專利名稱：甘藍型油菜核不育恢復基因BnaC.Tic40及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于油菜育種技術領域。具體涉及一個油菜隱性核不育恢復基因BnaC.Tic40 (BnMs3)的分離克隆、功能驗證和應用。本發明涉及的顯性基因BnaC. Tic40是隱性核基因BnaA. Tic40-1 (Bnms3)的功能獲得性變異的同源基因。恢復基因BnaC. Tic40的克隆、驗證和應用可以加快油菜等作物隱性細胞核雄性不育系和臨保系的選育，從而在繁殖制種時獲得100%不育的群體。
背景技術：
植物在有性繁殖的過程中不能產生正常花粉的遺傳現象稱為雄性不育，它涉及到花器中雄蕊的發生與發育、絨氈層結構、小孢子形成、花藥開裂以及外部生態環境等很多環節。雄性不育可以分為細胞質雄性不育(CMS)和細胞核雄性不育(GMS)。細胞質雄性不育為人類所知已有100多年的歷史，并且在水稻、玉米、油菜等作物中廣泛的用于生產雜交 種。目前，世界上可以用于油菜雜種優勢利用的CMS系統有ogiukos、tour和波里馬。其中，波里馬CMS是目前國際上公認的最有實用價值的CMS系統(傅廷棟，雜交油菜的育種與利用，湖北科學技術出版社，2000)，但是波里馬不育系育性受到溫度的影響表現不穩定，制種風險較大，其應用受到了一定的限制。細胞核雄性不育系由于育性表現穩定，易于回交轉育獲得新的不育系，并且一般不受恢保關系的限制，近年來受到育種家的廣泛關注。目前國內外利用的油菜核不育系主要有以下四種類型顯性核不育、兩對隱性基因控制的核不育、互作型核不育和轉基因核不育。四川省宜賓地區農科所(1972)發現的宜3A是顯性核不育系的典型代表，目前還沒有選育出大面積推廣的雙低雜交組合。美國和加拿大利用煙草的TA29基因的啟動子和核糖核酸水解酶(barnase)基因構建成融合基因轉化甘藍型油菜，人工創造了新的核不育材料，并通過向該材料中導入抗除草劑基因后達到了機械化作業。但是該系統的不足之處是必須對不育系和恢復系都進行轉基因，該系統目前也受到專利的保護。S45A(潘濤等，1988)和117A(侯國佐等，1990)是兩對隱性基因控制的核不育系的典型代表，由其選育而來的雜交種中已審定的有“蜀雜6號” “蜀雜7號”、“油研7號”、“油研8號”和“油研9號”等。這類系統主要缺點是不育系中存在50%的可育株，在制種時需要在初花期拔掉50%的可育株，由此不僅增加了制種的成本，而且往往由于可育株清除不徹底，影響制種純度，增加了生產的風險。9012A (陳鳳祥等，1998)和7365A(Huang et al.，2007)均屬于隱性上位互作型核不育系，以其為材料選育的品種中，已審定的雜交種有“皖油14號”、“皖油18號”(陳鳳祥等,2002 ；2003)和“滬油雜I號”(孫超才等，2004)等組合，該系統通過引入臨保系犾得100%的全不育系，在油菜核不育系統研究領域取得了重大進展。但是這個系統遺傳基礎復雜、臨保系選育困難，不利于選育強優勢組合。克服隱性上位互作型核不育這個缺點的可行性策略是建立不育恢復基因和上位基因的分子標記體系，克隆恢復基因和上位基因，利用分子標記實現不育系的臨保系的定向選擇。而且，開展核不育恢復基因的克隆和功能研究，對促進核不育雜種優勢利用，具有重大的理論意義和實用價值。
發明內容
本發明的目的在于克隆一個甘藍型油菜核不育恢復新基因BnaC. Tic40，利用該基因恢復甘藍型油菜隱性核不育系7365A、9012A的育性，或作為新的核不育系和臨保系選育的分子標記，以加快甘藍型油菜核不育系和臨保系的選育。申請人:通過分離和克隆技術，從甘藍型油菜中分離得到一種甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。分離得到一種甘藍型油菜隱性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所不；該基因編碼的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO 4所不。
可以采用已經克隆的多核苷酸作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發明的基因或同源基因。同樣，米用PCR(polymerase chain reaction)技術,也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發明的基因以及任何感興趣的一段多核苷酸或與其同源的一段多核苷酸。本發明為甘藍型油菜細胞核雄性不育遺傳改良提供了新用途，其中包括作為恢復甘藍型油菜核不育系的育性；或作為新核不育系與臨保系選育的分子標記。在本發明的實施例部分，申請人闡述了隱性基因BnaA. Tic40_l和顯性基因BnaC.Tic40的分離、功能驗證和應用過程以及這兩個基因的特點。
序列表SEQ ID NO :1.本發明分離的甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40的核苷酸序列，來源于甘藍型油菜核不育兩型系中的可育株7365B。序列表SEQ ID NO :2.本發明分離的甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40編碼的蛋白質的氨基酸序列，來源于甘藍型油菜核不育兩型系中的可育株7365B。序列表SEQ ID NO :3.本發明分離的甘藍型油菜隱性核不育基因BnaA. Tic40_l的序列，來源于甘藍型油菜核不育兩型系中的不育株7365A。序列表SEQ ID NO :4.本發明分離的甘藍型油菜隱性核不育基因BnaA. Tic40_l編碼的蛋白質的氨基酸序列，來源于甘藍型油菜核不育兩型系中的不育株7365A。圖I.本發明鑒定、分離、克隆并驗證甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40和它的基因功能的流程圖。圖2.覆蓋甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40區段的物理圖譜。圖中空心線表示BnaC. Tic40基因精細定位的遺傳圖譜；分子標記下面的數字表示在近等基因系群體中檢測到的BnaC. Tic40位點與分子標記之間發生重組交換的單株數；連接分子標記和BAC克隆的豎虛線表示通過序列比較分析證實了相對應的分子標記和BAC克隆具有同源性；實線表示細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆和擬南芥染色體；線上的橢圓代表相應區域擬南芥基因組圖譜上注釋的基因；線上的黑點代表根據BAC序列預測的甘藍型油菜基因。圖3.候選基因啟動子分析載體的結構。RB和LB =T-DNA的右側和左側邊界；NOS-pro :N0S啟動子APTII(Kanlr):新霉素磷酸轉移酶II基因；N0S_ter :N0S終止子；(；US 葡萄糖醛酸糖苷酶基因。圖4.擬南芥TO代遺傳轉化植株花蕾⑶S染色結果。只有恢復基因BnaC. Tic40的啟動子分析載體PBIP4-GUS轉化后的TO代遺傳轉化植株花蕾可看到明顯的GUS著色信號。圖5.甘藍型油菜功能互補測驗表達載體pC2300_BnaC. Tic40的構建圖。圖6.具有7365A遺傳背景的TO代遺傳轉化甘藍型油菜植株開花后育性表型與7365A和7365B表型的比較。7365A遺傳轉化TO代植株攜帶顯性基因BnaC. Tic40的候選基因，表現為花絲伸長，育性恢復，花粉KI染色正常。圖7.甘藍型油菜隱性核不育系7365A半薄切片顯微解剖結構。b、d、e、g、i、k和 m分別是正常花藥花粉母細胞時期、減數分裂前期與減數分裂后期、四分體時期、單核早期、單核靠邊期和成熟期半薄切片顯微照片，a、C、e、h、j、I和n分別是不育花藥對應時期的半薄切片顯微照片。MC:小孢子母細胞。T :絨氈層。TCW:絨氈層細胞壁。MMC:花粉母細胞。PCW:胼胝質壁。TE:四分體。M :小孢子。PW:花粉外壁。圖8.甘藍型油菜隱性核不育系7365A超薄切片顯微解剖結構。a、c分別是正常花藥減數分裂后期和四分體時期絨氈層細胞結構；b、d分別是不育花藥對應時期的絨氈層細胞結構。T :絨氈層細胞。N :細胞核。P:質體。TCW:絨氈層細胞壁。ER:內質網。圖9 :甘藍型油菜隱性核不育系7365A胼胝質觀察。D、E、F分別是正常花藥花粉母細胞時期、四分體時期和單核期用苯胺藍染色后觀察胼胝質熒光的顯微照片。A、B、C分別是不育花藥對應時期的胼胝質熒光的顯微照片。圖10 :甘藍型油菜隱性核不育系7365A胼胝質脂類物質合成。A、C、E和G分別是正常花藥減數分裂時期、四分體時期、單核早期和單核靠邊期用蘇丹黑B染色后的顯微照片，顏色越深說明脂類物質含量越高。B、D、F和H是不育花藥對應時期蘇丹黑B染色后的顯微照片.
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步定義本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如《分子克隆實驗室指南》(New York Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)中所述的條件，或者按照生產廠商提供的操作手冊中建議的條件。實施例I :構建含甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40區段的物理圖譜并精細定位不育恢復基因BnaC. Tic40aI.實驗材料本實驗所用的材料為甘藍型油菜隱性核不育兩型系7365AB (Huang et al. ,TheorAppl Genet. ,2007,115 :113-118)，其中不育株稱為 7365A，可育株稱為 7365B。材料 7365AB經過多代的兄妹交(25代以上)保存。另一個甘藍型油菜隱性核不育兩型系750AB(Huanget al. ,Mol Breeding, 2010, DOI10. 1007/sl 1032-010-9536—8)材料來源將 7365A 的核不育基因導入到新型甘藍型油菜750中，后代自交，選擇不育系作供體親本，并用750作為輪回親本，通過多代回交然后兄妹交后得到的近等基因系750AB。
隱性核不育基因的定位群體7365AB和750AB是由其對應的不育株和可育株兄妹交后構建的近等基因系群體(Huang et al. , Theor Appl Genet. , 2007,115 :113-118 ；Huang et al. ,Mol Breeding, 2010,D0I10. 1007/sll032-010-9536_8)，2007 年秋播種于武漢，2008年春天提取2135個來源于7365AB近等基因系和5022個來源750AB近等基因系的不育單株的DNA (提取DNA的方法參見Stewart and Via，1993，14 (5) :748-749)，用于基因的精細定位。2.精細定位不育恢復基因BnaC. Tic40根據初步定位的結果該基因位于油菜N19連鎖群的SCAR (Sequencecharacterized amplified region)標記 AR23 和 AR48 之 間(He et al. , Theor ApplGenet.，2008，117 :11-18)。即 BnaC. Tic40 位點位于 AR23 和 AR48 之間。設計的引物的核苷酸序列如下所示AR23F 正向引物 ITGTTCGCAAATGGITITTC，AR23R 反向引物 TATGGCCATCTCCAGACTGA ；AR48F 正向引物 ITCAACTCTCTCCGGAACCTG，AR48R 反向引物 CGGTAGCGGTTGCTTCTGIT。為了進一步縮小目標基因區域的范圍，基于內含子的多態性，申請人根據目標區域的序列設計了 57對特異引物(或稱之為標分子記)，發現21個IP分子標記(或稱引物)在親本間表現多態性。分子標記IPl和IP5在7365AB近等基因系群體的2135個不育單株中分別檢測到3個和5個交換單株，這些單株在標記和BnaC. Tic40位點間發生了重組(圖2)。然后用其余的IP標記對交換單株進行分析，發現兩側最近的分子標記是引物IP8R、IP8FF和IP17R，IP17F兩個標記分別有I個單株在標記與BnaC. Tic40間表現交換，并有10個IP標記與BnaC. Tic40基因表現為共分離。對與目標區段共線的擬南芥區域進行分析，發現該區域內有43個候選基因。為縮小候選基因范圍，申請人用標記IP8和IP17掃描了來源于近等基因系750AB的5022個不育株群體，IP8和IP17分別檢測到2個和I個交換單株，這些單株在標記和BnaC. Tic40位點間發生了重組，用在上一個群體中與BnaC. Tic40表現共分離的10個IP標記對交換單株進行分析，最近兩側標記IP21和IP18分別檢測到一個單株在標記與BnaC. Tic40間表現交換。通過以上精細定位，將BnaC. Tic40基因定位于分子標記IP21和IP18之間，與IP11、IP16共分離。用于精細定位的引物多的核苷酸序列見表I所示。表I精細定位的引物多的核苷酸序列IP IFGT AGGGTATCTAAGGCACTAA AGGC
IP IRGGTTGATGGATAGATATGACCAGC
IP2FTAACCAATTTGAGAGATAGCC
IP2RCTCGCAGTCTAGGAGAATCG
IP3FCAAGCAATGCTACTTCGACC
IP3RCCAATACTCCGTATAAAATTTTGT
IP4FGAACTTGAATACATTCTTCATGIP4RGGAGAGACTTGTGGTGCTTC
IP5FTGTTGGATGGGAAGAGTACAG
IP5RTAGCAAACTGTCCCACAAGC
IP6FAGCAGAATCAGGTCAAACCT
IP6RCAGATCCTGCGCCTCACT
IP7FCCAAGATTTGCTGC AAAGAC
IP7RACGGCTTCACAGTAGTCATC
IP8FGCTGTCCACAGATATCACTATTAC
權利要求
1.一種分離的甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 1 所示。
2.一種分離的甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC. Tic40，其編碼的氨基酸序列如SEQ IDNO :2 所示。
3.一種分離的甘藍型油菜隱性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 3 所示。
4.一種分離的甘藍型油菜隱性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
5.權利要求I至4任一項所述的基因在甘藍型油菜細胞核雄性不育遺傳改良中的應用。
全文摘要
本發明屬于作物分子育種技術領域。具體涉及一種油菜隱性核不育恢復基因BnaC.Tic40的分離克隆、功能驗證和應用。本發明分離的甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnaC.Tic40，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，它編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。分離的甘藍型油菜隱性雄性不育基因BnaA.Tic40-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。本發明還公開了所述的基因在甘藍型油菜細胞核雄性不育遺傳改良中的應用。利用分子標記技術定位和克隆恢復基因BnaC.Tic40，可以加快油菜等作物隱性細胞核雄性不育系和臨保系的選育，從而在繁殖制種時獲得100％不育的群體，突破核不育系在油菜等作物雜種優勢利用中的瓶頸。
文檔編號C07K14/415GK102747087SQ20111009655
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者傅廷棟, 文靜, 易斌, 李興華, 沈金雄, 涂金星, 頓小玲, 馬超芝 申請人:華中農業大學