專利名稱：一種在固體表面固定蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的固定方法，具體地說，涉及是一種利用氮化鋁薄膜固定蛋白質的方法，屬于生物檢測和傳感器領域。
背景技術：
近年來，隨著生物技術的不斷發展，生物傳感器和生物芯片的研究和應用日益廣泛。如何有效的將蛋白質固定在生物傳感器和生物芯片上，是生物檢測中的關鍵問題。目前，在固體表面固定蛋白質常用的固定方法主要有吸附法、包埋法、共價結合法等，如(1) Hoyer-Hansen G， Hamers M J， Pedersen A N， etc.Loss of ELISA specificity due to biotinylation of monoclonal antibodies. ImmunolMethods 2000，235 (1-2) :91-9 ；Haodan,Wayne M. Mullett and JanuszPawliszyn, Biological sample anysis with immounaffinity solid-phasemicroextraction, The Analyst，2001，126，1456-1461 中所述。雖然上述方法也實現了蛋白質的固定，但是也存在著相應的缺陷，主要有第一，步驟比較繁瑣；第二，固定效果不太明顯；第三，成本較高。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種在固體表面固定蛋白質的方法，使蛋白質高效地固定在固體表面，其優勢在于步驟簡單、固定效果好、成本低。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟(1)固體表面清洗；(2)在固體表面沉積氮化鋁薄膜；(3)蛋白質的固定直接將蛋白質滴加在氮化鋁薄膜表面，孵育后沖洗。所述固體表面清洗，是指依次用丙酮、無水乙醇、去離子水各自超聲處理3分鐘， 氮氣吹干。所述固體材料可以為表面平整度和光潔度較高的玻璃、硅片、陶瓷、金屬、有機聚合物等。所述的氮化鋁薄膜采用濺射、金屬有機化學氣相沉積或脈沖激光沉積的方法制備。所述的氮化鋁薄膜的厚度是10納米到100納米。所述氮化鋁薄膜通過刻蝕、剝離工藝形成各種圖形，實現蛋白質的圖形化固定。所述蛋白質的固定，是指在氮化鋁薄膜表面滴加蛋白質，恒溫孵育后用磷酸緩沖液清洗，氮氣吹干。所述恒溫孵育，是指37°C溫育2小時。所述磷酸緩沖液，是指PH = 7. 0的磷酸緩沖液。本發明的有益效果在于1本發明操作步驟簡單，可以省略蛋白質固定中的固體表面修飾和活化過程，縮短了實驗周期。2本發明固定蛋白質的含量高、活性好、均勻、牢固。3本發明使用的氮化鋁薄膜制備方便，成本較低。4本發明可以通過刻蝕氮化鋁薄膜的方法，實現蛋白質固定的圖形化。5本發明可以制備的氮化鋁薄膜固定表面具有較高的穩定性，易于長時間保存。
具體實施例方式下面對本發明的具體實施例作詳細說明本實施例以本發明技術方案為前提進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1本實施例是在以下的實施條件和技術條件要求下實施的本實施例所使用的固體基底為上面覆蓋一層100納米厚金膜的硅片。具體的蛋白質固定過程為(1)將硅片依次放入丙酮、無水乙醇、去離子水中，各自超聲清洗3分鐘后取出，氮氣吹干。(2)利用濺射沉積技術在金膜表面沉積一層厚度為10納米的氮化鋁薄膜。(3)在氮化鋁薄膜表面滴加0. 2mg/mL的人IgG，37°C恒溫孵育2小時。(4)用PH = 7. 0的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。(5)在氮化鋁表面滴加lOmg/mL的牛血清白蛋白封閉液，37°C溫育1小時。(6)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。(7)在氮化鋁表面滴加0. 2mg/mL的FITC標記羊抗人IgG溶液，37°C溫育濁。(8)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。通過熒光顯微鏡觀察，本實施例最終在固體表面的蛋白固定量明顯高于金表面巰基自組裝共價固定樣品，并且蛋白固定層均勻，超聲2分鐘后無脫落。實施例2本實施例是在以下的實施條件和技術條件要求下實施的本實施例所使用的固體基底為玻璃載玻片。(1)將玻璃載玻片依次放入丙酮、無水乙醇、去離子水中，各自超聲清洗3分鐘后取出，氮氣吹干。(2)利用濺射沉積技術在金膜表面沉積一層厚度為50納米的氮化鋁薄膜。(3)在氮化鋁薄膜表面滴加0. 2mg/mL的人IgG，37°C恒溫孵育2小時。(4)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。(5)在氮化鋁表面滴加lOmg/mL的牛血清白蛋白封閉液，37°C溫育1小時。(6)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。(7)在氮化鋁表面滴加0. 2mg/mL的FITC標記羊抗人IgG溶液，37°C溫育2小時。(8)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。通過熒光顯微鏡觀察，本實施例最終在固體表面的蛋白固定量明顯高于金表面巰基自組裝膜共價固定樣品，并且蛋白固定層均勻，超聲2分鐘后無脫落。實施例3
本實施例是在以下的實施條件和技術條件要求下實施的本實施例所使用的固體基底為硅片。(1)將硅片依次放入丙酮、無水乙醇、去離子水中，各自超聲清洗3分鐘后取出，氮氣吹干。(2)氮化鋁薄膜的圖形化旋涂光刻膠5微米并進行光刻，形成與所需要的氮化鋁圖形相反的光刻膠圖形。利用濺射沉積技術在光刻膠表面沉積一層厚度為100納米的氮化鋁薄膜。用丙酮浸泡樣品10分鐘，去除光刻膠，最終得到氮化鋁圖形。(3)在氮化鋁薄膜表面滴加0. 2mg/mL人IgG，37°C恒溫孵育2小時。(4)用PH = 7. 0的磷酸緩沖液沖洗氮化鋁薄膜表面3次，氮氣吹干。(5)在氮化鋁表面滴加lOmg/mL的牛血清白蛋白封閉液，37°C溫育1小時。(6)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。(7)在氮化鋁表面滴加0. 2mg/mL的FITC標記羊抗人IgG溶液，37°C溫育2小時。(8)用PH = 7. O的磷酸緩沖液沖洗3次，氮氣吹干。通過熒光顯微鏡觀察，本實施例最終在固體表面的蛋白固定量明顯高于金表面巰基自組裝膜共價固定樣品，并且蛋白固定層均勻，超聲2分鐘后無脫落。由以上實施例可以看出，本發明操作步驟簡單，成本較低，蛋白質的固定量高、活性好、均勻、牢固，并且可以實現圖形化固定，可以用于生物領域中生物芯片和生物探針上蛋白質的固定。盡管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細介紹，但應當認識到上述的描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容后，對于本發明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發明的保護范圍應由所附的權利要求來限定。
權利要求
1.一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于包括如下步驟(1)固體表面清洗；(2)在固體表面沉積氮化鋁薄膜；(3)蛋白質的固定直接將蛋白質滴加在氮化鋁薄膜表面，孵育后沖洗。
2.如權利要求1所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述固體材料為玻璃、硅片、陶瓷、金屬、有機聚合物中一種。
3.如權利要求1所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述的氮化鋁薄膜采用濺射、金屬有機化學氣相沉積或脈沖激光沉積的方法制備。
4.如權利要求1或3所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述的氮化鋁薄膜的厚度是10納米到100納米。
5.如權利要求4所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述氮化鋁薄膜通過刻蝕、剝離工藝形成各種圖形，實現蛋白質的圖形化固定。
6.如權利要求1所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述蛋白質的固定，是指在氮化鋁薄膜表面滴加蛋白質，恒溫孵育后用磷酸緩沖液清洗，氮氣吹干。
7.如權利要求6所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述恒溫孵育是指37°C溫育2小時。
8.如權利要求6所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述磷酸緩沖液是指PH = 7. 0的磷酸緩沖液。
9.如權利要求1所述的一種在固體表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述固體表面清洗，是指依次用丙酮、無水乙醇、去離子水各自超聲處理3分鐘，氮氣吹干。
全文摘要
本發明公開一種涉及生物傳感器領域的在固體表面固定蛋白質的方法，包括如下步驟(1)清洗固體表面；(2)在固體表面沉積氮化鋁薄膜；(3)蛋白質的固定直接將蛋白質滴加在氮化鋁薄膜表面，孵育后沖洗。本發明可以用于生物領域中生物芯片和生物探針上蛋白質的固定，其優勢在于操作步驟簡單，成本較低，蛋白質的固定量高、活性好、均勻、牢固，并且可以實現圖形化固定。
文檔編號C07K17/02GK102399290SQ20111034643
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者張亞非, 徐東, 徐航, 陳達, 韓程章 申請人:上海交通大學