斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因克隆、重組表達方法及應用與流程

本發明屬于生物
技術領域：
，具體地說，涉及斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因克隆、重組表達方法及應用。
背景技術：
：斯氏副柔線蟲病由斯氏副柔線蟲(Parabronemaskrjabini)寄生于駱駝、羊、牛等反芻動物真胃引起,尤以駱駝感染較為嚴重。大量蟲體寄生可導致患畜真胃發生炎癥、出血、潰瘍,嚴重者造成駱駝死亡,對養駝業危害極大，是危害我國養駝業的一種主要寄生蟲病，長期以來,給農牧民帶來了巨大的經濟損失。因此，今后對斯氏副柔線蟲病的監測和防制是駱駝等反芻動物寄生蟲病防治中的重點。由于世界上絕大多數駱駝都分布在第三世界國家的落后地區，所以時至今日，國內外關于斯氏副柔線蟲病的研究報道較少。嚴重危害我國駱駝養殖業的斯氏副柔線蟲病的相關研究滯后，在斯氏副柔線蟲病的防治上，目前存在的主要問題是缺少針對該病的基礎理論研究、缺乏有效的生前診斷方法和防治的新方法。適用于許多寄生性線蟲的糞便蟲卵檢查法用于該病的診斷，檢出率非常低，很難用于臨床實踐。該病的診斷主要依靠死后剖檢(在真胃查找蟲體)，此類診斷方法不能為早期治療提供參考。在實際的生產中，往往是在沒有診斷依據的情況下盲目地給藥驅蟲，造成經濟損失的同時也帶來了諸如毒副作用、出現耐藥蟲株和畜產品藥物殘留超標等諸多弊端。當前，在生產實踐中亟待研究斯氏副柔線蟲病的生前診斷方法，為該病的防制提供科學依據，使該病的防制更有針對性，提高防制效果，避免不必要的經濟投入，同時為該病的監測提供科學的技術手段。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因克隆、重組表達方法及應用。該方法通過斯氏副柔線蟲轉錄組測序預測出的編碼基因與已公布的線蟲數據庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因并進行功能注釋，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴增出特有基因Pj_CPI，克隆測序后，構建到原核表達載體pET30a中，轉化至E.coliBL21(DE3)，進行誘導表達，用western-bloting法驗證Pj_CPI重組蛋白的免疫原性。其具體技術方案為：斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本發明所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因的編碼蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。用于擴增權利要求1所述權利要求1所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因的特異性PCR引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示。本發明所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因在檢測和防治家畜斯氏副柔線蟲感染過程中的應用。斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因的克隆、重組表達方法，包括以下步驟：步驟1、引物設計根據Pj_CPI的基因序列，用Oligo6.0設計引物，分別在上游引物和下游引物中插入限制性內切酶EcoRI、XhoI酶切位點，引物的合成由華大基因有限公司完成。步驟2、斯氏副柔線蟲總RNA的提取按照TaKaRaRNAisoPlusRNA提取試劑說明書提取斯氏副柔線蟲總RNA，具體步驟如下：1.樣品的研磨和勻漿：將液氮中保存的斯氏副柔線蟲樣品迅速轉移至液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。然后，向研缽中加入適量的RNAisoPlus，反復吹打，至均一透明；然后，將勻漿液轉移至離心管中，室溫(15-30℃)靜置5min；12000g4℃離心5min；小心吸取上清液，移入新的離心管中。2.總RNA的提取：向上述勻漿裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色；室溫靜置5min；12000g4℃離心15min；從離心機中小心取出離心管(此時勻漿液分為三層，即：無色含RNA的上清液、中間白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。)吸取上清液轉移至另一新的離心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAisoPlus體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10min；12000g4℃離心10min。3.RNA沉淀的清洗：小心棄去上清液。加入與RNAisoPlus等量的75％乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，7500g4℃離心5min后小心棄去上清液。4.RNA的溶解：打開離心管蓋，室溫干燥沉淀數分鐘；沉淀干燥后，加入適量的RNase-free水溶解沉淀。步驟3、Pj_CPI基因RT-PCR擴增以提取的斯氏副柔線蟲總RNA為模板反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，用上述設計的特異性引物PCR擴增Pj_CPI基因并對其特有性進行驗證。PCR擴增反應條件為：預變性94℃5min；變性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35個循環；再延伸72℃10min。PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。步驟4、PCR產物回收按照AxygenPCR產物回收試劑盒說明書操作，回收Pj_CPI基因PCR產物。步驟5、PCR回收產物與pMD19-TSimple載體的連接取200μL離心管加1μLpMD19-TSimpleVector、4μLPCR回收產物和5μLSolutionⅠ，離心混勻，16℃過夜連接。步驟6、重組質粒的轉化按照北京全式金生物技術有限公司Trans1-T1感受態細胞使用說明書操作，將連接產物轉化于Trans1-T1感受態細胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固體LB培養基上，37℃培養過夜。步驟7、重組克隆菌PCR鑒定挑取陽性菌落，接種到含抗生素的液體LB培養基中培養過夜，以培養物做PCR擴增鑒定。步驟8、重組克隆質粒的雙酶切鑒定按照Axygen質粒提取試劑盒說明書提取重組質粒，用限制性內切酶XhoI和EcoRⅠ對重組質粒進行雙酶切和電泳檢測。步驟9、重組克隆菌測序經PCR鑒定及質粒雙酶切鑒定均為陽性的重組克隆菌，送北京華大基因公司進行雙向測序。步驟10、目的基因與表達載體pET30a的回收將測序正確的克隆菌株和含有pET30a質粒的菌株分別接種于LB培養基中培養過夜，分別提取質粒，用限制性內切酶XhoI和EcoRⅠ對重組克隆質粒和pET30a質粒進行雙酶切和電泳檢測，膠回收目的基因片段和pET30a片段。步驟11、目的基因與表達載體pET30a的連接取200μL離心管加入6μL回收的目的片段、2μLpET30a表達載體片段、1μLT4DNA連接酶和1μLbuffer，16℃連接過夜；構建重組表達質粒(pET30a-Pj_CPI，以下簡稱為pETCPI)如SEQIDNO:2所示。步驟12、重組表達質粒轉化感受態細胞按照北京全式金(TransGenBiotech)生物技術有限公司E.coliBL21(DE3)感受態細胞使用說明書操作，將連接產物轉化于E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含抗生素的固體LB培養基上37℃培養過夜。步驟13、重組表達菌的鑒定對構建的重組表達菌E.coliBL21(pETCPI)，以下簡稱BL21(pETCPI)進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，經PCR鑒定及質粒雙酶切鑒定均為陽性的重組表達菌，送北京華大基因公司進行雙向測序，具體步驟如步驟7、步驟8和步驟9所述。步驟14、重組表達菌誘導表達條件的優化分別對重組表達菌誘導表達時間、誘導劑IPTG濃度以及培養溫度進行優化，確定最佳誘導表達條件。步驟15、重組蛋白表達形式的檢測確定重組蛋白最佳誘導條件后，誘導表達500mL重組菌，離心收集菌體，將菌體沉淀用PBS洗3遍后，用PBS重懸沉淀，加入溶菌酶，常溫放置1h，-20℃反復凍融，冰浴超聲破碎15min，12000g離心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10min，12％SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達形式。步驟16、重組蛋白包涵體溶解及重組蛋白純化按最佳誘導條件誘導重組表達菌1L，12000g離心10min收集菌體，按上述方法裂解重組表達菌，離心收集裂解物沉淀，將沉淀用8M尿素溶解，12000g低溫離心10min，收集上清液，用0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni+柱蛋白純化試劑盒操作步驟純化重組蛋白。步驟17、重組蛋白westernblotting檢測將純化出的重組Pj_CPI蛋白(以下簡稱rCPI)進行SDS-PAGE電泳，從制膠板上將蛋白質膠取出，在夾子上放置濾紙、PVDF膜、蛋白膠、濾紙，按順序放好夾住，100V40min轉膜；轉膜后取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，用現配的5％脫脂乳封閉液常溫微搖封閉2h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，將PVDF膜在1：2000稀釋的感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中4℃孵育過夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重復3～4遍，將PVDF膜在辣根過氧化物酶標記的兔抗駱駝多克隆抗體中常溫微搖孵育1h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，用ECL顯色后照相。與現有技術相比，本發明的優勢所在：本發明通過斯氏副柔線蟲轉錄組測序，預測出的編碼基因與已公布的線蟲數據庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴增出特有基因Pj_CPI，克隆測序后，構建到原核表達載體pET30a中，轉化至E.coliBL21(DE3)，進行誘導表達，用western-bloting法驗證Pj_CPI重組蛋白的免疫原性。本發明所述斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因及其編碼產物在檢測家畜斯氏副柔線蟲感染過程中的應用，能診斷斯氏副柔線蟲的感染，且該方法具有較高的特異性、敏感性和較好的重復性。附圖說明圖1是本發明實施例1中斯氏副柔線蟲特有基因Pj_CPI的PCR檢測結果；其中，M為DNAMarkerDL10000；1為捻轉血矛線蟲；2為斯氏副柔線蟲；3為秀麗隱桿線蟲；4為盤尾絲蟲。圖2為本發明實施例1中基因Pj_CPI的PCR擴增電泳圖；其中，M為DNAMarkerDL10000；1-2為基因Pj_CPI；3為空白對照。圖3為本發明實施例1中重組克隆質粒雙酶切鑒定結果；其中，M為DNAMarkerDL2000；1-3為Pj_CPI基因克隆質粒。圖4為本發明實施例1中重組表達質粒pETCPI雙酶切鑒定結果；其中，M1為DNAMarkerDL2000；M2為DNAMarkerDL10000；1-3為重組表達質粒pETCPI。圖5為本發明實施例1中重組表達菌BL21(pETCPI)最佳誘導表達SDS-PAGE電泳結果；其中，M為蛋白質marker；1為BL21(DE3)空菌；2為BL21(pET30)誘導前；3為BL21(pET30)誘導后；4為BL21(pETCPI)誘導前表達菌；5-6為BL21(pETCPI)在25℃，1mMIPTG濃度，誘導4h后，誘導表達菌。圖6為本發明實施例1中重組蛋白表達形式的SDS-PAGE電泳檢測結果；其中，M為蛋白質marker；1為BL21(pETCPI)菌體裂解物上清；2為BL21(pETCPI)菌體裂解物沉淀。圖7為本發明實施例1中重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳檢測結果；其中，M1為蛋白質marker(10kDa-170kDa)；M2為蛋白質marker(14.9kDa-97.2kDa)；1-2為純化的重組蛋白rCPI。圖8為本發明實施例1中重組蛋白His標簽Western-bloting檢測結果；其中，M為蛋白質marker；1-2為純化重組蛋白rCPI。圖9為本發明實施例1中純化重組蛋白rCPI與感染斯氏副柔線蟲的駱駝陽性血清反應結果；其中，M為蛋白質marker；1-2為rCPI與感染斯氏副柔線蟲的駱駝陽性血清反應；3為rCPI與未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清反應。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方案對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。實施例1通過斯氏副柔線蟲轉錄組測序，預測出的編碼基因與已公布的線蟲數據庫比對分析，找出斯氏副柔線蟲特有基因，用RT-PCR方法從斯氏副柔線蟲中擴增出特有基因Pj_CPI，克隆測序后，構建到原核表達載體pET30a中，轉化至E.coliBL21(DE3)，進行誘導表達，用western-bloting法驗證Pj_CPI重組蛋白的免疫原性。1.1實驗方法：1.1.1引物設計根據Pj_CPI的基因序列，用Oligo6.0設計引物，分別在上游引物和下游引物中插入限制性內切酶EcoRI、XhoI酶切位點，引物的合成由華大基因有限公司完成，引物序列見表1。表1Pj_CPI基因引物序列1.1.2斯氏副柔線蟲總RNA的提取按照TaKaRaRNAisoPlusRNA提取試劑說明書操作，具體操作同上述總RNA提取方法。1.1.3Pj_CPI基因RT-PCR擴增以提取的斯氏副柔線蟲總RNA為模板反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，用上述設計的特異性引物PCR擴增Pj_CPI基因并對其特有性進行驗證。PCR擴增反應條件為：預變性94℃5min；變性94℃30sec，退火57℃1min，延伸72℃1.5min，35個循環；再延伸72℃10min。PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.1.4PCR產物回收按照AxygenPCR產物回收試劑盒說明書操作，回收Pj_CPI基因PCR產物。1.1.5PCR回收產物與pMD19-TSimple載體的連接取200μL離心管加1μLpMD19-TSimpleVector、4μLPCR回收產物和5μLSolutionⅠ，離心混勻，16℃過夜連接。1.1.6重組質粒的轉化按照北京全式金生物技術有限公司Trans1-T1感受態細胞使用說明書操作，將連接產物轉化于Trans1-T1感受態細胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固體LB培養基上，37℃培養過夜。1.1.7重組克隆菌PCR鑒定挑取陽性菌落，接種到含抗生素(Amp)的液體LB培養基中培養過夜，以培養物做PCR擴增鑒定。1.1.8重組克隆質粒的雙酶切鑒定按照Axygen質粒提取試劑盒說明書提取重組質粒，用限制性內切酶XhoI和EcoRⅠ對重組質粒進行雙酶切電泳檢測。1.1.9重組克隆菌測序經PCR鑒定及質粒雙酶切鑒定均為陽性的重組克隆菌，送到北京華大基因公司進行雙向測序。1.1.10重組表達載體的構建將測序正確的克隆菌株和含有pET30a質粒的菌接種于LB培養基中培養過夜，分別提取質粒，用限制性內切酶XhoI和EcoRⅠ對重組質粒進行雙酶切和電泳檢測，膠回收目的基因片段和pET30a片段。取200μL離心管加入6μL回收的目的片段、2μLpET30a表達載體片段、1μLT4DNA連接酶和1μLbuffer，16℃連接過夜；構建重組表達質粒(pET30a-Pj_CPI，以下簡稱為pETCPI)。1.1.11重組表達質粒轉化感受態細胞按照北京全式金(TransGenBiotech)生物技術有限公司E.coliBL21(DE3)感受態細胞使用說明書操作，將連接產物轉化于E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含抗生素的固體LB培養基上37℃培養過夜。1.1.12重組表達菌鑒定對構建的重組表達菌進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，經PCR鑒定及質粒雙酶切鑒定均為陽性的重組表達菌，送北京華大基因公司進行雙向測序，具體步驟同1.1.7、1.1.8和1.1.9。1.1.13重組表達菌誘導表達條件的優化將重組表達菌BL21(pETCPI)涂布于含Kan固體LB培養基上培養過夜，挑取單菌落接種在6mL含Kan液體培養基里，37℃培養過夜。第2天以1:100接種于20mL含Kan的LB培養基中，37℃150r/min培養，當OD600達到0.6～1.0時加入IPTG誘導劑至終濃度1.0mM，分別在25℃、30℃、37℃180r/min條件下培養4h后，各取2mL菌液，1mL測吸光值OD600，另1mL離心收集菌體，菌體沉淀物中加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10min，12％SDS-PAGE電泳檢測。將重組表達菌BL21(pETCPI)涂布于含Kan的固體LB培養基上培養過夜，挑取單菌落接種在6mL含Kan液體培養基中，37℃培養過夜。第2天以1:100的比例接種于20mL含KanLB培養基中，37℃150r/min培養，當OD600達到0.6～1.0時取1mL菌液作為0h對照，其余的培養物里加入IPTG誘導劑至終濃度1.0mM，37℃150r/min誘導培養。分別在0h、1h、2h、3h、4h、6h每個時間點各取2mL菌液，1mL測吸光值OD600，另1mL離心收集菌體，菌體沉淀物中加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10min，12％SDS-PAGE電泳檢測。將重組表達菌BL21(pETCPI)涂布于含Kan固體LB培養基上培養過夜，挑取單菌落接種在6mL含Kan的液體培養基里，37℃培養過夜。第2天以1:100的比例接種于20mL含Kan的LB培養基中，37℃150r/min培養，當OD600達到0.6～1.0時，加入誘導劑IPTG至終濃度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM。37℃150r/min繼續培養4h，各取2mL菌液，1mL測吸光值OD600，另1mL離心收集菌體，菌體沉淀物中加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10min，12％SDS-PAGE電泳檢測。1.1.14重組蛋白表達形式的檢測確定重組蛋白最佳誘導條件后，誘導表達500mL重組菌，離心收集菌體，將菌體沉淀用PBS洗滌3遍后，用PBS重懸沉淀，加入溶菌酶，常溫放置1h，-20℃反復凍融，冰浴超聲破碎15min，12000g離心10min，收集沉淀和上清，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10min，12％SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達形式。1.1.15重組蛋白包涵體溶解及純化按最佳誘導條件誘導重組表達菌1L，12000g離心10min收集菌體，按上述方法裂解重組表達菌，離心收集裂解物沉淀，將沉淀用8M尿素溶解，12000g低溫離心10min，收集上清液，0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni+柱蛋白純化試劑盒操作步驟純化重組蛋白。1.1.16重組蛋白westernblotting檢測將純化出的重組蛋白(rCPI)進行SDS-PAGE電泳，從制膠板上將蛋白質膠取出，在夾子上放置濾紙、PVDF膜、蛋白膠、濾紙，按順序放好夾住，100V40min轉膜；轉膜后取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，用現配的5％脫脂乳封閉液常溫微搖封閉2h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，將PVDF膜在1：2000稀釋的感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中4℃孵育過夜；取出PVDF膜TBST洗4min，重復3～4遍，將PVDF膜在辣根過氧化物酶標記的兔抗駱駝多克隆抗體中常溫微搖孵育1h；取出PVDF膜TBST洗滌4min，重復3～4遍，用ECL顯色后照相。1.2實驗結果1.2.1Pj_CPI基因特異性PCR檢測斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因序列與NCBI公布的線蟲序列進行BLAST比對，比對結果顯示該序列為斯氏副柔線蟲特有序列。Pj_CPI基因PCR擴增后進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。結果表明：Pj_CPI基因只在斯氏副柔線蟲RNA中擴增出約399bp條帶，而在捻轉血矛線蟲，秀麗隱桿線蟲和盤尾絲蟲中均未擴增出Pj_CPI基因條帶。1.2.2目的基因的擴增Pj_CPI基因RT-PCR擴增后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。結果顯示：Pj_CPI基因出現約399bp的條帶，與預期的目的基因大小相符。1.2.3重組克隆菌PCR鑒定目的片段與pMD19-T載體連接后轉入感受態細胞，在固體培養基上培養12～16h，挑取3個單菌落接種到LB液體培養基，培養12～16h，再以菌液為模板PCR擴增，并進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。Pj_CPI基因克隆菌擴增出了約399bp條帶，均獲得了預期大小的目的條帶。1.2.4重組克隆質粒的雙酶切鑒定經菌液PCR鑒定呈陽性的菌株提取質粒，用限制性內切酶(EcoRI、XhoI)進行雙酶切，酶切產物電泳檢測，結果見圖3。結果出現了兩個條帶，分別為Pj_CPI基因(0.4kb)和pMD19-T(2.7kb)，表明目的基因成功插入pMD19-T載體序列中。1.2.5重組表達菌PCR鑒定目的片段插入到pET30a載體后轉化感受態菌體細胞，涂布在固體培養基上培養12～16h，挑取3個單菌落接種到液體LB培養基中培養12～16h，以菌液為模板PCR擴增，進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出約399bp的條帶，與預期的目的基因大小相符。1.2.6重組表達質粒的雙酶切鑒定經PCR鑒定呈陽性的菌株提取質粒用限制性內切酶(EcoRI、XhoI)進行雙酶切，酶切產物電泳檢測，結果見圖4。結果出現兩個條帶，分別為Pj_CPI基因(0.4kb)和表達載體pET30a(5.4kb)，結果表明目的基因成功插入表達載體pET30a中。1.2.7測序結果及分析經PCR鑒定和雙酶切鑒定呈陽性的重組克隆菌和重組表達菌進行雙向測序，雙向測序得到的Pj_CPI基因序列與轉錄組測序得到的Pj_CPI基因核苷酸序列比對同源性為100％，說明Pj_CPI基因成功克隆至載體pET30a中，并成功構建重組表達載體。1.2.8重組表達菌誘導表達條件的優化培養的重組表達菌BL21(pETCPI)增殖培養至OD600達到0.6～1.0后，分別對其進行誘導溫度(25℃、30℃、37℃)，誘導劑IPTG濃度(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.6Mm、1.0mM、2.0mM)和誘導時間(0h、1h、2h、3h、4h、6h)進行優化。結果表明，重組表達菌BL21(pETCPI)與空菌BL21(DE3)、未誘導BL21(pET30)和誘導后重組菌BL21(pET30)比較，在20kDa處多出了一個條帶，與預期的目的表達產物大小一致。重組表達菌BL21(pETCPI)在誘導溫度為25℃，誘導時間為4h，誘導劑IPTG誘導濃度為1.0mM時，確定為BL21(pETCPI)最佳誘導條件，結果見圖5.1.2.9重組蛋白表達形式的檢測確定重組蛋白最佳誘導條件后，誘導表達重組菌，離心收集菌體沉淀，裂解菌體，離心收集沉淀和上清液，進行12％SDS-PAGE電泳，發現重組蛋白主要以可溶性表達蛋白存在于上清液中，結果見圖6。1.2.10重組蛋白的蛋白純化Pj_CPI基因重組表達菌誘導培養后，離心收集菌體，裂解，離心收集上清液，以0.45μm孔徑濾器過濾后按照上海生工Ni+柱蛋白純化步驟過柱子純化蛋白，得到了較純的重組蛋白，結果見圖7。1.2.11重組蛋白Western-bloting檢測以RabbitAnti-His.tagIgG為抗體做Western-Blotting檢測，重組菌BL21(pETCPI)在20kDa處出現了特異性條帶，證明重組蛋白融合表達了pET30a表達載體上的His標簽，結果見圖8。以確定感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清作為抗體檢測重組蛋白rCPI，在20kDa處出現了特異性條帶，表明重組蛋白能夠與感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中的抗體發生特異性反應，具有較好的免疫原性，而重組蛋白rCPI與未感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清不反應，結果見圖9。實施例22.1iELISA實驗方法將斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因重組蛋白(rCPI)用0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋成一定的濃度，每孔100μL加入酶標板，于4℃包被過夜。第2天取出酶標板在室溫下將其孔內液體棄掉，用PBST洗滌液洗滌酶標板3次，每次靜止5min，洗滌結束后在濾紙上拍干酶標板內的液體。每孔加100μL的3％BSA封閉液，在37℃放置2h后，用洗滌液洗3次，每次靜置5min，洗滌結束后拍干酶標板孔內的液體。用稀釋液將血清稀釋到一定的倍數后加入到酶標板孔內，每孔加入100μL于37℃孵育1h。棄掉孔內液體，用洗滌液洗3次，每次靜置5min，洗滌結束后拍干酶標板孔內的液體。加入按適當比例稀釋的HRP標記兔抗駱駝IgG，每孔加入100μL于37℃孵育45min，之后用洗滌液洗3次，每次靜置5min，洗滌結束后拍干酶標板。每孔加100μLTMB顯色液，37℃顯色10min。顯色結束后，每孔加100μL終止液終止反應，并在酶標儀上讀取OD450值。2.2斯氏副柔線蟲iELISA檢測方法的建立2.2.1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定按照棋盤滴定法，將實施例1中純化好的重組蛋白(rCPI)用包被液進行定量稀釋，使純化抗原每孔(100μL/孔)上樣總量分別為1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，抗原初始濃度為rCPI2.89μg/μL，4℃包被過夜，次日將已知標準陽性(81份陽性血清等體積混合的血清作為標準陽性血清)、陰性血清(9份陰性血清等體積混合的血清作為標準陰性血清)按1:25、1：50、1：100、1：200、1：400的5個梯度進行稀釋，兔抗駱駝IgG-HRP按1：5000稀釋，根據上述iELISA程序測定OD450值。根據OD450值計算每組的P/N值，P/N＝實驗組/對照組＝OD陽性血清/OD陰性血清，P/N值最大時所對應的抗原稀釋度和血清稀釋度為最佳稀釋度。2.2.2酶標二抗最佳稀釋度的確定確定了抗原最佳稀釋濃度和血清稀釋倍數后，兔抗駱駝IgG-HRP按1:2500、1：5000、1：7500、1：100004個梯度稀釋，每孔加100μL，進行iELISA試驗。根據OD450值計算每個二抗稀釋度的P/N值，P/N值最大時所對應的二抗稀釋度即為最佳二抗稀釋度。2.2.3重復性實驗選取2份陽性血清和2份陰性血清，并以標準陽性血清和標準陰性血清作為對照進行iELISA檢測，每個樣品重復3次，計算每個樣品的平均值和標準差。2.2.4判定點的確定按照上述確定的最佳反應條件，用重組蛋白rCPI抗原檢測81份斯氏副柔線蟲感染的駱駝陽性血清及9份未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清，并進行統計學分析，通過計算9份陰性血清OD450值的平均值和標準差(SD)。根據用以下公式確定重組抗原iELISA判定點：當待測樣品OD450值大于判定點時判為陽性，若小于判定點時判斷為陰性。當待測樣品OD450與臨界值接近時，進行二次檢測，檢測結果與第一次檢測結果相同時，確定為疑似斯氏副柔線蟲感染。2.2.5敏感性和特異性實驗以重組蛋白rCPI抗原檢測份81份斯氏副柔線蟲感染的駱駝陽性血清及9份未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清，確認重組抗原iELISA敏感性。以重組蛋白rCPI抗原對幾種常見的寄生蟲混合感染的24個陽性血清進行iELISA特異性檢測,主要包括：莫尼茨絳蟲、捻轉血矛線蟲、肺絲蟲、夏伯特線蟲、細頸線蟲、毛尾線蟲，毛圓線蟲，食道口線蟲，鼻蠅蛆。2.2.6田間實驗將待檢的140份駱駝血清進行iELISA檢測。2.3實驗結果2.3.1最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定將純化好的重組蛋白rCPI抗原按5個不同的濃度進行加樣，已知陽性血清和陰性血清按5個梯度稀釋，進行iELISA檢測，根據iELISA顯色后的OD450值可知陽性、陰性血清OD450值存在明顯差異，結果見表2。根據P/N值計算出抗原最佳包被濃度為4μg/孔，血清最佳稀釋度為1:50，結果見表3。表2重組蛋白rCPI抗原棋盤試驗OD450值表.3重組蛋白rCPI抗原iELISA檢測的P/N值2.3.2酶標二抗最佳稀釋度的確定根據iELISA檢測OD450值計算P/N值大小，確定酶標二抗最佳稀釋度為1:5000，結果見表4。表4酶標二抗最佳工作濃度的確定2.3.3重復性實驗分別選取標準陽性、標準陰性血清和2份已知陽性、陰性血清，用重組抗原進行iELISA檢測，每個樣品重復檢測3次。計算每個血清OD450的平均值和標準差，求出變異系數，結果變異系數均小于10％，表明重組抗原建立的iELISA檢測方法具有較好的重復性，結果如表5。表5重組抗原重復性實驗OD450值2.3.4判定點的確定通過對9份未感染斯氏副柔線蟲的駱駝陰性血清和81份斯氏副柔線蟲感染的駱駝陽性血清進行重組抗原iELISA法檢測，結果見表6。根據統計學原理,將的樣品,判斷為陽性。根據9份陰性血清的OD450值，計算出陰性血清的平均值標準差(SD)＝0.023.因此，樣品陰性、陽性的臨界值＝0.210+3×0.023＝0.279。樣品的判定標準為：樣本OD450值＞0.279時，判定為陽性；樣本OD450值＜0.279時，判定為陰性。表.6重組抗原rCPI檢測結果2.3.5特異性和敏感性分析根據表7中rCPI抗原對81份駱駝陽性血清及9份駱駝陰性血清的測定結果，根據敏感性計算公式，得出在81份陽性血清中檢測出來80份血清的OD450值大于0.279，有1份陽性血清OD450值為0.272,接近臨界值，判定為是疑似病例。其結果表明，重組蛋白rCPI作為診斷抗原敏感性為98.8％。用建立的iELISA方法，檢測常見的9種其它寄生蟲混合感染的24個血清樣本。結果顯示，24份血清OD450值均小于臨界值0.279，均判定為陰性。只有斯氏副柔線蟲感染的血清為陽性，和其它寄生蟲感染的陽性血清無交反應，表明所建立的檢測方法特異性良好，見表7。表7，特異性實驗結果2.3.6田間實驗根據實驗確定的最佳工作條件，用重組蛋白rCPI抗原包被酶標板，對140份駱駝血清進行iELISA檢測，在被檢的140份血清中有118份陽性血清，陽性率為84.3％。表8田間實驗結果抗原檢測血清份數陽性份數陰性份數陽性檢出率rCPI1401182284.3％本發明所建立的iELISA檢測方法能診斷斯氏副柔線蟲的感染，且該方法具有較好的重復性及較高的特異性和敏感性。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，本發明的保護范圍不限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到技術方案的簡單變化或等效替換，如對斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因的核苷酸序列經替換、缺失或添加若干核苷酸形成具有同等功能的核苷酸序列及其編碼產物，上述核苷酸序列及其編碼產物在制備家畜斯氏副柔線蟲感染檢測試劑及相關產品中的應用，均落入本發明的保護范圍內。SEQUENCELISTING<110>內蒙古農業大學<120>斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑Pj_CPI基因克隆、重組表達方法及應用<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>399<212>DNA<213>人工序列<400>1atgttgtgctttgctgtgttattggtattgttcgtgaacgtaaccaccttcagtaatatt60ggcaagtatacggggatacttgagagacttgacgatgcaaatgtgaatgatccggacgta120caggcagtagcgcaagaagcaatggtgcaattaaatggtcaattgaaggataagactttg180tataagcttgtgaaagtactcaaagcacaaactcaagtagtggatggcttaaaatatcac240cttacaatcctttccgcaccgacgaaatgtgaagagagttctagaaatagtgatccaacg300aattgtgacgccgataatacaaaaccgcaaaagcagtttaaagttgaagtattgacaagg360ccatgggaagacttcacacaagtccagctgaagtcttaa399<210>2<211>1983<212>DNA<213>人工序列<400>2atgttgtgctttgctgtgttattggtattgttcgtgaacgtaaccaccttcagtaatatt60ggcaagtatacggggatacttgagagacttgacgatgcaaatgtgaatgatccggacgta120caggcagtagcgcaagaagcaatggtgcaattaaatggtcaattgaaggataagactttg180tataagcttgtgaaagtactcaaagcacaaactcaagtagtggatggcttaaaatatcac240cttacaatcctttccgcaccgacgaaatgtgaagagagttctagaaatagtgatccaacg300aattgtgacgccgataatacaaaaccgcaaaagcagtttaaagttgaagtattgacaagg360ccatgggaagacttcacacaagtccagctgaagtcttaa399<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3gccgaattcatgttgtgctttgctgtgttat31<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4ttgctcgagttaagacttcagctggactt29<210>5<211>132<212>PRT<213>人工序列<400>5MetLeuCysPheAlaValLeuLeuValLeuPheValAsnValThrThr151015PheSerAsnIleGlyLysTyrThrGlyIleLeuGluArgLeuAspAsp202530AlaAsnValAsnAspProAspValGlnAlaValAlaGlnGluAlaMet354045ValGlnLeuAsnGlyGlnLeuLysAspLysThrLeuTyrLysLeuVal505560LysValLeuLysAlaGlnThrGlnValValAspGlyLeuLysTyrHis65707580LeuThrIleLeuSerAlaProThrLysCysGluGluSerSerArgAsn859095SerAspProThrAsnCysAspAlaAspAsnThrLysProGlnLysGln100105110PheLysValGluValLeuThrArgProTrpGluAspPheThrGlnVal115120125GlnLeuLysSer130當前第1頁1 2 3