專利名稱：一種opn基因的克隆、表達與蛋白純化方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種骨橋蛋白(OPN)基因的克隆、表達與蛋白純化方法。
背景技術：
骨橋蛋白(osteopontin,0PN)于1983年由Herring等在骨基質中分離出來,是一種具有多種功能分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白。OPN屬于小整合素結合配體N端聯接糖蛋白家方矣(small integrin binding ligand, N-Iingked glycoproteins ,SIBLING)中的一員，其相對分子量約為41-75 kD。人類OPN基因定位于4ql3，是一個獨立編碼基因，由7個外顯子和6個內含子組成。已經發現，其外顯子有3個單核苷酸多態性(SNPs)區域，其中2個、分別位于6號和7號外顯子，另一個位于7號外顯子翻譯區。人的OPN分子一般由信號肽序列、7-10個連續ASP序列、GRGDS (甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)結構域、α 9β I、α 4β I結構域和肝素結合結構域構成。研究表明，OPN參與了胰腺癌，宮頸癌，前列腺癌等癌癥的發生、轉移，尤其引人關注的是，近年研究發現，OPN在胰腺癌腫瘤細胞中呈高表達，并與胰腺癌的侵襲和轉移密切相關，胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，在美國占癌癥死亡原因的第五位，其發病率和死亡率幾乎相同，未經治療者一年生存率大約20%，5年生存率不到4%。在我國，胰腺癌發病率呈逐步上升趨勢，是導致人口死亡的十大惡性腫瘤之一。研究表明，侵襲(invasion)和轉移(metastasis)是目前胰腺癌患者治療失敗的主要原因。因此，OPN蛋白的表達純化用于研究和治療胰腺癌已成為近年來的熱點。由于OPN蛋白主要為分泌型蛋白，在細胞外作用，含量極少，因此從生物體中直接純化得率低，純度不高，操作繁瑣，成本也較高。
發明內容
本發明提供一種克隆、表達、分離純化骨橋蛋白(osteopontin, 0ΡΝ)的方法,該方法包括如下步驟
(1)重組克隆載體TA-OPN的構建；
(2)重組表達質粒pET-28a(+)-0PN的構建；
(3)OPN蛋白的誘導表達與鑒定；
(4)OPN蛋白的純化和鑒定。具體地，上述方法步驟(I)分為如下步驟
(I)OPN的引物設計
以pET28a (+) -OPN為模板，通過拼接PCR擴增0ΡΝ，設計出4條引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，。上游引物OPNpl含有內切酶位點I，下游引物mE7p2含有內切酶位點歷·/ (!III,OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3’
OPNpI-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’
0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’
0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3>
(2)拼接PCR擴增OPN基因片段 以pET28a (+) -OPN為模板，通過拼接PCR擴增OPN基因片段，先擴增Nde I與OPN基因第76堿基中間的片段(138bp，稱為I-OPN84)和OPN基因第56-297位堿基序列(稱為OPN56^297)ο PCR反應體系(Pyrobest 酶):41. 25 μ L無菌水，5 μ L IOXbuffer(含MgCl2), I μ LIOmM dNTPs,I μ L OPNpl/OPNpl-G-3’，I μ L 0PNp2_G_5，/0ΡΝρ2，0· 5 μ L pET28a(+)-OPN,O. 25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進行擴增，反應條件為94°C預變性3min ;然后進行以下35 個循環94°C 45s, 56°C lmin,72°C 45s ;最后在 72°C延伸 3min。上述PCR產物用1%瓊脂糖凝膠90V恒壓電泳20min，切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，再拼接PCR擴增I-OPN序列。PCR反應體系(Pyrobest酶)39. 75μ L無菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), IyL IOmM dNTPs, I μ L OPNpl, I μ L 0PNp2, ImL NdeI-OPN84,1 μ L 0ΡΝ56_297，O. 25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進行擴增。反應條件為94°C預變性3min ;然后進行以下35個循環94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。瓊脂糖凝膠電泳、膠回收DNA片段，為便于用Taq酶延伸加A，膠回收的洗脫緩沖液使用含MgCl2的Taq酶緩沖液，用25 μ L膠回收洗脫緩沖液洗脫PCR擴增的DNA片段，取13. 7μ L 的膠回收洗脫液，加入 I. 2μ L IOmM dOTl^PO.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 產物延伸A。(3) TA克隆連接
取I μ L PMD18-T載體，加入2 μ L延伸過A的OPN片段，再加入5 μ L的連接緩沖液，2 μ L無菌水補足至10 μ L體系，于16°C連接2hr。(4) TA克隆轉化
將上述TA連接產物IOyL轉移到DH5a感受態細胞中；冰上靜置30min ；42 °C熱激90s ;冰上再靜置5min ;加入800 μ L LB, 37 V搖床120rpm搖lhr ；4000rpm離心3min ;在超凈臺中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨節青霉素(Amp)的LB (Luria-Bertani)平板中；LB平板倒置于37°C培養箱培養過夜。(5) TA克隆的鑒定
隨機挑取4個TA陽性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并進行雙酶切和PCR鑒定，選取雙酶切和PCR都為陽性的TA克隆質粒測序。具體地，上述方法步驟(2)具體分為如下步驟
(O酶切與回收
OPN基因序列中有I酶切位點(0ΡΝ上游引物中引入)，用I/Hind III雙酶切TA-OPN及pET-28a(+)質粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標片段。(2 ) T4 DNA連接酶連接及轉化
連接體系為=IuL IOX連接酶緩沖液，lμL雙酶切pET-28a(+)質粒，7 μ L OPN片段，IuL Τ4 DNA連接酶，16°C連接過夜。
將連接產物轉入DH5a感受態，轉化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培養過夜。(3)陽性克隆鑒定
隨機挑取4個陽性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質粒進行雙酶切(&oR l/Η η III)和PCR鑒定。具體地，上述方法步驟(3)具體分為如下步驟
(I)重組質粒轉化大腸桿菌
將上述鑒定為陽性的重組質粒pET_28a(+) -OPN轉入感受態Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培養過夜。(2)異丙基硫代半乳糖昔(IPTG)誘導蛋白表達
挑單克隆于LB (Kan+)中，37°C搖床，220rpm培養過夜，以1:50接過夜菌于20 mL LB(Kan+)中，繼續培養3hr左右，OD6tltol達到O. 6-0. 8時加入IPTG至ImM誘導蛋白表達，分別于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定
取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心lmin,取10 μ L樣品進行12% SDS-PAGE,電泳條件為18mA, I. 5hr。取下凝膠在考馬斯亮藍染液中搖動染色lhr，移入洗脫液中搖動洗脫過夜。觀察誘導前后蛋白條帶的變化，結果顯示誘導4hr后蛋白表達到達高峰。
具體地，上述方法步驟(4)具體分為如下步驟
(I)OPN蛋白的誘導表達
將過夜培養已轉入pET-28a(+)-OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL LB(Kan+)中，37 °C搖床，220rpm培養2hr左右，OD600nm達到O. 6-0. 8時，加入IPTG至ImM，繼續誘導培養4hr，4°C, 7000rpm離心6min，收集菌體，-8CTC保存。(2)細菌蛋白表達形式的分析
-80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細菌裂解液(O. 5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巰基乙醇，ImM PMSF,pH7. 9),超聲破菌,4°C, 8000rpm離心20min,包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結果顯示OPN蛋白主要存在于包涵體中。(3) OPN蛋白的純化
超聲破菌后，4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液(O. 5M NaCl, 20mMTris, O. 5% Triton, ρΗ7· 9)超聲洗漆一次；4°C, 8000rpm離心20min,棄上清。沉淀即包涵體加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 鹽酸胍，ρΗ7· 9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C，16000rpm離心20min，取上清上樣至預先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的鎳柱，分別用溶液A、B、C (溶液A :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，6M鹽酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液B : O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，8M尿素，ρΗ7· 9 ;溶液C :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗滌10個柱床體積，再用洗脫緩沖液(O. 5M NaCl, 20mM Tris, 5mM巰基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脫，收集蛋白液，置4°C對I XPBS充分透析，40C，16000rpm離心20min，取上清液。收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析，結果顯示純化的蛋白分子量約為20kDa。(4) OPN蛋白的鑒定Western blot鑒定SDS_PAGE電泳結束后取下凝膠，電轉到硝酸纖維素膜上(4°C，100V，lhr)，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr，加入鼠抗人OPN抗體，室溫孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液顯色，在暗室內顯影、定影，結果顯示約40kDa處出現了 OPN的目標條帶。本發明還提供利用所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法獲得的骨橋蛋白在制備預防或治療腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌藥物中的應用。本發明通過建立原核生物基因表達系統，可以大量表達OPN蛋白，并建立高純度蛋白純化流程，獲得量多純度高且制備方法簡單可行的OPN蛋白。
具體實施例方式以下通過具體的實施例對本發明作進一步闡述。實施例I OPN某閔克降、表汰與蛋白鈍化
I.重組克隆載體TA-OPN的構建
(1)OPN的引物設計
以pET28a (+) -OPN為模板，通過拼接PCR擴增0ΡΝ，設計出4條引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，。上游引物OPNpl含有內切酶位點I，下游引物mE7p2含有內切酶位點歷·/ (!III,
OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3，
0PNpl-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’
0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’
0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3>
(2)拼接PCR擴增OPN基因片段
以pET28a (+) -OPN為模板，通過拼接PCR擴增OPN基因片段，先擴增Nde I與OPN基因第76堿基中間的片段(138bp，稱為I-OPN84)和OPN基因第56-297位堿基序列(稱為OPN56^297)ο PCR反應體系(Pyrobest 酶):41. 25 μ L無菌水，5 μ L IOXbuffer(含MgCl2), I μ LIOmM dNTPs, I μ L OPNpl/OPNpl-G-3’，I μ L 0PNp2_G_5，/0ΡΝρ2，0· 5 μ L pET28a (+) -OPN,
O.25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進行擴增。反應條件為94°C預變性3min ;然后進行以下35 個循環94°C 45s, 56°C lmin,72°C 45s ;最后在 72°C延伸 3min。上述PCR產物用1%瓊脂糖凝膠90V恒壓電泳20min，切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，再拼接PCR擴增I-OPN序列。PCR反應體系(Pyrobest酶)39. 75μ L無菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), IyL IOmM dNTPs, I μ L OPNpl, I μ L 0PNp2, ImL NdeI-OPN84,1 μ L 0ΡΝ56_297，O. 25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進行擴增。反應條件為94°C預變性3min ;然后進行以下35個循環94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。瓊脂糖凝膠電泳、膠回收DNA片段，為便于用Taq酶延伸加A，膠回收的洗脫緩沖液使用含MgCl2的Taq酶緩沖液。用25 μ L膠回收洗脫緩沖液洗脫PCR擴增的DNA片段，取13. 7μ L 的膠回收洗脫液，加入 I. 2μ L IOmM dOTl^PO.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 產物延伸A。(3) TA克隆連接取I μ L PMD18-T載體，加入2 μ L延伸過A的OPN片段，再加入5 μ L的連接緩沖液，
2μ L無菌水補足至10 μ L體系，于16°C連接2hr。(4) TA克隆轉化
將上述TA連接產物1(^1^轉移到0冊(1感受態細胞中；冰上靜置30min ;42°C熱激90s ;冰上再靜置 5min ;加入 800 μ L LB, 37°C搖床 120rpm 搖 lhr ；4000rpm 離心 3min ;在超凈臺中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨節青霉素(Amp)的LB平板中；LB平板倒置于37°C培養箱培養過夜。
(5) TA克隆的鑒定
隨機挑取4個TA陽性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并進行雙酶切和PCR鑒定，選取雙酶切和PCR都為陽性的TA克隆質粒測序。2.重組表達質粒pET_28a(+)-OPN的構建 (O酶切與回收
OPN基因序列中有I酶切位點(0ΡΝ上游引物中引入)，用I/Hind III雙酶切TA-OPN及pET-28a(+)質粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標片段。(2 ) T4 DNA連接酶連接及轉化
連接體系為=IuL IOX連接酶緩沖液，lμL雙酶切pET-28a(+)質粒，7 μ L OPN片段，I μ L Τ4 DNA連接酶，16°C連接過夜；
將連接產物轉入DH5 α感受態，轉化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培養過夜。(3)陽性克隆鑒定
隨機挑取4個陽性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質粒進行雙酶切(&oR Ι/Η η III)和PCR鑒定。3. OPN蛋白的誘導表達與鑒定 (I)重組質粒轉化大腸桿菌
將上述鑒定為陽性的重組質粒pET_28a(+) -OPN轉入感受態Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培養過夜。(2) IPTG誘導蛋白表達
挑單克隆于LB (Kan+)中，37°C搖床，220rpm培養過夜，以1:50接過夜菌于20 mL LB(Kan+)中，繼續培養3hr左右，OD6tltol達到O. 6-0. 8時加入IPTG至ImM誘導蛋白表達，分別于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3) SDS-PAGE 鑒定
取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心lmin,取10 μ L樣品進行12% SDS-PAGE,電泳條件為18mA, I. 5hr。取下凝膠在考馬斯亮藍染液中搖動染色lhr，移入洗脫液中搖動洗脫過夜。觀察誘導前后蛋白條帶的變化，結果顯示誘導4hr后蛋白表達到達高峰。4. OPN蛋白的純化和鑒定 (I) OPN蛋白的誘導表達
將過夜培養已轉入pET-28a(+)-OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL LB(Kan+)中，37 °C搖床，220rpm培養2hr左右，OD600nm達到O. 6-0. 8時，加入IPTG至ImM，繼續誘導培養4hr，4°C, 7000rpm離心6min，收集菌體，-8CTC保存。(2)細菌蛋白表達形式的分析
-80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細菌裂解液(O. 5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巰基乙醇，ImM PMSF,pH7. 9),超聲破菌,4°C, 8000rpm離心20min,包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結果顯示OPN蛋白主要存在于包涵體中。(3) OPN蛋白的純化
超聲破菌后，4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液(O. 5M NaCl, 20mMTris, O. 5% Triton, ρΗ7· 9)超聲洗漆一次；4°C, 8000rpm離心20min,棄上清。沉淀即包涵體加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 鹽酸胍，ρΗ7· 9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C， 16000rpm離心20min，取上清上樣至預先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的鎳柱，分別用溶液A、B、C (溶液A:0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，6M 鹽酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液 B: O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM 巰基乙醇，5mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7· 9 ;溶液C: O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗滌10個柱床體積，再用洗脫緩沖液(O. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脫，收集蛋白液，置4°C對I XPBS充分透析，40C，16000rpm離心20min，取上清液。收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析，結果顯示純化的蛋白分子量約為20kDa。(4) OPN蛋白的鑒定
Western blot鑒定SDS_PAGE電泳結束后取下凝膠，電轉到硝酸纖維素膜上(4°C，100V，lhr)，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr，加入鼠抗人OPN抗體，室溫孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液顯色，在暗室內顯影、定影，結果顯示約40kDa處出現了 OPN的目標條帶。實施例2 =OPN蛋白預防免疫抗腫瘤作用
I.5nmol蛋白(0ΡΝ蛋白，PBS組為對照)皮下免疫C57BL/6小鼠，兩周后腹腔加強免疫I次，一周后皮下接種IXIO5PANc-I細胞(人胰腺癌細胞)(接種前，經胰酶消化，PBS洗滌2次)。之后每天觀察腫瘤生長狀況，12d后用游標卡尺測量腫瘤長徑和垂直徑(每3d測量I次)，持續觀測直至對照組小鼠開始死亡為止，繼續觀察直到荷瘤小鼠全部死亡，記錄其荷瘤情況及存活時間，結果全部PBS組小鼠長出了腫瘤，而OPN蛋白免疫組則有效地保護了小鼠不生成腫瘤。植瘤40d時未長瘤小鼠皮下再接種2 X IO5 PANC-I細胞，以未免疫小鼠作為對照組，之后每天觀察腫瘤生長狀況，直到對照組小鼠全部死亡，記錄其荷瘤情況及存活時間，結果顯示對照組小鼠6d后全部長瘤，而OPN蛋白免疫組50d后仍無瘤體生長。用同樣的方法分別接種CCL_227(人結腸癌細胞)、0VCAR3 (人卵巢癌細胞)、NCI-H226 (人肺癌細胞系)，并觀測和評估結果，發現對照組小鼠6d全部長瘤，而OPN蛋白免疫組30 50d后仍無瘤體生長。上述實驗結果表明，用OPN蛋白免疫機體，可以有效預防腫瘤的發生。應當說明的是，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用于限制本發明的范圍，凡在本發明的精神和原則之內所作出的任何修改、等同的替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)重組克隆載體TA-OPN的構建； (2)重組表達質粒pET-28a(+)-0PN的構建； (3)OPN蛋白的誘導表達與鑒定； (4)OPN蛋白的純化和鑒定。
2.根據權利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(I)具體分為如下步驟 (1)OPN的引物設計 以pET28a (+) -OPN為模板，通過拼接PCR擴增0ΡΝ，設計出4條引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，； 上游引物OPNpl含有內切酶位點I，下游引物mE7p2含有內切酶位點歷id III， OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3，0PNpl-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3> ； (2)拼接PCR擴增OPN基因片段 以pET28a(+)-OPN為模板，通過拼接PCR擴增OPN基因片段，先擴增I與OPN基因第76堿基中間的片段和OPN基因第56-297位堿基序列； 上述PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，再拼接PCR擴增Nde I-OPN序列； (3)TA克隆連接 取I μ L pMD18-T載體，加入2 μ L延伸過A的OPN片段，再加入5 μ L的連接緩沖液，2 μ L無菌水補足至10 μ L體系，于16°C連接2hr ； (4)TA克隆轉化 將上述TA連接產物10 μ L轉移到DH5a感受態細胞中，冰上靜置30min，42°C熱激90s，冰上再靜置5min ;加入800 μ L LB, 37。。搖床120rpm搖lhr, 4000rpm離心3min ;在超凈臺中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板中，LB平板倒置于37 °C培養箱培養過夜； (5)TA克隆的鑒定 隨機挑取4個TA陽性克隆，接入4mL含氨芐青霉素LB中；37°C搖床220rpm搖過夜；抽提質粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并進行雙酶切和PCR鑒定，選取雙酶切和PCR都為陽性的TA克隆質粒測序。
3.根據權利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(2)具體分為如下步驟 (1)酶切與回收 OPN基因序列中有&oR I酶切位點，用&oR I/Nind III雙酶切ΤΑ-0ΡΝ及pET_28a(+)質粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標片段； (2)T4 DNA連接酶連接及轉化 將OPN片段和T4 DNA連接酶在連接體系中16°C連接過夜，將連接產物轉入DH5 α感受態，轉化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養過夜； (3)陽性克隆鑒定 隨機挑取4個陽性克隆，接入4mL的含卡那霉素LB板中，37°C搖床220rpm搖過夜，抽提質粒進行雙酶切I/Hind III和PCR鑒定。
4.根據權利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(3)具體分為如下步驟 (1)重組質粒轉化大腸桿菌 將上述鑒定為陽性的重組質粒pET_28a(+) -OPN轉入感受態Rosetta，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 °C倒置培養過夜； (2)IPTG誘導蛋白表達 挑單克隆于含卡那霉素LB中，37°C搖床，220rpm培養過夜，以1:50接過夜菌于20 mL含卡那霉素LB板中，繼續培養3hr左右，OD6tltol達到O. 6 O. 8時加入IPTG至ImM誘導蛋白表達，分別于Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr后收集ImL菌液；(3)SDS-PAGE 鑒定 取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心lmin，取10 μ L樣品進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠在考馬斯亮藍染液中搖動染色lhr，移入洗脫液中搖動洗脫過夜，觀察誘導前后蛋白條帶的變化，結果顯示誘導4hr后蛋白表達到達高峰。
5.根據權利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(4)具體分為如下步驟 (1)OPN蛋白的誘導表達 將過夜培養已轉入pET_28a (+) -OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL含卡那霉素LB中，37°C搖床，220rpm培養2hr左右，OD6tltlnm達到O. 6-0. 8時，加入IPTG至ImM，繼續誘導培養4hr, 4°C, 7000rpm離心6min,收集菌體，-8CTC保存； (2)細菌蛋白表達形式的分析 -80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細菌裂解液，超聲破菌，4°C，8000rpm離心20min，包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結果顯示OPN蛋白主要存在于包涵體中； (3)OPN蛋白的純化 超聲破菌后，4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液超聲洗滌一次；4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀即包涵體加入30mL溶液，置37°C溶解2hr以上；4°C，16000rpm離心20min，取上清上樣至預先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的鎳柱，分別用三種溶液洗滌10個柱床體積，再用洗脫緩沖液洗脫，收集蛋白液，置4°C對I XPBS充分透析，40C，16000rpm離心20min，取上清液；收獲的蛋白用SDS-PAGE進行純度分析； (4)OPN 蛋白的 Western blot 鑒定 SDS-PAGE電泳結束后取下凝膠，電轉到硝酸纖維素膜上，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr，加入鼠抗人OPN抗體，室溫孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入底物液顯色，在暗室內顯影、定影。
6.根據權利要求5所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(3)中所述的三種溶液分別為，溶液A :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，6M鹽酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液B : O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM 咪唑，8M尿素，ρΗ7· 9 ;溶液 C:0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM 巰基乙醇，20mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7· 9。
7.利用權利要求I 6中任一項所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法制得的骨橋蛋白在制備預防或治療腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌或肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種用原核細胞表達系統表達了OPN蛋白的方法首先構建OPN的克隆載體TA-OPN和表達載體pET-28a(+)-OPN，并原核表達、分離純化了OPN蛋白。利用該方法制備骨橋蛋白具有產量高、純度好、成本較低的優點。本發明還提供利用所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達與蛋白純化方法獲得的骨橋蛋白在制備預防或治療腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌藥物中的應用。
文檔編號C07K1/36GK102719470SQ20121023573
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者張峰, 梁靜, 蔣晟, 陳愛萍, 顧傳虎 申請人:南京新港醫藥有限公司