專利名稱：重組人促紅素的連續聚乙二醇化反應方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質的化學修飾，尤其是涉及一種重組人促紅素的連續聚こニ醇化反應方法。
背景技術：
重組人促紅細胞生成素(簡稱EP0)，是保護和促進骨髓中造血干細胞分化、増殖和成熟為紅細胞的特異性造血因子，由美國安進公司首先開發上市，在臨床上用于治療各種腎性貧血和非腎性貧血，被稱為迄今技術最成熟、療效最確切和全球銷售額最高的基因エ程藥物。不過，該藥物存在用藥頻繁(每周ー針或三針)和生物活性低等主要問題，給患者帶來較大的治療痛苦和生活不便，因此有進一步修飾改良的需要，也就是開發長效化EPO藥物。目前，國際上比較成熟的長效EPO藥物之一，就是美國安進公司開發上市的第二代EPO 制劑“Aranesp”，其半衰期比第一代EPO延長了 2倍，可以實現每周只需注射I次的治療方案，自上市以來，受到醫院和病人的歡迎，在2008年的年銷售額已達10億美元以上，并超過了第一代EPO的市場年增長率。同時，聚こニ醇化(PEG化)作為ー種很有效的制備長效蛋白質藥物的化學修飾途徑，也已應用于長效EPO藥物的制備。以瑞士羅氏公司于2007年8月上市的“Mircera”為例，其藥物活性成分就是單取代的PEG化EPO (mPEG-EPO),該藥物擁有比“Aranesp”更為持久的半衰期，達到了大約134小時，可以實現毎月只需注射2次或I次的治療方案，進ー步壓縮了常規EPO藥物的市場份額，形成了“長效、高活性、低治療成本”的藥物特點和競爭優勢，從而顯著地降低患者的治療痛苦和經濟負擔，有效地提高了患者的生活質量。而在PEG-EPO藥物的研發過程中，PEG-EPO的合成反應エ藝是非常關鍵的技術。一個好的PEG-EPO合成エ藝可以顯著地減低PEG-EPO藥物的生產成本，同時直接影響到了最終所得PEG-EPO藥物的生物活性以及藥效。目前在國際上，比較成功的PEG-EPO藥物是羅氏上市的“ Mircera”，其合成エ藝的單取代反應率大約在40%左右，同時多取代產物含量達到38%，其中的單取代產物是PEG-EPO合成反應的目標產物，具有較為確定的分子結構和較高的藥物活性，而多取代產物則是反應的副產物，會加大后續純化工藝的難度。此外，相比已有的其它PEG化蛋白質藥物，EPO具有9個反應位點(如圖I所示)，包括8個賴氨酸殘基和N端氨基，在反應中容易形成多取代產物，更難于實現特異性定點PEG化合成。以羅氏的PEG-EPO藥物為例，其最終形成制劑的單取代PEG-EPO藥物是由三種以上不同取代位置的單取代產物組成的，其主要的取代位置分別是氮端氨基酸、52位賴氨酸和45位賴氨酸。因此，PEG-EPO合成エ藝的重點和難點在于提高單取代率，同時降低多取代率，以利于后續純化工藝。
發明內容
為解決上述問題，本發明的目的在于提供一種單取代率高、多取代率低的重組人促紅素的連續聚こニ醇化反應方法。
本發明的目的是通過以下技術措施實現的，一種重組人促紅素的連續聚こニ醇化反應方法，其中，EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應后至少還包括以下步驟將第一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進ー步加入PEG進行第二次PEG化反應，得到最終反應液。為了使單取代率更高，在得到最終反應液前還包括以下若干步驟將前一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的緩沖液中進ー步加入PEG進行后一次PEG化反應。作為ー種優選方式，在得到最終反應液前還包括以下步驟將第二次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液或第三種緩沖液中進ー步加入PEG進行第三次PEG化反應。具體的，所述第一種緩沖液包括pH6. 5 7. 5的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括與第一種緩沖液PH值不重疊的pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液、pH7. 4
9.0的硼砂緩沖液、pH9. 0 12的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH4. 5 7. 0的醋酸緩沖液。更具體的，所述第一種緩沖液包括pH7. 2的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括PH7. 4的磷酸緩沖液、pH7. 4的硼砂緩沖液、pH9. 3的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或PH5.8的醋酸緩沖液。一種優選的反應條件，所述PEG化反應方法包括將PEG與EPO混合反應至少2小時，反應pH值為7.0 7. 5，所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 I，所述PEG中聚こニ醇的分子量為30，000 40，000道爾頓。具體的，所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 I為全部PEG化反應步驟中PEG與EPO的摩爾比。具體的，所述PEG化反應方法包括將PEG與EPO混合反應為2. 5小時。作為進一歩提高單取代率的方式，還包括在最終反應液中純化單取代PEG-EPO的步驟將最終反應液經疏水層析純化得到單取代PEG-EPO與PEG的混合物，再從單取代PEG-EPO與PEG的混合物中分離得到單取代PEG-EP0。PEG-EPO合成エ藝之所以單取代率低、多取代率高，是因為在第一次PEG化反應以后，所得PEG-EPO反應液具有較高的穩定性，未反應的EPO原液很難進一歩與新加入的PEG試劑發生二次PEG化反應。其原因在于反應液中已經水解失去活性的PEG試劑，在EPO分子周圍形成的空間位阻很大，阻止了新加入的帶有反應活性的PEG試劑與反應液中的游離的EPO分子的相互反應。同吋，已經被單取代或多取代的EPO分子中可供修飾的氨基數目也變少了，并且剩下的位點比較難被修飾。依據緩沖液可改變蛋白質構象或封閉某些反應部位的原理，在試驗中發現，在相同的PH值范圍內，采用不同的緩沖體系進行修飾反應，所得反應效果有很明顯的差別。這應該是由于在不同的緩沖環境中，PEG與EPO分子的氨基結合位點不同，同時在離子類型不同的緩沖液中，EPO分子各賴氨酸殘基所處的微環境不同，即PEG與各氨基結合的難易程度不同。通過更深入的實驗研究，我們進一歩發現，在EPO分子完成第一次PEG化反應以后，往所得反應液體系中，加入適量的另ー種緩沖液，可以非常有效地降低溶液中游離EPO分子所受到的PEG分子的位阻作用，從而為EPO分子的第二次，乃至多次PEG化反應提供了合適的反應條件。在此基礎上，我們已經成功地實現了 EPO的二次、三次，乃至四次PEG化反應，建立了一種新的PEG-EPO的制備方法，所得單取代產物的收率較高，并顯著地降低了多取代產物的形成。同吋，紫外光譜測試、電泳測試、唾液酸測試和體外活性測試等測試結果表明，所得PEG-EPO單取代產物很好地保留其生物活性和蛋白質分子結構。因此本發明創造性地應用了多緩沖體系的反應方法，實現了 EPO的可連續PEG化反應，建立了ー種具有較高單取代率、較低多取代率的反應方法。
圖I為EPO分子的氨基酸序列圖；圖2為純化產物mPEG-EPO的SEC-HPLC分析圖譜；圖3為純化產物mPEG-EPO的紫外光譜分析結果(從上到下M-PEG-SCM聚合物樣品；EP0原液樣品；純化產物mPEG-EPO樣品)；
圖4為純化產物mPEG-EPO的電泳分析結果(從左到右EP0原液樣品；分子量Marker樣品；M_PEG_SCM聚合物樣品；純化產物mPEG-EPO 樣品)。
具體實施例方式下面結合相關實驗和具體實施例并對照附圖對本發明作進ー步詳細說明。在實驗和具體實施例中使用了兩種PEG試劑都來自北京鍵凱科技有限公司，分別是35KD的GLUC-PEG-NHS (葡萄糖聚こニ醇NHS酷)，以及35KD的M-PEG-SCM (甲氧基聚こニ醇こ酸酷)。所用的EPO原液，由深圳賽保爾生物藥業有限公司制備。實驗ー PEG-EP0反應液成分含量的長期穩定性用15ml塑料離心管，加入I. 63ml EPO原液(EP0含量3. 07mg/ml)，以及3. 37mlpH7. 5的40mM磷酸緩沖液，EPO的終濃度為lmg/ml。準確稱量109. 4mg GLUC-PEG-NHS，加入1094 ill 2mM且pH3. 0的磷酸緩沖液溶解。溶解后，將GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，試紙測定EPO溶液的pH為7. 5。反應混合液放置于振蕩器上，室溫振蕩反應2. 5小吋。反應完畢后，取樣作SEC-HPLC檢測。SEC-HPLC檢測條件如下SEC-HPLC 柱GE superpose 6 分析柱流動相PBS緩沖液HPLC 儀島津 HPLC，PDA 檢測器，LC solution 工作站檢測波長280nm上樣量20ill流速0.5ml/min所得PEG-EPO反應液未經進ー步處理，封閉保存于4°C冰箱中，在20個月后，重新取樣作SEC-HPLC檢測。結果列于表I。表1PEG-EP0反應液成分含量的長期穩定性考察的SEC-HPLC檢測結果
權利要求
1.一種重組人促紅素的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應后至少還包括以下步驟將第一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進ー步加入PEG進行第二次PEG化反應，得到最終反應液。
2.根據權利要求I所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于在得到最終反應液前還包括以下若干步驟將前一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的緩沖液中進ー步加入PEG進行后一次PEG化反應。
3.根據權利要求2所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于在得到最終反應液前還包括以下步驟將第二次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液或第三種緩沖液中進ー步加入PEG進行第三次PEG化反應。
4.根據權利要求I或2或3所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于所述第一種緩沖液包括PH6. 5 7. 5的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括與第一種緩沖液PH值不重疊的pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液、pH7. 4 9. 0的硼砂緩沖液、pH9. 0 12的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH4. 5 7. 0的醋酸緩沖液。
5.根據權利要求4所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于所述第一種緩沖液包括pH7. 2的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括pH7. 4的磷酸緩沖液、PH7. 4的硼砂緩沖液、pH9. 3的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH5. 8的醋酸緩沖液。
6.根據權利要求I或2或3所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于所述PEG化反應方法包括將PEG與EPO混合反應至少2小時，反應pH值為7. 0 7. 5，所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 1，所述PEG中聚こニ醇的分子量為30,000 40，000道爾頓。
7.根據權利要求6所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 I為全部PEG化反應步驟中PEG與EPO的摩爾比。
8.根據權利要求6所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于所述PEG化反應方法包括將PEG與EPO混合反應為2. 5小時。
9.根據權利要求I或2或3所述的連續聚こニ醇化反應方法，其特征在于還包括在最終反應液中純化單取代PEG-EPO的步驟將最終反應液經疏水層析純化得到單取代PEG-EPO與PEG的混合物，再從單取代PEG-EPO與PEG的混合物中分離得到單取代PEG-EP0。
全文摘要
本發明涉及蛋白質的化學修飾，公開了一種重組人促紅素的連續聚乙二醇化反應方法，其中，EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應后至少還包括以下步驟將第一次PEG化反應的反應液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進一步加入PEG進行第二次PEG化反應，得到最終反應液。本發明應用多緩沖體系的反應方法，實現了EPO的可連續PEG化反應，建立了一種具有較高單取代率、較低多取代率的PEG化反應方法。
文檔編號C07K17/08GK102746405SQ20121025754
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月24日 優先權日2012年7月24日
發明者吳園園, 張向榮, 張滌平, 盛光陽, 鄭崇吉, 陳賢光, 黎雄輝 申請人:深圳賽保爾生物藥業有限公司