專利名稱：利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮l-茶氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及分離、提取L-茶氨酸的方法，具體涉及應用集成膜技術從微生物發酵酶轉化L-茶氨酸的酶轉化液分離、濃縮L-茶氨酸的方法。
背景技術：
L-茶氨酸(N-乙基-Y-谷氨酰胺，theanine)是一種天然的氨基酸，是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉中有效的呈味物質。L-茶氨酸主要用于(1)作為一種新興的食品添加劑，可用作為茶飲料的品質改良劑、改善食品風味的添加劑、功能食品的添加劑、 “情緒食品”的添加劑等。已在歐美、日本、中國臺灣等國家、地區廣泛使用。如日本已開發出添加茶氨酸的巧克力、果凍、布丁、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。(2)作為醫藥中間體領域，茶氨酸可以用作抗腫瘤、降血壓、安神鎮靜、抗疲勞等藥物中。此外L-茶氨酸現已作為鎮靜劑中的有效成分，對帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導神經功能紊亂等疾病起預防效果。L-茶氨酸的生產方法主要有茶葉提取法、化學合成法、微生物發酵酶轉化法。(1) 茶葉提取法由于茶葉中茶氨酸的含量不高，從茶葉提取茶氨酸無法實際生產價值。所以植物提取法實際上是從提取茶多酚后的殘留液中用離子交換樹脂法提取茶氨酸。缺點是生產工序復雜、產品純度低、產量小、價格高。(2)化學合成L-茶氨酸需要高溫、高壓及化學催化劑等條件，反應條件要求比較高，副產物多，且產生的都是DL-型消旋體，還需要進行拆分才能得到L-型產品。因此，消旋體的拆分是制約茶氨酸的化學合成法的主要因素。由于化學合成方法在解決手性方面有一定難度，因此會使成本提高以及質量難以控制，且易混雜有毒物質，產品不宜用于食品行業應用，同時生產工藝復雜，且易造成環境污染。(3)微生物發酵酶轉化法生產的L-茶氨酸都是L型的，且生產成本低，可大量生產，由于生物酶法合成具有高度的專一性，所以在產品質量方面更接近天然的L-茶氨酸，其發展前景非常廣闊。 此外酶轉化法生產L-茶氨酸還具有純度高、副產物少、純化步驟少、生產能力強等優點，， 因此微生物發酵法是目前國內外研究人員公認的最直接、最經濟的L-茶氨酸生產方法。在微生物發酵酶轉化L-茶氨酸酶轉化液中，除有底物L-谷氨酰胺、乙胺目標產物 L-茶氨酸等成分外，還有微生物菌體、細胞碎片、雜蛋白、小肽和色素等雜質，故L-茶氨酸的分離濃縮工藝難度大，目前國際上報道的分離濃縮L-茶氨酸方法是離子交換樹脂分離法，在某一 PH情況下，用離子交換樹脂吸附酶轉化液中L-茶氨酸，然后再在另一 PH溶液下洗脫被吸附的L-茶氨酸，經濃縮得到L-茶氨酸。但是，從操作工藝、分離濃縮、產品純度、 經濟效益上分析，離子交換樹脂的平衡活化，洗雜洗脫、再生清洗都需要消耗大量的酸堿和水，需要的設備和樹脂成本較高，同時還產生大量難處理廢水，另外L-茶氨酸收率不高(一般低于70%)和產品純度低，因此開發一種高收率、低成本的L-茶氨酸分離、濃縮方法對促進L-茶氨酸的工業化生產顯得十分迫切。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高收率、低成本、產品純度高的從酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法。本發明的技術方案如下
利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法， 包括如下步驟
(a)將酶轉化液利用孔徑為0.001-0. 01 μ m的超濾膜進行過濾，過濾后得到超濾膜透過液；
(b)將超濾膜透過液用納濾膜進行過濾，截留分子量為200-1000的物質，過濾后得到納濾膜透過液；
(c)將納濾膜透過液通過反滲透膜進行濃縮提取，得到濃縮液；
(d)將濃縮液真空濃縮，結晶得到L-茶氨酸晶體。步驟(a)中的操作壓力為0. 15-0. 45MPa，操作溫度為20_40°C、pH為8-12 ；步驟 (b)中的操作壓力為1. 5-2. OMpa，操作溫度為20_35°C，pH為8_11 ；步驟(c)中的操作壓力為 15-25Mpa、操作溫度為 25-35°C、pH 為 7-10。步驟(a)中酶轉化液利用超濾膜進行過濾后，加水稀釋過濾得到超濾膜透過液； 步驟(b)中超濾膜透過液用納濾膜進行過濾后，加水稀釋過濾得到納濾膜透過液。所述水選自純化水、去離子水、蒸餾水中的一種或幾種。所述超濾膜的材質選自陶瓷、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚砜酰胺中的一種。所述納濾膜的材質為聚酰胺。所述反滲透膜的材質為醋酸纖維素或芳香聚酰胺。本發明所用的超濾膜只需滿足孔徑為0. 001-0. 01 μ m即可，優選膜的材質選自陶瓷、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚砜酰胺
本發明所用的納濾膜能截留分子量為200-1000并具有類似于聚酰胺納濾膜結構的膜。由于谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶合成L-茶氨酸的酶轉化液中，除有底物L-谷氨酰胺、乙胺、L-茶氨酸等成分外，還有少量微生物菌體、細胞碎片、雜蛋白、小肽和色素等雜質，采用孔徑為0. 001-0. 01 μ m的超濾膜對酶轉化液進行過濾，因超濾膜的截留分子量范圍是1000 - 200000，酶轉化液中的少量微生物菌體、細胞碎片、大分子的色素和雜蛋白的分子量都大于1000，所以超濾膜可有效截留這些雜質，而對分子量小于200的L-茶氨酸產品沒有截留作用；然后用孔徑截留分子量為200-1000的納濾膜對透過液進行過濾，一些小分子色素和小肽的分子量正好在200 1000之間，可被納濾膜截留，另外由于納濾膜的電荷效應能有效截留少量離子；最后通過反滲透膜對目標產物進行濃縮提取，是最精細的一種膜分離產品，其能有效截留分子量大于100的有機物，同時允許水分子通過，故能達到濃縮L-茶氨酸的目的。本發明具有如下優點
1提取工藝全部采用膜技術分離工藝，操作簡單且易實現自動化，收率高，產品純度高， 耗能少，污染物少；
2整個分離、濃縮過程全部采用物理分離法，分離濃縮過程中不消耗酸堿和蒸汽，水的使用量也大量減少，提取濃縮成本也大大減低。3采取集成膜分離技術，膜及其配套設備使用壽命長，操作容易，裝置維護方便，投資成本低。
具體實施例方式本發明所用的酶轉化液為谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶合成L-茶氨酸的酶轉化液 (簡稱L-茶氨酸酶轉化液)。實施例1
(a)取100升L-茶氨酸酶轉化液，L-茶氨酸的濃度為15.4克/升，選用0. 5m2的管式陶瓷超濾膜在0. 2Mpa，溫度為32pH為10. 5時進行過濾，膜孔徑為0. 001-0. Olum，截留液體積為15L時，加IOL純化水稀釋后再過濾，重復3次后，得到超濾膜透過液113升，超濾膜透過液中L-茶氨酸濃度為13. 5克/升；
(b)將超濾膜透過液113升，用孔徑截留分子量為300的聚酰胺納濾膜在壓強為
1.5MPa,溫度為30°C，pH為9. O的條件下進行過濾，截留液體積約20L時，加20L去離子水稀釋后再過濾，重復3次后，得到納濾膜透過液143. 2L，納濾膜透過液中L-茶氨酸的濃度為 10. 3克/升;
(c)將納濾膜透過液143.2升，經膜材料為醋酸纖維素的反滲透膜在壓強為18MPii，溫度為34°C，pH為8. O的條件下濃縮，最終得到濃度為90. 6克/升的L-茶氨酸濃縮液16. 1 升；
(d)將濃縮液真空濃縮、結晶得到純度為99.4%得L-茶氨酸晶體1436克，整個分離、濃縮工藝L-茶氨酸的收率為93.實施例2
(a)取100升L-茶氨酸酶轉化液，L-茶氨酸的濃度為15.4克/升，選用0. 5m2的管式聚偏氟乙烯超濾膜在0. 3Mpa，溫度為25°C, pH為10. 5時進行過濾，膜孔徑為0. 001-0. Olum, 截留液體積為15L時，加IOL蒸餾水水稀釋后再過濾，重復3次后，得到超濾膜透過液118 升，超濾膜透過液中L-茶氨酸濃度為13. O克/升；
(b)將超濾膜透過液118升，用孔徑截留分子量為400的聚酰胺納濾膜在壓強為
2.OMPa,溫度為25°C，pH為9. 5的條件下進行過濾，截留液體積為20L時，加20L純化水稀釋后在過濾，重復3次后，得到納濾膜透過液150 L，納濾膜透過液中L-茶氨酸的濃度為 10. 1克/升;
(c)將納濾膜透過液150升，經膜材料為醋酸纖維素的反滲透膜在壓強為20.OMPa,溫度為30°C，pH為8. 5的條件下濃縮，最終得到濃度為97. 6克/升的L-茶氨酸濃縮液15 升；
(d)將濃縮液真空濃縮、結晶得到純度為99.7%的L-茶氨酸晶體1393克，整個分離、濃縮工藝L-茶氨酸的收率為90. 5%。實施例3
(a)取100升L-茶氨酸酶轉化液，L-茶氨酸的濃度為15.4克/升，選用0. 5m2的管式聚砜超濾膜在0. 35MPa，溫度為30°C，pH為11. 5時進行過濾，膜孔徑為0. 001-0. Olum，截留液體積為15L時，加IOL純化水稀釋后再過濾，重復3次后，得到超濾膜透過液122升，超濾膜透過液中L-茶氨酸濃度為12. 5克/升；
(b)將超濾膜透過液122升，用孔徑截留分子量為500的聚酰胺納濾膜在壓強為1. 8MPa,溫度為35°C，pH為9. 0的條件下進行過濾，截留液體積為15L時，加15L純化水稀釋后過濾，重復3次后，得到納濾膜透過液155 L，納濾膜透過液中L-茶氨酸的濃度為9. 6
克/升；
(c)將納濾膜透過液155升，經膜材料為芳香聚酰胺的反滲透膜在壓強為22MPii，溫度為35°C，pH為8. 0的條件下濃縮，最終得到濃度為80. 4克/升的L-茶氨酸濃縮液17升；
(d)將濃縮液真空濃縮、結晶得到純度為99.7%的L-茶氨酸晶體1355. 9克，整個分離、 濃縮工藝L-茶氨酸的收率為88. 0%。實施例4
(a)取100升L-茶氨酸酶轉化液，L-茶氨酸的濃度為15.4克/升，選用0. 5m2的管式聚氨酯超濾膜在0. 45MPa，溫度為40°C，pH為12. 0時進行過濾，膜孔徑為0. 001-0. Olum，截留液體積為15L時，加IOL去離子水稀釋后再過濾，重復3次后，得到超濾膜透過液120升， 超濾膜透過液中L-茶氨酸濃度為12. 6克/升；
(b)將超濾膜透過液122升，用孔徑截留分子量為800的聚酰胺納濾膜在壓強為 1. 6MPa,溫度為25°C，pH為11. O的條件下進行過濾，截留液體積約15L時，加15L去離子水稀釋后再過濾，重復3次后，得到納濾膜透過液150 L，納濾膜透過液中L-茶氨酸的濃度為9.8克/升；
(c)將納濾膜透過液150升，經膜材料為醋酸纖維素的反滲透膜在壓強為20MPii，溫度為^°C，pH為9. 5的條件下濃縮，最終得到濃度為94. 8克/升的L-茶氨酸濃縮液15升；
(d)將濃縮液真空濃縮、結晶得到純度為99.7%的L-茶氨酸晶體1385. 8克，整個分離、 濃縮工藝L-茶氨酸的收率為90. 0%。實施例5
(a)取100升L-茶氨酸酶轉化液，L-茶氨酸的濃度為15.4克/升，選用0. 5m2的管式聚砜酰胺超濾膜在0. 4MPa，溫度為20°C，pH為10. O時進行過濾，膜孔徑為0. 001-0. Olum, 截留液體積為15L時，加IOL蒸餾水稀釋后再過濾，重復3次后，得到超濾膜透過液115升， 超濾膜透過液中L-茶氨酸濃度為13. O克/升；
(b)將超濾膜透過液122升，用孔徑截留分子量為600的聚酰胺納濾膜在壓強為 1. 9MPa,溫度為^°C，pH為9. 8的條件下進行過濾，截留液體積為15L時，加15L蒸餾水稀釋后再過濾，重復3次后，得到納濾膜透過液145 L，納濾膜透過液中L-茶氨酸的濃度為 10. 1克/升;
(c)將納濾膜透過液145升，經膜材料為芳香聚酰胺的反滲透膜在壓強為15MPii，溫度為25°C，pH為7. 5的條件下濃縮，最終得到濃度為105克/升的L-茶氨酸濃縮液13升；
(d)將濃縮液真空濃縮、結晶得到純度為99.9%的L-茶氨酸晶體1360. 6克，整個分離、 濃縮工藝L-茶氨酸的收率為88. 4%。對比實驗
732型陽離子交換樹脂從酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸
取100升L-茶氨酸酶轉化液，L-茶氨酸的濃度為15. 4克/升。用鹽酸將酶轉化液調 pH到2. 5 3. 5之間，加人絮凝劑后離心去掉微生物菌體、細胞碎片、雜蛋白等雜質，離心液用DlOl大孔吸附樹脂除去色素及大分子物質后得到清澈液體；用732型強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂交換吸附L-茶氨酸，再用純水將吸附后的離子交換樹脂洗至中性，換用pH為9-11的氨水溶液洗脫，收集洗脫液；洗脫液經濃縮塔真空濃縮得到濃縮液，對濃縮液進行乙醇沉降，然后離心分離后得到離心清液；離心清液減壓濃縮至干后，加人無水乙醇溶解，冷卻，重結晶，干燥后得到白色L-茶氨酸晶體。L-茶氨酸純度低于80%，收率一般在60%左右。
權利要求
1.利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(a)將酶轉化液利用孔徑為0.001-0. 01 μ m的超濾膜進行過濾，過濾后得到超濾膜透過液；(b)將超濾膜透過液用納濾膜進行過濾，截留分子量為200-1000的物質，過濾后得到納濾膜透過液；(c)將納濾膜透過液通過反滲透膜進行濃縮提取，得到濃縮液；(d)將濃縮液真空濃縮，結晶得到L-茶氨酸晶體。
2.根據權利要求1所述的利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于步驟(a)中的操作壓力為0. 15-0. 45MPa，操作溫度為20-40°C、pH為8-12 ；步驟(b)中的操作壓力為1. 5-2. OMpa，操作溫度為20-35°C, pH為 8-11 ；步驟(c)中的操作壓力為15-25Mpa、操作溫度為25_35°C、pH為7-10。
3.根據權利要求1或2所述的利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于步驟(a)中酶轉化液利用超濾膜進行過濾后，加水稀釋過濾得到超濾膜透過液；步驟(b)中超濾膜透過液用納濾膜進行過濾后，加水稀釋過濾得到納濾膜透過液。
4.根據權利要求3所述的利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于所述水選自純化水、去離子水、蒸餾水中的一種或幾種。
5.根據權利要求1或2所述的利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于所述超濾膜的材質選自陶瓷、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚砜酰胺中的一種。
6.根據權利要求1或2所述的利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于所述納濾膜的材質為聚酰胺。
7.根據權利要求1或2所述的利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，其特征在于所述反滲透膜的材質為醋酸纖維素或芳香聚酰胺。
全文摘要
本發明涉及一種利用集成膜技術從谷氨酰胺酶或谷氨酰轉肽酶的轉化液中分離、濃縮L-茶氨酸的方法，包括如下步驟(a)將酶轉化液利用孔徑為0.001-0.01μｍ的超濾膜進行過濾，將酶轉化液中的菌體、細胞碎片、大分子雜蛋白截留去掉，過濾后得到超濾膜透過液；(b)將超濾膜透過液用聚酰胺納濾膜進行過濾，對超濾膜透過液進行脫鹽、脫色和截留小分子雜蛋白，截留分子量為200-1000的物質，過濾后得到納濾膜透過液；c)將納濾膜透過液通過反滲透膜進行濃縮提取，得到濃縮液；(d)將濃縮液真空濃縮，結晶得到L-茶氨酸晶體。提取工藝全部采用膜技術分離工藝，操作簡單且易實現自動化，收率高，產品純度高，耗能少，污染物少。
文檔編號C07C231/24GK102432495SQ20111034332
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者萬紅貴, 呂志祥, 徐大春, 殷志敏, 沈青紅, 王漢領 申請人:江蘇阿格羅生物科技有限公司