入苯乙酮700mL將得到的225.9g樹脂充分溶脹后，加入90g的 NH2(CH2)2NHCOCH2CH3，混合均勻后，升溫至120°C,充分反應12小時，停止反應，過 濾、洗滌即得帶有酰胺功能基的大孔吸附樹脂，即為酰胺樹脂。
實施例4:
將上述酰胺樹脂用于分離燈盞花乙素與燈盞花甲素，具體操作步驟如下 將30mL上述酰胺樹脂裝入玻璃交換柱(柱徑14mm，柱長25cm)，用去離子水清洗 后，加入2BV、濃度為l.Omg /mL燈盞花提取物上柱液，通過樹脂吸附，流速為1BV/小 時，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用4BV水清洗樹脂床層，同時接 收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品。經HPLC 檢測，燈盞花乙素質量含量為99.4%,甲素未檢出。將上述吸附后的樹脂柱用2 BV的體 積濃度為30%的乙醇水溶液再生后可重復使用。 實施例5:
將50mL上述酰胺樹脂裝入玻璃交換柱(柱徑18mm，柱長30cm)，用去離子水清洗 后，加入4BV、濃度為0.3mg /mL燈盞花提取物上柱液，通過樹脂吸附，流速為1.5BV/ 小時，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用3BV水清洗樹脂床層，同時 接收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品。經HPLC 檢測，燈盞花乙素質量含量為99.2%，甲素未檢出。將上述吸附后的樹脂柱用3 BV的體 積濃度30%的乙醇水溶液再生后可重復使用。
實施例6:
將100mL上述酰胺樹脂裝入玻璃交換柱(柱徑25mm，柱長35cm)，用去離子水清洗 后，加入6BV、濃度為0.5mg /mL燈盞花提取物上柱液，通過樹脂吸附，流速為2.5BV/ 小時，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用5BV水清洗樹脂床層，同時 接收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品。經HPLC 檢測，燈盞花乙素質量含量為99.0%，甲素未檢出。將上述吸附后的樹脂柱用2 BV的體 積濃度為40%的乙醇水溶液再生后可重復使用。
實施例7:將500mL上述酰胺樹脂裝入玻璃交換柱(柱徑34mm，柱長40cm)，用去離子水清洗 后，加入3BV、濃度為0.8mg /mL燈盞花提取物上柱液，通過樹脂吸附，流速為2BV/小 時，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用3BV水清洗樹脂床層，同時接 收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品。經HPLC 檢測，燈盞花乙素質量含量為99.1%,甲素未檢出。將上述吸附后的樹脂柱用3 BV的體 積濃度為45%的乙醇水溶液再生后可重復使用。
實施例8:
將1L上述所酰胺樹脂裝入玻璃交換柱(柱徑55mm，柱長85cm)，用去離子水清洗 后，加入3BV、濃度為0.6mg /mL燈盞花提取物上柱液，通過樹脂吸附，流速為2BV/小 時，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用6BV水清洗樹脂床層，同時接 收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品。經HPLC 檢測，燈盞花乙素質量含量為99.5%，甲素未檢出。將上述吸附后的樹脂柱用5 BV的體 積濃度為50%的乙醇水溶液再生后可重復使用。
權利要求
1、一種燈盞花提取物中燈盞花乙素的吸附樹脂法分離工藝，其特征在于，該工藝步驟如下第1、將具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附樹脂裝入玻璃交換柱中，用去離子水清洗樹脂柱，待用；第2、將市售的燈盞花提取物溶解在去離子水中，配成質量體積濃度為0.3～1.0mg/mL的燈盞花提取物溶液，調節溶液pH為7.0～8.5，即為上柱液；第3、室溫下，將1～8BV的上柱液以0.5～2.5BV/小時的流速通過樹脂柱吸附，同時接收從樹脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用2～6BV水清洗樹脂床層，同時接收此部分水溶液，與上述流出液合并，旋轉蒸發，濃縮，干燥，即得所需樣品；經HPLC檢測，燈盞花乙素質量含量高于98％，燈盞花甲素質量含量低于0.5％；其中，第1步所述的具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附樹脂經過如下步驟制成第1.1、將聚乙烯醇和氯化鈉溶于水中配成水溶液作為懸浮聚合的水相，保持聚乙烯醇的質量濃度為0.5％～5％，氯化鈉的質量濃度為3％～5％，并將水相加熱至30～50℃；第1.2、將質量分數為30％～50％的丙烯酸甲酯、15％～25％的苯乙烯及余量為二乙烯苯配成反應的單體，同時加入單體質量的100％～150％的混合溶劑作為致孔劑，混合溶劑的組成為甲苯∶長鏈烷烴質量比為1∶1～2∶1，加入單體質量的1～3％的偶氮二異丁腈或過氧化苯甲酰作為引發劑，混合均勻后，成為反應的油相；第1.3、將上述第1.2步中的油相加入到第1.1步的水相中，其中水相與油相的體積比為3∶1～4∶1；開動攪拌，同時將反應體系升溫至65～80℃，反應4～6小時，再繼續升溫至80～90℃，反應3-5小時，停止反應，過濾、洗滌、干燥，即得初始吸附樹脂；第1.4、加入上述第1.3步得到的樹脂質量的200％～500％的溶劑將其充分溶脹后，再加入第1.3步得到的樹脂質量的30％～50％的含伯胺基的有機試劑H2N-(CH2)2-R，混合均勻后，升溫至90～120℃，充分反應8～15小時，停止反應，過濾、洗滌即得具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附樹脂，簡稱為酰胺樹脂。
2、 根據權利要求1所述的分離工藝，其特征在于第1步中的玻璃交換柱的直徑:柱長 =1:8~1:20。
3、 根據權利要求1所述的分離工藝，其特征在于將上述第3步吸附后的樹脂柱用2~5 BV的體積濃度為30~50%的乙醇水溶液再生后可重復使用。
4、 根據權利要求1或2或3所述的分離工藝，其特征在于第2步所述的市售燈盞花 提取物中燈盞花乙素質量含量為80%~90% 。
5、 根據權利要求1或2或3所述的分離工藝，其特征在于第L4步所述的溶劑可為 N,N-二甲基甲酰胺、二乙苯、苯乙酮等。
全文摘要
本發明公開了一種燈盞花提取物中燈盞花乙素的吸附樹脂法分離工藝。基于結構極為相近的燈盞花乙素和燈盞花甲素形成分子間氫鍵能力的不同，在大孔吸附樹脂骨架上引入能形成氫鍵的酰胺功能基，通過疏水和氫鍵的協同作用，高選擇性吸附燈盞花乙素，以市售提取物為原料，通過“吸附-解吸”一步連續工藝，制備燈盞花乙素含量高于98％、燈盞花甲素含量低于0.5％的樣品。本發明避免使用有毒、低沸點的有機溶劑，且無需其他純化方法的輔助，因此操作簡單、環境友好，同時樹脂可再生使用，生產成本大大降低，適于大規模工業化生產。所得樣品可滿足進一步提高燈盞花素制劑的質量標準、減小臨床副反應等要求，有很好的應用前景。
文檔編號C07H17/00GK101580527SQ20091006866
公開日2009年11月18日 申請日期2009年4月29日 優先權日2009年4月29日
發明者施榮富, 王春紅, 艷 趙 申請人:南開大學