專利名稱：人mchr1抗原表位區基因表達相關蛋白mchr1-c及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人黑素濃集素受體-l(Melanin Concentrating Hormone Receptor 1,MCHR1)抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C及其編碼基因、重組載體，以及 這種多肽在鑒定白癜風患者血清中自身抗體中的應用。
背景技術：
白癜風是黑素細胞破壞所致的皮膚色素缺失性疾病，白癜風患者遍布世界各地， 約占世界人口的1 2%。我國如以計算，約有1000多萬白癜風患者，該病對美容所 造成的損害嚴重影響了患者的心理健康和正常社交活動及就業選擇，降低了患者的生活質 量，部分人甚至因患該病而輕生。目前由于該病發病機制尚未明確，治療困難。近年來的大 量研究表明白癜風患者的發病很大部分與自身免疫功能紊亂密切相關。白癜風患者血清 中有抗黑素細胞的自身抗體，且抗黑素細胞抗體滴度與該病活動性和嚴重程度密切相關， 50%局限性白癜風患者血清有抗黑素細胞的抗體，泛發性白癜風則高達93%。黑素細胞自身抗原包括胞漿抗原和胞膜抗原，目前已經明確的胞漿抗原為TYR相 關蛋白家族。TYR是一種相對分子質量為75000的含銅蛋白，研究表明TYR相關蛋白家族很 可能是與白癜風病情相關的重要抗原。課題組在前期研究中根據已報道的人TYR的B細胞 表位，合成了 5個表位區的編碼基因，通過原核表達、純化后獲得了相對分子質量為33000 的目的融合蛋白TYR-C，此目的融合蛋白具有結合白癜風患者血清IgG的能力。對胞膜抗 原的大量鑒定研究表明，MCHRl是目前唯一明確的胞膜抗原。黑素濃集素(MCH)是一種含 有19個氨基酸的神經肽，主要存在于下丘腦，它有兩種黑素濃集素受體MCHRl和MCHR2，這 兩種受體的分布及在大腦中的表達基本相似，但MCHR2不存在于嚙齒動物中。MCHRl屬于G 蛋白偶聯受體家族，它與α-黑素刺激素(α-MSH)結合后可引起黑素合成。MCH是α-MSH 的拮抗物，與受體MCHRl結合后可抑制黑色素的合成，所以MCH/MCHR1信號途徑在調節黑素 細胞黑素合成中起重要作用。白癜風自身抗體不必通過細胞膜即可引起對受體功能的負面 效應，最終導致正常黑素細胞的破壞。Kemp 等于 2002 年(J Clin Invest, 2002，109 (7) :923_930)發現 MCHRl 是一個新 的白癜風相關黑素細胞抗原，并且對白癜風具有高度特異性，引起許多學者的關注。賀秋 豪等于2005年(中國皮膚性病學雜志，2005，19 (2) :77_79轉88)構建了 MCHRl真核表達 載體，并獲得了 MCHRl的真核表達蛋白，以該蛋白為抗原，檢測白癜風患者血清中抗MCHRl 抗體陽性率為17. 1% ；同年，賀秋豪等(中華皮膚科雜志，2005，38(1) :29_31)還表達了 MCHRl中1-94位氨基酸的B細胞表位肽段，獲得了原核表達重組蛋白GST-MCHR1，以其為 抗原，13. 2%的白癜風患者血清抗MCHRl自身抗體IgG呈陽性反應。Kemp等于2009年 (Experimental Dermatology. 2009,18(5) :454_463)鑒定了 MCHRl 的 B 細胞抗原表位區 分別位于51-80,85-98，154-158和254-260位氨基酸，其中主要抗原表位區位于51-80和 254-260位氨基酸，次要抗原表位區位于85-98和154-158區。
本發明以含有MCHRl的4個B細胞表位的GST-MCHR1純化蛋白為抗原，檢測白癜風 患者血清中抗MCHRl自身抗體陽性率為36%，高于已有研究的抗MCHRl自身抗體檢出陽性 率，這可能與所選待檢患者血清均來自于進展期患者有關，也可能與目的純化蛋白包含的4 個表位有關。人全長MCHRl由于分子量較大，表達難度增加，直接表達抗原表位肽，其分子 量小，結構簡單，去除了非抗原表位區，有較高的特異性和敏感性。如上所述，人MCHRl是白癜風患者血清中產生自身抗體的主要胞膜抗原，因而本 領域中一直需要制備一種更有效的能夠鑒定白癜風患者血清中抗胞膜抗原自身抗體的人 MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白。
發明內容
本發明目的既是為了提供一種能有效鑒定色素性皮膚病MCHRl抗體尤其是鑒定 白癜風患者血清中自身抗體的多肽人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C及其 編碼基因，以及這種多肽在鑒定白癜風患者血清中自身抗體中的應用。本發明采用的技術方案是一種人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHR1-C，具有SEQID NO :1所示的氨
基酸序列。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO 1所示氨基酸序列的多肽的片段或 其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸 序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與 原氨基酸相似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變， 如用色氨酸替換甘氨酸。本發明所述多肽的片段、衍生物或類似物是指基本上保持本發明 所述的人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C相同的生物學功能或活性的多肽， 可以是下列情形(I) 一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優選的是保守 氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；(II) 一個 或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代；(III)成熟多肽與另一種化合物(比如 延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合進成熟多肽 而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。所述多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，可以是天然純化的產物，或是化 學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺 乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的。本 發明的多肽還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還涉及編碼所述相關蛋白MCHRl-C的基因。具體的，所述編碼基因具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO 2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核 苷酸具有70%以上同源性，均屬于本發明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具 有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非 生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是 一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上
4改變其編碼的多肽的功能。另外，可以SEQ NO :2所示多核苷酸序列雜交的多核苷酸(至少具有50%同源性， 優選具有70%同源性)，也在本發明保護范圍之列，特別是在嚴格條件下可與本發明所述 核苷酸序列雜交的多核苷酸。所述“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的 雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1% SDS, 60°C ；或⑵雜交時加用變性劑，如50% (V/V)甲酰 胺，0. 小牛血清，0. 1% Ficoll,42°C ；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在95%以 上，更好是97%以上是時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO 1所示的多肽有相同的生物學功能和活性。編碼本發明所述人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的多核苷酸序列 能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不局 限于(1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列和(2)表達文庫的 抗體篩選以檢出具有共同結構特征的克隆的多核苷酸片段。本發明的DNA片段序列也能用 下列方法獲得(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學合成DNA序列以獲得所述多 肽的雙鏈DNA。可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限于) (I)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現或喪失；(3)測定人MCHRl抗原表位 區基因表達相關蛋白MCHRl-C的轉錄本的水平；⑷通過免疫學技術或測定生物學活性，來 檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規方 法雙脫氧鏈終止法(Sanger et al. PNAS, 1977, 74 =5463-5467)測定。這類多核苷酸序列測 定也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定 多個克隆的cDNA序列，才能拼接全長的cDNA序列。本發明還涉及一種含有所述核苷酸序列的重組載體。本發明中，編碼人MCHRl抗 原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發明 所述多核苷酸的重組載體。“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞 病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其它載體。在本發明中適用的載體包括 但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(Rosenberg, et al. Gene, 1987，56 125)；在哺乳動物細胞中表達的pcDNA3. 1 載體(Lee and Nathans, J Bio Chem. 263 :3521， 1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩 定，任何質粒和載體都可以用于構建重組表達載體。表達栽花本報一個重要特征是通常含 有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含編碼人MCHRl抗原表位區基因表達 相關蛋白MCHRl-C的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體 外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambrook，et al. ,Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。所述的 DNA序 列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子 有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；噬菌體的P^啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、 HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控 制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核
5糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉 錄得到增強。增強子是DNA表達順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟 動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的 SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性等。本發明中，編碼人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的多核苷酸或含 有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該核苷酸或重組載體的基 因工程化宿主細胞。“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞； 或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠 傷寒沙門你菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ；動物細胞如CH0、 COS或Bowes黑素瘤細胞等。用本發明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領 域技術熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸丁菌時，能吸收DNA的感受態細胞 可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的本領域眾所周知，可供選擇的是用MgCl2。 如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方 法磷酸鈣共沉淀法，或者常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的 人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHR1-C。一般來說有以下步驟(1)用本發明的編碼人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的多核苷酸 (或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。在步驟(2)中，根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養 基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合 適的方法(如溫度置換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在步驟(3)中，重組多肽可包被于細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。 如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。 這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規的復性處理、蛋白 沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合.本發明的要點在于提供了 SEQ NO :1所示的核苷酸序列和SEQ NO :2所示的氨基酸 序列，在已知該核苷酸序列和氨基酸序列的情況下，該核苷酸序列和氨基酸序列的獲得，以 及相關載體、宿主細胞的獲得，對于本領域技術人員來說均是顯而易見的。本發明還涉及所述的相關蛋白MCHRl-C在制備檢測色素性皮膚病MCHRl抗體的試 劑盒中的應用。具體的，所述試劑盒為檢測白癜風患者血清中MCHRl自身抗體的試劑盒。所檢測的人MCHRl自身抗體水平，可以用作解釋人MCHRl在白癜風患者發病中的重要性和用于診 斷人MCHRl起作用的自身免疫性疾病。本發明還涉及所述的編碼基因在制備檢測人MCHRl多核苷酸表達的試劑盒中的應用。編碼人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的多核苷酸可用于檢測人 MCHRl多核苷酸的表達與否或在疾病狀態下人MCHRl多核苷酸的異常表達。如編碼人MCHRl 多核苷酸抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的DNA序列可用于對活檢標本進行雜交以 判斷人MCHRl的表達情況。雜交技術包括Southern印跡法，Nouthern印跡法，原位雜交等。 這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷 酸的一部分或全部可作為探針固定在微列陣(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯 片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。檢測人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C基因的突變也可用于診斷人 MCHRl相關的疾病。人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C突變的形式包括與正 常野生型人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白MCHRl-C的DNA序列相比的點突變、易位、 缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法，DNA序列分析、PCR和 原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白表達，因此用Nouthern印跡法，Western印 跡法可間接判斷基因有無突變。本發明還提供了一種檢測白癜風患者血清中MCHRl自身抗體的方法，所述方法 包括以白癜風患者血清為樣本，以健康者血清為對照，以1 μ g/mL純化后的相關蛋白 MCHRl-C包被ELISA板，4°C過夜，1 XPBST洗滌，拍干；加入稀釋的患者血清溫育，1 XPBST 沖洗，加入1 5000HRP偶聯的兔抗人IgG酶標結合物37°C溫育30min，IXPBST沖洗，TMB 避光顯色，終止反應，采用450nm和630nm雙波長測定吸光值，以大于健康血清A值的平均 值加2倍標準差判為陽性。本發明的有益效果主要體現在提供了一種有效的能夠鑒定白癜風患者血清中 自身抗體的多肽人MCHRl抗原表位區基因表達相關蛋白及該多肽在檢測色素性皮膚病 MCHRl體尤其是白癜風患者血清中自身抗體中的應用，為今后的新藥篩選提供了基礎。
圖1為原核表達載體pGEX-4T-l的質粒圖譜；圖2為重組表達載體的酶切結果。M =KB ladder Marker ；1 =BamH I/Xhol雙酶切 質粒pGEX-MCHRl-C ；3 目的基因的PCR擴增片段；圖3為目的蛋白的SDS-PAGE分析。1 中分子量蛋白Marker ；2 大腸桿菌BL21的 表達蛋白；3 :pGEX-4T-l的表達蛋白；4 無IPTG誘導的pGEX-MCHRl-C的表達蛋白；5 =IPTG 誘導后pGEX-MCHRl-C表達的總蛋白；6 =IPTG誘導后pGEX-MCHRl-C表達的可溶蛋白；7 目 的純化蛋白。圖4為目的蛋白的western印跡檢測。1 中分子量蛋白預染Marker ;2 :BL21表 達的蛋白；3 :pGEX-4T-l的表達蛋白；4 無IPTG誘導的pGEX-MCHRl-C的表達蛋白；5 =IPTG 誘導后pGEX-MCHRl-C表達的總蛋白；6 =IPTG誘導后pGEX-MCHRl-C表達的可溶蛋白；7 目 的純化蛋白；圖5為以MCHRl-C為抗原，白癜風自身抗體陽性患者血清IgG抗體滴度檢測。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子 克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條 件，或按照制造廠商的建議的條件。材料與試劑pGEX-4T-2質粒及BL21大腸桿菌菌種由浙江大學昆蟲科學研究所張傳溪教授惠 贈，DH5ci大腸桿菌菌種由杭州市第三人民醫院皮膚科實驗室保存。TaqDNA聚合酶購于上 海申能博彩生物公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶、溶菌酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)及中分子量蛋白質標準參照物購于上海生物工程公司。谷胱苷肽S-轉移酶(GST) 鼠抗單克隆抗體購自美國Upstate公司，GST純化試劑盒購于美國Pierce公司。ELISA檢 測中包被液為0. 2mol/L pH9. 6碳酸鈉鹽緩沖；封閉液為含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液 (PBS)溶液，洗滌液為含0. 5%Tween-20的PBS溶液(PBST)，3，3，5，5-四甲基聯苯胺(TMB) 溶液購于美國Pierce公司。實施例1 病例收集收集2008年1月1日至2009年12月30日杭州市第三人民醫院皮膚科門診就 診的未合并其他疾病且近3個月未經免疫抑制劑治療、病情有明顯進展的白癜風患者血清 100例，其中尋常型82例(泛發性10例，局限性8例，肢端性16例，散在性33例，散在性結 合肢端性15例)，節段型18例；男48例，女52例，年齡16 67歲，平均年齡32歲，病程1 個月到20年，平均3. 5年。正常人血清30例，其中男16例，女14例，年齡18 47歲，平 均31歲，均采自體檢健康者。所有收集病例均獲患者知情同意簽署及杭州市第三人民醫院 理委員會批準。實施例2 人MCHRl抗原表位區基因MCHRl-C的合成根據文獻報道人MCHRl抗原表位區51_80，85_98，154-158和254-260，按照人 MCHRl全長基因(基因庫登錄號NM005297. 3)的核苷酸序列進行人工合成，并在基因的5’ 端引入BamH I酶切位點，在3’端引入Xho I酶切位點及終止密碼子序列，合成基因MCHRl-C 大小為183bp。此項工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。合成后的抗原表位區基因 所測序列與SEQ ID NO 2 一致。實施例3 人MCHRl抗原表位區基因MCHRl-C表達載體的構建擴增后MCHRl-C片段經純化、BamHI/xhoI (購于寶生物工程(大連)有限公司) 雙酶切后連至原核表達載體pGEX-4T-2(由浙江大學昆蟲科學研究所張傳溪教授惠贈)的 BamH I/Xho I位點，T4DNA連接酶(購于寶生物工程(大連)有限公司)連接后將重組質 粒轉化BL21大腸桿菌感受態細胞中，篩選重組轉化子，將篩選后的重組質粒pGEX-MCHRl-C 經酶切、PCR鑒定后送上海生工公司測序。插入的抗原表位片段所測序列與SEQ ID NO 2 一致。實施例4 =GST融合蛋白的誘導表達和純化將含有實施例3所得重組質粒的菌液搖至A 0. 4時，加入異丙基-β -D-硫代半 乳糖苷(IPTG，購于上海生物工程公司)至終濃度1.0mmOl/L，37°C誘導培養4 8h，按常
8規方法收集菌體。以超聲波破碎細胞，40C，6s/次X 3次；4°C 12000r/min離心5min ；分別 取上清和沉淀，加入4X上樣緩沖液，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結 果表明，表達后的目的融合蛋白大小為32660Da，與預期表達產物(SEQ ID NO=D大小相一 致，其可溶蛋白約占目的融合蛋白的60%，陽性對照中表達的GST蛋白大小為相對分子質 量26000Da，陰性對照沒有目的蛋白表達(圖2)。按照美國Pierce公司的GST融合蛋白純化試劑盒說明書操作。250ml菌體用IOml 蛋白裂解液懸浮，離心后上清加入GST純化柱，500 1洗滌緩沖液洗3次，最后用2ml洗脫 緩沖液洗脫重組蛋白共4次。應用凝膠分析系統分析目的純化蛋白，其純化率為90% (圖 3)。由圖3可見，陰性對照BL21 (lane 2)與未經IPTG誘導的pGEX-MCHRl-C無目的 蛋白表達(lane 4)，IPTG誘導后，陽性對照pGEX_4T_l有一相對分子量26000的蛋白表達 (lane 3)，pGEX-MCHRl_C有相對分子量32660的蛋白表達表達(lane 5)，經超聲波處理后， pGEX-MCHRl-C表達的蛋白部分可溶(lane 6)，其可以經過GST純化試劑盒處理，得到目的 純化蛋白(lane 7)。實施例5 =Western印跡檢測目的融合蛋白的表達重組蛋白進行10% SDS-PAGE電泳后轉印到硝酸纖維素膜上。使用鼠抗GST單克 隆抗體(購于美國upstate公司)，稀釋至1 2000孵育，二抗使用辣根過氧化物酶(HRP) 偶聯的羊抗鼠抗體(購于美國Santa CruzBiotechnology公司)，稀釋至1 5000孵育，免 疫反應條帶使用超敏發光液(購于美國Applygen Technologies公司)檢測，實驗結果曝 光到X線膠片上。免疫印跡結果表明目的融合蛋白及其可溶蛋白在相對分子質量32660Da 處均有一條特異性條帶，陽性對照在相對分子質量26000Da處有一條特異性條帶(圖4)。由圖4可見，應用鼠抗GST單克隆抗體可以檢測到pGEX-4T-l表達的蛋白在相對 分子質量26000處有一條特異性條帶(lane 3)，IPTG誘導后pGEX-MCHRl-C表達的總蛋白、 可溶蛋白以及其純化蛋白在相對分子質量32660處各有一條特異性條帶(lane 5 7)， BL21表達的蛋白(lane 2)和未經IPTG誘導的pGEX-MCHRl-C表達的蛋白均未檢測到特異 性條帶(lane 4)。實施例6 在白癜風中的抗原性檢測及滴度測定檢測100例進展期白癜風患者中的人MCHRl自身抗體，以30例健康者血清為陰性 對照，采用間接ELISA法檢測該蛋白的抗原性。以lg/mL實施例4所得純化蛋白包被ELISA 板，4°C過夜，IXPBST洗滌3次，拍干。加入10倍稀釋的患者血清溫育lh，IXPBST沖洗3 次，加入1 5000HR偶聯的兔抗人IgG酶標結合物37°C溫育30min，lXPBST沖洗3次，TMB 避光顯色30min后，2mol/L H2SO4終止反應，采用450nm和630nm雙波長測定吸光值。以大 于健康血清A值的平均值加2倍標準差( ±2S )判為陽性。方陣滴度結果表明，抗原包被最佳濃度為0. 125ug/ml, 二抗最佳稀釋度為 1 5000。進展期100例白癜風患者中，36例血清與目的蛋白之間有結合反應，陽性率為 36%。30名健康對照者血清無陽性反應。比較白癜風患者血清與健康對照血清在1 10 至1 10240稀釋的OD值，結果顯示兩組樣本OD值在此區間有統計學差異(P < 0. 05，圖 5)。由圖5可見，將待檢血清從1 10開始進行倍比稀釋，至1 10240時患者血清
9與健康血清吸光值之間均有顯著性差。實施例7 (對比例)與現有的多肽進行對比Kemp 等(J Clin Invest，2002，109 (7) :923_930.)研究 55 例白癜風患者血清抗 MCHRl抗體陽性率為16. 4%，賀秋豪等用含1-94位氨基酸B細胞表位的GST-MCHR1純化蛋 白為抗原，檢測白癜風患者血清中抗MCHRl自身抗體陽性率為13.2% (中華皮膚科雜志， 2005,38(1) :29-31)。本發明以含有MCHRl的4個B細胞表位的GST-MCHR1純化蛋白為抗 原，檢測白癜風患者血清中抗MCHRl自身抗體陽性率為36%，高于已有研究的抗MCHRl自身 抗體檢出陽性率，這可能與所選待檢患者血清均來自于進展期患者有關，也可能與目的純 化蛋白僅包含4個特異性抗原表位而無其它非特異性表位有關。實施例8 與已有胞漿抗原的聯合檢測收集2010年5月1日至2010年6月20日杭州市第三人民醫院皮膚科門診就診 的未合并其他疾病且近3個月未經免疫抑制劑治療、多數患者病情有明顯進展的白癜風患 者血清149例，其中尋常型120例(其中局限性20例，肢端性45例，散在性50例，泛發性 5例)，節段型29例；男70例，女79例，年齡16 70歲，平均年齡28. 7歲，病程1個月到 28年，平均3. 9年。所有收集病例均獲患者知情同意簽署及杭州市第三人民醫院理委員會 批準。分別以胞漿抗原TYR-C和胞膜抗原MCHRl-C為抗原，分別包被ELISA板，檢測上述 149例白癜風患者中IgG抗體。結果表明，以TYR-C為抗原檢測的IgG抗體陽性率為41.3%， 以MCHRl-C為抗原檢測的IgG抗體陽性率為39. 3%，二者檢測結果聯合統計后的總陽性率 為45. 3%，較單獨檢測的陽性率高，表明同時應用此二種抗原檢測，較單獨應用其中一種抗 原檢測效果更好。
權利要求
一種人MCHR1抗原表位區基因表達相關蛋白MCHR1 C，具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述相關蛋白MCHRl-C的基因。
3.如權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因具有SEQIDNO :2所示的 核苷酸序列。
4.一種含有權利要求3所述核苷酸序列的重組載體。
5.權利要求1所述的相關蛋白MCHRl-C在制備檢測色素性皮膚病MCHRl抗體的試劑盒 中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述試劑盒為檢測白癜風患者血清中MCHRl 自身抗體的試劑盒。
7.權利要求3所述的編碼基因在制備檢測人MCHRl多核苷酸表達的試劑盒中的應用。
8.—種檢測白癜風患者血清中MCHRl自身抗體的方法，所述方法包括以白癜風患者 血清為樣本，以健康者血清為對照，以1 μ g/mL純化后的相關蛋白MCHRl-C包被ELISA板， 4°C過夜，IXPBST洗滌，拍干；加入稀釋的患者血清溫育，IXPBST沖洗，加入1 5000HR偶 聯的兔抗人IgG酶標結合物37°C溫育30min，IXPBST沖洗，TMB避光顯色，終止反應，采用 450nm和630nm雙波長測定吸光值，以大于健康血清A值的平均值加2倍標準差判為陽性。
全文摘要
本發明提供了一種人黑素濃集素受體-1(Melanin Concentrating Hormone Receptor 1，MCHR1)抗原表位區基因表達相關蛋白MCHR1-C及其編碼基因、重組載體，以及這種多肽在鑒定白癜風患者血清中自身抗體中的應用。本發明人MCHR1抗原表位區基因表達相關蛋白MCHR1-C，具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本發明的有益效果主要體現在提供了一種有效的能夠鑒定白癜風患者血清中自身抗體的多肽人MCHR1抗原表位區基因表達相關蛋白及該多肽在檢測色素性皮膚病MCHR1抗體尤其是白癜風患者血清中自身抗體中的應用，為今后的新藥篩選提供了基礎。
文檔編號C12N15/12GK101955528SQ201010245879
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者關翠萍, 周妙妮, 許愛娥 申請人:許愛娥;關翠萍