甘藍型油菜抗病相關基因BnERF56及其應用的制作方法

專利名稱：甘藍型油菜抗病相關基因BnERF56及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和生物技術領域。具體涉及一種增強植物對菌核病抗性 的BnERF56基因，同時還涉及一種增強植物對菌核病抗性的BnERF56基因的制備方法，還涉 及BnERF56基因在增強植物對核盤菌抗性、對灰霉菌抗性中的應用。
背景技術：
植物通過激活一系列抗性響應來抑制病原侵染，達到自我保護的目的(Feys， B. J. , and Parker, J. E. Interplay of signal ing pathways in plant disease resistance. Trends Genet. 2000. 16 :449_455.Glazebrook，J.Genes controlling expression of defense responses in Arabidopsis-2001 status. Curr. Opin. Plant Biol. 2001. 4 :301-308.)對特異病原的識別啟動了這些快速的細胞反應，激活了一個或者 多個抗性信號傳導途徑，導致了一系列抗性基因的快速誘導表達(Bostock，R. M-Signal crosstalk and induced resistance :Straddling the line between cost and benefit. Annu. Rev. Phytopathol. 2005. 43 :545_580 Rojo, E.，Solano，R.，and Sanchez—Serrano， J. J. Interactions between signaling compounds involved in plant defense. J. Plant Growth Regul. 2003. 22 :82_98)。這些抗性途徑主要被水楊酸，茉莉酸，乙烯，和他們的衍生 物所調節(Thatcher LF, Anderson JP, Singh KB Plant defense responses :What have we learnt from Arabidopsis ？ Funct Plant Biol 2005，31 :1—19)。他們與不同的病源 抗性相關，大量研究表明，水楊酸在植物抵抗活體營養型病源的局部和系統獲得性抗性中 發揮著關鍵作用(Durrant W. Ε. , and Dong，X. Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42 185-209. Gaffney T.，Friedrich, L，Vernooij, B.，Negrotto, D.， Nye，G.，Uknes，S.，Ward，Ε·，Kessmann，H.，and Ryals,J. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science 1993. 261 :754_756)； 而誘導系統性抗性依賴于茉莉酸和乙烯信號途徑，這兩種激素信號途徑對于植物抵抗腐生 型病源，如灰毒等，是很重要的(Thomma B.，Eggermont, K.，Penninckx, I.，Mauch-Mani, B.，Vogelsang, R.，Cammue, B.，and Broekaert, W. Separate jasmonate—dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. 95 15107-15111. Thomma B.，Eggermont，K.，Tierens，K.，and Broekaert，W. Requirement of functional ethylene-insensitive 2 gene for efficient resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea. Plant Physiol. 1999. 121 :1093_1102·)。然而，這 種簡單的二分法，把SA和MJ/ET信號割裂幵來，即認為他們分別針對于活體營養型和腐 生營養型病源的看法，可能過于簡單；最近，水楊酸信號也被發現參與了對腐生營養型病 源灰霉的局部抗性，用水楊酸處理后顯著的抑制了灰霉的侵染(Ferrari S.，Plotnikova, J. M. ,De, L. G. , and Ausubel, F. Μ. Arabidopsis local resistance to Botrytis cinerea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2,but not SID2,EDS5 or PAD4. Plant J. 2003. 35 193-205.)。病源的侵染激活的不是一個單一的信號途 徑，而是一個復雜的相互作用的信號網絡。 植物的抗性調節是復雜的，牽涉進大量的轉錄因子家族(Singh KB, Foley RC, Ori ate-Sa ‘ nchez L(2002)Transcription factors in plant defense and stress responses. Curr Opin Plant Biol 5 :430_436)，鑒定和利用關鍵的轉錄因子，對于改 造農作物，提高抗性是非常重要的，其中一個被利用的轉錄因子家族就是乙烯響應因子 (ERF)家族，它屬于AP2/ERF超家族的一部分。在擬南芥中，AP2/ERF超家族大約有147 個成員，他們編碼的蛋白有不同的功能，相關于植物的整個生命過程，包括調節發育(van der Graaff E，Dulk-Ras AD, Hooykaas PJ, Keller B(2000)Activation tagging of the LEAFY PETIOLE gene affects leaf petiole development in Arabidopsis thaliana. Development 127 4971-4980 Banno H， Ikeda Y， Niu QW, Chua NH(2001)Overexpression of Arabidopsis ESRl induces initiation of shoot regeneration. Plant Cell 13 2609-2618)，響應于非生物壓力，如干旱，寒冷等(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K(1998)Two transcription factors， DREBl and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought—and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10 1391-1406 Stockinger EJ, Gilmour SJ, Thomashow MF(1997) Arabidopsis thaliana CBFl encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/ DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1035-1040)，生物壓力，如真菌侵染(Berrocal-Lobo MiMolina AiSolano R Constitutive expression of ETHYLENE-RESP0NSE-FACT0R1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J, 200229 23~32 Luis Onate-Sanchez, Jonathan P. Anderson, Jodi Young，and Karam B· Singh氺 AtERF14，aMember of the ERF Family of Transcription Factors， Plays a Nonredundant Role in PlantDefense Plant Physiology,2007,143 ；400-409, Martial Pre 丨,Mirna Atallah, Antony Champion, Martin De Vos2, Corne r M.J. Pieterse, and Johan Memelink* The AP2/ERF Domain Transcription Factor 0RA59Integrates Jasmonic Acid and Ethylene Signals in Plant Defense Plant Physiology，2008，147 ;1347_1357)。AP2/ERF 超家族都含有一個 AP2/ERF保守結構域，它由60-70個氨基酸組成，與DNA結合相關；AP2/ERF超家族被分成 ERF，AP2，和RAV三個亞家族。ERF亞家族包含了所有的抗病相關的AP2/ERF基因(Gutterson N，Reuber TL，Regulation of disease resistance pathways by AP2/ERF transcription factors. Curr Opin Plant Biol，2004，7 :465_471)。ERFl 和 0RA59 被證明是擬南芥中茉 莉酸和乙烯信號的節點，組成型表達ERFl激活了一系列抗性相關基因的表達，包括PDF1. 2 and ChiB，顯著增強了對灰霉等真菌的抗性(Solano，R.，Stepanova, A.，Chao, Q. M. and Ecker,J. R. (1998)Nuclear events in ethylene signaling :a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENERESP0NSE-FACT0R1. Genes Dev， 12，3703—3714. Berrocal-Lobo M，Molina A，Solano R(2002)Constitutive expressionof ETHYLENE-RESP0NSE-FACT0R1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J 29 :23_32 Lorenzo O, Piqueras R, Sanchez-Serrano JJ, Solano R(2003)ETHYLENE RESPONSE FACT0R1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 15:165-178 Martial Pre', Mirna Atallah, Antony Champion, Martin De Vos2, Corne' M. J. Pieterse, and Johan Memelink* The AP2/ERF Domain Transcription Factor 0RA59Integrates Jasmonic Acid and Ethylene Signals in Plant Defense Plant Physiology,July 2008,Vol. 147, pp. 1347-1357)。在擬南芥中組成型表達 AtERF2 (McGrath KC, Dombrecht B, Manners JM, Schenk PM, Edgar Cl, Maclean DJ, Scheible WR, Udvardi MK, Kazan K(2005)Repressor-and activatortype ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol 139 :949_959)禾口 AtERF14 (Luis Onate-Sanchez, Jonathan P. Anderson, Jodi Young, and Karam B.Singh* AtERF14, aMember of the ERF Family of Transcription Factors, Plays a Nonredundant Role in Plant Defense Plant Physiology, January 2007，Vol. 143，pp. 400—409)也被 艮道 引起高水平的抗性相關基因PDF1. 2和ChiB的表達；然而，AtERF4卻抑制抗性相關基因 PDFL 2 的表達(McGrath KC,Dombrecht B,Manners JM, Schenk PM,Edgar CI,Maclean DJ, Scheible WR, Udvardi MK, Kazan K Repressor—and activatortype ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen of Arabidopsis transcription factor gene expression. Plant Physiol. 2005. 139 949-959)，暗示ERF家族的成員對抗性相關基因的調節作用是 多樣的，由正調控，也有負調控。菌核病是一種類似于灰霉的腐生營養型真菌，這種破壞性病源侵染超過400種植 物，分布廣泛。油菜是最世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，莖和角果的 腐爛，導致了巨大的產量損失。盡管菌核病嚴重威脅了農業生產，植物對核盤菌的寄主抗 性的分子機制，我們依然知之甚少。暨今為止還沒有發現完全免疫或者高抗的油菜栽培 品禾中(Liu, S.，Wang, H.，Zhang，J.，Fitt, B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang，W.，and Guo, X. 2005. In vitro mutation and selection of doubled—haploid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24 133-144.)，因此，探究植物對這種病源的抗性機制，發現新的抗性基因具有深遠意義。因此，本發明開發了一個增強植物對腐生營養型真菌抗性的BnERF56基因。通過 熒光定量PCR檢測該基因在主要在根，莖，葉中表達；核盤菌侵染后顯著誘導該基因的表 達；該基因的超表達顯著提高了病源相關基因PDF1. 2，ChiB, PR-I and PR-2的表達，增強 了對腐生營養型真菌核盤菌和灰霉的抗性。預示著該基因在油菜抗性育種中具有相當的應 用前景。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種增強植物對腐生營養型真菌抗性的BnERF56基 因，該基因在核盤菌侵染過程中被誘導表達，該基因的組成型表達可以增強植物對腐生營養型真菌核盤菌和灰霉的抗性，應用于抗性育種。本發明的另一個目的是在于提供了一種油菜BnERF56基因的制備方法，根據本實 驗室進行甘藍、甘藍型油菜和白菜型油菜基因組測序結果提供的基因片段序列信息，通過 BLAST比對油菜的EST數據庫，獲得油菜全長序列的電子克隆后，應用簡單的PCR方法即可 以獲得該基因的序列。本發明的再一個目的是在于提供了一種油菜BnERF56基因在增強植物對腐生營 養型真菌核盤菌的抗性中的應用。BnERF56基因的超表達顯著增強了植物對核盤菌的抗性。本發明的再一個目的是在于提供了一種油菜BnERF56基因在增強植物對腐生營 養型灰霉菌的抗性中的應用。BnERF56基因的超表達顯著增強了植物對灰霉菌的抗性。為了完成上述目的，本發明采用如下技術方案為了獲得本發明，申請人對油菜菌核病抗性相關基因進行了深入和全面的研究， 結果發現了一個新基因，該基因在核盤菌侵染后被顯著誘導表達，該基因超表達顯著提高 了病源相關基因PDF1. 2，ChiB, PR-I and PR-2的表達，增強了對腐生營養型真菌核盤菌和 灰霉的抗性。根據本發明的一個方面，上述目的可以通過提供植物核盤菌響應基因來實現，所 述基因含有SEQ ID No. 1核苷酸序列或與SEQ ID No. 1實質上同源的核苷酸序列。根據本發明的一個方面，上述目的可以通過提供植物核盤菌響應蛋白來實現，所 述的蛋白含有SEQ ID No. 2核苷酸序列或與SEQ ID No. 2實質上同源的氨基酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的通過提供含有BnERF56基因超表達重組載體 0X-BnERF56 (申請人構建)來實現對植物體中BnERF56基因表達量的抑制。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體0X_BnERF56 轉化的微生物(根癌農桿菌EHA105，購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)來實現 對擬南芥以及其他植物的轉化，從而增強擬南芥以及其他植物中BnERF56基因的表達量。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物(包含有 0X-BnERF56重組載體的根癌農桿菌EHA105)轉化的轉基因植物來實現對核盤菌抗性的調 控，獲得抗性轉基因植株。一種增強植物對菌核病抗性的BnERF56基因在增強植物對核盤菌抗性、對灰霉菌 抗性中的應用，其步驟是1、油菜BnERF56基因的克隆在液氮中將植物幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol提取試劑盒(購自 Invitrogen公司，以下相同)的要求進行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸 水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650BECKMAN,USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結合(質量體積比) 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板進行逆轉錄，得到的cDNA分 裝后于-20°C保存備用。根據GenBank中擬南芥AtERF56基因序列(at5g61600)，在NCBI網站上用 BLASTN(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)與本實驗室測序獲得的甘藍、甘藍型油菜 和白菜型油菜基因片段序列進行比對，獲得與擬南芥AtERF56基因序列5'端同源的甘藍 型油菜的CDS (Coding sequence，編碼序列，以下相同)序列以及和擬南芥AtFRF56基因序列3'端同源的甘藍型油菜的CDS序列。然后根據獲得的甘藍型油菜BnERF56基因的CDS 序列與擬南芥AtERF56基因起始密碼子和終止密碼子同源區域設計引物，從而確保擴增 產物為全長序列。以甘藍型油菜的根、莖、葉、花、角果的cDNA為模版，進行PCR擴增。回 收并純化擴增的PCR產物，連接到pMDIS-T載體上(購自Promega公司，以下相同)，用凍 融法轉化大腸桿菌(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三 版)科學出版社，96-99)，涂布于含有氨芐青霉素50yg/mL的LB固體(配方如下分別稱 取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于 1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X104Pa下高壓消毒15分鐘。4°C冷 藏備用)平板上，37°C培養過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR檢測所用引物序列為M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ；M13R 5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同)，反應體 系為10XTaq 酶反應緩沖液 2ul、25mM MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1. 5ul、IOuM 引物 0. 2ul、 0.3單位Taq酶，加無菌水至20 μ 1。反應程序為94°C變性5min，94°C 45s、55°C 45s,72°C 2min 32循環，72°C延伸5min (以下相同)。以M13F/M13R為引物(前面已述)，將連接過的 PMD18T載體進行序列測定，分析結果，獲得了一種分離的基因，其序列為SEQ ID No. 1所示 的核苷酸序列。利用NCBI的開放閱讀框，尋找程序(ORF founder)確定BnERF56基因的開 放閱讀框，推導出核苷酸序列編碼的多肽，一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的 氨基酸序列。根據獲得的上述核苷酸序列(SEQ ID No. 1)，通過構建BnERF56超表達植物重組載 體(0X-BnERF56)，轉化擬南芥，申請人獲得23株轉基因擬南芥，分別接種腐生真菌核盤菌 和灰霉菌進行抗病鑒定，結果顯示BnERF56超表達顯著增強了轉基因擬南芥對核盤菌和灰 霉菌的抗性。對蛋白質的分子量和理論等電點進行在線計算(http://us. expasyorg/tools/ pi tool.htm)。 用 NCBI 的 Conserved Domains 工具(http://wwwncb.inlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb. cgi)在線進行保守區域分析結果表明該基因屬于乙烯響應因子 (ERF)家族；通過Blastx程序對NCBI的NR數據庫進行同源性比對，并對具有同源性、不同 物種來源的抗病相關的ERF蛋白DNAMAN進行多序列比對；用Prosite軟件在線分析該蛋白 質的基本結構域。結果如圖1，2，3。2、油菜BnERF56基因的表達模式本發明所用油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L. ) zhongshuang 9。供試材料播 種于大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花、角果，每種材料至少取三 個重復，每個重復至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。利用 Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進行RNA的提取。PCR儀為DNA-Engine (BIO-RAD)，采用油菜Actin作為內標基因(登 錄號 AFl 11812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘和 5' -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3‘。BnERF56 基因引物為 5‘ -TGAAGATAGATGGCAACTAAGCA AGAAG-3'和 5 ‘ -AATTCAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC-3‘。半定量PCR反應每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技 術重復。分別檢測BnERF56在油菜組織(根、莖、葉、花、角果)中的表達。結果如圖4所示，
7BnERF56主要在根種表達，其次是莖和葉，花和角果中基本不表達。3、BnERF56基因的表達受核盤菌侵染誘導。對菌核病不同抗性的甘藍型油菜品種M083(高抗)和84039 (高感)由中國農業 科學院油料作物研究所生物技術育種課題組提供，核盤菌菌核培養采用PDA培養基。PDA培 養基(1L)配方馬鈴薯200g，蔗糖10-20g，瓊脂粉17-20g，雙蒸水1000g ；將去皮馬鈴薯切 成小塊，加水800ml，煮沸0. 5h，用紗布濾去殘渣，加水補足1000ml，然后加入糖和瓊脂，加 熱使瓊脂完全融化，趁熱分裝，高壓滅菌后備用。菌核病不同抗性的油菜品種M083和84039種子采用土壤盆栽，嚴格控制其生長 條件，油菜生長至四葉一心期時進行菌絲塊活體接種處理。分別在接種后0、6、24、72h等 不同時間點取局部葉，每種材料至少取三個重復，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮 中，-80°C保存。利用Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進行RNA的提取。DNasel消 化后進行逆轉錄反應，得到的cDNA分裝后于-80°C保存備用。熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler(博奧)，采用油菜Actin作為內標基 因(登錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 禾口 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘ 。 BnERF56 基因 引物為 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘。焚光定 量PCR反應每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技術重復。分別 檢測BnERF56基因在不同抗性品種中，侵染后不同時間點的表達。用比較Ct法(A A Ct)計算基因的相對表達量。通過2_A ACt估算目的基因的相對 表達量禾口系統誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the AcT Method. METHODS 25,402-408.)。在計算相對表達量時，以未接種的樣本為參照，即將其值轉換成 1(標準值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達值。結果如圖5所示，BnERF56是一個在 受核盤菌侵染誘導的基因，在抗性品種中的表達高于感性品種中的表達，表明BnERF56是 一個抗性相關基因。4、BnERF56基因超表達載體(0X_BnERF56)的構建和根癌農桿菌菌株EHA105轉化 (購于上海滬尚生物科技有限公司)構建的重組載體是將實驗室構建的質粒PG4A (Zheng Wang，Han Mao，Caihua Dong, Ruiqin Ji, Li Cai,Hao Fu,and Shengyi Liu Overexpression of Brassica napus MPK4 Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed Rape MPMI, 22 (3)，2009，235-244.)上的目的基因用前期克隆得到的BnERF56基因替換而來。為完成此 目的，首先用Pstl/Xhol雙酶切克隆的BnERF56基因片段，同時用Pstl/Xhol酶切PG4A質 粒(前面已述)。酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之后，用瓊脂糖膠電泳 檢測。將酶切后的BnERF56基因片段和PG4A質粒(前面已述)上切下的大片段用DNA凝 膠回收試劑盒(前面已述)回收。把BnERF56基因片段比PG4A質粒(前面已述)載體片 段按3 1(摩爾濃度比)的比例混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，10X反應緩沖液，無 菌水補充體積至20i!L，16°C連接過夜。轉化后，在含有卡那霉素(50i!g/mL)固體LB平板 上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質粒，酶切驗證正確的重組質粒命名為0X-BnERF56，并對 獲得的載體進行測序以驗證準確性。載體結構如圖6。
然后利用凍融法(前面已述)將0X-BnERF56轉入根癌農桿菌EHA105(購自大連寶 生物生物制品有限公司，以下相同)，涂布于含有50 u g/mL卡那霉素和利福平(50 u g/mL) 的LB固體(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂 依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859X104Pa 下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR 檢測(前面已述)。本發明所使用的研究BnERF56基因功能的重組植物表達載體，含有所述BnERF56 基因的編碼區核苷酸序列，組成型35S啟動子可以增強BnERF56基因的表達水平。該載體 大小適合，在植物中易與轉化，所帶有的除草劑標記基因Bar表達強度高，容易檢測。通過 這個載體轉化擬南芥可以獲得菌核病抗性增強的擬南芥轉基因植株。5、BnERF56基因超表達載體(0X-BnERF56)的遺傳轉化參照文獻中的方法進行擬南芥轉化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1 1-6)。制備含有構建好載體的根癌農桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉化前一天轉 入含有卡那霉素50 u g/ml、利福平50 u g/ml的LB液體培養基中，28°C過夜培養。第二天， 用紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測的吸光值，當菌液的吸光值達 到在1.6-2.0之間時取出。室溫(20-25 °C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，將沉 淀懸浮于等體積的5%蔗糖(質量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化 前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet L-77(購自北京五洲元業科貿中心，以下相 同)。混勻后把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15s，取出植株。轉化 后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方 培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥3-5 天。將轉化收獲的T0代種子播在混有PNS營養液的蛭石中，(PNS營養液成份為每升含 5ml 1M KN03，2ml 1M Ca(N03)2 4H20,2ml 1M MgS04 7H20，2. 5ml 20mM Fe. EDTA,2. 5ml 1M磷酸緩沖液(pH5.5)，lml MS微量元素)；4°C春化一星期，在21_22°C的生長間中自然生 長兩星期左右，待到達四葉期的早期進行除草劑草胺磷(30mg/L)的噴灑第一次，一星期之 后進行第二次噴灑。兩次噴灑后對存活的綠苗進行PCR陽性檢測，獲得擬南芥轉基因陽性
田o6、BnERF56基因超表達載體(0X_BnERF56)轉化苗的篩選及PCR鑒定根據本實 驗室進行的除草劑草胺磷濃度梯度篩選實驗，確定除草劑(草胺磷，購自拜爾公司，以下相 同)篩選濃度為30mg/L。T1代植株在苗期(播種后10天)噴施30mg/L除草劑，得到成活 植株°米用 CTAB法(M. G. Murray and ff. F. Thompson, Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, _Nucleic Acids Research, 1980, Vol. 8, No. 194321-4326，以下相同) 提取篩選后存活的擬南芥以及野生型擬南芥葉片DNA。根據表達載體上外源BnERF56基因 序列，設計引物進行 PCR 檢測(序列為 F-5 ‘ TGAAGATAGATGGCAACTAAGCAAGAAG3 ‘ R-5 ‘ MTT CAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC‘)，預期擴增長度為680bp。將經過PCR檢測的陽性植株編號并 標記。7、BnERF56基因的超表達增強了病源相關蛋白表達通過熒光定量PCR驗證干擾效率并觀察轉基因擬南芥T1代表型。觀察結果顯示，在正常生長狀況下，各BnERF56基因超表達轉基因植株與野生型植株并無明顯差異；PCR鑒 定后獲得轉基因T2代超表達(0X-BnERF56)各個株系的幼苗。摘取這些幼苗的葉片，速凍于 液氮中，用Q-PCR對目標基因BnERF56的表達水平進行分析。具體方法如下取經過PCR檢 測后獲得的T2代陽性植株的葉片，在液氮中將植物幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol 提取試劑盒的要求進行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I去 除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN,USA)分別檢測RNA在260納米和280 納米光吸收值，結合(質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的 RNA為模板進行逆轉錄(前面已述)，得到的cDNA分裝后于_20°C保存備用。熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler (博奧)，采用擬南芥Act in作為內標基因。BnERF56 引物為 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘； 擬南芥 PDF1. 2 引物為 5 ‘ -TGTTCTCTTTGCTGCTTTCGACG-3 ‘ 禾P 5' -GCATGATCCATGTTTGGCTCCT-3‘；擬南芥ChiB 引物為 5‘ -ATCAGCGCTGCAAAGTCCTTC-3‘ 和 5 ‘ -GTGCTGTAGCCCATCCACCTG-3 ‘；擬南芥冊_1 引物為 5 ‘ -TTCTCCCTCGAAAGCTCAA-3 ‘ 和 5 ‘ -AAGGCCCACCAGAGTGTATG-3 ‘；擬南芥冊_2 引物為 5 ‘ -AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3 ‘ 和 5 ‘ -CCCGTAGCATACTCCGATTT-3‘；熒光定量PCR反應體系為20iiL:含有SYBR Mix 10 y L，正反向引物(10 ii mol/L) 各0. 8 ii L，模板2 u L，DEPC處理過的無菌水補足至20 u L。擴增條件為94°C，5min ；94°C 15s,60°C 20s,72°C 30s，40個循環；每個循環于72°C復性末端進行熒光檢測。反應結束后 先加熱到95°C，然后降至72°C，再緩慢升溫至95°C，記錄熒光信號的變化，得出擴增產物的 熔解曲線。每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技術重復。用比較Ct法(A ACt)計算基因的相對表達量。利用儀器所帶軟件，首先優化內 標基因和目的基因擴增條件，分別測定Actin和目的基因的Ct值，選取九次實驗測定值中 最為接近的三次結果(Ct值系統誤差小于0. 3)取平均值，然后通過內標基因對目的基因 進行校正得到A ACt，最后通過2_AAet估算目的基因的相對表達量和系統誤差(前面已 述)。在計算相對表達量時，以野生型擬南芥葉片的樣本為參照，即將其值轉換成1，其它樣 品再與其比較，獲得相對表達值。結果顯示BnERF56超表達效率非常明顯，如圖7所示而 BnERF56基因超表達轉基因植株中，BnERF56的表達被顯著上調17-30倍，相應的，病源相關 蛋白PDF1. 2，ChiB, PR-1和PR-2的表達也顯著上調；表明BnERF56基因的超表達增強了病 源相關蛋白表達8、BnERF56基因超表達顯著增強植株對腐生型真菌核盤菌和灰霉菌的抗性核盤菌(Scleortinia sclerotiorum)菌核采自武漢大田油菜莖桿；選完好菌核， 先用75%酒精(體積比)泡1分鐘，再用0. 1% HgC12消毒8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次。 把滅菌菌核切去兩端，中間部分切成綠豆大小，切面朝下，接種于Minimal平板。通常每粒 菌核接一板，一次接種8-9板。于22°C靜置培養3-4天，當菌核即將鋪滿平板時，用cj^mm 打孔器沿菌絲外緣打孔，取菌絲塊，用于接種。Minimal培養基(1L)配方NaOH lg，DL_蘋 果酸3g，NH4N03 2g，MgS04 7H20 0. lg，細菌瓊脂粉39g ；按順序將上面藥品溶于盛有800ml 的蒸餾水中，在加藥品時，加入的藥品充分溶解后再加入下一種藥品，藥品加完后加水補足 lOOOmL，然后加入細菌瓊脂粉，于117°C滅菌15min。灰霉菌(B.cinerea)由華中農業大學李國慶教授提供，來源于武漢大田油菜葉片。菌株培養在PDA培養基上(前面已述)，28°C培養8d。用無菌水從培養基上洗脫灰霉 病原孢子，配制成含5X105 and 1X106 spores mL—1的孢子懸浮液待用。擬南芥0X_BnERF56超表達株和野生型WT播種于23°C光照培養室內保濕培養(每 天16h光照，8h黑暗)；選取4周齡的擬南芥苗(包括0X-BnERF56超表達株和野生型WT)用 于核盤菌和灰霉的接種實驗，每種基因型至少接種12株，每株接種兩片葉，試驗重復三次。 對于核盤菌接種，菌絲生長在mini培養基上，直徑約2mm的含有核盤菌菌絲的瓊脂塊被接 種到葉的近軸表面；對于灰霉接種，菌絲生長在PDA培養基上，PDA培養基上收集的孢子用 水稀釋到5X105 and 1X106 spores mL—1，接種時先將葉用細針刺傷，然后每個接種點滴加 3ul的灰霉孢子的懸浮液。核盤菌和灰霉菌接種植物都需要保持高濕，溫度和光照與接種前 保持一致。發病后不同時間統計病斑面積，結果如圖8和圖9，與野生型相比，0X-BnERF56 超表達株顯著增強了對核盤菌和灰霉的抗性，表明BnERF56是腐生型真菌核盤菌和灰霉的 抗性相關基因。本發明的優點1通過克隆該基因，研究該基因在植物抗病中的作用，明確了該基因具有增強植株 對腐生型真菌的抗性的功能。通過該基因的過表達，申請人可以人工創造抗性增強材料，為 實現抗性分子育種提供新的抗性基因。2通過克隆該基因，研究該基因對核盤菌侵染的響應，以及在抗性品種和感性品種 中受核盤菌侵染得誘導表達水平。即研究其在植物抗病響應中的表達，從而在植物抗腐生 病害中應用。3通過構建該基因的超表達載體(0X_BnERF56)，轉化擬南芥，獲得有效的的超表 達(0X-BnERF56)轉基因植株，為研究基因功能提供了一個有效的方法。4、通過對轉基因擬南芥進行的核盤菌和灰霉的抗病接種鑒定，得到了該基因的超 表達顯著增強植物對腐生真菌核盤菌和灰霉抗性的結果。說明該基因是植物的抗性相關基 因。


圖1為一種BnERF56與其它ERF基因的氨基酸保守區的比對圖，表明BNERF56基 因與其它ERF基因在ERF保守結構域上高度相似。圖2為一種BnERF56與其它ERF基因的蛋白質全序列的比對圖，表明BNERF56基 因與其它ERF基因在蛋白序列上由差異。圖3BnERF56與其它ERF基因的蛋白質序列系統進化樹分析圖，表明BNERF56基因 與其它ERF基因在蛋白序列上由差異。圖4為一種甘藍型油菜BnERF56基因的組織特異性表達電泳圖。泳道根，莖，葉， 花，角果分別代表經根，莖，葉，花，角果組織的cDNA的PCR擴增結果；圖5為一種BnERF56的表達對和核盤菌侵染的響應圖。Y軸表示BnERF56基因的 相對表達量，X軸核盤菌侵染的后不同時間點。圖6為一種BnERF56基因超表達載體0X_BnERF56的構建示意7為一種BnERF56超表達轉化株中，BnERF56基因和病源相關蛋白基因的相對 表達水平圖。Y軸表示BnERF56基因的相對表達量，X軸表示不同株系。A圖是BnERF56基因的相對表達水平圖，B圖是PDF1. 2基因的相對表達水平圖，C圖是ChiB基因的相對表達 水平圖，D圖是PR-1基因的相對表達水平圖，E圖是PR-2基因的相對表達水平圖。圖8為一種BnERF56基因超表達和干擾轉化株的核盤菌的抗病鑒定圖。Y軸表示 病斑面積，X軸接種后不同時間。圖9為一種BnERF56基因超表達和干擾轉化株的灰霉菌的抗病鑒定。Y軸表示病 斑面積，X軸接種后不同時間。
具體實施例方式根據以下實施例，可以更好的理解本發明，但所述的實施例是為了更好的解釋本 發明，而不是對本發明的限制。實施例1.一種油菜抗性相關基因BnERF56的克隆和表達模式分析1、一種油菜抗性相關基因BnERF56的克隆根據Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進行RNA的提取，具體方法如下分 別取0. 05-0. lg的根、莖、葉、花、角果樣品，在液氮中研磨至粉狀，根據Trirol提取試劑盒 的要求進行RNA的提取。提取的總RNA溶于60uL的無RNase的雙蒸水中。DNase I去除可 能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN,USA)分別檢測RNA在260納米和280納米 下的光吸收值，結合(質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以上述獲 得的RNA為模板按下列方案進行逆轉錄2 ii g RNA中加1 y L Oligo (dT)，70°C溫育5min， 立即置于冰上 5min，短暫離心，加入 5XM-MLV Buffer 4u L, dNTP (lOmmol/L) 1 u L, RNase Inhibitor 20單位，M-MLV逆轉錄酶(購自Promega公司)200單位，用DEPC處理過的無菌 水補至總體積20 u L，混勻，42°C溫育lh，70°C水浴15min，得到的cDNA分裝后于_20°C保存 根據GenBank中擬南芥AtERF56基因序列(at5g61600)，在NCBI網站上用 BLASTN(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)與本實驗室測序獲得的甘藍、甘藍型油菜 和白菜型油菜基因片段序列進行比對，獲得與擬南芥AtBNERF56基因序列5'端同源的甘 藍型油菜的CDS (Coding sequence，編碼序列，以下相同)序列以及和擬南芥AtERF56基因 序列3'端同源的甘藍型油菜的CDS序列。然后根據獲得的甘藍型油菜BNERF56基因的CDS 序列與擬南芥BNERF56基因起始密碼子和終止密碼子同源區域設計引物，從而確保擴增產 物為全長序列。油菜BnERF56擴增引物序列分別為5‘ -TGAAGATAGATGGCAACTAAGCAAGAAG-3' (5'端引物)；5' -AATTCAGMGTTTCAAGTAGCGGAGC-3‘ (3'端引物)。PCR程序為94°C， 5min ；94°C，45s，55°C，45s，72°C，lmin，33 個循環；72°C，10min。結果如圖 1 所示。PCR 反應 產物在的(質量體積比)低熔點瓊脂糖上電泳，把擴增產物條帶從膠上切下放入1. 5ml Eppendoff離心管中，65°C水浴15min，加入等體積苯酚(PH7. 9)，顛倒搖勻5min，13000轉/ 分鐘離心8分鐘，取上清，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24 1)顛倒搖勻5min，13000 轉/分鐘離心8分鐘，取上清，加入1/10體積的3摩爾/升醋酸鈉(PH5. 2)溶液，2倍體積預 冷的95% (質量體積比，以下相同)乙醇，混勻后置-20°C冰箱中20min以上，13000轉/分 鐘離心15分鐘，倒掉95% (前面已述)乙醇后再用75% (質量體積比，以下相同)乙醇浸洗 沉淀，自然風干，DNA沉淀溶于20 ill無菌去離子水。按pMD18-T(購自TaKaRa公司)載體說明書，連接到PMD18-T載體上，轉化大腸桿菌(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯 分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，96-99)。方法如下通過菌落PCR挑選陽性克隆， 引物序列為M13F 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ；M13R 5’ -GTAAAACGACGGCCAGT-3)， 反應體系為10XTaq 酶反應緩沖液 2ul、25mM MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM 引物 0.2111、0.3單位1&卩酶，加無菌水至20111。反應程序為94°C變性5min，94°C 45s、55°C 45s、72°C 2min 32循環，72°C延伸5min。每個PCR產物分別挑選3個克隆搖菌并提取質粒， 測序，獲得BnERF56基因全長序列，一種分離的基因，其序列為SEQ ID No. 1所示核苷酸序 列。利用NCBI的開放閱讀框，尋找程序(ORF founder)確定BnERF56基因的開放閱讀框，推 導出核苷酸序列編碼的多肽，一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。根據獲得的上述核苷酸序列(SEQ ID No. 1)，通過構建BnERF56超表達植物重組載 體(0X-BnERF56)，轉化擬南芥，申請人獲得23株轉基因擬南芥，分別接種腐生真菌核盤菌 和灰霉菌進行抗病鑒定，結果顯示顯著增強了轉基因擬南芥對核盤菌和灰霉菌的抗性。對蛋白質的分子量和理論等電點進行在線計算(http://us. expasyorg/tools/ pi tool.htm)。 用 NCBI 的 Conserved Domains 工具(http://wwwncb.inlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb. cgi)在線進行保守區域分析結果表明該基因含有一個保守的ERF 結構域，屬于乙烯響應轉錄因子(ERF)家族；通過Blastx程序對NCBI的NR數據庫進行同 源性比對，并對具有同源性、不同物種來源的ERF蛋白用ClustalXl. 83進行多序列比對； 用Prosite軟件在線分析該蛋白質的基本結構域。根據上述方法分析結果顯示該基因 的開放讀碼框所推導的蛋白質序列編碼218個氨基酸。在線計算蛋白質的分子量大約為 24155Da，理論等電點約為10. 08。BLASTp在線分析軟件將推導的編碼蛋白與Genebank中 的序列進行同源性比較，發現該序列與AtBNERF56、ERFl、0RA59、AtERF4、AtERF5、AtERF14、 Pti4和Tsil的蛋白質氨基酸序列在ERF保守結構域上的同源性分別達到91. 4%,68. 9%, 70. 7%,74. 1%,84. 5%,75. 9%,74. 和63. 8%，見圖1 ；但是在蛋白全序列上相似性較 低，分別為 68. 2%,25. 7%,24. 8%,23. 4%,21. 5%,28. 4%,23. 2%和 26. 2%，見圖 2 ；表明 BnERF56是一個新的未知功能的ERF轉錄因子。對已克隆的BnERF56蛋白進行系統樹分析 表明BnERF56與擬南芥AtPABP5具有高度的同源性，BnERF56和AtPABP5可能有相似的功 能，見圖3。實施例2.一種油菜抗性相關基因BnERF56的表達模式和病菌侵染響應模式分析1、一種油菜抗性相關基因BNERF56的表達模式分析本發明所用油菜(Brassica napus L.)為甘藍性油菜中雙9號。供試材料播種于
大田，正常田間管理。從同一大田生長條件相同的可育植株上取根、莖、葉、花、角果，每種材料至少取三 個重復，每個重復至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。提取 RNA(方法前面已述)。PCR儀為DNA-Engine (BI0-RAD)，采用油菜Actin作為內標基因(登 錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘和 5' -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3‘。BnERF56 基因引物為 5‘ -TGAAGATAGATGGCAACTAAGCA AGAAG-3'和 5 ‘ -AATTCAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC-3‘。
PCR反應體系為10iiL，正反向引物(10umol/L)各0. 4 ii L，模板1 ii L，加無菌水 補足至 10iiL。擴增條件為:94°0，51^11:941，308，551，308，721，508，25個循環。分別檢 測BNERF56在油菜組織(根、莖、葉、花、角果)中的表達。半定量PCR反應每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技 術重復。分別檢測BnERF56在油菜組織(根、莖、葉、花、角果)中的表達。結果如圖4所示， BnERF56主要在根種表達，其次是莖和葉，花和角果中基本不表達。2、BnERF56基因的表達受核盤菌侵染誘導。對菌核病不同抗性的甘藍型油菜品種M083(高抗)和84039 (高感)由中國農業 科學院油料作物研究所生物技術育種課題組提供，核盤菌菌核培養采用PDA培養基(前面 已述)。菌核病不同抗性的油菜品種M083和84039種子采用土壤盆栽，嚴格控制其生長 條件，油菜生長至四葉一心期時進行菌絲塊活體接種處理。分別在接種后0、6、24、72h等 不同時間點取局部葉，每種材料至少取三個重復，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮 中，-80°C保存。利用Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進行RNA的提取。DNase I消 化后進行逆轉錄反應，得到的cDNA分裝后于-80°C保存備用。熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler (博奧)，采用油菜Actin作為內標基 因(登錄號 AF111812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 禾口 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘ 。 BnERF56 基因 引物為 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘。焚光定 量PCR反應體系為20ii L 含有SYBR Mix 10yL，正反向引物(10iimol/L)各0. 8yL，模板 2iiL，DEPC處理過的無菌水補足至20iiL。擴增條件為94°C，5min ;94°C 15s，60°C 20s， 72°C 30s，40個循環；每個循環于72°C復性末端進行熒光檢測。反應結束后先加熱到95°C， 然后降至72°C，再緩慢升溫至95°C，記錄熒光信號的變化，得出擴增產物的熔解曲線。每組 實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技術重復。分別檢測BnERF56基 因在不同抗性品種中，侵染后不同時間點的表達。用比較Ct法(A ACt)計算基因的相對表達量。利用儀器所帶軟件，首先優化內 標基因和目的基因擴增條件，分別測定Actin和目的基因的Ct值，選取九次實驗測定值中 最為接近的三次結果(Ct值系統誤差小于0. 3)取平均值，然后通過內標基因對目的基因進 行校正得到A ACt，最后通過2_AAet估算目的基因的相對表達量和系統誤差(前面已述)。 在計算相對表達量時，以水處理的擬南芥葉片樣本為參照，即將其值轉換成1，其它處理樣 品再與其比較，獲得相對表達值。結果如圖5所示，BnERF56是一個在受核盤菌侵染誘導的 基因，在抗性品種中的表達高于感性品種中的表達，表明BnERF56是一個抗性相關基因。實施例3 一種抗性相關的BnERF56基因在增強植物對核盤菌抗性、對灰霉菌抗性中的應 用，其步驟是l、BnERF56基因超表達載體(0X_BnERF56)的構建和根癌農桿菌菌株EHA105轉化 (購于上海滬尚生物科技有限公司)構建的重組載體是將實驗室構建的質粒PG4A (Zheng Wang，Han Mao，Caihua Dong,Ruiqin Ji,Li Cai,Hao Fu,and Shengyi Liu Overexpression of Brassica napusMPK4 Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Oilseed Rape MPMI, 22 (3)，2009，235-244.)上的目的基因用前期克隆得到的BnERF56基因替換而來。為完成此 目的，首先用Pstl/Xhol雙酶切克隆的BnERF56基因片段，同時用Pstl/Xhol酶切PG4A質 粒(前面已述)。酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之后，用瓊脂糖膠電泳 檢測。將酶切后的BnERF56基因片段和PG4A質粒(前面已述)上切下的大片段用DNA凝 膠回收試劑盒(前面已述)回收。把BnERF56基因片段比PG4A質粒(前面已述)載體片 段按3 1(摩爾濃度比)的比例混合樣品，加入T4 DNA連接酶5單位，10X反應緩沖液， 無菌水補充體積至20iiL，16°C連接過夜。轉化后，在含有卡那霉素(50iig/mL)固體LB平 板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質粒，酶切驗證正確的重組質粒命名為0X-BnERF56，并 對獲得的載體進行測序以驗證準確性。載體結構如圖6。然后利用凍融法(前面已述)將0X_BnERF56轉入根癌農桿菌EHA105(購自大連寶 生物生物制品有限公司，以下相同)，涂布于含有50 u g/mL卡那霉素和利福平(50 u g/mL) 的LB固體(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂 依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859X104Pa 下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR 檢測(前面已述)。本發明所使用的研究BnERF56基因功能的重組植物表達載體，含有所述BnERF56 基因的編碼區核苷酸序列，組成型35S啟動子可以增強BnERF56基因的表達水平。該載體 大小適合，在植物中易與轉化，所帶有的除草劑標記基因Bar表達強度高，容易檢測。通過 這個載體轉化擬南芥可以獲得菌核病抗性增強的擬南芥轉基因植株。2、BnERF56基因超表達載體(0X-BnERF56)的遺傳轉化參照文獻中的方法進行擬南芥轉化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1 1-6)。制備含有構建好載體的根癌農桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉化前一天轉 入含有卡那霉素50 u g/ml、利福平50 u g/ml的LB液體培養基中，28°C過夜培養。第二天， 用紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測的吸光值，當菌液的吸光值達 到在1.6-2.0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，將沉 淀懸浮于等體積的5%蔗糖(質量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉 化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet L-77(購自北京五洲元業科貿中心，以下 相同)。混勻后把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15s，取出植株。轉 化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地 方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥 3-5天。具體流程如下①把利福平配制成為50Mg/ml的濃縮液，放于4度保存，使用前要吹打均勻，稀釋 100倍使用。②在5ml的LB液體培養基中加入5微升利福平濃縮液，搖勻，挑入單菌落，活化過夜。③看到活化的菌液很混濁時，吸出不少于2ml活化的菌液，加入在200ml的LB液 體培養基中，28度200轉培養過夜至0D值1. 6-2. 0。
④4000g室溫離心10分鐘(臺式離心機SIGMA2-16K)，4500轉，棄上清，在濾紙上 扣干。⑤配制好5% (質量體積比)蔗糖溶液200毫升，將上一部收集獲得的沉淀溶解， 用槍吹打均勻。⑥將溶解好的菌液加到平皿中，50毫升溶液/平皿，然后加入40微升的 SiLwet-L-77 (前面已述)混勻。⑦將擬南芥的植株的花序浸入平皿中，用手將分枝的花攏在一起，輕輕浸入其中 15秒。⑧用不透明的袋子將每一個質粒轉化的擬南芥植株套好，避光保濕一天即可。⑨一個星期后再重復轉化一次。將轉化收獲的TO代種子播在混有PNS營養液的蛭石中，(PNS營養液成份為每升 含 5ml 1M KN03，2ml 1M Ca(N03) 2 .4H20，2ml 1M MgS04 .7H20，2. 5ml20mM Fe. EDTA, 2. 5ml 1M磷酸緩沖液(pH5.5)，lml MS微量元素)；4°C春化一星期，在21_22°C的生長間中自然生 長兩星期左右，待到達四葉期的早期進行除草劑草胺磷(30mg/L)的噴灑第一次，一星期之 后進行第二次噴灑。兩次噴灑后對存活的綠苗進行PCR陽性檢測，獲得擬南芥轉基因陽性
田o轉化苗的篩選及PCR鑒定根據本實驗室進行的除草劑草胺磷濃度梯度篩選實 驗，確定除草劑(草胺磷，購自拜爾公司，以下相同)篩選濃度為30mg/L。T1代植株在苗期 (播種后10天)噴施30mg/L除草劑，得到成活植株。PCR檢測篩選苗待四葉苗時期，取一 片真葉(播種時期大約為四星期)用CTAB法(前面已述)提取基因組DNA，根據表達載體 上外源BnERF56基因序列，設計引物進行PCR檢測(序列為F-5 ‘ TGAAGATAGATGGCAACTA AGCMGAAG3 ‘ R-5 ‘ AATTCAGAAGTTTCAAGTAGCGGAGC ‘ ) ；PCR 反應體系如下基因組 DNA 模板 liiL(約 50ng)、10XTaq 酶反應緩沖液 2ul、25mM MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM 引物 各0.2111、0.3單位1&9酶，加無菌水至20111。反應程序為941變性51^11，941 45s、55°C 45s、72°C 2min 32循環，72°C延伸5min。用(質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 反應產物，結果表明該超表達(0X-BnERF56)載體已經成功轉入擬南芥。實施例4:一種抗性相關的BnERF56基因在增強植物對核盤菌抗性、對灰霉菌抗性中的應 用，。其步驟是l、BnERF56基因的超表達增強了病源相關蛋白表達通過熒光定量PCR驗證干擾效率并觀察轉基因擬南芥T1代表型。觀察結果顯示， 在正常生長狀況下，各BnERF56基因超表達轉基因植株與野生型植株并無明顯差異；PCR鑒 定后獲得轉基因T2代超表達(0X-BnERF56)各個株系的幼苗。摘取這些幼苗的葉片，速凍于 液氮中，用Q-PCR對目標基因BnERF56的表達水平進行分析。具體方法如下取經過PCR檢 測后獲得的T2代陽性植株的葉片，在液氮中將植物幼嫩葉片樣品研磨至粉狀，利用Trirol 提取試劑盒的要求進行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I去 除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650 BECKMAN,USA)分別檢測RNA在260納米和280 納米光吸收值，結合(質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的 RNA為模板進行逆轉錄(前面已述)，得到的cDNA分裝后于_20°C保存備用。
熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler (博奧)，采用擬南芥Act in作為內標基因。BnERF56 引物為 5 ‘ -GGAGGAAGAGACGGTGCCGGTTAGG-3 '和 5 ‘ -GCGGAGCTGGGAGACGTCGGAGTTA-3 ‘； 擬南芥 PDF1. 2 引物為 5 ‘ -TGTTCTCTTTGCTGCTTTCGACG-3 ‘ 禾P 5' -GCATGATCCATGTTTGGCTCCT-3‘；擬南芥ChiB 引物為 5‘ -ATCAGCGCTGCAAAGTCCTTC-3‘ 和 5 ‘ -GTGCTGTAGCCCATCCACCTG-3 ‘；擬南芥冊_1 引物為 5 ‘ -TTCTCCCTCGAAAGCTCAA-3 ‘ 和 5 ‘ -AAGGCCCACCAGAGTGTATG-3 ‘；擬南芥冊_2 引物為 5 ‘ -AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3 ‘ 和 5 ‘ -CCCGTAGCATACTCCGATTT-3‘；熒光定量PCR反應體系為20iiL:含有SYBR Mix 10 y L，正反向引物(10 y mol/L) 各0. 8 ii L，模板2 u L，DEPC處理過的無菌水補足至20 u L。擴增條件為94°C，5min ；94°C 15s,60°C 20s,72°C 30s，40個循環；每個循環于72°C復性末端進行熒光檢測。反應結束后 先加熱到95°C，然后降至72°C，再緩慢升溫至95°C，記錄熒光信號的變化，得出擴增產物的 熔解曲線。每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技術重復。用比較Ct法(A ACt)計算基因的相對表達量。利用儀器所帶軟件，首先優化內 標基因和目的基因擴增條件，分別測定Actin和目的基因的Ct值，選取九次實驗測定值中 最為接近的三次結果(Ct值系統誤差小于0. 3)取平均值，然后通過內標基因對目的基因 進行校正得到A ACt，最后通過2_AAet估算目的基因的相對表達量和系統誤差(前面已 述)。在計算相對表達量時，以野生型擬南芥葉片的樣本為參照，即將其值轉換成1，其它樣 品再與其比較，獲得相對表達值。結果顯示BnERF56超表達效率非常明顯，如圖7所示而 BnERF56基因超表達轉基因植株中，BnERF56的表達被顯著上調17-30倍，相應的，病源相關 蛋白PDF1. 2, ChiB, PR-1和PR-2的表達也顯著上調；表明BnERF56基因的超表達升高了病 源相關蛋白表達，增強了植物的抗病能力。實施例5:一種抗性相關的BnERF56基因在增強植物對核盤菌抗性、對灰霉菌抗性中的應 用，其步驟是l、BnERF56基因超表達顯著增強植株對腐生型真菌核盤菌和灰霉菌的抗性核盤菌(Scleortinia sclerotiorum)菌核采自武漢大田油菜莖桿；選完好菌核， 先用75%酒精(體積比)泡1分鐘，再用0. 1 % HgCl2消毒8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次。 把滅菌菌核切去兩端，中間部分切成綠豆大小，切面朝下，接種于Minimal平板。通常每粒 菌核接一板，一次接種8-9板。于22°C靜置培養3-4天，當菌核即將鋪滿平板時，用cj^mm 打孔器沿菌絲外緣打孔，取菌絲塊，用于接種。Minimal培養基(1L)配方NaOH lg，DL_蘋 果酸3g，NH4N03 2g，MgS04 -7H20 0. lg，細菌瓊脂粉39g ；按順序將上面藥品溶于盛有800ml 的蒸餾水中，在加藥品時，加入的藥品充分溶解后再加入下一種藥品，藥品加完后加水補足 lOOOmL，然后加入細菌瓊脂粉，于117°C滅菌15min。灰霉菌(B.cinerea)由華中農業大學李國慶教授提供，來源于武漢大田油菜葉 片。菌株培養在PDA培養基上(前面已述)，28°C培養8d。用無菌水從培養基上洗脫灰霉 病原孢子，配制成含5X105 and 1X106 spores mL—1的孢子懸浮液待用。擬南芥0X-BnERF56超表達株和野生型WT播種于23 °C光照培養室內保濕培養(每 天16h光照，8h黑暗)；選取4周齡的擬南芥苗(包括0X-BnERF56超表達株和野生型WT)用 于核盤菌和灰霉的接種實驗，每種基因型至少接種12株，每株接種兩片葉，試驗重復三次。
17對于核盤菌接種，菌絲生長在mini培養基上，直徑約2mm的含有核盤菌菌絲的瓊脂塊被接 種到葉的近軸表面；對于灰霉接種，菌絲生長在PDA培養基上，PDA培養基上收集的孢子用 水稀釋到5X105 and 1X106 spores mL—1，接種時先將葉用細針刺傷，然后每個接種點滴加 3ul的灰霉孢子的懸浮液。核盤菌和灰霉菌接種植物都需要保持高濕，溫度和光照與接種前 保持一致。發病后不同時間統計病斑面積，結果如圖8和圖9，與野生型相比，0X-BnERF56 超表達株顯著增強了對核盤菌和灰霉的抗性，表明BnERF56是腐生型真菌核盤菌和灰霉的 抗性相關基因。
權利要求
一種分離的基因，其序列為SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.權利要求2所述的一種油菜BnERF56基因在增強植物對腐生營養型真菌核盤菌抗性 中的應用。
4.權利要求2所述的一種油菜BnERF56基因在增強植物對腐生營養型灰霉菌抗性中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種增強植物對腐生營養型真菌抗性的BnERF56基因及制備方法和用途，一種分離的基因，其序列為SEQ ID No.1所示核苷酸序列。一種分離的多肽，其序列為SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。一種BnERF56基因在增強植物對腐生營養型真菌核盤菌和灰霉菌抗性中的應用。該基因在病源侵染后顯著誘導表達。涉及抗病相關基因BnERF56的分離克隆、表達調控和應用。BnERF56基因可以增強植物對腐生營養型真菌核盤菌和灰霉菌的抗性。通過基因工程技術升高BnERF56基因的表達能夠增強植物對腐生營養型真菌核盤菌和灰霉菌的抗性，可作為抗性標記用于油菜抗病品種的選育，或者作為基因工程的候選基因用于分子育種。
文檔編號C07K14/415GK101921776SQ201010230380
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者劉勝毅, 劉越英, 汪承剛, 董彩華, 黃軍艷 申請人:中國農業科學院油料作物研究所